LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM LABORATORIUM PEMULIAAN TANAMAN Oleh : Emil Rahim A1D019163 Rombongan 6 Penanggung Jawab Asisten: Deni Yulianto KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2020 i PRAKATA Segala puji kami panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia yang diberikan, sehingga Laporan Praktikum Teknik Dasar Laboratorium ini bisa terselesaikan dengan baik. Adapun laporan ini kami susun sebagai bagian dari tugas mata kuliah Teknik Dasar Laboratorium. Dalam penyusunan laporan ini, kami mengucapkan terimakasih sebesarbesarnya kepada semua pihak yang telah membantu terselesaikannya laporan ini. Adapun pihak-pihak tersebut antara lain: 1. Bapak Ir. Budi Prakoso, Grad.Dip.App.Sc., M.Sc., D.Tech.Sc selaku dosen pengampu mata kuliah Teknik Dasar Laboratoriun. 2. Seluruh petugas laboratorium Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, asisten praktikum, sahabat, kerabat, dan pihak-pihak lainnya yang tidak bisa penyusun sebutkan satu persatu. penulis menyadari bahwa laporan praktikum ini belumlah dikatakan sempurna. Untuk itu, kami dengan sangat terbuka menerima kritik dan saran dari pembaca sekalian. Semoga laporan praktikum ini bermanfaat untuk kita semua. Bekasi , 24 April 2020 Penulis, ii DAFTAR ISI COVER UTAMA ........................................................................................... i PRAKATA .................................................................................................... ii DAFTAR ISI ................................................................................................ iii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... vii ACARA XII. ISOLASI DNA ......................................................................... 1 I. PENDAHULUAN.............................................................................. 2 A. Latar Belakang ............................................................................. 2 B. Tujuan .......................................................................................... 3 II. TINJAUAN PUSTAKA .....................................................................4 III. METODE PRAKTIKUM ...................................................................7 A. Bahan dan Alat ............................................................................. 7 B. Prosedur Kerja .............................................................................. 7 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................... 8 A. Hasil ............................................................................................. 8 B. Pembahasan.................................................................................. 9 V. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................... 13 A. Kesimpulan ................................................................................ 13 B. Saran .......................................................................................... 13 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 14 LAMPIRAN ........................................................................................... 16 ACARA XIII. APLIKASI PCR UNTUK DETEKSI GEN TAHAN HERBISIDA PADA TANAMAN KEDELAI .................. 24 I. PENDAHULUAN............................................................................ 25 A. Latar Belakang ........................................................................... 25 B. Tujuan ........................................................................................ 26 II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 27 III. METODE PRAKTIKUM ................................................................. 29 iii A. Bahan dan Alat ........................................................................... 29 B. Prosedur Kerja ............................................................................ 29 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................... 31 A. Hasil ........................................................................................... 31 B. Pembahasan................................................................................ 31 V. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................... 37 A. Kesimpulan ................................................................................ 37 B. Saran .......................................................................................... 37 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 38 LAMPIRAN ........................................................................................... 39 ACARA XIV. TEKNIK ELISA UNTUK DETEKSI ANTI GEN ..............44 I. PENDAHULUAN............................................................................ 45 A. Latar Belakang ........................................................................... 45 B. Tujuan ........................................................................................ 46 II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 47 III. METODE PRAKTIKUM ................................................................. 49 A. Bahan dan Alat ........................................................................... 49 B. Prosedur Kerja ............................................................................ 49 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................... 50 A. Hasil ........................................................................................... 50 B. Pembahasan................................................................................ 51 V. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................... 54 A. Kesimpulan ................................................................................ 54 B. Saran .......................................................................................... 54 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 55 LAMPIRAN ........................................................................................... 57 Riwayat Hidup ...................................................................................................62 iv DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. ACC Acara 12 ............................................................................ 16 Lampiran 2. Dokumentasi Praktikum ............................................................. 17 Lampiran 3. Pustaka....................................................................................... 18 Lampiran 1. ACC Acara 13............................................................................ 39 Lampiran 2. Dokumentasi Praktikum ............................................................. 41 Lampiran 3. Pustaka....................................................................................... 42 Lampiran 1. ACC Acara 14 ................................................................................57 Lampiran 2. Dokumentasi Praktikum ............................................................. 58 Lampiran 3. Pustaka....................................................................................... 59 v LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM ACARA XII ISOLASI DNA Oleh: Emil Rahim A1D019163 Rombongan 6 KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2020 1 I.PENDAHULUAN A.Latar belakang Indonesia merupakan salah satu negara yang melakukan kegiatan impor kedelai. Kebijakan kedelai impor tersebut menuai kritik di media massa nasional karena selain dianggap merugikan petani, tetapi secara kebijakan hal itu menunjukkan kian rapuhnya kedaulatan pangan nasional. Masalah lain yang cukup serius tapi luput dari pengamatan publik terkait informasi mengenai biji kedelai impor tersebut, dan informasi tersebut tak pernah disampaikan terbuka kepada publik. Sementera itu, dari berbagai informasi perkembangan di kalangan pengamat dan akademisi sudah lama menjelaskan bahwa biji kedelai impor adalah biji kedelai transgenik atau produk Genetically Modified Organism (GMO), akan tetapi secara pasti dan ilmiah belum bisa diketahui dan dijelaskan sifat gen apa yang disisipkan ke dalam genom kedelai impor. Genetically Modified Organism (GMO) atau yang dalam bahasa Indonesia disebut dengan produk rekayasa genetika adalah organisme yang DNA-nya telah dirubah dengan menggunakan suatu teknologi yang disebut dengan bioteknologi modern sehingga menghasilkan suatu organisme atau produk yang berbeda dengan produk alamiahnya yang mempunyai beberapa kelebihan karena dalam pembuatannya dilakukan seleksi terhadap sifat-sifat baiknya. Walaupun memiliki kelebihan, produk GMO juga memiliki kekurangan yang besar diantaranya berpotensi menyebabkan alergi dan dipercaya tidak ramah lingkungaN, untuk itu diperlukan teknologi deteksi GMO yang akan mendeteksi keberadaan gen sisipan juga jumlah dan prosentasenya apakan sudah memenuhi persyaratan produk GMO. Kebutuhan kedelai di Indonesia sebesar 30 juta ton per tahun, untuk memenuhi kebutuhan protein nabati baik balam bentuk segar, maupun olahan dan fermentasi seperti : minyak kedelai, susu kedelai, kecap, tahu, tempe, camilan dll. 2 Sedang produksi kedelai Indonesia sangat rendah dibanding Amerika (1:2), sehingga impor kedelai dari tahun ke tahun mengalami peningkatan. Penurunan produksi kedelai antara lain 2 disebabkan oleh adanya serangan hama dan penyakit. Pemerintah DIY mulai tahun 2000 mencanangkan program “Gema palagung” dalam rangka swasembada kedelai. Mosaik daun merupakan penyakit virus penting pada tanaman yang hingga kini belum ditemukan metode pengendalian yang memadai. Virus tersebut dapat bertahan hidup bertahun-tahun dalam sisa tanaman yang mudah terinfeksi atau di dalam tanah, mudah menular dan sulit dikendalikan (Agrios, 1988). Soybean Mosaic Virus (SMV) merupakan virus yang menyerang kedelai, penyebab penyakit Mosaik. Biji kedelai yang terserang SMV akan berkeriput dan bila menjadi bibit memperlihatkan gejala tumbuh tinggi dan kurus, daun nekrotik dan melengkung ke bawah, tulang daun menguning serta cepat rontok, tanaman menjadi kerdil dan akhirnya mati. Penyakit Mosaik kedelai dapat mempengaruhi pertumbuhan dan hasil sampai mencapai 60 – 90 %, bahkan mengakibatkan kegagalan panen (Somaatmadja, 1988; Semangun, 1991; Wang et al., 1998). Data dari dinas HPT secara nyata menunjukkan bahwa serangan SMV di lapangan dapat menimbulkan kerugian sebesar 50 – 90 %. Iklim tropis yang lembab di Indonesia, menyebabkan serangan virus semakin meluas. Soybean Mosaic Virus termasuk potyvirus bentuk batang dengan satu tipe coat protein, terdiri atas RNA dengan ukuran 10 kb dan poly A pada ujungnya. Soybean Mosaic Virus menyandi 8 protein yang pada awalnya merupakan protein besar kemudian mengalami pemrosesan menjadi protein virus (Eggenberger et al, 1989; Sismindari dan Sujadi, 1996; Somaatmadja, 1998). Berbagai cara pengendalian penyakit telah dilakukan, namun hasilnya kurang memuaskan. B.Tujuan Tujuan Praktikum ini yaitu 1. Untuk mengetahui cara melakukan isolasi DNA kedelai. 3 II.TINJAUAN PUSTAKA Kedelai merupakan sumber pangan yang bernilai gizi tinggi, digunakan sebagai bahan pakan ternak, pangan manusia, industri, sumber minyak dan protein nabati.Di Indonesia produktivitaskedelai masih dipengaruhi oleh faktor genetik (varietas) dan lingkungan (teknik budidaya). Pada kenyataannya varietas unggul memegang peranan paling menonjol dalam kontribusi peningkatanhasil kedelai per satuan luas bagi petani(Arisetianingsih et al., 2010). Deoxyribonucleic Acid (DNA), merupakan salah satu makro molekul yang mempunyai peranan yang sangat penting pada jasad hidup. DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada jasad keturunannya. Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa nukleotida dan menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologis suatu jasad. Molekul DNA berbentuk double helix (untai ganda) yang terpilin, pada masing-masing untaian terdapat asam fosfat dan deokxyribose, satu dari empat basa terikat secara kovalen, yaitu : adenin, guanin, sitosin, dan timin (Hidayat, 2014). DNA pada sel eukariotik dapat ditemukan baik pada kromosom inti (DNA kromosomal) maupun pada organel, yaitu pada mitokondria dan kloroplas (DNA ekstrakomosomal) (Fatchiyah et al., 2011). Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam identifikasi molekuler.Keberhasilan isolasi DNA sangat mempengaruhi kualitas DNA yang diperoleh.Pada Gambar 1 dapat dilihat bahwa terdapat pita DNA pada gel elektroforesis.Pita DNA hasil isolasi yang diperoleh tidak berupa pita tunggal, melainkan berbentuk noda memanjang.Pita DNA yang berbentuk noda memanjang pada gel elektroforesis ini disebut smear. Hal ini kemungkinan besar disebabkan karena polisakarida yang dihasilkan oleh fungi tersebut ikut terekstraksi saat isolasi DNA dilakukan (Rahayu et al., 2015). 4 Usaha dalam mendapatkan DNA murni memerlukan suatu cara yaitudengan isolasi DNA. Prinsip isolasi DNA adalah mendapatkan DNA murni yang tidak tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein dan karbohidrat. Sel tanaman dilindungi oleh membran sel dan dinding sel yang kuat. Membran sel terdiri dari ikatan antara protein dan lemak, sedangkan dinding sel tersusun atas polisakarida. Dinding sel dan membran sel harus dipecah untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel. Proses penghancuran sel dipengaruhi oleh jumlah bahan (kuantitas), kondisi bahan (kualitas), dan proses penghancuran itu sendiri. (Ferniah & Pujiyanto, 2013). Secara umum, ekstraksi DNA memiliki beberapa tahapan yaitu tahap penghancuran jaringan tanaman dengan cara digerus menggunakan motar dan pistil maupun menggunakan nitrogen cair atau buffer ekstraks, lalu tahap eliminasi senyawa kontaminan menggunakan pelarut organik seperti fenol, kloroform, dan isoamil alkohol, dan tahap presipitasi DNA menggunakan etanol atau isopropanol (Nugroho et al., 2019) Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA tanaman.Metode-metode tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi DNA (Ribeiro et al. 2007). Beberapa metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada tahap awal ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik (Utami et al., 2012). Isolasi DNA genom dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik dan kimia. Secara fisik sel dipecah dengan kekuatan mekanik yaitu secara freeze thaw, bead mill homogenization dan resonansi misalnya dengan sonikasi. Sedangkan secara kimia sel dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel (Murtiyaningsih, 2017). Kehadiran sejumlah kontaminan seperti polisakarida dan senyawa metabolit sekunder akan menghambat kerja enzim polymerase pada kegiatan PCR. Oleh karena itu proses penghilangan senyawa kontaminan tersebut mutlak diperlukan dalam suatu metode ekstraksi DNA (Amani et al., 2011). Produk isolasi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi menggunakan elektroforesis. Setelah proses elektroforesis DNA dan dihasilkan pita DNA yang berkualitas 5 dilanjutkan proses PCR, yaitu metode in vitro yang secara cepat dapat menyalin sekuen-sekuen DNA target yang ada di dalam keseluruhan DNA (Sundari, 2017). Sebuah isolasi yang baik harus sederhana, cepat dan efisien serta menghasilkan jumlah DNA yang cukup berkualitas tinggi yang cocok untuk analisis molekuler. Hasil DNA dari protokol yang dioptimalkan diamati secara luas bebas dari polyphenolik dan metabolit sekunder, sebagaimana ditentukan oleh digesti yang sukses dengan restriksi endonuklease dan amplifikasi PCR. (Alatar et al., 2012). Indikasi lain bahwa DNA yang diperoleh mempunyai kualitas yang baik (murni) adalah dapat digunakan untuk aplikasi molekuler lain dan dapat dipotong oleh enzim restriksi dengan sempurna karena tidak adanya kontaminan dalam DNA yang dapat mengganggu kerja dari enzim restriksi dengan begitu hasil pemotongan menjadi bagus dan terlihat adanya fragmentasi DNA yang hampir sempurna (Syafarudin et al., 2011). 6 III.METODE PRAKTIKUM A.Alat dan Bahan Alat yang diperlukan pada praktikum ini adalah Vortex,Mikropipet beserta Tip,Tub,Mortar dan pestle,Timbangan Analitik,Spidol.Sedangkan Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah Kedelai jenis GMO,enzim RNAse,etanol dan larutan buffer. B.Prosedur kerja 1. Disiapkan terlebih dahulu alat dan bahan yang akan digunakan saat praktikum, diantaranya PCR, tube, air steril, Etanol, Esopropanol, Vortex mixer, Contifuge, Mikro pipet, dan elenmayer. 2. Pertama, biji kedelai digerus dan itimbang sebanyak 50 ml gram dengan timbangan analitik. 3. Selanjutnya, ditambahkan dengan NLS sebanyak 600 ml untuk menghancurkan dinding sel pada DNA, kemudian dihomogenkan. 4. Kemudian, larutan yang sudah dihomogenkan di inkubasi pertama selama kurang lebih 30 menit dengan suhu 65 derajat celcius. 5. Larutan yang sudah di inkubasi di tambahkan RNAse guna dihancurkannya RNA sebanyak 3 ml. 6. Inkubasi kembali dengan suhu 37 derajat celcius selama 30 menit. 7. Ditambahkan lagi dengan PPS (Protein Precipitation Solution) sebanyak 200 ml yang berfungsi untuk mengendapkan protein. 8. Larutan kemudian dihomogenkan menggunakan vortex. 9. Selanjutnya, setalah dihomogenkan larutan dipisahkan berdasarkan berat jenis menggunakan centrifuge selama 3 menit. 10. Kemudian, supernatan dipindahkan ke ube baru sebanyak kurang lebih 30 ml. 7 11. Supernatan yang telah dipindah, ditambahkan isopropanol sebanyak 600 ml yang berfungsi untuk memurnikan DNA. 12. Kemudian larutan dipisahkan kembali menggunakan centrifuge selama 1 menit. 13. Supernatan pada larutan di buang dan di tambahkan etanol 70% sebanyak 600 ml. 14. Larutan dipisahkan kembali dengan menggunakan centrifuge selama 1 menit. Supernatan dibuang dan pellet ditunggu hingga kering. 15. Setelah pelet kering, DNA RS di tambahkan sebanyak 100 ml dan siap digunakan untuk praktikum PCR 8 IV.HASIL DAN PEMBAHASAN A.Hasil 1. Disiapkan biji kedelai jenis GMO yang sudah digerus 2. Ditimbang Biji kedelai yang sudah digerus sebanyak 50 mg 3. larutan NLS dimasukan kedalam kedalam tub sebanyak 50 mikromg 4. kemudian dihomogenkan menggunakan vortex 5. Diinkubasi selama 1 jam 15 menit pada suhu 65oC dan dihomogenkan menggunakan mesin water bath 6. Dimasukan 3 ml RNAse ke dalam tube 9 7. Kemudian diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 37 oC 8. Setelah selesai diinkubasi,dimasukan larutan PPS ( Protein Precipitacion solution ) sejumlah 200 ml selama 10 menit 9. Larutan dihomogenkan menggunakan vortex 10. Setelah dihomogenkan,larutan di pisahkan berdasarkan berat jenis menggunakan centrifuge . 11. Setelah di centrifuge,supernatan dibuang dari Tub dan ditambahkan DNA RS sejumlah 100 ml B.Pembahasan Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis molekuler. Dibutuhkan DNA dengan kualitas yang baik untuk berbagai kegiatan seperti pemanfaatan marka molekuler, pembuatan pustaka genom, hingga sekuensing. Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses isolasi DNA tanaman adalah kehadiran senyawa kontaminan pada sampel yang diisolasi seperti senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tumbuhan obat (Varma et al., 2007). Menurut Ranjan et al. (2010), kehadiran senyawa kontaminan tersebut dapat menghambat berbagai proses mulai dari pemotongan DNA, amplifikasi, hingga kloning. Isolasi DNA yang memiliki kualitas terbaik dan sedikit kontaminan diharapkan untuk kebutuhan PCR sehingga diperoleh metode terbaik untuk metode SDS, yaitu variasi metode menggunakan Proteinase K. Variasi metode menggunakan kalium asetat 5M bukan metode terbaik disebabkan metode tersebut memiliki ketebalan pita DNA yang lebih tipis dibandingkan dengan variasi menggunakan Proteinase K. Meskipun demikian, variasi kalium asetat memiliki keunggulan daripada Proteinase. Isolasi DNA merupakan langkah penting dari sampel klinis untuk diagnosis molekuler tuberkulosis dengan PCR (Aygan, 2006). Prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen 10 lainnya yang harus dilakukan dengan baik dan bebas dari kontaminasi sehingga diperoleh DNA hasil isolasi dengan kualitas yang baik (Tenriulo, et al., 2001). Proteinase K merupakan suatu protease endolitik yang memecah ikatan peptide pada sisi karboksil dari asam amino alifatik, hidrofobik atau aromatik. Proteinase K digunakan untuk pencernaan protein pada bagian jaringan sebagai perlakuan awal pada preparasi DNA dan RNA serta untuk menginaktivasi aktivitas enzimatik protein lain. Penambahan Proteinase K pada preparasi asam nukleat dengan cepat dapat menginaktivasi nuklease, RNase dan DNase (Abcam plc. 2009). Bahan lain yang digunakan dalam isolasi DNA adalah NaCl. NaCl merupakan rumus molekul dari Natrium Klorida/ Sodium Klorida yang mempunyai berat molekul 58,44 (Bioshop Canada Inc. 2009). Istilah umum bagi senyawa kimia ini adalah garam.Garam adalah senyawa ionik yang terdiri dari ion positif (kation) dan ion negatif (anion), sehingga membentuk senyawa netral (tanpa bermuatan).Garam terbentuk dari hasil reaksi asam dan basa.Penggunaannya diperkirakan telah berlangsung sejak 4.700 tahun yang lalu. Senyawa kimia ini sekarang diproduksi secara besar-besaran dari penguapan air laut, walaupun di beberapa negara lain seperti Australia dan USA garam yang diproduksi lebih banyak bersumber dari penambangan garam (UBB 2008). Ukuran molekul DNA teramat kecil, sehingga molekul DNA tidak dapat dilihat secara kasat mata.Namun demikian, ukuran (panjang-pendeknya), jumlah (konsentrasi) dan kualitas (tingkat kemurnian) molekul DNA itu sendiri dapat diketahui melalui pendugaan yang cukup akurat. Untuk kuantitas dan kualitas DNA, dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofometer sinar ultra violet sedangkan untuk mengetahui ukuran molekul DNA digunakan elektroforesis gel agarosa (Muladno 2002: 20). Protokol yang baik dalam menyiapkan DNA genom adalah protokol yang dapat menghasilkan DNA berukuran besar (high molecular weight DNA), tidak terdegradasi selama proses ekstraksi dan pemurnian serta dapat dipotong dengan baik oleh enzim restriksi yang digunakan (Horizon et al. 2003). Pada penelitian ini 11 telah mampu mengisolasi DNA genom pisang yang berukuran besar, ditandai dengan terlihatnya pita DNA yang menyala terang hasil elektroforesis. Pada semua perlakuan terlihat adanya pita DNA yang menyala terang. Hal ini menunjukkan DNA genom pisang telah dapat diisolasi namun masih kurang sempurna karena pada elektroforegram masih terlihat adanya smear yang berarti DNA yang terisolasi masih terikat dengan kontaminan senyawa lain seperti polisakarida dan senyawa fenolik. Senyawa-senyawa tersebut membentuk kompleks yang tidak reversibel dengan DNA selama proses isolasi. Smear yang terlihat pada elektroforegram kemungkinan juga merupakan molekul-molekul dengan bobot bervariasi yang dapat berasal dari DNA yang terdegradasi ataupun materi ikutan lain yang tidak diketahui (Horizon et al. 2003). 12 V.PENUTUP A.Kesimpulan Kesimpulan dari Praktikum acara ini adalah 1. Prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen lainnya yang harus dilakukan dengan baik dan bebas dari kontaminasi sehingga diperoleh DNA hasil isolasi dengan kualitas yang baik 2. Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis molekuler. Dibutuhkan DNA dengan kualitas yang baik untuk berbagai kegiatan seperti pemanfaatan marka molekuler, pembuatan pustaka genom, hingga sekuensing. B.Saran Dalam Praktikum Mengenai isolasi DNA sudah cukup efektif dalam rangka pembelajaran pengenalan teknik dasar laboratorium.Penulis hanya dapat menyarankan agar praktikum lebih kondusif dan berjalan dengan waktu yang efisien. \ 13 DAFTAR PUSTAKA Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The Isolation Of PCRAmplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research 11 (1): 348-354. Amani J, Kazemi R, Abbasi AR, Salmanian AH (2011) A simple and rapid leaf genomic DNA extraction method for Polymerase Chain Reaction analysis. Iran J Biotechnol 9:69-71 Arisetianingsih, R. E. D., Totok, A. D. H., & Prakoso, B. (2010). Keragaman genetik kedelai berdasarkan pola pita dna hasil rapd (Random Amplified Polymorphic DNA). Agrin, 14(1). Aygan, A. (2006). Nucleic acid extraction from clinical specimens for PCR applications. Turkish Journal of Biology, 30(2), 107-120. Buyya, R., Ranjan, R., & Calheiros, R. N. (2010, May). Intercloud: Utilityoriented federation of cloud computing environments for scaling of application services. In International Conference on Algorithms and Architectures for Parallel Processing (pp. 13-31). Springer, Berlin, Heidelberg. Fatchiyah, E.L., Arumingtyas S., Widyarti, & Rahayu, S. 2011. Biologi molekuler prinsip dasar analisis. Jakarta:Penerbit Erlangga Ferniah RS, Pujiyanto S (2013) Optimasi isolasi DNA cabai (Capsicum annuum L.) berdasar perbedaan kualitas dan kuantitas daun serta teknik penggerusan. BIOMA Juni 2013 Vol.156, No. 1, Hal. 14-19 Murtiyaningsih, Hidayah. 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi Kekerabatan Genetika Nanas Menggunakan RAPD (Random Aplified Polimeric DNA). Agritrop. 15(1):83-93 Nugroho, K., Terryana, R. T., & Lestari, P. (2019). METODE EKSTRAKSI DNA TANAMAN TANPA PRESIPITASI ETANOL UNTUK KEGIATAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia (JBBI), 6(1), 29-38. Rahayu, R., & Day, J. (2015). Determinant factors of e-commerce adoption by SMEs in developing country: evidence from Indonesia. Procedia-Social and Behavioral Sciences, 195, 142-150. Sundari (2017).Pengembangan Protokol Isolasi DNA Genom Tanaman Durian Dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB JURNAL TECHNO (JURNAL ILMU EKSAKTA) Vol 6 14 Syafaruddin, E., Randriani, Teknik Isolasi dan RISTRI.2(2) : 151-160. &Tri,J.S. (2011). Efektivitas dan Efisiensi Purifikasi DNA Pada Jambu Mete. Buletin Utami, E. R. (2012). Antibiotika, resistensi, dan rasionalitas terapi. Sainstis. Varma, M., & Ray, D. (2007). Learning the discriminative power-invariance trade-off. In 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision (pp. 1-8). IEE 15 LAMPIRAN 1. ACC Acara 12 16 2. Dokumentasi Praktikum Acara 12 Gambar 1 Gambar 2 Hasil PCR Alat Centrigfuge sedang memisahkan larutan Gambar 3 Gambar 4 Timbangan Analitik Timbangan analitik sedang menimbang bahan 17 3.Lampiran pustaka 18 19 20 21 22 23 LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM ACARA XIII APLIKASI PCR UNTUK DETEKSI GEN TAHAN HERBISIDA PADA TANAMAN KEDELAI Oleh: Emil Rahim A1D019163 Rombongan 6 KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2020 24 I.PENDAHULUAN A.Latar belakang Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia. Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis.Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers.Primer DNA suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan dan berasal dari patogen yang terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3‟ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polimerase. Teknik PCR dapat digunakan untuk dapat mendeketksi gen-gen asing yang disisipkan pada produk GMO.PCR memungkinkan untuk membuat sejumlah 25 besar DNA dari suatu campuran DNA yang kompleks dengan urutan basa tertentu dalam waktu yang singkat dan tanpa kloning. DNA untai ganda dapat diperoleh dalam jumlah besar dan murni secara kimia dengan cara polymerase chain reaction (PCR). Sejumlah kecil DNA untai tunggal dapat disintesis dari nukleotida tunggal dengan bantuan oligonukleotida. B.Tujuan Tujuan Praktikum acara ini yaitu 1. Mengetahui cara melakukan aplikasi PCR untuk deteksi gen tahan herbisida pada tanaman kedelai. 26 II.TINJAUAN PUSTAKA Gulma merupakan organisme yang dalam kehidupannya dapat mengganggu pertumbuhan dan perkembangan pada tanaman. Perkembangan gulma pada areal pertanaman dapat menghambat pertumbuhan tanaman karena tanaman tidak dapat menyerap nutrisi dengan maksimal akibat sebagian nutrisi diserap oleh gulma. Pengendalian gulma perlu dilakukan untuk mengurangi kerugian ekonomi, salah satu pengendalian yang banyak digunakan petani adalah pengendalian secara kimiawi (Sembodo, 2010). Pengendalian kimiawi merupakan teknik pengendalian gulma dengan menggunakan herbisida. Herbisida merupakan senyawa kimia yang dapat mematikan gulma dengan cepat dan efektif digunakan dalam skala luas (Lubis & Widanarko, 2011). Herbisida bersifat non selektif yang bersifat racun untuk semua golongan gulma dan berpotensi untuk meracuni tanaman budidaya. Karena sifatnya yang non selektif maka perlu digunakan tanaman transgenik tahan terhadap herbisida glifosat agar tanaman tidak teracuni. Tanaman transgenik memiliki bentuk menyerupai tanaman asalnya, tetapi memiliki sifat-sifat tertentu yang menyebabkan tanaman tersebut lebih baik (Simanjuntak et al., 2014). Kekhawatiran terhadap penggunaan tanaman transgenik membuat beberapa negara membuat peraturan tersendiri terkait pemanfaatan tanaman hasil rekayasa genetik atau biasa disebut Genetically Modified Organism (GMO). Untuk mengetahui apakah suatu tanaman termasuk tanaman transgenik dapat digunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk melipat gandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro (Hidayat, 2014). Penggandaan tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersifat spesifik terhadap DNA target yang akan dilipatgandakan. Sehingga nantinya dapat digunakan untuk keperluan lain yang berkaitan dengan DNA. Komponen-komponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA 27 cetakan yaitu potongan DNA yang akan dilipatgandakan, primer yaitu suatu potongan atau sequence dari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, deoksiribonukleotida trifosfat, enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dan senyawa bufer (Joko et al., 2011). Konsentrasi template DNA berhubungan dengan konsentrasi primer, sehingga perlu dicari optimalisasi rasio antara konsentrasi templete DNA dengan primer (Martida & Pharmawati, 2016). Tahapan pada PCR terdiri dari 5 tahapan yaitu, Pra-Denaturasi DNA, Denaturasi DNA, Annealing atau penempelan primer, Polimerasi atau Extention DNA dan Polimerase akhir atau Past Extention (Bangol dkk., 2014). Hasil dari PCR dapat dilihat setelah melalui proses elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan dan purifikasi fragmen pada DNA, RNA, dan protein. Pemisahan molekul pada fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan muatan listrik. Elektroforesis DNA dipisahkan berdasarkan perbedaan ukurannya. Pemisahan DNA dapat menggunakan gel agarosa yang merupakan polisakarida dari rumput laut. Penggunaan agarosa gel pada elektroforesis merupakan cara yang efektif dan efisien untuk memisahkan fragmen DNA. Pemisahan fragmen DNA menyebabkan fragmen DNA menjadi potongan beberapa fragmen berdasrkan molekulnya (Lee et al., 2012). Terdapat beberapa faktor yang dapat menentukan tingkat keberhasilan teknik amplifikasi DNA menggunakan PCR. Faktorfaktor itu antara lain deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP); oligonukleotida primer; DNA cetakan (template); komposisis larutan buffer; jumlah siklus reaksi; enzim yang digunakan; dan faktor teknis dan non-teknis lainnya, seperti kontaminasi (Feranisa, 2016). 28 III.METODE PRAKTIKUM A.Alat dan Bahan Alat yang diperlukan dalam praktikum ini yaitu Vortex,Timbangan analitik,Mikropipet beserta Tip,Spidol,Label,Tub dan Thermocycler .Sedangkan Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini yaitu Primer RR 122 10 mol sejumlah 2,5 mikroliter,GO TAG PCR master mix (2x) sejumlah 10 mikroliter,Primer 122 (AAT) v 10 mol sejumlah 2,5 mikroliter,Air steril dan DNA 10 mg sebanyak 5 mikroliter. B.Prosedur kerja Praktikum ini dilakukan dengan prosedur kerja,sebagai berikut : Reaksi amplifikasi gen tahan Herbisida 1. Disiapkan DNA sebanayk 5 mikro liter 2. Diencerkan larutan GO TAG PCR Master mix(2x) sebanyak 10 mikroliter ,Primer 122 (AAT) v 10 mol sebanyak 2,5 mikroliter, Primer 122 (AAT) v 10 mol sejumlah 2,5 mikroliter ke dalam tub hingga berwarna ke hijauhijauan 3. Dimasukan DNA 10 mg sebanyak 5 mikroliter ke dalam campuran larutan menggunakan mikropipet 4. Campuran ditaruh ke dalam alat thermocycler 5. Untuk mengatur alat, menu create ditekan kemudian tombol f2 ditekan 6. Disesuaikan suhu,waktu dan siklus a. Denaturasi awal dengan suhu 940C,waktu 3 menit,siklus 1x b. Deanturasi dengan suhu 940C ,waktu 30 detik,siklus 40x c. Annealing dengan suhu 580C , waktu 40 detik,siklus 40x 29 d. Extension dengan suhu 720C,waktu 90 detik,siklus 40x e. Final extension dengan suhu 720C,waktu 10 menit,siklus 1x 7. Tombol start ditekan untuk memulai program 8. Lalu volume total dicek agar sesuai volume yang diinginkan 9. Ditekan tombol start 10. Ditunggu selama waktu yang telah ditentukan 11. Hasil DNA di hold pada suhu 40C ,ditunggu dengan waktu 2 ½ jam. Prosedur kerja elektroforesis,yaitu : 1. Disiapkan Agarost sejumlah 1 gram dengan konsentrasi tinggi agar dapat mendekati DNA dengan baik. 2. Dimasukan Agarost ke dalam alat elektroforesis 3. Ambil hasil DNA dari vortex menggunakan mikropipet 4. Hasil DNA dimasukan ke dalam Agarost berkonsentrasi 1% 5. Disiapkan loading dai sebanyak 60 mg 6. Dicampurkan loading dai ke dalam Agarost afar memberatkan DNA sehingga dapat masuk ke dalam gel 7. Ditambahkan TBE ke dalam alat elektroforesis sampai menutupi sel 8. Ditekan tombol di belakang alat,lalu waktu di set selama 20 menit dan Ditekan tombol start 9. Selanjutnya running dengan tegangan 100 V 10. Hasil Agarost di scan dengan ultraviolet 30 IV.HASIL DAN PEMBAHASAN A.HASIL B.Pembahasan Berdasarkan Hasil DNA PCR kedelai yang telah divisualisasikan menggunakan pendekatan elektroforesisi terlihat bahwa pada sample kedelai GMO dan slamet dengan terlihat samar-samar profil DNA Ladder tidak terlihat dengan jelas pada kedelai GMO Profil ladder hanya pada pita DNA kedelai GMObp 10.000 sisanya tidak terbaca sedangkan pada pita DNA kedelai slamet Terlihat samar hingga 1000 bp. 31 PCR adalah suatu tekhnik amplifikasi fragmen DNA secara in vitro, atau disebut juga dengan reaksi rantai polymerase. Sebenar PCR hampir sama dengan replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Anggereini, 2008). PCR merupakan suatu tekhnik sangat kuat dan sensitive yang dapat diaplikasi dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, diagnostic, genetika populasi dan analisis forensic PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua oligonukleotida primer yang komplementer dengan ujung 5 dari kedua rantai sekuens target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR) untuk memungkinkan DNA template dikopi oleh DNA polymerase (Syamsurizal, 2016). Menurut (Yusuf, 2010) ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat : 1. Denaturasi Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC. 2. Annealing (penempelan primer) Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalahbahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. 32 Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36oC sampai dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60oC. 3. Pemanjangan Primer (Extention) Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’.Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakanuntuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi. Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakanelektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik.Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif. Menurut (Handoyo & Rudiretna, 2001), untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR dan waktu. 1. Jenis polimerase DNA Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan 33 berbeda dengan untuk DNA rantai pendek. Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan aktivitas tinggi. 2. Konsentrasi dNTPs, MgCl2; polimerase DNA Konsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang target DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM. Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 – 1,5 mM. Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming. Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 – 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 – unit per 50 uL campuran reaksi. 3. Suhu Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 – 95o C, ini semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94o C. Secara umum 34 suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60o C. Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm – 5)o C sampai dengan (Tm + 5)o C. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72o C karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR. 4. Buffer PCR Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu “Lowsalt buffer” (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 – 5 kilobasa biasanya diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”. 5. Waktu Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama 30 – 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna. Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang primer 18 – 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik Pemilihan waktu ekstensi primer 35 tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 – 60 detik.Pada setiap melakukan PCR harus dilakukan juga kontrol positif, ini diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan.Selain itu juga harus dilakukan terhadap kontrol negatif untuk menghindari kesalahan positif semu. 36 V.PENUTUP A.Kesimpulan Kesimpulan pada praktikum ini adalah 1. Fungi PCR adalah Untuk membentuk cetakan DNA secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu. 2. PCR menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan diamplifikasi. 3. Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu: Denaturasi, Annealing, Polimerisasi. 4. Hasil DNA PCR yang telah divisualisasikan menggunakan eletroforesis dengan sinar ultraviolet menunjukan sampel kedelai Slamet lebih baik dari pada sampel kedelai GMO.Terlihat pita DNA Slamet mencapai 1000 bp dengan samar sedangkan kedelai GMO hanya mencapai 10.000 bp B.Saran Dalam Praktikum Mengenai PCR dan eletroforesis sudah cukup efektif dalam rangka pembelajaran pengenalan teknik dasar laboratorium.Penulis hanya dapat menyarankan agar praktikum lebih kondusif dan berjalan dengan waktu yang efisien. 37 DAFTAR PUSTAKA Bangol, I., Momuata, L. I., & Kumaunang, M. (2014). Barcode DNA tumbuhan pangi (Pangium edule R.) berdasarkan gen matK. Jurnal MIPA Unsrat Online, 3(2), 113-119. Feranisa A. 2016. Komparasi antara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Loop Mediatedf Isothermal Amplification (LAMP) dalam Diagnosis Molekuler. ODONTO Dental Journal . 3: 145-151. Hidayat, C. (2014). APLIKASI PCR-RAPD FMA. JURNAL ISTEK, 8(2). DALAM IDENTIFIKASI Joko, T., N. Kusumandari, S. Hartono. 2011. Optimasi Metode PCR untuk Deteksi Pectobacterium carotovorum, Penyebab Penyakit Busuk Lunak Anggrek. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, 17 (2): 54-59. Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C., dan Kim, Y.H. 2012. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Visualized Experiments Journal, (62): 1-5. Lubis,R. E.,dan A. Widanarko. 2011.Buku AgromediaPustaka. Jakarta Selatan. Pintar Kelapa Sawit. PT Martida, V. & Pharmawati, M. (2016). Pemilihan primer RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) pada PCR (Polymerase Chain Reaction) tanaman kamboja (Plumeria sp.). Jurnal Simbiosis, 1, 16-18. Sembodo, D. R. J. BandarLampung. 2010.Gulma dan Pengelolaannya.Graha Ilmu. Simanjuntak N.S., E. Purba, dan J. Gisting. 2014. Pertumbuhan dan ProduksiJagung (zea maysl.) pada Berbagai Metode Pengendalian Gulma. Medan.Jurnal Online Agroteknologi1 (3): 1056-1064 38 LAMPIRAN 1. Lampiran ACC acara 13 39 2. Lampiran Dokumentasi Praktikum Gambar 1 Hasil Analisis PCR Gambar 2 Pencampuran larutan dengan termocycler 3. Lampiran pustaka 40 41 42 43 LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM ACARA XIV TEKNIK ELISA UNTUK DETEKSI ANTI GEN Oleh: Emil Rahim A1D019163 Rombongan 6 KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2020 44 I.PENDAHULUAN A.Latar Belakang Pemantauan produk yang beredar di pasar oleh pihak terkait (produsen dan pemerintah) tidak memberikan informasi yang cukup terutama pada produk impor maupun produk dari industri rumahan yang terindikasi tidak sesuai dengan label yang tercantum. Hal ini akan memberikan rasa ketidakpuasan konsumen untuk membeli produk tersebut berkaitan dengan keamanan produk yang beredar di masyarakat. Analisis untuk mengetahui komposisi suatu produk sangat beragam. Salah satu penentuan komposisi pangan hewani dapat menggunakan teknik Elisa. Teknik Elisa dapat digunakan untuk menguji kandungan sapi, kambing, ayam, dan babi pada suatu bahan secara kualitatif dan kuantitatif. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) melibatkan enzim (suatu protein yang mengkatalisis reaksi biokimia). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan protein lebih spesifik dari beberapa sumber protein seperti kandungan sapi, kambing, ayam, dan babi. Penelitian ini dilakukan untuk pemantauan produk yang beredar saat ini yang mengindikasikan tidak sesuai dengan label produk. Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengendalikan penyakit layu bakteri, baik menggunakan salah satu atau beberapa komponen pengendalian maupun dengan menerapkan strategi pengendalian terpadu, tetapi hasilnya belum memuaskan.Diagnosis penyakit secara dini merupakan langkah pertama dan utama yang sangat menentukan keber- hasilan pengendalian suatu penyakit.Langkah ter- penting dalam diagnosis penyakit adalah mendeteksi dan mengidentifikasi jenis patogennya secara efektif dan efisien, sehingga langkah pengendaliannya dapat dilakukan secara cepat dan akurat. Teknik deteksi dan identifikasi yang efektif dan efisien memiliki lima kriteria, yaitu cepat, peka, akurat, dapat langsung digunakan di murah(Machmud & Suryadi, 2006). 45 lapangan, dan biayanya relatif ELISA merupakan salah satu uji serologi untuk mendeteksi adanya antibodi dalam serum hewan. Teknik ini sangat disukai karena secara umum lebih sensitif, spesifik, sangat efektif dan efisien untuk menguji sampel dalam jumlah besar, lebih murah, serta cukup mudah pengerjaannya. Penggunaan ELISA untuk penyakit unggas sudah banyak dilakukan oleh peneliti sebelumnya diantaranya SLAGHT et al. (1978), HOWIE dan THORESEN (1981). Deteksi antibodi terhadap virus ILT dengan uji ELISA pertama kali dikembangkan oleh MEULEMANS dan HALEN (1982). Uji ini dikembangkan sebagai uji alternatif dengan hasil yang cepat, sensitif, dan spesifik. ADAIR et al. (1985) dan BAUER et al. (1999) melaporkan bahwa ELISA memiliki sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan uji serum netralisasi. B.Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk : 1. Mengetahui teknik ELISA untuk deteksi gen. 46 II.TINJAUAN PUSTAKA ELISA adalah teknik biokimia yang umum digunakan dalam immunologi untuk mendeteksi keberadaan antibodi atau antigen dalam sampel, melalui adsopsi permukaan atau penangkapan antibodi spesifik untuk antigen yang sama yang dihubungkan dengan enzim dengan reaksi visual untuk menandakan keberadaan antigen atau antibodi dalam sampel, ciri utama metode ini adalah menggunakan suatu indikator enzim (Samarang et al., 2015). Prinsip utama teknik ELISA adalah penggunaan indikator enzim untuk reaksi imunologi (Akonor et al., 2018). Komponen ELISA terdiri dari pelat polistirene, sampel diluent, kontrol, konjugat, substrat, dan stop solution. Pelat yang digunakan berupa fase padat dilapisi oleh antigen dan menjadi tempat pengikatan antibodi dalam sampel. Pelapisan antigen terjadi secara adsorpsi pasif ke permukaan mikroplat karena adanya interaksi hidrofobik antara protein dan permukaan pelat (Susanti et al., 2019) Metode ELISA didasarkan pada kerja immunologi yang dikombinasi dengan reaksi enzimatik, reaksi immunologi dalam sistem ELISA adalah adanya ikatan antigen-antibodi atau sebaliknya. Reaksi enzimatik antara enzim dan reaktan digunakan untuk menandakan adanya reaksi yang kemudian dapat diukur secara kualitatif berdasarkan pada perubahan warna dalam sistem (Rohima dan Nurminabari, 2018). Reaksi antara antigen dan antibodi dipengaruhi oleh beberapa faktor di antaranya temperatur, waktu inkubasi dan pH (kondisi buffer) (Jiang et al., 2014). Kompleks antigen atau antibody akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi .Perubahan warna akan diukur dengan spektrofotometer atau ELISA reader dengan mengunakan panjang gelombang tertentu (Primadharsini & Wibawa, 2013). Antigen adalah zat-zat asing yang pada umumnya merupakan protein yang bertindak sebagai benda asing atau non self oleh suatu organisme dan akan merangsang timbulnya antibodi. Antibodi merupakan protein-protein yang 47 terbentuk sebagai respon terhadap antigen yang masuk ke tubuh, yang bereaksi secara spesifik dengan antigen tersebut. Konfigurasi molekul antigen-antibodi sedemikian rupa sehingga hanya antibodi yang timbul sebagai respon terhadap suatu antigen tertentu saja yang ccocok dengan permukaan antigen itu sekaligus bereaksi dengannya. Berdasarkan sistem kerja dalam reaksinya ELISA terbagi menjadi tiga kelompok yaitu Direct Elisa, Indirect ELISA dan Sandwich ELISA. Pengelompokkan tersebut didasarkan pada kompetisi atau inhibisi dari ELISA. Direct ELISA adalah salah satu jenis ELISA yang paling sederhana dalam reaksinya. Jenis ELISA ini hanya membutuhkan antigen, antibodi, enzim dan substrat (Sirois, 2016). Tahapan pengujian ELISA diataranya adsorpsi antigen atau antibodi pada fase padat, penambahan sampel dan reagen, inkubasi, pemisahan dengan reaktan, penambahan reagen enzim, penambahan enzim pendeteksi, dan pembacaan hasil (Crowther, 2001). ELISA merupakan metode yang paling banyak digunakan, karena murah, cepat, dan mempunyai spesifitas yang tinggi. Walaupun variatif, metode ELISA mempunyai sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan uji serologi lain (Adji et al., 2015). 48 III.METODE PRAKTIKUM A. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam praktikum ini,yaitu Urine.Sdangkan Bahan yangdigunakan dalam praktikum ini,yaitu Testpack. B. Prosedur Kerja Praktikum ini dilakukan dengan prosedur, sebagai berikut : 1. Urine dimasukkan ke dalam wadah. 2. Strip testpack dicelupkan ke dalam wadah. 3. Setelah itu, ditunggu 5-10 detik dan angkat. 4. Jika strip testpack menunjukkan 2 garis maka positif. 49 IV.HASIL DAN PEMBAHASAN A.Hasil 50 B.Pembahasan Praktikum ini membahas mengenai Mengetahui teknik Elisa untuk mendeteksi gen.alat yang diperlukan pada praktikum ini adalah testpack dan bahan yang diperlukan adalah urine laki-laki dan perempuan. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay ) adalah metode imunologi yang melibatkan suatu enzim untuk mendeteksi antibodi atauanti gen dalam suatu sampel. Pemanfaatan ELISA secara luas dapatdigunakan untuk mendeteksi senyawa toksi dalam makanan. Metode inidigunakan juga untuk berbagai matrik sampel (jagung, pakan, formatindirect dandirect kacang,hati dan telur) microplate-ELISA ( p-ELISA) dengan untuk ELISA mendeteksi aflatoksin B1(AFB1). ELISAmempunyai kelebihan dibandingkan dengan alat kromatografi cairkinerja tinggi (KCKT) yaitu lebih spesifik, murah, mudah, dan sensitif(Rachmawati et al, 2013). Metode ELISA didasarkan pada kerja immunologi yang dikombinasi dengan reaksi enzimatik, reaksi immunologi dalam sistem ELISA adalah adanya ikatan antigen-antibodi atau sebaliknya. Reaksi enzimatik antara enzim dan reaktan digunakan untuk menandakan adanya reaksi yang kemudian dapat diukur secara kualitatif berdasarkan pada perubahan warna dalam sistem (Rohima dan Nurminabari, 2018). Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitasunt uk ant igen t ert ent u. Sampel dengan jumlah ant igen yang t idak diket ahuidiimobilisasi pada suatu permukaan solid(biasanya berupa lempeng mikrotiterpolistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atauspesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yangsama, disebut ‘sandwich’ ELISA).Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentukkompleks dengan ant igen. Ant ibodi pendet eksi dapat berikat an juga denganenzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatandengan enzim 51 melalui biokonjugasi.Di ant ara t iap t ahap, plat e harus dicucidengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodiyang tidak terikat.Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkansubstrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkankuantitas antigen dalam sampel. Fungsi dari test ELISA yaitu bukan hanya untuk mengetahui keberadaan suatu antigen dengan antibodi tetapi juga untuk mengukur kadar antigen atau antibodi tersebut dengan menggunakan alat spektrofotometer. Spektrofotometer adalah sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate. Kompleks antigen-antibodi yang terjadi pada well mcroplate dan setelah pemberian substrat, enzim yang terikat pada antibody ke dua pada kompleks antigen-antibodi yang terbentuk akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda. Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut. Sebagai teknik serologi, prinsip dasar ELISA adalah reaksi antaraantigen (Ag) dengan antibody (Ab) menjadi molekul Ag-Ab yang lebihbesar dan mudah mengendap. Perbedaannya, penggamatan hasilreaksi pada serologi biasa berdasarkan endapan molekul Ag-Ab,sedangkan pada ELISA berdasarkan perubahan warna yang terjadipada substrat pereaksi sesuai dengan label atau imunoprob (immuno probe) konjugat Ab-enzim. Perubahan warna terjadi akibat hidrolisaenzimatik pada reaksi antara konjugat Ab enzim dengan substratnya, Sehingga hasil ELISA lebih peka dan dapat dikuantifikasi (Suryadi et al,2009). Tahapan umum ELISA atau Ab pada media reaksi (solid meliputi phase), penempelan seperti (trapping ) cawan Ag ELISA, diikutipenambahan konjugat Abenzim, dan diakhiri dengan penambahansubstrat serta bufer penghenti reaksi (blocking buffer ). Uraian rincitentang berbagai teknik serologi termasuk ELISA dijumpai di pustakaacuan (Suryadi et al, 2009).Sebagai uji biokimia analitik, ELISA meliputi deteksi analit(senyawa 52 spesifik yang terkandung dianalisis secara kuantitatif dankualitatif) dalam sampel cair dengan metode yang menggunakanpereaksi cair selama analisis ini (misalnya urutan teratur dari reaksibiokimia) yang menghaislkan sinyal dengan jumlah analit dalam sampel) yang tetap dalam bentuk cair dalam sumuran. Hal ini berbedadengan penggunaan strip, walaupun sampel berupa cairan, denganakhir deteksi meliputi analisis kering dengan membaca hasil analisispita yang muncul (Sudjadi dan Rohman, 2018). Sebagai suatu uji campuran, ELISA memisahkan beberapa komponen campuran reaksi analitik dengan penyerapan komponenetertentu pada fase padat sehingga tidak bergerak. Pada ELISA,sampel cair ditambahkan pada fase padat diam dengan ikatan tertentudan kemudian dilanjutkan penambahan berbagai pereaksi cair secaraberuruan, didiamkan, dicuci, dan dilanjutkan dengan perubahan warna(misal, pembentukan warna yang terjadi merupakan hasil reaksienzimatik) dalam cairan akhir dalam sumuran yang berhubungandnegan jumlah analit.Reaksi enzimatik merupakan proses amplifikasi,sinyal dihasilkan enzim yang berhubungan dengan pereaksi deteksidalam proporsi tertentu sehingga dapat dikuantifikasi dengan tepat.Oleh karena itu, metode ini dinamakan enzyme linked (Sudjadi danRohman, 2018). Analit juga dinamakan ligan sebab akan berikatan secara spesifikdengan pereaksi. Oleh karena itu, ELISA digolongkan dalam uji iaktan. 53 V.PENUTUP A.Kesimpulan Pada praktikum ini dapat disimpulkan bahwa: 1. Prinsip utama teknik ELISA adalah penggunaan indikator enzim untuk reaksi imunologi. 2. Metode ELISA didasarkan pada kerja immunologi yang dikombinasi dengan reaksi enzimatik, reaksi immunologi dalam sistem ELISA adalah adanya ikatan antigen-antibodi atau sebaliknya. Reaksi enzimatik antara enzim dan reaktan digunakan untuk menandakan adanya reaksi yang kemudian dapat diukur secara kualitatif berdasarkan pada perubahan warna dalam sistem. 3. Tahapan umum ELISA meliputi penempelan (trapping ) Ag atau Ab pada media reaksi (solid phase), seperti cawan ELISA, diikuti penambahan konjugat Abenzim, dan diakhiri dengan penambahan substrat serta bufer penghenti reaksi (blocking buffer). B.Saran Penulis menyarankan agar praktikum mengenai ELISA dapat dijelaskan secara runtut dalam hal pertanian agar mahasiswa dapat lebih paham,kemudian penulis berharap praktikan dapat lebih kooperatif dalam hal pengambilan sampel. 54 DAFTAR PUSTAKA Adji, Rahmat Setya., I Wayan Teguh Wawan., Denny Widaya Lukman., dan Surachmi Setiyaningsih. 2015. Pengembangan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Paratuberkulosis dengan Antigen Protoplasmik Mycobacterium avium SubsprsiesParatuberculosis Isolat Lapang. Jurnal Veteriner. 16 (2) : 159-166 Akonor M., Kwasi O., Paa T., & Holly S. (2018). Widespread exposure to infectious bronchitis virus and Mycoplasma gallisepticum in chickens in the Ga-East district of Accra, Ghana. Coagent Foof & Agriculture, (4) 1439260,1-11. Crowther, J.R. 2001. The ELISA Guidebook. Humana Press Inc. New Jersey. Ira Endah Rohima Ina Siti Nurminabari 2018 IDENTIFIKASI PROTEIN HEWANI PADA PRODUK BUMBU INSTAN DENGAN METODE ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Pasundan Food Technology Journal, Volume 5, No.3, Jiang W., Sarah C., Julian N.R., George A.O., Bradley J.S.O., & Donald P.W. (2014). A Rapid Live-Cell ELISA for Characterizing Antibodies Against Cell Surface Antigens of Chlamydomonas Reinhardtii and Its Use in Isolating Algae from Natural Environments with Related Cell Wall Components. BMC Plant Biology, 14(244), 1-12. Primadharsini, P. P., & Wibawa, I. D. N. (2013). Correlation between quantitative HbsAg and HBV-DNA in chronic hepatitis B infection. Indonesian Journal of Gastroenterology, Hepatology, and Digestive Endoscopy, 14(1), 9-12. Rachmawati, H., Edityaningrum, C. A., & Mauludin, R. (2013). Molecular inclusion complex of curcumin–β-cyclodextrin nanoparticle to enhance curcumin skin permeability from hydrophilic matrix gel. Aaps Pharmscitech, 14(4), 1303-1312. Rohima, I. E., & Nurminabari, I. S.(2018)IDENTIFIKASI PROTEIN HEWANI PADA PRODUK BUMBU INSTAN DENGAN METODE ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Samarang, S., Satrija, F., Murtini, S., Nurjana, M. A., Chadijah, S., Maksud, M., & Tolistiawaty, I. (2015). Deteksi antigen ekskretori-sekretori Schistosoma japonicum dengan metode ELISA pada penderita schsistosomiasis di Napu Sulawesi Tengah. Media Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, 25(1), 65-70. 55 Sirois, M. 2016. Elsevier’s Veterinary Assisteing Textbook, Elsevier, Asworth College, Georgia Wulandari, R., Sudjadi, S. M., & Rohman, A. (2018). Liquid Chromatography and Fourier Transform Infrared Spectroscopy for quantitative analysis of individual and total curcuminoid in Curcuma longa extract. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 8(09) Yenni Tyas Wulandari K. E, R. Susanti, dan Siti Harnina Bintari (2019) Analisis Perkembangan Titer Antibodi Hasil Vaksinasi Infectious Bronchitis pada Ayam Petelur Strain Hisex Brown Life Science 8 (1) 56 LAMPIRAN 1. Lampiran Dokumentasi Gambar 1 Hasil Testpack yang sudah dipakai 2. Lampiran Pustaka 57 58 59 mmmmmm 60 61 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bekasi 28 November 2001 anak ke -3 dari 3 bersaudara dari pasangan Bapak iwan avrianto dan Ibu Ehat . Saat ini penulis bertempat tinggal di Jl,Cempaka III, Villa nusa indah, Kabupaten Bogor 16969 dengan nomor telepon 085886973864 dan e-mail emilrahim83@gmail.com. Penulis memulai pendidikan tingkat dasar di SDN 8 jatiasih lulus tahun 2013, kemudian melanjutkan ke jenjang tingkat menengah pertama di SMPN 12 bekasi tahun 2016. Jenjang pendidikan menengah lulus tahun 2019 di SMAN 6 Bekasisebelum melanjutkan ke Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, melalui program Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru di tahun yang sama. Selama menempuh studi penulis aktif di unit kegiatan mahasiswa tingkat fakultas seperti UKT (Unit Klinik Tani) dan GAMAIS ( Keluarga mahasiswa islam fakultas pertanian. 62