10_imunodiagnóstico_2024

Imunoensaios:
Interações entre Antígeno e

anticorpo.
NATUREZA DAS REAÇÕES
ANTÍGENO-ANTICORPO
◼ Fab: regiões hipervariáveis
◼ Afinidade
◼ Avidez
◼ Especificidade
◼ Reação cruzada
Afinidade
Avidez
INTERAÇÕES
ANTÍGENO-ANTICORPO
Visam a detecção,
quantificação e caracterização
dos anticorpos, bem como o
seu uso como ferramenta para
pesquisa e diagnóstico.
Imunoensaios:
◼ Metodologias que utilizam:
✓ Reagentes não marcados

◼ Reação de precipitação
◼ Reação de aglutinação
◼ Reação de floculação
✓ Reagentes marcados
◼ RIA
◼ ELISA
◼ Imunofluorescência
◼ Quimioluminescência
1. Reação de precipitação
◼ A interação Ac e Ag solúvel forma uma rede (um
precipitado visível).
◼ Variações da técnica:
◼ Em Gel: 1. Imunodifusão Dupla 2. Imunodifusão Radial
◼ Execução da técnica
◼ Em Lâmina Em Placas Em tubo
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
PRECIPITADO
IMUNODIFUSÃO DUPLA
• Coloca-se agarose sobre uma placa de Petri:
• Faz-se pequenos orifícios no gel

• Adiciona-se as soluções testes de Ag (Histoplasma) e Ac (Anticorpo
anti-Histoplasma - soro)
Ac Ac
Ag
IMUNODIFUSÃO DUPLA
◼ Incuba-se por 24 – 48 horas.
◼ As soluções sofrem difusão
◼ Ag e o Ac se encontram (zona de equivalência) =
linha de precipitação
Ac Ac
Ag
Ac Ac Ac Ac
Ag 24 – 48 horas Ag
IMUNODIFUSÃO DUPLA
Linha de
precipitação
IMUNODIFUSÃO RADIAL
(Método de Mancini)
◼ O Ac é incorporado no gel de agarose.
◼ Faz-se orifícios neste gel.
◼ Aplica-se os soros nos orifício, em diferentes
concentrações (Quantificação)
◼ Incubação por 24/48 horas.
◼ POSITIVO: ocorre formação de um halo de
precipitação ao redor dos orifícios
Poços onde são

colocados padrões
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo Halo de precipitação
anticorpos IgG – anti-IgG
anti-IgG humana
IMUNODIFUSÃO RADIAL
(Método de Mancini)
2. Reação de aglutinação
◼ Ac ou Ag fixado a uma partícula
◼ Direta
◼ Indireta (PASSIVA)
◼ Hemaglutinação
◼ Principais usos:
◼ Triagem sanguínea
◼ PCR/FR/Teste de gravidez (B-HCG)/ASLO
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
Ex: Grupo sanguíneo (ABO)
1) Amostra de sangue na lâmina 2) Reagente (anticorpo anti- A)
3) Reagente (anticorpo anti- B): 4) Homogeneização

AGLUTINAÇÃO DIRETA
5) Leitura do resultado:
negativo positivo
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

visível.
17
Aglutinação direta (Hm)
xxxxxxxxxxxxxx
Reação de aglutinação por partículas
de Látex
Leitura do teste de aglutinação
POSITIVO NEGATIVO
HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA
*Paciente
negativo?
*Paciente
positivo?
*Efeito zona
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
◼ Partículas de látex ou superfície de hemácias

recobertas por Ag solúvel.
◼ Adiciona-se o soro (contendo Ac) em diferentes
concentrações.
◼ Leitura:
POSITIVO: presença do Ac específico contra o Ag, as
hemácias se aglutinam e formam uma camada no
fundo do poço
NEGATIVO: ausência do Ac específico as hemácias
formam um botão no fundo do poço.
USOS: ASLO, sífilis, doenças de Chagas...
3. Reação de Floculação
◼ Bastante usada na triagem da Sífilis.
◼ Isoladamente não dá diagnóstico da doença
◼ Usa antígenos inespecíficos, de caráter lipoidal
◼ Sinônimos:
◼ VDRL
◼ Teste da reagina(RPR)
◼ Composição do antígeno:
◼ Cardiolipina
◼ Colesterol e
◼ Lecitina
VDRL
◼ Foi desenvolvido pelo VENERAL DISEASE
Research Laboratory.
◼ Não discrimina a classe do anticorpo detectado
◼ Técnica:
◼ Usar a placa de Kline ( lâmina de vidro escavada)
◼ Pipetar 50 uL de soro do paciente inativado pelo calor
a 56ºC
◼ Pipetar 25 uL do reagente do VDRL
◼ Homogeneizar em um agitador de Kline por 4 minutos.
◼ Realizar a leitura em um microscópio ótico na objetiva
de 10.
VDRL
◼ Interpretação do resultado:
◼ NEGATIVO:ausência de floculação
◼ POSITIVO: presença de floculação

Imunoensaios:
◼ Metodologias que utilizam:
✓ Reagentes não marcados

◼ Reação de precipitação
◼ Reação de aglutinação
◼ Reação de floculação
✓ Reagentes marcados
◼ RIA
◼ ELISA
◼ Imunofluorescência
1. ELISA (enzime linked imunno
sorbent assay) (ensaio de
imunoabsorção enzimática)
◼ Ac ou Ag marcado com enzimas
◼ Direto-sanduiche
◼ Indireto
◼ competitivo
◼ Principais usos: B-HCG, HIV...
1. Elisa
◼ O princípio básico da técnica: imobilização de um
dos reagentes (anticorpo ou antígeno) em uma fase
sólida.
◼ Adição da amostra
◼ o outro reagente ligado a uma enzima reagirá com o
complexo antígeno-anticorpo.
◼ Adição do substrato da enzima + um cromógeno
formando um produto colorido.
◼ Leitura em espectrofotômetro
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
PLACA
INDIRETO DIRETO OU UTILIZADA
SANDUÍCHE
Lavadora de ELISA
Leitora de ELISA
2. RADIOIMUNOENSAIO - RIA
➢ Ac ou Ag marcado com radioisótipos (iodo/trítio)
➢ Marcações: I125: emite raios gama H3: raios beta
➢ Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo(Risco operacional)
➢ Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas.
RIA
3. Imunoflorescência
◼ Ac ou Ag marcado com compostos imunoflorescentes
(fluorocromo)
◼ Direta
◼ Indireta
◼ Microscopio de imunoflorescência/Citometria de fluxo
◼ Principais usos: FTA-ABS, FAN...
Imunofluorescência Indireta - IFI
Leitura em microscópio de luz ultravioleta
Segundo anticorpo marcado com fluoresceína

(conjugado)
Anticorpo específico da amostra
Antígeno
Lâmina de vidro
Imunofluorescência
IFI EM SUBSTRATO ESPECÍFICO – Crithidia luciliae
Teste positivo Teste negativo
Crithidia luciliae – detecta anti-DNA
Baixa sensibilidade e alta especificidade

LES
Imunoflorescência
Microscópio de fluorescência
Imagem da fluorescência
fluorescência emitida
chega ao observador
luz UV atinge o
material examinado
Filtro: 490 – 520 nm

Teste de FAN-HEp-2 → método padrão para triagem de auto-anticorpos
Reagente Não reagente
Titulação
Padrão: Nuclear Pontilhado Fino

Titulo: maior ou igual a 1:1280
Fc
Aplicações da IF:
• FTA-Abs
• Identificar espécies bacterianas
• localização de hormônios
• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
Detecção anticorpos anti-DNA
• Teste qualitativo e quantitativo
Citometria de Fluxo
➢ Separação de células ativadas por fluorescência
➢ Anticorpos contra moléculas de membrana ou
Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)
➢ Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente
➢ Teste qualitativo e quantitativo
CD 8
CD 4
CD 125
CD 147
Princípios Básicos da Citometria de Fluxo
CITO METRIA FLUXO
Célula Medida Movimento

Aplicações:
➢ Determinar o tipo e n o de
CD4 céls. sanguíneas brancas
➢ isolar populações celulares
➢ distribuição de céls de acordo

CD8 com a densidade dos Ag
➢ o tamanho celular.
CD20
❖ Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes
HIV , Leucemias
➢ Tamanho
➢ Granulosidade
➢ Fluorescência
OUTRAS TÉCNICAS
◼ Western blotting (enzimas)
◼ Testes rápidos
(imunocromatografia/enzimas)
◼ Equipamentos de larga escala:
◼ Nefelometria
◼ Turbidimetria
WESTERN BLOTTING
◼ Eletroforese de proteínas.
◼ Identifica antígenos ou anticorpos.
◼ HIV
WESTERN BLOTTING
Testes rápidos
Método dipstick – Ensaios imunocromatográficos:
● Busca de Ac (soro) ou Ag (soro, urina, sangue
lisado, fezes, líquidos);
● Teste qualitativo simples, rápido, fácil e barato, além
de fácil interpretação e os controles positivos e
negativos já estão contidos;
● Método de impregnação, semelhante ao Western
blot
● Reagente de detecção pode ser marcado com
corante coloidal ou enzimas.
Testes rápidos
Nefelometria
◼ Análise das imunoprecipitinas pelo uso da
dispersão da luz.
◼ A ocorrência de formação do imune
complexo está relacionado com a quantidade
de dispersão de luz
◼ Nefelometria: detecta a energia liberada
durante a dispersão da luz.
◼ Mede a luz que sofre dispersão quando esta
incide sobre o complexo Ag-Ac.
Turbidimetria
◼ Turbidez: diminuição da claridade da luz, causada
por reflexão, dispersão e absorção por uma
suspensão de partículas.
◼ Mesmos princípios aplicados na espectrofotometria
◼ A atenuação da luz incidente, ao passar pelo tubo
contendo os complexos suspensos, determina a
concentração final do elemento analisado.
Quimioluminescência
◼ É o método que emprega uma substância luminescente para

detecção da reação antígeno-anticorpo. O resultado é definido
por emissão de luz que é captada e analisada em equipamento
próprio.
◼ Vantagens:
Acesso aleatório
Vários testes de uma só vez
Rápido
Automação
Quimioluminescência
O IMMULITE 2000 é um analisador

automatizado de imunoensaios, de
acesso randômico dedicado a
realização de imunoensaios
quimiluminecentes, desenvolvido para
determinações diagnósticas de analitos
“ in vitro” no soro, plasma e urina . Immulite 2000
IMMULITE 2000

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Imunoensaios:

Interações entre Antígeno e

◼ Metodologias que utilizam:

✓ Reagentes não marcados

• Coloca-se agarose sobre uma placa de Petri:

• Faz-se pequenos orifícios no gel

Poços onde são

1) Amostra de sangue na lâmina 2) Reagente (anticorpo anti- A)

3) Reagente (anticorpo anti- B): 4) Homogeneização

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

◼ Partículas de látex ou superfície de hemácias

◼ POSITIVO: presença de floculação

◼ Metodologias que utilizam:

✓ Reagentes não marcados

Leitura em microscópio de luz ultravioleta

Segundo anticorpo marcado com fluoresceína

Anticorpo específico da amostra

Teste positivo Teste negativo

Crithidia luciliae – detecta anti-DNA

Baixa sensibilidade e alta especificidade

Filtro: 490 – 520 nm

Reagente Não reagente

Padrão: Nuclear Pontilhado Fino

CITO METRIA FLUXO

Célula Medida Movimento

➢ isolar populações celulares

➢ distribuição de céls de acordo

◼ É o método que emprega uma substância luminescente para

O IMMULITE 2000 é um analisador

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