INSTITUTO SUPERIOR POLITCNICO JOS ANTONIO ECHEVERRA

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA

Establecimiento del Espacio de Diseo del Proceso

Fermentativo de Obtencin de la Insulina
Recombinante en Pichia pastoris

Tesis en opcin al ttulo de Doctor en Ciencias Tcnicas

Por

Autor:

M. C. Jos Manuel Pas Chanfrau

Centro de Inmunologa Molecular

Tutores:

Dra. C. Mercedes Rodrguez Edreira

Instituto Superior Politcnico Jos Antonio Echeverra
Dr. C. Rolando Pez Meireles
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa

La Habana
Diciembre 2010

AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer en primer lugar a la Direccin del Centro de Ingeniera Gentica y
Biotecnologa (CIGB) y en especial a su Director General el Dr. Luis S. Herrera Martnez, por
haber accedido amablemente a que se presentara este trabajo. Tambin, deseo expresar mi
especial gratitud a los compaeros, Dr. Eduardo Martnez Daz y M. C. Jorge Valds
Hernndez, ambos de la Direccin de Desarrollo del CIGB, en cuyas reas se llevaron a cabo
la totalidad de los experimentos, y sin cuyas ideas y tiles discusiones no hubiese sido posible
la culminacin de esta tesis. Deseo tambin decir que todos los resultados, parciales o
conclusivos de este trabajo, pertenecen al Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa.
Agradezco a mis tutores el Dr. C. Rolando Pez Meirelles (CIGB) y, muy especialmente, a la
Dra. C. Mercedes Rodrguez Edreira (ISPJAE), sus enseanzas, condescendencia e infinita
paciencia, a la hora de trasmitirme sus experiencias y conocimientos. Gracias a la profesora
Mercedes por haberme guiado tan certeramente en este trabajo.
Muchas gracias a la Dra. C. Ileana Pereda Reyes (CIPRO, ISPJAE) por haberme dado el impulso
inicial y estimulado constantemente en la culminacin de este proceso. Mi agradecimiento
sincero a los oponentes de la pre-defensa el Dr. C. Fidel Domenech Lpez (ICIDCA) y
fundamentalmente al Dr. C. Arturo Toledo Rivero (CIM), por la detallada revisin realizada al
documento original y las sugerencias dadas, que mejoraron notablemente este trabajo.
Muchas gracias tambin a los compaeros de mi colectivo del Centro de Inmunologa
Molecular (CIM); entre otros, al Dr. C. Ernesto Chico, M. C. Adolfo Castillo, Dra. C. Lizette
Fondevilla, Dr. C. David Curbelo, Dr. C. Daniel Amaro, M. C. Pablo Vitn, Ing. Katia Zorrilla y
M. C. Rosario Martnez, por sus consejos, apoyo y sugerencias.
A mi compaera la Dra. C. Carmen Menndez Rodrguez (CIGB), por las sugerencias tcnicas
realizadas al trabajo y por ayudarme, en todo momento, a lo largo de estos meses. Y a toda
mi familia por haberme apoyado incondicionalmente en estas ltimas semanas.
ii

SNTESIS
La diabetes es causada por dficits de insulina, hormona secretada en el pncreas. A partir de
un clon de mini-proinsulina de Pichia pastoris (clon 27), se determin los espacios de diseo
(DS) y un espacio de operacin (OS) de la fermentacin a escala de laboratorio que da
solucin a la protelisis del producto. Un anlisis de riesgo permiti encontrar los parmetros
crticos del proceso (CPP) fermentativo que determinan el atributo crtico de calidad de la
mini-proinsulina (sus correctas estructuras primaria, secundaria y parcialmente la terciaria).
Los CPP encontrados fueron: el medio de cultivo, pH, temperatura y la fuente de nitrgeno.
Del anlisis surgi el medio MBSM, ms barato que el resto. Con 12 experimentos se
determin el DS, que estuvo formado por medios de cultivo: comerciales, MBSM;
suplementados con extracto de levadura, hidrolizado de casena o (NH 4)2SO4; pH: 3,8-6,3 y
temperatura: 20-28C. El OS propuesto consta de: MBSM con EDTA y (NH4)2SO4; pH=0,7t(C)9,1 y 20-22C. Con tres plantas de 2 millones bulbosao-1 cada una, se asegurara la
demanda del 2025 de los pacientes del ALBA a un precio preferencial (US$4,50/bulbo). Con
una inversin de

US$146,39 millones se obtendra un VANUS$6,36 millones y un

TIR=10,85% al final del proyecto (15 aos).

iii

TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ................................................................................... II
SNTESIS ................................................................................................. III
TABLA DE CONTENIDO ...............................................................................IV
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................... VII
INTRODUCCIN .......................................................................................... 1
CAPTULO 1. REVISIN BIBLIOGRFICA ...................................................... 12
1.1 La Insulina Humana .................................................................... 12
1.1.1 La Diabetes Mellitus ........................................................ 12
1.1.2 Estructura de la Insulina Humana ..................................... 15
1.1.3 Vas para la Obtencin de la Insulina ................................. 16
1.1.4 Produccin de la Insulina Humana Recombinante................ 18
1.2 Parmetros de la Fermentacin para la Expresin de Protenas
Heterlogas en Pichia pastoris ........................................................... 21
1.2.1 Pichia pastoris como Sistema de Expresin ........................ 21
1.2.2 Medio de Cultivo Qumicamente Definido ........................... 22
1.2.3 Condiciones de Cultivo .................................................... 23
1.3 Entorno Regulatorio .................................................................... 26
1.3.1 Atributos de Calidad de la Insulina .................................... 35
1.4 Factibilidad Econmica del Proyecto .............................................. 38
CAPTULO 2. MATERIALES Y MTODOS ........................................................ 41
iv

2.1 Microorganismo empleado ........................................................... 41

2.2 Medios y Condiciones de Cultivo ................................................... 41
2.3 Determinaciones Analticas .......................................................... 45
2.3.1 Crecimiento Celular ......................................................... 45
2.3.2 Concentracin de Protenas .............................................. 45
2.3.3 Actividad Proteoltica en el sobrenadante de cultivo ............ 45
2.3.4 Anlisis de la Expresin por Electroforesis en Geles de
Poliacrilamida (Tricina-SDS-PAGE) y Western-Blot ...................... 46
2.3.5 Determinacin de la Concentracin de Mini-proinsulina ........ 47
2.4 Caracterizacin del Monmero de Mini-proinsulina .......................... 47
2.5 Otras Herramientas y Metodologas Empleadas .............................. 48
CAPTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................... 50
3.1 Espacios de Diseo y Operacin del Proceso de Fermentacin para la
Obtencin de la Mini-proinsulina en Pichia pastoris ............................... 50
3.1.1 Anlisis de Riesgo del Proceso Fermentativo de Obtencin de la
Mini-proinsulina Recombinante en Pichia pastoris ........................ 51
3.1.2 Antecedentes con el Clon M44 Productor de la Mini-proinsulina
............................................................................................ 57
3.1.3 Establecimiento del Medio Basal Salino Modificado (MBSM) .. 58
3.1.4 Establecimiento del Espacio del Conocimiento y la Propuesta
de Espacio de Diseo ............................................................... 60
3.1.5 Experimentos en los Fermentadores de 2,5 L ..................... 64
3.1.6 Experimentos en el Fermentador de 14 L ........................... 80
3.2

Caracterizacin de la Mini-proinsulina ........................................ 84

3.2.1 Anlisis por Tricina-SDS-PAGE y Western-blot .................... 84

3.2.2 Repurificacin de las Muestras Colectadas de los Experimentos

de Fermentacin ..................................................................... 86
3.2.3 Conversin Enzimtica .................................................... 87
3.2.4 Caracterizacin por Espectrometra de Masas ..................... 88
3.3 Anlisis de Factibilidad Econmica de la Produccin de Insulina
Recombinante en los pases de La Alianza Bolivariana para las Amricas
(ALBA)............................................................................................ 92
3.3.1 Algunas Consideraciones sobre el Mercado Mundial, Regional y
Nacional de la Insulina Humana ................................................ 92
3.3.2 Descripcin y Dimensionamiento de los Equipos del Proceso
Propuesto .............................................................................. 97
3.3.3 Anlisis Econmico........................................................ 106
CONCLUSIONES .......................................................................................... I
RECOMENDACIONES .................................................................................. II
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. - 1 AUTOBIBLIOGRAFA RELACIONADA CON LA TESIS ....................................- 25 ANEXOS ............................................................................................... - 26 Tablas ........................................................................................ - 26 Figuras ....................................................................................... - 29 Fotos .......................................................................................... - 36 -

vi

LISTA DE ABREVIATURAS
3-D

Tres dimensiones

AcN

Acetonitrilo

ADA

Asociacin Americana de Diabticos (de sus siglas en ingls: American

Diabetic Association)

ADN

cido Desoxirribonucleico

Ala

Alanina

ALBA

Alianza Bolivariana para las Amricas

ANOVA

Anlisis de Varianza (del ingls: Analysis of Variance)

AOX1

Gen codificante para la enzima Alcohol OXidasa 1 de Pichia pastoris

AP

Actividad Proteoltica

Arg

Arginina

ARM

Gastos anuales en materias primas (en ingls: Annual Raw Material),

US$ao-1

ARN

cido Ribonucleico

AS

Ventas anuales (en ingls: Annual Sale), US$ao-1

Asp

cido asprtico

ATE

Gastos totales anuales (en ingls: Annual Total Expenses), US$ao-1

ATG

Acrnimo de Antigua y Barbudas, segn la ISO 3166-1 alpha 3

bbo

Bulbo de 10 mL con 100 UImL-1

BOL

Acrnimo de Bolivia, segn la ISO 3166-1 alpha 3

BSM

Medio Basal Salino (de sus siglas en ingls: Basal Saline Medium)

BT

Banco de Trabajo

CE

Costo del Equipamiento, US$

CEPCI

ndice de Costo de Plantas de Ingeniera Qumica (del ingls: Chemical

vii

Engineering Plant Cost Index)

CFC

Capital fijo de inversin, US$

CIGB

Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa

CIM

Centro de Inmunologa Molecular

CoG

Costo unitario de produccin (del ingls: Cost of Goods), US$g-1

US$bbo-1

CpA

Carboxipeptidasa A

CpB

Carboxipeptidasa B

CPP

Parmetro Crtico del Proceso (de sus siglas en ingls: Critical Process
Parameter)

CQA

Atributo Crtico de Calidad (de sus siglas en ingls: Critical Quality

Attribute)

CTC

Capital total de inversin, US$

CTDP

Costo Total Directo de Produccin, US$

CTIP

Costo Total Indirecto de Produccin, US$

CTP

Costo Total de Produccin, US$

CUB

Acrnimo de Cuba, segn la ISO 3166-1 alpha 3

Cys

Cistena

Funcin de Deseabilidad

Da

Dalton

DFP

Diagrama del Flujo de Proceso

DM

Diabetes Mellitus

DMA

Acrnimo de Dominica, segn la ISO 3166-1 alpha 3

DMID

Diabetes Mellitus Insulino-Dependiente

DMNID

Diabetes Mellitus No Insulino-Dependiente

DO

Oxgeno Disuelto (del ingls: Dissolved Oxygen), %

viii

DoE

Diseo de Experimentos (de sus siglas en ingls: Design of Experiments)

DS

Espacio de Diseo (de sus siglas en ingls: Design Space)

EBA

Cromatografa de cama expandida (del ingls: Expanded Bed-Adsorption)

ECU

Acrnimo de Ecuador, segn la ISO 3166-1 alpha 3

EDTA

cido etileno-diamino tetra-actico (de sus siglas en ingls: Ethylene

Diamine Tetra-acetic Acid)

EM

Espectrmetro de masas

EMEA

Agencia Europea de Medicamentos (de sus siglas en ingls: European

MEdicines Agency)

fD

Factor de descuento

FMEA

Anlisis Modal de Fallas y Efectos (de sus siglas en ingls: Failure Mode
and Effect Analysis)

GDP

Buenas Prcticas de Desarrollo (del ingls: Good Developing Practices)

GEP

Buenas Prcticas de Ingeniera (del ingls: Good Engineering Practices)

GF

Cromatografa de Exclusin Molecular (del ingls: Gel Filtration

Chromatography)

GLP

Buenas Prcticas de Laboratorio (del ingls: Good Laboratory Practices)

Glu

cido glutmico

Gly

Glycina

HC

Hidrolizado de casena

HCP

Protenas del Hospedero (de sus siglas en ingls: Host Cell Proteins)

His

Histidina

HPLC

Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (de sus siglas en ingls: HighPerformance Liquid Chromatography)

I+D

Investigacin & Desarrollo

IC

Intervalo de confianza
ix

ICH

Congreso Mundial de Armonizacin (de sus siglas en ingls: International

Conference of Harmonization)

IDF

Federacin Internacional de la Diabetes (del ingls: International

Diabetes Federation)

IEC

Cromatografa de intercambio inico (del ingls: Ion Exchange

Chromatography)

IFA

Ingrediente Farmacutico Activo

IH

Insulina Humana

IH-r

Insulina Humana recombinante

Ile

Isoleucina

INEN

Instituto Nacional de Endocrinologa de Cuba

IQ

Calificacin de la Instalacin (del ingls: Installation Qualification)

Litro (1 L = 10-3 m3)

Leu

Leucina

LS

Litro de sobrenadante de cultivo

Lys

Lisina

MBSM

Medio Basal Salino Modificado

MM

Millones

MPI

Mini-proinsulina

MUI

Mega (Un milln de) Unidades Internacionales de insulina humana

(1 UI = 0,0347 mg IH, por tanto: 1 MUI = 34,7 g IH)

Mut+

Fenotipo de mayor velocidad de consumo del metanol (del ingls:

Methanol utilization plus)

Muts

Fenotipo de menor velocidad de consumo del metanol (del ingls:

Methanol utilization slow)

NIC

Acrnimo de Nicaragua, segn la ISO 3166-1 alpha 3

x

OMS

Organizacin Mundial de la Salud

OQ

Calificacin de la Operacin (del ingls: Operation Qualification)

OS

Espacio de Operacin (de sus siglas en ingls: Operational Space)

PAT

Tecnologa Analtica del Proceso (de sus siglas en ingls: Process

Analytical Technology)

Phe

Fenilalanina

pI

Punto isoelctrico

PQ

Calificacin del Procedimiento (del ingls: Procedural Qualification)

Pro

Prolina

PT

Productividad total, g MPIh-1

PTM1

Suplemento de sales trazas para los medios de Pichia pastoris

PU

Precio Unitario, US$g-1

PVDF

Difloruro de polivinilo (del ingls: Polyvinyl difluoride)

QbD

Calidad por Diseo (de sus siglas en ingls: Quality by Design)

QRM

Gestin del Riesgo en Calidad (de sus siglas en ingls: Quality Risk
Management)

RP-HPLC

HPLC de fase reversa (del ingls: Reversed Phase HPLC)

RPN

Nmero de prioridad de riesgo (del ingls: Risk Priority Number)

RSM

Metodologa de la Superficie de Respuesta (del ingls: Response Surface

Methodology)

S, O, ND

Severidad, Ocurrencia y No-Detectabilidad

SDS-PAGE

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (de

sus siglas en ingls: Sodium Dodecyl-Sulphate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis)

Ser

Serina

TCA

cido tricloroactico (del ingls: Trichloracetic Acid)

xi

TFA

cido trifluoroactico (del ingls: Trifluoroacetic Acid)

Thr

Treonina

TIR

Tasa Interna de Retorno, %

Tris

Tris (hidroximetil)-metilamina

Tyr

Tirosina

UF

Ultrafiltracin

USFDA

Agencia

del

gobierno

estadounidense

para

los

alimentos

medicamentos (de sus siglas en ingls: United State Food and Drug
Administration)
Val

Valina

VAN

Valor Actual Neto, US$

VCT

Acrnimo de San Vicente y Granadinas, segn la ISO 3166-1 alpha 3

VEN

Acrnimo de Venezuela, segn la ISO 3166-1 alpha 3

VIF

Factor de inflacin de la varianza (del ingls: Variance Inflation Factor)

WFI

Agua para inyeccin (del ingls: Water for Injection)

YE

Extracto de levadura (de sus siglas en ingls: Yeast Extract)

YNB

Medio YNB (del ingls: Yeast Nitrogen Base)

YPD

Medio de cultivo YPD (de sus siglas en ingls: Yeast Peptone Dextrose)

YPX

Rendimiento producto-biomasa, g MPIg biomasa-1

YXS

Rendimiento biomasa-sustrato, g biomasag fte. carbono-1

xii

INTRODUCCIN
La insulina humana (IH) es una hormona globular de 51 aminocidos, compuesta por dos
cadenas polipeptdicas independientes A y B, conectadas entre s por dos puentes disulfuro
[1]. Esta hormona se produce en las clulas de los islotes de Langerhans en el pncreas y es
vital para los mecanismos de asimilacin de la glucosa.
Una ausencia total o niveles deficitarios de ella en el torrente sanguneo produce
hiperglicemia y diferentes desrdenes metablicos asociados a ella, conocidos como
diabetes mellitus (DM) [2].
Para el ao 2003, en el mundo existan ms de 150 millones de diabticos, pero este nmero
est por debajo del valor real, porque por cada caso diagnosticado en los pases del primer
mundo, se estima que existe al menos uno no diagnosticado y este valor asciende a 8 en los
pases del llamado tercer mundo [1, 3]. Se espera que en los prximos 25 aos el nmero de
personas con la enfermedad se duplique y se alcancen cifras de ms de 300 millones de
pacientes [1]. Un estudio realizado por la Federacin Internacional de la Diabetes (IDF) del
2009, pronosticaba que el nmero de pacientes con DM para el 2010 y el 2030, sera de
284,6 y 438,4 millones, respectivamente [4].
En los pacientes con DM tipo 1 o diabticos insulino-dependientes (que representan
aproximadamente el 7% de todos los diabticos), existe una ausencia total o casi total de la
produccin de esta hormona, la cual debe ser suministrada por va exgena al paciente so
pena de poner en peligro su vida. En la DM de tipo 2, a pesar de que los niveles de la
hormona son insuficientes el padecimiento puede ser controlado con un adecuado rgimen
alimentario y de vida, sin la necesidad de suministrar la hormona de manera directa; aunque
algunos de estos pacientes tambin requieren de este frmaco.
La insulina fue usada por primera vez para el tratamiento de un paciente diabtico en enero
de 1922 [5]. Posteriormente comenz a ser extrada en gran escala a partir de pncreas de
1

vacas y cerdos, expandindose sus fuentes de suministro considerablemente [2]. Entre 100 y
150 mg de insulina pueden ser obtenidos a partir de 1 kg de pncreas porcino [6], y de
acuerdo a los niveles actuales y perspectivos sera muy difcil satisfacer la demanda por esta
va [1]. Adicionalmente, la insulina de origen animal tiene otras desventajas. sta no es
idntica a la humana, pudiendo provocar efectos colaterales en algunos pacientes. Adems,
los procedimientos de extraccin son largos y difciles y los contaminantes virales,
potencialmente peligrosos, no siempre pueden ser eliminados con seguridad.
Con el advenimiento a inicio de los aos 70 del siglo pasado de la tecnologa del ADN
recombinante se abrieron nuevas perspectivas para el tratamiento de la enfermedad. A nivel
industrial la IH recombinante se produce fundamentalmente empleando Escherichia coli [7] y
Saccharomyces cerevisiae [8] como sistemas hospederos.
Ms recientemente ha sido expresada y sintetizada en la levadura metilotrfica Pichia
pastoris [9-11] la cual presenta algunas ventajas sobre los sistemas anteriores y que ha sido
utilizada con xito para la expresin de protenas heterlogas de diversos orgenes [12-15].
En el mundo existen unas pocas compaas que producen insulina recombinante, entre ellas
la Eli Lilly & Co. (Indianpolis, IN, EEUU) y la Novo Nordisk A/K (Bagsvaerd, Dinamarca). Entre
ambas poseen ms del 80% del mercado mundial, con ventas anuales que superan los
US$ 4 mil millones.
Pese a la ventaja que ofrece la insulina humana recombinante, razones bsicamente de costo
y disponibilidad hacen que alrededor del 30% de la insulina que se consume en el mundo sea
an de origen natural, bsicamente insulina porcina (17%), vacuna (8%) o mezclas de insulina
vacuna-porcina (5%) [16]. El precio de la insulina natural es de 20 a 60% menor que el precio
de la insulina humana recombinante [17], por lo que su consumo se reparte, principalmente,
entre los pases en vas de desarrollo [16, 18]. Por razones similares, se continan empleando

en muchas naciones las presentaciones de 40 UImL-1, junto a la ms difundida y

recomendada presentacin en bulbos de 10 mL con 100 UImL-1 [17].
Segn una encuesta del 2002, realizada por la Federacin Internacional de la Diabetes (IDF)
en 74 pases de todos los continentes, mostr que, en 30 de ellos las personas con diabetes
no contaban con un acceso ininterrumpido a la insulina todo el tiempo [18]. Las principales
razones fueron los costos, la falta de disponibilidad en la regin, los problemas de transporte,
la falta de adecuacin de los suministros o la mala calidad de la insulina [18]. El problema se
agravaba por el hecho de que de los 74 pases, 31 gravaban la insulina en porcentajes que
iban del 1% al 90%, a pesar de que la OMS ha calificado a la insulina como medicamento
esencial, con la peticin explcita a los gobiernos de que no incrementen sus costos con tasas
impositivas [16, 17, 19].
A todo esto se suman las dificultades que se presentan con los suministros diabticos, como:
jeringas desechables, equipos de diagnstico, aseguramientos en la cadena de almacenaje y
distribucin, etc., que encarecen notablemente el tratamiento de la enfermedad [17, 19].
Segn los datos brindados al IDF por una importante firma de estudios de mercado (IMS
Health, Norwalk, CT, EEUU) y que cubra alrededor del 80% de la poblacin mundial, en el
2005, slo en las regiones desarrolladas de Europa y Norteamrica se garantizaba
completamente la cobertura de insulina [18]. Un estudio desarrollado en 2006* indicaba que
la situacin no haba mejorado: tan slo el 20% de los pases encuestados eran capaces de
garantizar un acceso constante a la insulina [20].
A 89 aos de su descubrimiento, miles de personas con diabetes tipo 1 y 2 mueren cada ao
en los pases en vas de desarrollo, ya sea por falta de acceso a la insulina o por no poder
pagarla. Muchas ms personas con diabetes tipo 2 se veran enormemente beneficiadas del
uso de la insulina, si fuese accesible para ellas [18].

Vea encuesta en el sitio: www.idf.org/insulin

Por otro lado, a pesar de que las principales patentes de proceso asociadas a la tecnologa de
produccin de insulina ya expiraron, lo que convierte a la insulina en un biosimilar, el knowhow asociado a su produccin y formulacin contina en manos de unas pocas compaas en
el mundo, por lo que ha tenido poco impacto el trmino del perodo de proteccin de las
patentes sobre los niveles de produccin y los precios de la insulina [18, 21].
Slo con la aparicin de nuevos productores en el mercado se pudiera contribuir a la
disminucin real de los precios de este medicamento y a garantizar su suministro
establemente en todo el mundo. Con ello tambin se contribuira a evitar la situacin actual,
en donde los ricos con diabetes ven mejorar y aumentar sus expectativas y calidad de vida,
mientras que muchos pobres mueren porque no pueden costearse el tratamiento [18].
En Cuba, segn un estudio realizado, entre los aos 1990-94, en nios y adolescentes
menores de 14 aos, exista entre ellos, una prevalencia de la DM tipo 1 de 2,6 0,3
pacientes por cada 100 000 [22].
En cuanto a la poblacin adulta, en sendos estudios realizados entre las aglomeraciones
urbanas de las ciudades de La Habana y Santiago de Cuba, en los aos 1998 y 1987, y entre
una poblacin de ms de 25 y 15 aos, respectivamente, arroj una prevalencia de 11,8%
[23] y 4.6% [24] de la poblacin.
Segn, se conoce, en la actualidad, unos 34 kg de insulina por ao, son necesarios para
satisfacer la demanda nacional. No obstante, los crecimientos que se pronostican para el
mercado cubano, pudieran colocar esta demanda en un futuro no muy lejano en los 50 kg.
Por todo lo expuesto anteriormente, para Cuba, pas bloqueado por la superpotencia, sera
de sumo inters contar con una tecnologa para producir este frmaco, que permitiera
asegurar, bajo cualquier circunstancia, darle tratamiento a sus pacientes diabticos.

En el marco de la Alianza Bolivariana para Las Amricas (ALBA), mecanismo de integracin

basado en la complementariedad de las economas y que hace nfasis en el desarrollo social
y solidario de sus miembros, pudiera insertarse adecuadamente este proyecto, e intentar
buscar una solucin conjunta a las necesidades para los millones de diabticos, que viven en
los pases del ALBA, que tienen dificultades para acceder a este vital frmaco.
En el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB, La Habana, Cuba), se ha estado
trabajando durante los ltimos aos en la obtencin de clones capaces de producir las
cantidades necesarias del precursor de la insulina, que permita desarrollar una tecnologa
autnoma para producir esta hormona.
El sistema de expresin en la levadura metilotrfica Pichia pastoris desarrollado a mediados
de la dcada de 1980, est basado en el uso del promotor AOX1, y permiti un incremento
sustancial en los rendimientos de protenas con respecto a los obtenidos en
Saccharomyces cerevisiae [15, 25, 26]. Su desventaja fundamental consiste en la intensa
actividad proteoltica observada en los sobrenadantes de cultivos de alta densidad, que lleva
a una limitacin importante en su capacidad de acumular de forma intacta la protena de
inters [13, 27]. Se han ensayado con xitos parciales, diversas estrategias para reducir la
actividad proteoltica contra las protenas de inters. Estos mtodos se han basado en la
manipulacin de las condiciones de fermentacin, como la adicin de fuentes de nitrgeno
orgnico [15, 28, 29], el cultivo a valores de pH extremos [30-32], el crecimiento a bajas
temperaturas [33], as como el uso de cepas de P. pastoris mutantes de proteasas vacuolares
[34], o combinando varias de las estrategias anteriores [35].
Los primeros precursores de insulina expresados en S. cerevisiae, del tipo B1-30-K-R-A1-21, eran
convertidos a insulina por procesamiento secuencial con las enzimas Tripsina y
Carboxipeptidasa B (CpB) [36, 37]. Posteriormente se implement un procedimiento ms

Fundada en La Habana el 14 de diciembre del 2004, y la forman en la actualidad ocho estados: Antigua y
Barbuda, Bolivia, Cuba, Dominica, Ecuador, Nicaragua, San Vicente y Granadinas, y Venezuela.

sencillo de obtencin de insulina por transpeptidacin trptica a partir del precursor

B1-29-A-A-K-A, proceso con una mayor complejidad tecnolgica, pero que elimina la
necesidad de emplear la CpB [38].
En un trabajo previo se demostr que era posible de expresar la mini-proinsulina (MPI) de
estructura B1-30-K-R-A1-21 en la levadura metilotrfica P. pastoris y que su expresin poda ser
incrementada aumentando el nmero de copias del gen por retransformaciones sucesivas
[11]. Sin embargo, se observ en dicho trabajo que la expresin se vea afectada por la
intensa actividad proteoltica del hospedero, lo cual afecta la eficiencia del proceso
fermentativo [11].
PROBLEMA DE INVESTIGACIN:
Cuba no cuenta con una tecnologa autctona para la obtencin de la insulina humana lo que
constituye el problema de investigacin que debe ser resuelto. La etapa de fermentacin es
una de las etapas principales de la tecnologa para la produccin de insulina. En dicha etapa
es necesario encontrar las condiciones que permitan evitar la accin de las proteasas del
sistema hospedero, con lo que se lograra establecer sus condiciones ptimas de operacin.
OBJETO DE LA INVESTIGACIN:
Obtencin de la mini-proinsulina, precursor de la insulina humana recombinante y primer
paso para la produccin de la insulina humana, requerida para el tratamiento de la Diabetes
Mellitus tipo I
CAMPO DE INVESTIGACIN:
Obtencin de frmacos por va de la ingeniera gentica y recombinante
OBJETIVO GENERAL:
Establecer el espacio de diseo y proponer un espacio de operacin del proceso de
fermentacin de Pichia pastoris para obtener la mini-proinsulina que cumpla con los

atributos crticos de calidad de la insulina a escala de laboratorio, que al ser exitosamente

escalado, permita implementar un proceso comercial y econmicamente viable.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
1. Determinar, mediante un Anlisis de Riesgo, los parmetros del proceso de
fermentacin catalogados como crticos en el proceso de obtencin de la miniproinsulina
2. Probar la criticidad de los parmetros de fermentacin establecidos a partir del
anlisis de riesgo
3. Demostrar que la mini-proinsulina expresada en P. pastoris posee la estructura
primaria, secundaria y parte de su estructura terciaria adecuadas, lo que constituye el
atributo crtico de calidad de la mini-proinsulina, de especial relevancia en la posterior
obtencin del monmero de la insulina
4. Estimar la Demanda Perspectiva de insulina humana en los pases miembros del ALBA
para el 2025
5. Realizar un Anlisis de Pre-factibilidad Econmica de la produccin de la insulina
humana para suministrar la demanda dentro de los pases miembros del ALBA
HIPTESIS PRELIMINAR:
Es posible identificar los Parmetros Crticos y establecer el Espacio de Diseo del proceso
de fermentacin de la mini-proinsulina en Pichia pastoris, tales que, al garantizar el
Atributo Crtico de Calidad del precursor de la insulina, asegure la integridad de la molcula
y el establecimiento de un proceso econmicamente viable.
MTODOS DE INVESTIGACIN:
Mtodo Hipottico-Deductivo: Se emple para la elaboracin de la hiptesis del
trabajo.
Mtodo Histrico-Lgico: Se emple para el estudio y anlisis crtico de los trabajos
existentes en la literatura especializada, y a partir de dicho anlisis tomar los aspectos
positivos para aplicarlos creadoramente y darle solucin al problema cientfico
planteado.

Mtodo Analtico-Sinttico: Se emple para descomponer el problema de investigacin

en varios sub-problemas menos complejos que fueron adecuadamente resueltos,
despus de ser estudiados separadamente.
Mtodo de Comparacin-Clasificacin: Se emple en el anlisis de los resultados de los
diseos experimentales, en el anlisis del modelo fermentativo que mejor se adecu a
los datos experimentales y en el anlisis sobre la pertinencia o no de producir en Cuba
la insulina, comparando cada una de las respuestas obtenidas con reportes obtenidos
de la literatura especializada.
Mtodo de la Observacin Cientfica: Se emple para la definicin del problema de
investigacin, plantear la hiptesis preliminar, elaborar los objetivos y el informe de los
resultados.
Mtodo de la Medicin: Se emple para encontrar los valores cualitativos de los
parmetros de operacin del proceso de fermentacin y los atributos de calidad de la
insulina, para lograr posteriormente encontrar los nexos entre estos grupos de
magnitudes, que permitan resaltar su criticidad dentro del proceso fermentativo.
Mtodo Experimental: Se emple para demostrar la hiptesis planteada y dar
cumplimiento al objetivo general del trabajo.
NOVEDAD CIENTFICA:
La novedad cientfica del presente trabajo consiste en que, por primera vez, se logra
controlar la degradacin proteoltica que ejerce la Pichia pastoris sobre la mini-proinsulina y
se garantizan los atributos crticos de calidad de la molcula, mediante el empleo de los
recientes lineamientos de la ICH y la aplicacin de los conceptos emanados de la Calidad por
Diseo a la tecnologa de produccin de la Insulina humana recombinante; mediante un
enfoque de anlisis de riesgo y estableciendo el espacios de diseo del proceso fermentativo.
ACTUALIDAD DEL TRABAJO:
La actualidad del trabajo est dada por la aplicacin de los lineamientos y directrices
recientes de la ICH para el desarrollo de productos farmacuticos, lo que presupone la
mejora continua del proceso productivo y una conocimiento mayor, tanto de la molcula que
compone el ingrediente farmacutico activo, como del proceso que da lugar a su obtencin.

IMPACTO CIENTFICO:
El impacto cientfico de la tesis est dado en los resultados alcanzados que permiten la
obtencin de los parmetros requeridos para la implementacin de la fermentacin en la
escala industrial, y con ello el establecimiento de una tecnologa autctona de obtencin de
la insulina humana recombinante.
Adicionalmente, este trabajo pudiera servir como referencia para la expresin de otras
protenas heterlogas en P. pastoris sensibles a la degradacin por proteasas.
IMPACTO ECONMICO:
El desarrollo de una tecnologa propia para la obtencin de la insulina humana recombinante
a partir de P. pastoris, permitira sustituir un rengln de importacin nacional (el pas eroga
actualmente ms de US$ 4 millones al ao), a la par que abrira interesantes perspectivas
comerciales, dado el hecho del aumento sostenido de la demanda de este frmaco.
IMPACTO SOCIAL:
El presente trabajo es una contribucin necesaria para lograr contar con una tecnologa
autctona de produccin de la insulina humana, hormona vital en la actualidad para ms de
90 000 cubanos y alrededor de 290 000 ciudadanos que residen en los pases del ALBA y que
crece, de ao en ao, con una tasa anual de 2,50,5%. Contar con esta tecnologa
contribuira a la independencia tecnolgica de nuestro pas y del ALBA, permitira garantizar
este vital frmaco bajo cualquier escenario por desfavorable que fuese y sera una
contribucin de Cuba al tratamiento de esta pandemia moderna.
Los resultados de este trabajo han sido reflejados en tres publicaciones internacionales del
campo de la biotecnologa, una tesis de pregrado y dos tesis de maestra, y se han
presentado trabajos en cuatro eventos internacionales. El trabajo de desarrollo de un
proceso de obtencin de insulina humana ha sido premiado como Logro Institucional del
CIGB en los aos 2003 y 2005.
9

Establecimiento del Espacio de Diseo del

Proceso Fermentativo de Obtencin de la
Insulina Recombinante en Pichia pastoris

CAPTULO 1
REVISIN BIBLIOGRFICA

11

CAPTULO 1. REVISIN BIBLIOGRFICA

1.1 La Insulina Humana
1.1.1 La Diabetes Mellitus

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad producida por una alteracin en el

metabolismo de los carbohidratos en la que aparece una cantidad excesiva de azcar en la
sangre y a veces en la orina. Fue por primera vez descrita en un papiro egipcio descubierto
por el egiptlogo y novelista alemn Georg M. Ebers (1837-1898) en una tumba en la
antigua ciudad de Tebas en el ao 1862. La antigedad del documento se ubica entre los
aos 3 000 y 1 500 antes de nuestra era [39].
La DM es una enfermedad del sistema endocrino, causada por la reduccin del nivel de
insulina secretada por el pncreas, aunque tambin se puede desarrollar, en caso de una
pobre respuesta de los tejidos a la insulina [2]. La insulina juega un papel crucial en la
regulacin de la concentracin de glucosa en la sangre. Hasta el presente no existe cura
para la diabetes y de no ser tratada puede conllevar al coma diabtico y a la muerte [2].
Sin embargo, un diagnstico a tiempo y un tratamiento eficaz pueden prevenir muchos de
sus sntomas y elevar la calidad de vida de las personas que la padecen.
En el ao 1985, se contabilizaban unos 30 millones de personas en el mundo con este
padecimiento. Diez aos despus esta cifra alcanzaba los 135 millones de pacientes. Para
el ao 2003 existan 171 millones de pacientes con DM en el mundo. La cifra se elev a
ms de 180 millones para el 2005 y se estima que para el 2030 esta cifra alcanzar los 366
millones [40]. Se cree sin embargo, que estas cifras son conservadoras y que en realidad
algunas estadsticas de muertes por afecciones cerebro-vasculares, estn relacionadas con

12

la DM directamente [41]. La mortalidad global atribuible a la diabetes se estim en unos

2,9 millones de muertes para el ao 2000, lo que represent el 5,2% de todas las muertes
ocurridas en ese ao [42], mientras que, segn la Federacin Internacional de Diabticos
(IDF), ya para el 2007 la cifra fue de 3,8 millones, contabilizando el 6% de todos los
decesos, casi la misma cantidad que provocan el VIH/SIDA.
Se estima que los pacientes diabticos en Cuba para al ao 2000 rondaban los 480 000 y
ubica esta cifra en unos 855 000 para el 2030, para un crecimiento anual promedio de
2,14% [40]. Por otra parte, segn cifras brindadas por el Dr. Oscar Daz, Jefe del Grupo
Nacional de Endocrinologa y Director del Instituto Nacional de Endocrinologa (INEN, La
Habana), en marzo del 2008, existan en Cuba unos 375 095 diabticos, de los cuales
75 000 (20%), constituan pacientes insulino-dependientes**. Sin embargo en un estudio
piloto de pesquisaje activo realizado en la occidental provincia de La Habana, en la
localidad de Jaruco, se encontr un incremento en un ~2,5% en la poblacin de diabticos
ms un incremento de un 5,5% de pacientes pre-diabticos, por lo que la cifra real de
diabticos en Cuba podra rondar a cifras cercanas a los estimados de la OMS.
A nivel mundial, el incremento de la enfermedad est en el rango del 2-6% anual [43], lo
que permite que se catalogue a la DM como una de las pandemias modernas y unos de los
grandes retos de la medicina moderna en la actualidad.
En Cuba la diabetes ha estado entre las 10 primeras causas de muerte durante las ltimas
dcadas. En el 2006 ocasion 2 056 defunciones, para una tasa de 18,2 por cada 100 000
habitantes. Su tasa de prevalencia se increment de 19,3 en el ao 1996, a 33,3 por cada
1 000 habitantes en el 2006 [44].

Para ms informacin, consulte el sitio: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html

Para ms informacin: http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD37B7FA0-B63432BA3
**
Tomado del sitio: http://www.sld.cu/sitios/diabetes/

13

1.1.1.1 Tipos de Diabetes y algunos sntomas de la enfermedad

Existen dos tipos de diabetes. En la DM insulino-dependiente (DMID), comnmente

llamada diabetes de comienzo juvenil, el organismo no produce insulina o la produce en
muy pequeas cantidades. Los sntomas aparecen de forma sbita y en individuos
menores de 20 aos de edad, en la mayora de los casos alrededor de la pubertad. La
DMID representa del 5 - 10% de todos los casos de la enfermedad diagnosticados cada
ao. La DMID es considerada una enfermedad autoinmune, pues el sistema inmune
destruye las clulas

pancreticas productoras de insulina [45]. Los cientficos creen que

factores genticos y ambientales, tales como virus y protenas de alimentos pueden de

alguna forma activar al sistema inmunolgico para destruir las propias clulas [45].
En la DM no insulino-dependiente (DMNID), llamada diabetes de comienzo en adultos,
pues se manifiesta, como regla, despus de los 40 aos y con frecuencia despus de los 55
aos, el organismo produce cantidades insuficientes de insulina o no es capaz de utilizarla
en el transporte de glucosa. Los sntomas caractersticos de la DMNID incluyen infecciones
repetidas en la piel, dificultades en la cicatrizacin de heridas, cansancio generalizado,
inflamacin y adormecimiento de las manos y los pies [3]. Debido al desarrollo lento de la
enfermedad, muchos pacientes no se dan cuenta de que estn enfermos [3]. La DMNID
constituye del 90 al 95% de todos los casos diagnosticados cada ao. Cerca del 20% de
dichos pacientes reciben, no obstante, insulina en sus tratamientos.
1.1.1.2 Costos asociados a la enfermedad

Dependiendo del pas, la DM puede generar entre el 5 y el 14% de los gastos de salud [46].
Diamond estima que el costo anual asociado a esta enfermedad en los EEUU ascenda, en
el ao 2002, a ms de US$ 100 mil millones [3]. En otro estudio presentado por la
Asociacin Americana de Diabticos (ADA) situaban la cifra total en los US$ 132 mil
millones [47]. El propio estudio, conclua que el gasto mdico promedio anual de un

Consulte el sitio: http://www.aventis.com/ future/fut0203/metabolism_out_of_balance

Vea el sitio: http://www.dragonbiotech.com/

14

paciente diabtico era de US$ 13 243, mientras que un no diabtico era de tan slo US$ 2
560, lo que significa que el gasto anual de un paciente diabtico es ms de 5 veces el gasto
de una persona no diabtica [47].
A nivel mundial, para el 2007, se contabilizaron gastos de US$ 232 mil millones, y se
estiman en unos US$ 302,5 mil millones para el 2025. La OMS, por otro lado, asegura que
en el decenio 2005-2015, China perder US$ 558 mil millones de ingresos nacionales
previstos debido a las cardiopatas, los accidentes vasculares cerebrales y la diabetes. Se
cree que de acuerdo a los ritmos de crecimiento actuales, la DM se convertir en una de
las enfermedades ms comunes y en uno de los problemas ms graves de salud pblica en
las sociedades del futuro [3].
Como en el resto de las enfermedades, en la DM se observan marcadas diferencias en
cuanto a la distribucin de los fondos destinados a la enfermedad. Se conoce que cerca
del 80% de todos los gastos mundiales son consumidos por los pases desarrollados, e
incluso, en un solo pas, los EEUU con cerca del 8% de todos los diabticos en el mundo, se
consume aproximadamente el 50% de todos los fondos destinados al cuidado de la DM y
en Europa se consume otro 25%***.
1.1.2 Estructura de la Insulina Humana

La molcula de insulina est formada por dos cadenas polipeptdicas, denominadas A y B,

de 21 y 30 aminocidos respectivamente (Fig. 1). Esta molcula se forma a partir de un
precursor, la proinsulina, que cuenta adems con una cadena C adicional que se pierde
durante la maduracin de la molcula. Dichas cadenas se encuentran unidas por dos
puentes disulfuro que se establecen entre las cistenas localizados en las posiciones A7-B7
y A20-B19. Adicionalmente la cadena A contiene un puente disulfuro intracatenario (A9A11). Tiene una frmula molecular de: C257H383N65O77S6 (masa molecular: 5807,69 Da) y
posee un punto isoelctrico de pI 5,4. Fue aislada por primera vez de un pncreas canino,

Vea el sitio: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html

Para ms informacin: http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD3-87B7FA0-B63432BA3

***

15

por el cirujano canadiense Frederick G. Banting (1891-1941) y su asistente Charles H. Best

(1899-1978) en el ao 1921 [5, 48] y cristalizada por Abel en 1926 [49, 50]. Su estructura
primaria fue elucidada en 1953 por Sanger y Thompson [51].
En 1966, tres laboratorios, en Alemania [52], EEUU [53] y
China [54], de manera independiente, lograron sintetizar
qumicamente la insulina.
En los humanos, el gen de la insulina est localizado en el
cromosoma 11. En 1967, Steiner descubri que la insulina
era sintetizada como proinsulina, la cual es procesada a
insulina por una serie de procesos enzimticos [55]. La
insulina humana es producida en las clulas de los islotes
de Langerhans, en forma de pre-proinsulina. El pre-pptido
(pptido seal) es removido una vez que llega al retculo
endoplasmtico. La proinsulina se pliega correctamente
tambin en este compartimiento de las clulas y es
Figura 1. Representacin esquemtica de la posible estructura
terciaria de la insulina humana,
modificado de [3].

transportada hacia el aparato de Golgi y procesada

subsecuentemente hasta la molcula madura que es

almacenada en las vesculas transportadoras que la llevan hacia la membrana una vez que
las clulas reciben la seal para ello [1, 56-58]. El pptido C de unin, es secretado junto
a la insulina madura al torrente sanguneo y aunque no han sido descubiertos receptores
del pptido C, se cree que ste posee alguna funcin biolgica an por descubrir [59].
1.1.3 Vas para la Obtencin de la Insulina

Un extracto obtenido de pncreas canino fue empleado con xito por primera vez en un
paciente diabtico el 11 de enero de 1922, cuando el adolescente de 14 aos Leonhard
Thompson fue inyectado con el preparado y se logr disminuir, hasta niveles casi

16

normales, la concentracin de azcar en su orina y sangre. El xito del descubrimiento se

divulg rpidamente y cubri de esperanzas a millones de diabticos en todo el mundo.
Para el ao 2000 ms de 7 000 kg de insulina eran necesarios para satisfacer la demanda
de este frmaco [1]. sta era muy difcil, sino imposible, de satisfacer a partir de las
tecnologas de extraccin de insulina de pncreas bovino y porcino [1]; mxime si el
crecimiento de la demanda no se vislumbra que se detenga y se aproxima al 3% anual.
Slo a travs de la tecnologa del ADN recombinante se podran obtener las cantidades
necesarias para cubrir las necesidades presentes y futuras asociadas a la diabetes [60].
Desde el descubrimiento de la insulina por Banting y Best [48], en los aos 20 del siglo
pasado, la evolucin de los preparados para tratar a los pacientes diabticos ha mostrado
una evolucin sostenida. Inicialmente, la insulina fue aislada a partir de pncreas de
ganado porcino y bovino mediante una serie de extracciones complejas. Esta va, produjo
reacciones adversas, que fueron reducindose a medida que se desarrollaban productos
de una mayor pureza, tendientes a eliminar los contaminantes de origen animal
provenientes de los pncreas utilizados [60].
Por otro lado, las insulinas de origen animal son ligeramente diferentes de la humana. La
porcina tiene un aminocido diferente en la cadena B y la bovina tiene dos ms diferentes
en la A [39]. Estas diferencias estructurales por s solas son suficientes para provocar
reacciones inmunolgicas desfavorables en algunos pacientes diabticos [60].
Para corregir el problema de la heterogeneidad entre las molculas de insulina humana y
porcina se dise un procedimiento de humanizacin de la hormona, reemplazando la
AlaB30 del extremo C-terminal de la cadena B por ThrB30, a travs de una reaccin de transpeptidacin mediada por la tripsina (EC.3.4.21.4) en presencia de ster de treonina en
exceso [8, 11, 60].
Otros procedimientos, como la obtencin de insulina a partir del pncreas de cadveres o
su sntesis qumica han sido descartados por su alto riesgo y precio prohibitivo, adems de

http://www. aventis.com/future/ fut0203 /the_discovery of_insulin

17

las posibles implicaciones ticas, filosficas y religiosas que el primero, pudiera traer
consigo [11, 39].
1.1.4 Produccin de la Insulina Humana Recombinante

Con la irrupcin de la ingeniera gentica a finales de los aos 70 del siglo pasado
comenzaron los intentos de producir la insulina en microorganismos. Como fruto de
ingentes esfuerzos, se logr lanzar al mercado la Humulin, el primer producto de la
tecnologa del ADN recombinante para el tratamiento de la DMID, en el ao 1982 [61].
1.1.4.1 Produccin de Insulina en Escherichia coli

En el procedimiento original, de Eli & Lilly and Co. (Indianpolis, IN, EEUU) se obtenan por
separado las cadenas A y B de la insulina a partir de cepas recombinantes de E. coli
transformadas con genes que codifican para dichas cadenas. Posteriormente las cadenas
eran sometidas a una serie de modificaciones qumicas in vitro, transformndolas en la
insulina humana [11, 60, 62]. Este procedimiento fue sustituido a partir de 1986, por uno
ms simple que elimina la necesidad de la sntesis separada de las cadenas A y B; proceso
que an hoy es empleado para la obtencin del producto [63].
1.1.4.2 Produccin de Insulina en Saccharomyces cerevisiae

En 1986, investigadores de la Novo Nordisk A/K (Bagsvaerd, Dinamarca) patentaron un

procedimiento para la obtencin de la insulina humana, empleando un precursor ms
corto que el natural, al que denominaron mini-proinsulina (MPI), y utilizando como
hospedero a la levadura S. cerevisiae, con un amplio historial de servicios a la
humanidad, siendo catalogada como completamente segura para el hombre [36, 37].
La levadura, como organismo eucariota, posee la capacidad de efectuar transformaciones
post-traduccionales y de secretar las protenas heterlogas [64, 65]. La capacidad de
formar correctamente los puentes disulfuro, posibilita el plegamiento de la molcula de la
pro-insulina, tal y como ocurre en las clulas
aislamiento y purificacin.
18

del pncreas humano, lo que facilita su

(A)
A

(B)
B

Figura 2. Precursores cortos de la Insulina y su conversin a Insulina. (A) MPI: B1-30-KR-A; (B) MPI:
B1-29-AAK-A utilizados por Thim y col. [2, 3].

19

Dicho precursor lograba secretarse casi ntegramente y puede ser convertido in vitro a
insulina humana por la accin combinada o secuencial, de las enzimas tripsina
(EC.3.4.21.4) y carboxipeptidasa B (EC 3.4.17.2), ambas de origen bovino (Fig. 2A) [37].
Aos ms tarde se ampli esta idea y se empez a utilizar el espaciador AK- entre las
cadenas A y B de la insulina porcina, que slo difiere de la humana por la presencia de una
Ala en la posicin B30 [66]. Debido a que el aminocido B29 es una lisina al efectuar el
tratamiento enzimtico con la tripsina, bajo determinadas condiciones, sta realiza el
corte despus de la LysB29 y entre la lisina del espaciador y el aminocido de la posicin
A1, quedando la molcula des-ThrB30-insulina. Posteriormente a travs de la reaccin de
sntesis con la propia tripsina y en presencia de cantidades en exceso de un ster de
treonina se efecta la adicin de la treonina en la posicin correcta B30, obtenindose la
insulina humana (Fig. 2B) [8, 66].
1.1.4.3 Expresin de precursores de Insulina en la Levadura Pichia pastoris

Kjeldsen y col. [9], hicieron un estudio comparativo de la expresin del precursor corto de
la insulina (MPI, B1-29-AAK-A), demostrando algunas ventajas como la ausencia total de la
molcula intracelularmente y el procesamiento completo de la molcula a lo largo de su
ruta de secrecin.
Para un precursor similar, Wang y col. [10], reportaron niveles de expresin del orden de
los 1,5 gL-1 de MPI, aunque se brinda escasa informacin sobre las condiciones
experimentales del hallazgo.
Por otra parte, Zhu y col. [67], reportaron niveles ms modestos (181 mgL-1) los que
fueron logrados con un clon Mut+ con 12 copias del casete de expresin. En el propio
estudio, los autores aseguran que los clones con ms de 12 copias del casete de expresin
disminuye significativamente el nivel de expresin del precursor.
Ms recientemente, Gurramkonda y col. reportaron los ms elevados valores de expresin
hasta ahora obtenidos de 3 gL-1 de MPI (B1-29-AAK-A), empleando una cepa X-33 de P.
20

pastoris, y optimizando previamente el uso de codones, el vector de expresin, el medio y

las condiciones de cultivo [68].
En el CIGB, se ha laborado durante ms de una dcada en la obtencin de esta hormona.
Los primeros intentos fueron realizados empleando E. coli como hospedero [69]. Despus
de explorar en la levadura S. cerevisiae, se logr obtener niveles apreciables y crecientes
de la MPI, utilizando la construccin B-KR-A en la levadura P. pastoris, a travs del
aumento del nmero de copias del casete de expresin [11, 39].

1.2 Parmetros de la Fermentacin para la Expresin

de Protenas Heterlogas en Pichia pastoris
1.2.1 Pichia pastoris como Sistema de Expresin

Esta levadura ha sido ampliamente utilizada en la expresin de protenas recombinantes

[12, 13, 15, 71-75]. Desde que Ogata y col. [70] describieran la capacidad de la levadura
Pichia pastoris de utilizar eficazmente el metanol como fuente de carbono a la actualidad,
cerce de 500 protenas recombinantes de diferentes orgenes han sido expresadas en este
hospedero y su nmero no para de aumentar [12, 72, 76].
La popularidad de esta levadura se basa en su potencialidad para producir muy altos
niveles de protenas forneas y su capacidad para crecer hasta muy altas densidades
celulares en medios qumicamente definidos, en los que se pueden lograr rutinariamente
rendimientos de 5 a 40% de las protenas celulares; resultando valores ms altos que los
obtenidos en la levadura S. cerevisiae, y con frecuencia equivalente a los de E. coli [77, 78].
Adicionalmente, cultivar a gran escala P. pastoris hasta alta densidad celular es
relativamente fcil y se obtienen altos rendimientos volumtricos [11-13, 79-81], como
por ejemplo los 12 gL-1 de fragmentos C de la toxina del ttano [28] y de 3 a 4 gL-1 de
albmina de suero humana [77, 82] y de 6 a 10 gL-1 de factor de necrosis tumoral [25, 83].
Con el uso de este sistema, tambin se obtienen altos rendimientos en protenas

Para ver un listado ms completo, revisar el sitio: http://www.kgi.edu/x753.xml

21

intracelulares, logrndose una alta estabilidad gentica y es posible aumentar la escala sin
mermas en los rendimientos [64], como lo demuestra un reporte de 4 gL-1 de interleucina
2 intracelular, lo que representa un 30% del total de protenas [77].
Ms recientemente, se ha logrado la expresin de complejas protenas humanas,
reproduciendo en las protenas expresadas en P. pastoris, el complejo patrn de
glicosilacin que las clulas de mamfero le confieren a sus protenas nativas [84-89]. Esto
ha permitido la expresin extracelular de un anticuerpo monoclonal completamente
funcional en una cepa glico-ingenierizada de P. pastoris hasta alcanzar niveles de 1 gL-1 en
el sobrenadante de cultivo [90].
1.2.2 Medio de Cultivo Qumicamente Definido

Aunque se reconoce la capacidad de P. pastoris de alcanzar elevadas concentraciones

celulares con medios salinos, la abundante bibliografa que ha sido publicada sugiere que
la composicin ptima del medio de cultivo para lograr los mejores resultados depende de
la cepa escogida y las particularidades de la protena fornea que se va a expresar en este
hospedero [79, 91, 92].
Se recomienda comenzar los estudios de expresin, empleando el medio basal salino
(BSM) de Invitrogen Co. (Carlsbad, CA, EEUU) [93], el cual ha sido ampliamente probado
con xito, para la expresin de cientos de protenas heterlogas [12].
A pesar del xito acumulado con su empleo, el medio BSM presenta algunos
inconvenientes fciles de observar a simple vista cuando se prepara y esteriliza,
notndose una turbidez de color blanquecina antes de inocular, en especial los cultivos en
los que se preestablece valores de pH 5 [94]. Este cambio de coloracin se atribuye a la
baja solubilidad de los cationes polivalentes de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) presentes
en el suplemento PTM1, en presencia del orto-fosfato (HPO42-) [95]. Esta ligera
precipitacin no es muy problemtica y tiende a desaparecer sin dejar secuelas a medida
que el cultivo se desarrolla, pero puede acarrear problemas de desbalance, sobre todo en

22

la medida que el pH del medio se incrementa por encima de pH 5 [94]. Una solucin a este
problema fue propuesta por Oehler y col. [96] y consiste en la sustitucin del medio del
cido orto-fosfrico por el hexametafosfato de sodio [(NaPO3)6], una sal que no forma
precipitados en presencia de cationes de calcio y magnesio.
Tambin han aparecido nuevos medios de cultivo alternativos, como los propuestos por
Daugulis y col. [97, 98] o el denominado como FM22 formulado por Stratton y col. [99].
Todos ellos, han sido ideados, no obstante, para alcanzar, al igual que el medio BSM, altas
densidades celulares en los cultivos de P. pastoris [79].
El medio BSM de Invitrogen fue desarrollado a partir de los trabajos desarrollados por
Wegner y col. [100, 101], en los cuales se establecieron los rangos necesarios para el
crecimiento hasta altas densidades celulares de la levadura P. pastoris para su empleo
como fuente de protena unicelular.
1.2.3 Condiciones de Cultivo

Se conoce que P. pastoris es mesfila, y capaz de crecer y multiplicarse entre 20 y 37C

[35, 102], aunque, segn experiencias del autor, puede soportar, por cortos espacios de
tiempo, temperaturas fueras de este rango.
En cuanto al pH, como el resto de las levaduras, es capaz de crecer a pH cidos o neutros,
lo que significa en trminos prcticos un rango bastante amplio que cubre desde pH 3
hasta pH 7 [35], aunque otros autores han enmarcado este rango de pH 2,8 a 6,5 [103].
Diferentes autores han sealado la importancia de la correcta seleccin del pH para la
expresin extracelular de protenas forneas en P. pastoris [14, 33, 35, 77, 102-105]. El
amplio rango en que puede multiplicarse esta levadura, que oscila entre los pH 2,8 y 7, sin
que se afecte apreciablemente la velocidad especfica de crecimiento, hace que el pH sea
una variable ideal para optimizar la expresin de protenas heterlogas [35, 72].
Los cultivos de esta levadura en los que se emplea el promotor AOX1, suelen dividirse en
dos fases, una de crecimiento y otra de produccin [94]. La primera fase, cuyo objetivo es

23

alcanzar la mayor densidad celular posible y desreprimir el gen AOX1 para su uso en la
fase productiva, a su vez, se divide en dos etapas, una en que se cargan todos los
nutrientes de una vez como en un lote, y otra que comienza una vez agotada esta etapa y
en la que se incrementa el lote inicial con determinada cantidad de medio fresco
(comnmente se emplea slo la fuente de carbn suplementada con determinadas
cantidades de soluciones trazas y vitaminas). En esta fase, la fuente de carbono que se
utiliza es el glicerol, por representar un sustrato menos represor del gen AOX1 que la
glucosa, aunque recientemente ha sido empleada la glucosa, en lugar del glicerol, y un
sistema de control adecuado para producir fitasa recombinante con P. pastoris [106].
En la segunda fase se cambia la fuente de carbono, por el metanol. En dependencia del
fenotipo que tenga, la cepa ser capaz de crecer a una velocidad mayor (Mut+) o una
menor (MutS). Existe tambin una tercera posibilidad en que se pueden bloquear los dos
genes, el AOX1 y el AOX2, y en ese caso se tiene un fenotipo Mut0 (o Mut- para algunos
autores) y dicha cepa podr expresar el gen heterlogo, pero ser incapaz de utilizar el
metanol como fuente de carbono [107].
Algunos autores han observado que la acumulacin de la protena fornea en el medio de
cultivo va en aumento durante un perodo de la fase productiva, pero a partir de algunas
decenas de horas del inicio de la induccin tal acumulacin no slo deja de observarse,
sino que comienza a disminuir, a pesar de que el crecimiento del cultivo contina su
aumento [91, 105, 108]. Este fenmeno ha sido atribuido a la existencia en P. pastoris de
un sistema proteoltico fuerte y bien estructurado que compite con la expresin de
protenas heterlogas [91, 108].
Diferentes han sido las estrategias para evitar las consecuencias de la degradacin
proteoltica [14, 33, 104, 106, 108-112]. Entre las ms utilizadas han estado la utilizacin
de cepas mutantes de proteasas [34, 113, 114], cepas hipersecretoras [115], la
modificacin de la estructura de la protena para hacerla menos vulnerable a la accin de

Los precios de mercado de la glucosa son comparativamente menores a los del glicerol (N. del A.).

24

las proteasas del hospedero [116, 117], la adicin de inhibidores de proteasas [118], lo
que incluye su fusin a otro fragmento [102, 119], la manipulacin del pH en el medio de
cultivo [120, 121], la manipulacin del oxgeno en el cultivo [122-126] y efectuar los
procesos de cultivo a temperaturas reducidas [33, 127].
Tambin, se conoce que el agotamiento de las fuentes de nitrgeno es uno de los factores
que induce la produccin de proteasas en la clula hospedera [14, 128], por lo que
suplementar los cultivos con alguna fuente, inorgnica u orgnica, de nitrgeno que de
manera directa elimine este dficit, constituye una de las vas para superar los efectos
negativos que sobre la expresin de la protena de inters ejercen las proteasas. De
manera que, suplementar el medio con hidrolizado de casena (HC) [29], peptona [129],
extracto de levaduras (YE) [130] y adicionando alguna otra fuente de origen orgnico [131,
132] o inorgnico [105, 109, 133, 134], han sido vas exploradas para minimizar los efectos
de este fenmeno.
En los casos de excesos de in amonio en el cultivo, Mendoza-Vega y col. [129] han
reportado la disminucin significativa de la concentracin de protenas totales en el
sobrenadante del medio de cultivo, en la produccin de hirudina en S. cerevisiae.
Por ltimo, se ha reportado que la adicin de EDTA al medio de cultivo, ha sido la causa de
la mejora en la estabilidad del producto heterlogo [104], lo que parece asociado a que el
EDTA impide agregaciones no deseadas de ste y de favorecer la solubilidad de algunas
sales complejas, as como tambin a la posible accin sobre las metalo-proteasas que esta
sustancia inhibe. Adicionalmente, el EDTA es un agente quelante, el cual desfavorece la
posible dimerizacin y posterior hexamerizacin de la molcula de MPI, evento que ha
sido detectado no slo en la insulina madura, sino que tambin en la proinsulina [57] y la
MPI [135]. Por ltimo, existen reportes de que el EDTA ejerce un positivo efecto sobre las
membranas de las levaduras para propiciar la secrecin de protenas heterlogas [136].
En resumen, es posible encontrar una composicin de medio de cultivo, qumicamente
definido, que se adece al crecimiento de la cepa de P. pastoris que se emplea para la
25

expresin y secrecin extracelular de la MPI. De modo similar, es posible encontrar, a

escala de laboratorio, las condiciones de cultivo ms favorables para disminuir, al mnimo
posible, la degradacin proteoltica de la MPI expresada en este hospedero.

1.3 Entorno Regulatorio

Unida al desarrollo de la biotecnologa, y en especial en sus aplicaciones en la medicina,
ha estado la intencin de garantizar la seguridad de los productos de esta ciencia para los
potenciales consumidores de sus logros. Innumerables accidentes, asociados al
desconocimiento unos y a la negligencia otros, han impulsado a que los gobiernos
establezcan fuertes controles sobre las compaas y empresas biotecnolgicas, a travs de
el otorgamiento de licencias, inspecciones y recomendaciones, cuya violacin pueden
acarrear fuertes sanciones para los infractores.
Pudiera creerse errneamente que tales eventos ha sido una prctica ya superada en la
actualidad y que constituye un asunto resuelto y que por tanto, las actuales regulaciones
slo son el fruto o consecuencia de los errores del pasado. Slo dos ejemplos recientes
para demostrar que es menester estar vigilantes, en octubre de 2006, mueren ms de 100
personas en Panam al consumir un jarabe anticatarral formulado con dietilenglicol****. En
marzo de 2008, mueren 19 personas en los EEUU al tratarse con una heparina
contaminada.
Esto demuestra la necesidad de que los procesos productivos deban ser exhaustivamente
diseados y controlados de manera responsable, so pena de poner en riesgo, lo ms
preciado, la vida humana. Sin embargo, existi la tendencia de querer pre-establecer
rgidamente los procesos productivos en momentos muy tempranos de su desarrollo,
cercenando las posibles mejoras tecnolgicas que pudieran surgir ulteriormente producto
de la experiencia acumulada con el empleo del producto y su caracterizacin fsico-

****

Vea el sitio: http://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_de_par%C3%A1lisis_e_insuficiencia_renal_aguda

Consulte el sitio: http://www.quiminet.com.mx/nt6/nt_%2584%259C%252B%2517%25F3XRv.htm

26

qumica y farmacolgica; lo que unido a la necesidad de registrar los productos ms

tempranamente haca que fuese extremadamente engorrosa la tarea de la mejora
efectiva de los procesos una vez registrados. Esto ltimo provoca que muchas compaas
se vieran tentadas a burlar estas recomendaciones y a establecer procedimientos
engaosos para sortear las barreras regulatorias.
La contradiccin existente entre la necesidad de establecer reglas definidas para la
elaboracin de los medicamentos y la necesidad de la mejora continua de los procesos
para su fabricacin, parece que puede ser resuelta con los conceptos que han emanado
en los ltimos aos al intentar armonizar las regulaciones vigentes de las farmacopeas de
los pases que encabezan el desarrollo del sector farmacutico (EEUU, Europa y Japn). En
efecto, expertos de estos pases han elaborado un marco conceptual, a travs de
lineamientos y recomendaciones recogidas en el Encuentro Internacional sobre la
Armonizacin (ICH) [137-142].
Segn estos lineamientos, lo ms importante es garantizar la seguridad del medicamento
a lo largo de toda la vida til del mismo, construyendo su calidad desde el propio diseo
y no verificndola solamente en la etapa final. Esta idea se resume en el concepto de
calidad por diseo (QbD), que presupone una etapa de desarrollo del producto con una
extensa caracterizacin fsico-qumica y farmacolgica del ingrediente farmacutico activo
(IFA), con un conocimiento profundo de los mecanismos de accin del IFA avalados por los
estudios pre-clnicos y por los ensayos clnicos realizados [138, 140-144].
La QbD constituye un acercamiento sistemtico al desarrollo que empieza con pre-definir
los objetivos y da nfasis a la comprensin del producto y el proceso, basndose en el
conocimiento cientfico y el manejo adecuado del riesgo sobre la calidad [141, 143, 144].
La QbD no es un evento aislado, es un proceso que presupone que el conocimiento y la
experiencia ganada por un producto en su proceso productivo puede acumularse y
revertirse en la mejora del propio producto u otros similares a lo largo de todo el ciclo de
27

vida del mismo [145]. La QbD es una oportunidad prometedora para las compaas para
capitalizar el ambiente regulatorio vigente y enfocar a la industria hacia la calidad del
producto farmacutico y el control del proceso productivo a travs del uso y potenciacin
de los avances de la ciencia, garantizar la conformidad regulatoria y la inversin adecuada
para el beneficio de los pacientes y accionistas [144-146].
Lo que la QbD como concepto expresa es que los productos, y los procesos que los hacen
posible, debern ser diseados para reunir por adelantado las especificaciones de los
propios productos y sus requisitos de control de proceso [145]. Cuando los lineamientos
de la QbD se apliquen, se deben alcanzar productos ms puros y potentes, procesos ms
robustos, confiables y seguros, y procesos en los que se alcanzan una productividad
superior [140-142, 144, 145, 147].
Actualmente existe un intenso debate entre desarrollistas, productores y las agencias
regulatorias, en cmo implementar estos conceptos [140-142, 144, 147-150].
En el documento emitido por la USFDA Buenas Prcticas de Produccin de Farmacuticos
para el siglo XXI basados en un enfoque de riesgo contiene conceptos innovadores con
los que sta agencia confa que se modernicen las regulaciones para la produccin de
farmacuticos y su control de la calidad. Algunos de los conceptos que se mencionan
incluyen la utilizacin desde las etapas iniciales del desarrollo del producto las ms
avanzadas tecnologas, la utilizacin de tcnicas de direccin de la calidad y recomienda la
implementacin de enfoques basados en anlisis de riesgo [151]. Producto de esta
iniciativa es la aplicacin de los novedosos avances cientfico-tecnolgicos en el proceso
productivo con la implementacin de la iniciativa denominada tecnologa analtica del
proceso (PAT) de la USFDA [149, 151, 152].
La PAT ha sido definida como un sistema para el diseo, el anlisis y el control del proceso
de produccin a partir de mediciones oportunas (o sea durante el proceso) de atributos

Para ms detalles vea el sitio: http://www.fda.gov/oc/guidance/gmp.html

28

crticos de calidad (QCA) de variables del proceso, de las materias primas y productos
intermedios, con el objetivo de asegurar la calidad del ingrediente farmacutico activo
(IFA) y el producto final [152]. De tal modo, que el objetivo de la iniciativa PAT es mejorar
la comprensin y el control de los procesos productivos, los cuales sean consistentes con
nuestros lineamientos vigentes del sistema de calidad del producto: la calidad no puede
ser medida dentro de los productos, sta deber ser inherente al producto o deber
existir por diseo [150].
Actividades como la QbD y la PAT han sido prctica habitual en las compaas qumicas
desde mediados de los aos 1950 [145]. Las compaas de este sector abrazaron estos
conceptos ya que con ellos ahorraban grandes cantidades de dinero y tiempo en sus
actividades de desarrollo [145].
Para complementar esta iniciativa han sido emitidos por la USFDA y el resto de las
farmacopeas del primer mundo otros documentos, y son la ICH Q7A sobre las buenas
prcticas para la produccin de ingrediente farmacutico activo [139], la ICH Q8 sobre el
desarrollo de productos farmacuticos [138] y la ICH Q9 sobre el manejo del riesgo [137].
En la ICH Q7A se describen las posibles fuentes de obtencin de productos farmacuticos
que cubre desde la medicina tradicional, pasando por la sntesis qumica, hasta los
procesos fermentativos basados en la tecnologa del ADN recombinante [139]; mientras
que en la ICH Q8, se plantea que el objetivo de desarrollo farmacutico es disear
productos de calidad y sus procesos de fabricacin para entregar productos que realicen
las funciones especificadas y que lo hagan de manera consistente.
La informacin y conocimiento ganados de los estudios de desarrollo farmacuticos y la
experiencia industrial proporcionan el conocimiento cientfico suficiente para apoyar el
establecimiento del espacio de diseo (DS), las especificaciones, y los controles del
proceso productivo [138].

29

Posteriormente, en un anexo aadido a este lineamiento [143], se detalla que el

desarrollo farmacutico debe incluir, como mnimo, los elementos siguientes:
La definicin del perfil del producto designado en relacin a la calidad, seguridad y
eficacia, considerado la va de administracin, la presentacin final, la dosificacin,
biodisponibilidad, dosificacin y estabilidad
La identificacin de los CQA de modo que aquellas caractersticas del producto que
tengan un impacto en la calidad del producto puedan estudiarse y ser controladas
La determinacin de los atributos de calidad de la IFA, los excipientes, etc., y
seleccionando el tipo y cantidad de excipientes que deban ser adicionados al
producto farmacutico de la calidad deseada
La seleccin de un proceso industrial apropiado
La identificacin de la estrategia de control del proceso ms conveniente
El CQA constituye una propiedad o caracterstica fsica, qumica, biolgica y/o
microbiolgica, que debe estar dentro de un lmite, rango, o en una distribucin
apropiada, para que slo as, pueda asegurar la calidad deseada del producto [153]. Los
CQAs son generalmente asociados con la sustancia componente del producto, los
excipientes, los productos intermedios dentro del proceso y el producto final [153].
Un parmetro crtico del proceso (CPP) es un parmetro cuya variabilidad tiene un
impacto sobre un atributo crtico de calidad (CQA) y por consiguiente debe controlarse
para asegurar que el proceso produzca el producto con la calidad deseada [143].
El espacio de diseo (DS) constituye la combinacin multidimensional e interaccin de las
variables de entrada (por ejemplo, los atributos de los materiales) y los parmetros del
proceso que han demostrado que aseguran la calidad del producto [138, 143].
El DS es un concepto que puede ser aplicado tanto a un proceso completo, como a
determinadas operaciones e incluso a una operacin aislada [154]. Si un proceso se

30

encuentra operando dentro del DS, aunque sus variables de proceso no coincidan con las
predefinidas, no ser considerado como un cambio de proceso [138]. El movimiento fuera
del DS se considerar como cambio y normalmente ser necesario gestionar un proceso
de post-aprobacin con la agencia regulatoria correspondiente [138]. El DS ser propuesto
por el productor solicitante y ser sujeto a la valoracin, revisin y aprobacin por la
agencia regulatoria correspondiente [138, 143]. Un proceso bien diseado se espera que
sea robusto y consistente en reproducir la productividad y calidad del producto. La fuente
primaria de la variabilidad de los procesos biolgicos complejos es la interaccin entre dos
o ms variables del proceso [150].
Inicialmente se establece la variabilidad aceptable en la calidad del producto y son
establecidos los atributos de comportamiento del proceso, basados en los datos clnicos
obtenidos con el producto, conocimientos reportados de productos similares y el

Variabilidad aceptable
en los atributos
crticos de calidad

ESPACIO DEL CONOCIMIENTO

ESPACIO DE DISEO

Estudios de
caracterizacin del
Proceso

ESPACIO DE
OPERACIN

Figura 3. Ilustracin de la creacin del espacio de diseo a partir de los estudios de caracterizacin del
proceso y la interrelacin entre el espacio de diseo y los espacios de caracterizacin y de operacin [143].

conocimiento cientfico fundamentado de las caractersticas de la molcula (Fig. 3).

Posteriormente, son realizados los estudios de caracterizacin del proceso que permitan
explorar los rangos de caracterizacin del proceso y poder establecer los rangos
aceptables de las variables donde se obtengan los parmetros operacionales crticos del
proceso. Al operar dentro de tales rangos aceptables se podr asegurar la calidad del
31

producto [150]. Basndose en valores lgicos y posibles, los estudios de caracterizacin

deben cubrir amplios rangos de calidad del producto y de los atributos de
comportamiento del proceso, ms all de aqullos para los cuales son tpicamente
testados. Del mismo modo, es deseable que el rango de operacin del proceso se
encuentre dentro de los lmites del DS y que garantice la robustez, repetitividad y calidad
del producto [150, 151, 155, 156].
La informacin de los estudios de desarrollo farmacuticos puede ser una base para el
manejo del riesgo en la calidad. Es importante reconocer que la calidad no puede
probarse en el producto; en su lugar, la calidad debe ser inherente al proceso productivo y
construirse junto con l y deber durar todo el ciclo de vida del producto [153]. Los
cambios realizados en la formulacin y los procesos durante las etapas del desarrollo y
manejo del ciclo de vida del producto deben verse como oportunidades que se tiene de
ganar en conocimiento adicional y el establecimiento de un adecuado DS. De manera
similar, puede ser til el conocimiento generado por los experimentos fallidos [138].
En la ICH Q9, se establece que la gestin del riesgo en calidad (QRM) es un proceso
sistemtico de evaluacin, control, comunicacin y revisin de riesgos a la calidad del
producto farmacutico a lo largo de toda su vida til. En la figura A-1, del Anexo, se
muestra el diagrama bsico para efectuar el manejo del riesgo, el cual consta de cuatro
componentes: la valoracin, el control, la revisin y la comunicacin del riesgo [137].
Varias tareas debern ser completadas antes de ejecutar la evaluacin del riesgo. Se
deben acometer la definicin del alcance de la evaluacin, la definicin del equipo
evaluador y establecer las acciones que den respuesta a la evaluacin del riesgo [157].
Frecuentemente el QRM es llevado a cabo por equipos multidisciplinarios de especialistas
formados por expertos de las diversas reas involucradas [137, 158].

32

Existen diversas herramientas para implementar el manejo del riesgo en calidad, las cuales
se podrn aplicar aislados o en complementacin, en dependencia del estado del
producto, el nivel de informacin requerida, y el alcance del proceso de manejo del riesgo.
Entre las herramientas ms empleadas para el QRM se encuentran: el anlisis modal de
fallas y efectos (FMEA), anlisis del rbol de fallas, anlisis de riesgo y control de los
puntos crticos, anlisis operativo del riesgo y anlisis preliminar del riesgo [137]. La
gestin del riesgo es necesario que sea incorporado en todo el ciclo de vida del producto
farmacutico, aunque sus objetivos varen en dependencia de la etapa en que se
encuentre el producto.
Al analizar las directrices de la ICH Q7A, Q8, Q9 y Q10, resalta el profuso uso matemtico/
estadstico que se pretende dar, como soporte al logro del objetivo principal, de proveer
seguridad y eficacia a bajo costo, a los pacientes con el empleo de los productos
farmacuticos obtenidos bajo estos preceptos [159].
Las herramientas estadsticas que se necesiten dependern del momento en que se
encuentre el producto en su ciclo de vida. En las etapas de desarrollo del producto y del
proceso, se emplearn frecuentemente el diseo de experimentos (DoE) y la evaluacin y
construccin de modelos que ajusten los datos obtenidos [158]; mientras que durante la
etapa de produccin, suelen emplearse las cartas de control de proceso y la minera de
datos. Cada compaa deber establecer sus propias normas y maneras, adecundolas a
su experiencia y necesidad, implementndolas a travs de procedimientos de operacin.
Rathore y col. [151] proponen un esquema, en la que el desarrollo de un producto
farmacutico se subdivide en tres etapas: la de desarrollo temprano, la de desarrollo
comercial y la etapa de post-lanzamiento (Fig. 4). Ntese que la acumulacin del
conocimiento sobre el proceso no se detiene y continua despus del lanzamiento
comercial a travs del monitoreo del proceso y que la informacin acumulada, y

33

adecuadamente sistematizada, puede ser empleada creadoramente para convertir ms

robustos los procesos, contribuyendo a la mejora continua de stos.
En resumen, los conceptos emanados de las ICH Q7A, Q8, Q9 y Q10 [137-139, 143, 153,
154, 160], deben verse como un intento de las agencias regulatorias por impulsar el
conocimiento por parte de los productores de los productos que elaboran, y con ello
aumentar la eficacia y seguridad de los mismos, al tiempo que se disminuyan
sustancialmente las prdidas por concepto de rechazo y no conformidad en los procesos
productivos [161].
Para su implementacin se requiere desde las etapas iniciales de desarrollo articular
esfuerzos y recursos, para acumular
DESARROLLO
TEMPRANO

DESARROLLO
TEMPRANO DEL
PROCESO

conocimientos

cientficos

evidencias clnicas en los productos

DESARROLLO
COMERCIAL DEL
PROCESO

que

permitan

determinar

sus

atributos crticos de calidad (CQA)

CARACTERIZACIN
DEL PROCESO

primero y luego, en el proceso de

DESARROLLO
COMERCIAL

manufactura,
VALIDACIN DEL
PROCESO

determinar

los

parmetros crticos del proceso (CPP),

y los espacios del conocimiento, de

COMPLETAMIENTO
REGULATORIO

diseo (DS) y de la operacin (OS),

con lo que se reducira la variabilidad

POST-LANZAMIENTO

MONITOREO
DEL PROCESO

de los procesos y aumentara la

Figura 4. Una ilustracin de las fases de desarrollo de un

proceso: Desarrollo temprano del proceso, comercializacin
y post-lanzamiento [151].

robustez de stos.
Estos elementos insertados en un

proceso productivo adecuadamente instrumentado, segn los conceptos de la tecnologa

analtica del proceso (PAT) permitiran reducir sustancialmente las prdidas por rechazo e

A finales de 2006, las prdidas en el sector farmacutico de EEUU, asociadas a estos conceptos rondaban los 50 mil
millones de US$ anuales.

34

inconformidades, y por ende, incrementar la seguridad para los pacientes y la

productividad de los procesos farmacuticos, para beneplcito de los productores.
1.3.1 Atributos de Calidad de la Insulina

La insulina humana, es una de las molculas ms estudiadas y caracterizadas que existe

[162, 163]. Sanger y col. [51, 164-167] determinaron, entre 1949-1955, la estructura
primaria de la insulina, trabajos por lo que recibi el premio Nobel en Qumica en 1958.
Ha sido de las pocas protenas que ha podido ser sintetizada qumicamente [168, 169].
Despus de la hormona de crecimiento humana, fue la segunda molcula expresada por
las tcnicas del ADN recombinante [7, 170], y fue la primera en ser cristalizada [171],
hecho que contribuy a que Hodgkin y col. [172] determinaran su estructura
tridimensional. Antes, en 1964, Dorothy Hodgkin haba recibido el premio Nobel de
Qumica por sus trabajos en cristalografa.
Adems, se conocen completamente sus mecanismos de accin a nivel celular [173].
Decenas de formulaciones, para modelar su accin farmacolgica, extender su periodo de
accin y disminuir el rechazo en algunos pacientes, han sido probadas y aprobadas para su
empleo [174]. A esto se une, la existencia de productos basados en molculas de insulina
modificadas, conocidos como anlogos de la insulina, que vienen a engrosar el nmero de
candidatos de productos para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo I [174].
Puede asegurarse que pocas protenas han acumulado durante su ciclo de vida, an en
curso, tal cmulo de experiencias y conocimientos. Con su existencia se ha logrado salvar
a millones de diabticos en el mundo y a pesar de que promisorios tratamientos se
investigan intensamente en la actualidad para el tratamiento de la DMID, vinculadas a la
terapia gnica, las clulas madres [175] y el trasplante de pncreas, no parece que en un
futuro cercano pueda ser sustituido este medicamento de los dispensarios.

35

Todos estos estudios confirman que la estrecha relacin existente entre el monmero de
la insulina humana y su correspondiente receptor, es el elemento primordial para la
actividad biolgica de la insulina [176-178]. La unin entre el monmero de IH y su
receptor es de naturaleza compleja y se alternan sitios de alta y baja afinidad, lo que
permite existan diversas respuestas celulares a la unin ligando-receptor [177]. Esto
ltimo ha permitido el surgimiento de toda una gama de los denominados anlogos de la
insulina, en los que se explota las peculiaridades de la unin ligando-receptor para lograr
diversos efectos farmacolgicos [174, 179].
En cualquier caso, no existen dudas del nexo entre la estructura espacial del monmero
de la insulina y su accin biolgica[180, 181]. Los monmeros de la IH y la MPI slo
difieren por la existencia de un espaciador formado por dos aminocidos que unen el
primer aminocido de la cadena A (A1: Gly) y el ltimo aminocido de la cadena B (B30:
Thr) del monmero de la IH (-B30-KR-A1-). La estructura tanto del monmero de la MPI,
como de la IH, es definida en primera instancia por su estructura primaria. Esta ltima, a
su vez, es la responsable de la estructura secundaria (formacin de las hlices y hojas ).
Finalmente, el hospedero eucariota durante la sntesis y secrecin del monmero de la
MPI, es capaz de formar correctamente los puentes disulfuros del precursor, que se
conservarn tambin en la molcula madura, despus del tratamiento enzimtico del
monmero de la MPI. La existencia de los puentes disulfuro contribuye al establecimiento
de la estructura terciaria, tanto del monmero de la MPI, como del monmero de IH.
De modo que, el principal objetivo que se debe alcanzar en la etapa fermentativa es la
obtencin del monmero de la MPI, con sus correspondientes estructuras primaria,
secundaria y terciaria, lo cual garantizara, a la larga, la obtencin de la IH madura.
En la Tabla A-1, del Anexo, se presenta las especificaciones que debe cumplir, la insulina
humana biosinttica, como ingrediente farmacutico activo (IFA), segn recomiendan la
Farmacopea Europea y la compaa danesa Novo Nordisk A/S. Puede notarse de la
36

referida tabla, que existen dos aspectos relevantes, uno referido a la integridad de la
molcula de la IH, y otro referido a los contaminantes que la acompaan. La identificacin
de la molcula ha de servir para garantizar la existencia ntegra de la IH-r.
A travs de la HPLC-RP se verifica que el tiempo de retencin de la IH-r corresponde
efectivamente con la de un patrn internacional de IH. Mediante el trazado de pptidos,
se comprueba, despus de una definida digestin enzimtica que los pptidos resultantes
corresponden a los de la IH; sirviendo adems, para verificar la correcta formacin de los
tres puentes disulfuro existentes en la IH. A travs de la secuenciacin de la IH-r se verifica
la composicin de aminocidos que garantiza la estructura primaria de la molcula.
El resto de los aspectos de la Tabla A-1 se refieren a los contaminantes acompaantes de
la IH biosinttica y sus niveles de tolerancia en el IFA. Entre stos estn las protenas del
hospedero (HCP), que se toleran a concentraciones por debajo de 1 ppm (1 mgL -1).
Sin embargo, ms all de este aspecto cuantitativo, deber prestarse atencin a la calidad
de este contaminante, pues pequeas trazas de proteasas del hospedero pudieran causar
severas daos a la integridad de la molcula e incrementar la inestabilidad en las etapas
intermedias del proceso de purificacin.
En resumen, es posible disear la etapa de desarrollo del proceso fermentativo de
obtencin de la MPI en P. pastoris, de modo tal que consiga el cumplimiento de las
directrices de la ICH y se logre asegurar las exigencias de la agencias regulatorias. Para
esto, a travs de la ejecucin de los experimentos pertinentes, es posible encontrar, a
escala de laboratorio, los espacios de diseo y operacin del proceso de fermentativo; con
los que se faciliten su escalado e implementacin a la escala productiva, as como su
posible registro como medicamento.

37

1.4 Factibilidad Econmica del Proyecto

El desarrollo de cualquier producto farmacutico transita por diversas fases, que van
desde la concepcin de la idea, hasta su implementacin en el laboratorio, la
demostracin del concepto en estudios pre-clnicos, clnicos y toxicolgicos, hasta su
implementacin final en la escala productiva. En cada una de las fases de desarrollo, con
misiones y objetivos especficos, se va perfilando y ajustando el conocimiento que se tiene
del producto, con lo cual se confecciona el paquete tecnolgico que permite elaborar con
xito el producto de inters. En cada fase debe ser evaluada la factibilidad de acometer el
proyecto desde el punto de vista econmico.
La misin de los desarrollistas estriba en lograr la consecucin de los objetivos arriba
mencionados, con la calidad requerida para garantizar siempre la seguridad de los
pacientes y con el menor impacto sobre el medio ambiente y al menor costo posible.
Recientemente han irrumpido con fuerza el empleo de equipos desechables, entre los
cuales se incluyen: reservorios, filtros, membranas, e incluso, fermentadores [182]. La
necesidad de disminuir los elevados costos de inversin y las grandes cantidades de
energa asociada a la generacin de vapor y la produccin de aguas de calidad
farmacutica, adems de los costos de validacin, han favorecido esta tendencia [183].
Al comparar las tecnologas basadas exclusivamente en equipos y dispositivos reusables
(los que comnmente se construyen de acero inoxidable y requieren de procedimientos
de limpieza y esterilizacin in situ) con otras que emplean, parcial o completamente,
equipos o dispositivos desechables (usualmente elaborados con plsticos y/o polmeros
esterilizados por radiacin gamma, listos para ser usados y que no requieren de limpieza y
esterilizacin), numerosos autores han sealado las ventajas de los ltimos en el
acortamiento de los plazos de inversin, y la disminucin del costo capital y los costos de
produccin [184-188]. La magnitud del beneficio va a depender, sin embargo, del tipo de

38

producto y su valor agregado, de la escala y del grado de sustitucin del equipamiento

desechable en la instalacin [183, 187].
El Centro de Inmunologa Molecular (CIM, La Habana, Cuba) ha sido el pionero en Cuba en
el uso del desechable, basando las tecnologas de produccin de la Eritropoyetina (EPO) y
del anticuerpo monoclonal humanizado Nimotuzumab (hR3) en plantas hbridas donde
se combinan equipos reusables, con equipos y partes desechables [183].

39

CAPTULO 2
MATERIALES Y MTODOS

40

CAPTULO 2. MATERIALES Y MTODOS

2.1 Microorganismo empleado
Durante todo el trabajo se emple la cepa GS115 (his4) de Pichia pastoris, de Invitrogen
Co. (San Diego, CA, EEUU), la cual fue previamente transformada, primero, con el
plasmidio pPIH-M4, para obtener el clon MutS M44 [11, 39], el cual contiene 4 copias
consecutivas del casete de expresin de la MPI, y posteriormente, retransformado con el
plasmidio pPIH-M6Z, el cual posee 6 copias consecutivas del casete de expresin de la MPI
y el gen de resistencia a la Zeocina (Sh ble) como marcador de seleccin [11]. Despus de
tamizar varias decenas de clones en concentraciones crecientes de Zeocina (0,2; 0,5; 1,0
y 2,0 gL-1) se obtuvieron siete clones candidatos (los que resistieron la concentracin
mxima), de los cuales se seleccion el clon C27, como el que posea los mejores niveles
de expresin de MPI a nivel de zaranda, chequeado por RP-HPLC [11]. Se confeccion los
Bancos de Trabajo (BT) con los clones M44 y C27 que se almacenaron a -70oC [11].

2.2 Medios y Condiciones de Cultivo

Para el crecimiento en zaranda y la propagacin de la cepa, se emplearon los medios YPD
(2% (m/v) glucosa, 2% (m/v) peptona bacteriolgica, 1% (m/v) extracto de levadura) y
YPD-agar (YPD + 1,5% (m/v) agar), respectivamente.
Cada nuevo experimento se inici a partir de un vial del BT, inoculndose dos precultivos
de 5 mL de YPD, dejndose crecer toda la noche en el cuarto de incubacin a 28C en un
rolex RT01 (Retomed, Santiago de Cuba, Cuba).
Para el caso de los fermentadores de 2,5 L (vea Foto 1, en las Anexos), ambos precultivos
fueron empleados en la siembra de un Erlenmeyer de 2 L con 300 mL de YPD que fueron
41

agitados a 150 rpm y 28C por alrededor de 24-h, en una zaranda orbital G-53 (New
Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EEUU). Posteriormente, el contenido es lavado dos
veces con agua desionizada estril empleando 6 tubos corning de 50 mL, despus de
separar la biomasa de levaduras por centrifugacin a 3 000 rpm por 15 min en una
centrfuga de mesa CM005B11 (Hitachi, Tokio, Japn). Durante toda la manipulacin se
mantuvieron los tubos corning en hielo para disminuir el stress de la poblacin de
levaduras durante el lavado. Finalmente, el contenido de la biomasa lavada es
resuspendida hasta 50 mL, con lo que se inocul cada experimento llevado a cabo en los
fermentadores de 2,5-L.
Para el caso del fermentador de 14 L (vea Foto 2 en los Anexos), el procedimiento
empleado fue similar, lo que se parti de cuatro Erlenmeyers de 2 L con 300 mL de medio
YPD, que se lav dos veces y se concentr hasta 500-mL la biomasa lavada. En este caso se
centrifug a 10 000 rpm por 30 min a 4C en una centrfuga refrigerada de pomos SCR20B
(Hitachi, Tokio, Japn), empleando para ello, pomos estriles de 300 mL. Los 500 mL de
biomasa lavada se transfirieron a un sifn para inocular el fermentador de 14 L.
Para el crecimiento en los fermentadores de 2,5 y 14 L, se emple un Medio Basal Salino
Modificado (MBSM), qumicamente definido, y que fue suplementado o no, con alguna
fuente adicional de nitrgeno.
A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos empleados fueron de calidad
espectral o analtica de las firmas Merck KGaA (Darmstadt, Alemania) y Oxoid Ltd.
(Basingstoke, Hants, Reino Unido).
Las fermentaciones C27F08 y C27F17 fueron realizadas en un fermentador de 14 L
(Chemap AG, Volketswil, Suiza). Se emple cinco fermentadores (No.1, 2, 4, 7 y 8) de 2,5 L
(B.E. Marubishi, Tokio, Japn) para los experimentos con el clon C27, y un fermentador de
7 L (B.E. Marubishi, Tokio, Japn) para los experimentos con el clon M44. En los
experimentos llevados a cabo en los fermentadores No. 1, 2 y 4 de 2,5 L, se registraron y
42

controlaron todas las variables de fermentacin a travs del software FERMACS (CIGB, La
Habana, Cuba).
Todos los experimentos de fermentacin fueron del tipo de cultivo por lote incrementado
(fed-batch), donde se delimit claramente dos fases: una de crecimiento, donde se utiliza
el glicerol como fuente de carbono y energa, y otra fase productiva, donde se sintetiza y
produce la MPI, por la adicin de metanol, que constituye tanto el inductor de la
expresin de la protena recombinante, como la fuente de carbono y energa.
La primera fase, a su vez transcurre en dos etapas, en la primera el crecimiento ocurre a
expensas de una cantidad de glicerol adicionada al lote inicial. Una vez agotado o a punto
de hacerlo, suele adicionarse en una segunda etapa, cantidades adicionales de glicerol,
para continuar incrementando la densidad celular del cultivo [94, 189]. Adems, adiciones
a flujo constante o decreciente en esta segunda etapa de la primera fase, contribuyen a
desreprimir el gen AOX1 y preparar al sistema para la fase productiva [14, 94, 190].
El proceso en esta primera fase fue efectuado, en todos los casos, a 28,0 1,0 C y pH 5,1
0,2. El pH se control mediante la adicin de 30% (v/v) NH3 y 85% (v/v) H3PO4, cuando
era necesario. Para los de 2,5 L se comenz con 350 25 rpm y 1,0 0,2 Lmin-1 de aire, y
para el de 14 L con 500 rpm y 10 Lmin-1 de aire. Paulatinamente estos valores fueron
incrementndose hasta alcanzar los 900 rpm y 3 Lmin-1, para los de 2,5-L y para el
fermentador de 14-L, hasta alcanzar los 1 400 rpm y 15 Lmin-1.
El volumen inicial para los experimentos en 2,5 L fue de 1 L (0,95 L de medio + 0,05 L de
inculo) y de 10 L para el caso del de 14 L (9,5 L de medio inicial + 0,5 L de inculo).
A todos los experimentos de 2,5 L se les realizaron dos adiciones sbitas de 100 mL con
medio fresco con glicerol a las 24 y 44 h aproximadamente de cultivo, despus de lo cual,
el cultivo continu creciendo hasta agotar completamente la fuente de carbono
adicionada. Durante la fase de produccin se impuso un flujo escalonado de medio de
cultivo (metanol + 12 mLL-1 PTM1) de 4 a 8 mLh-1, incrementndose en 1 mLL-1 por da.
43

En el caso del fermentador de 14 L, se adicion aproximadamente 2 L de medio fresco con

70 % (m/v) glicerol, suplementado con 76,5 gL-1 de hidrolizado de casena, 12 mLL-1 de
solucin de trazas y 6 mLL-1 de solucin de vitaminas, a un flujo escalonado y creciente
desde 109,0 hasta 272,5-mLh-1 durante 9 h, y 61 hasta 153 mLh-1 por espacio de 14,5 h,
para los experimentos C27F08 y C27F17, respectivamente. Despus de lo cual, se esper a
que el oxgeno disuelto (DO) se incrementara por encima del 60%, dando por concluida la
fase de crecimiento e inicindose la fase productiva. Antes, cuando an quedaba unos
0,2 L del medio fresco con glicerol, se estableci en el fermentador las condiciones de pH y
temperatura de la fase productiva (pH 6,3 y 22C, para ambos experimentos).
En los fermentadores de 2,5 L, antes de comenzar la fase productiva, despus de las 40 h
de cultivo, se pre-establecieron en el sistema de control del fermentador la temperatura y
el pH de la fase productiva.
Primeramente, sobre un medio de cultivo ajustado (que se llam MBSM) suplementado
con hidrolizado de casena (HC) se estudi la influencia sobre la expresin de MPI de la
adicin de 1 gL-1 de Na2-EDTA. Seguidamente, sobre el mismo medio suplementado
(MBSM + HC) se analiz el efecto de disminuir la temperatura del cultivo en la fase de
produccin hasta los 22 y 20C. Posteriormente, se evalu la influencia del pH sobre la
expresin en la fase productiva, elevndola o disminuyndola 1,2 unidades de pH
respecto al pH de la fase de crecimiento. Por ltimo, se evalu el empleo de otras fuentes
de nitrgeno como el extracto de levadura (YE), la peptona bacteriolgica (Pept.), el
sulfato de amonio y la mezcla de YE y Pept., y su influencia sobre la expresin de la MPI.
El fin de la etapa de crecimiento en glicerol se detect por el aumento del pH por encima
de 0,7 unidades del valor impuesto en el sistema. En la fase de produccin, con el objetivo
de favorecer la expresin de la MPI, se realizaron adiciones a intervalos regulares de
tiempo, los que incluan junto a la fuente de nitrgeno bajo anlisis, 1 gL -1 de Na2-EDTA.

44

2.3 Determinaciones Analticas

2.3.1 Crecimiento Celular

El crecimiento celular fue determinado gravimtricamente para cada punto experimental,

tanto en base hmeda, como en base seca. Muestras de 10 mL se extrajeron
peridicamente de cada experimento llevado a cabo en los fermentadores de 2,5 L (50 mL
para el caso del fermentador de 14 L) en tubos corning de 15 mL ( 50 mL) previamente
tarados. Cada muestra fue centrifugada a 3 000 rpm por 15 min y el sobrenadante de
cultivo fue separado en eppendorff en alcuotas de 1 mL y almacenados a -20C hasta que
se llevaran a cabo el resto de las determinaciones. Para el crecimiento en base seca, se
parti de una muestra de 1 mL, la cual fue centrifugada por 15 min a 10 000 rpm, el pellet
de biomasa fue ulteriormente lavado con agua destilada, repitiendo la operacin por dos
veces. Finalmente se resuspendi la biomasa del ltimo lavado y se pes sobre el
analizador de humedad MA30 (Sartorius AG, Gottingen, Alemania). La relacin entre los
pesos en base seca y hmeda fue de 0,269 0,003.
2.3.2 Concentracin de Protenas

La concentracin de protenas totales en el sobrenadante de cultivo fue determinada de

acuerdo al mtodo de Bradford [191].
2.3.3 Actividad Proteoltica en el sobrenadante de cultivo

La determinacin de la actividad proteoltica en el sobrenadante de las muestras de los

experimentos, se realiz de acuerdo al mtodo de Anson [192] modificado, utilizando
casena como sustrato.
Para la determinacin, se verti 313 L de solucin de casena al 2% (m/v) en tampn de
Tris-HCl pH 8 en un eppendorf de 1,5 mL y se calent por 5 min a 37C. Posteriormente se
aadi 62,5 L de la muestra de sobrenadante de cultivo, libre de clulas, a la cual se le
desea determinar la actividad proteoltica. La reaccin fue detenida con la adicin de

45

620 L de cido tricloroactico (TCA) al 5% (m/v) cuando transcurrieron 35 min de

incubacin. Por cada muestra se prepar un blanco, utilizando los mismos volmenes
anteriormente descritos, pero primero se aadi el TCA, luego la casena y por ltimo la
muestra. Finalmente, ambos se centrifugaron a 10 000 rpm durante 10 min, debiendo
precipitar la casena hidrolizada. Se separa el sobrenadante, donde permanecen los
pptidos pequeos producto de la reaccin de hidrlisis de las proteasas y se monitorea
su absorbancia a 280 nm. La actividad proteoltica (AP) est determinada por la variacin
de la absorbancia provocada por unidad de volumen y tiempo de reaccin, segn la
frmula:

Donde: AP actividad proteoltica [UA/mLmin]; DO280 nm Diferencia de la absorbancia

a 280 nm entre la muestra y su blanco; VEnzT = 0,0625 mL35 min = 2,1875 mLmin.
2.3.4

Anlisis

de

la

Expresin

por

Electroforesis

en

Geles

de

Poliacrilamida (Tricina-SDS-PAGE) y Western-Blot

Las protenas del sobrenadante de cultivo fueron separadas por SDS-PAGE [Tricina 16,5%
(m/v)] de acuerdo a un protocolo preestablecido para protenas de bajo peso molecular
[193]. Antes, 4-L de muestras de sobrenadante, libre de clulas, fueron mezclados e
incubados con 4 L de solucin de aplicacin 2X, a 95C por 5 min. Las protenas fueron
reveladas por azul de Coomassie o tincin inversa [194] antes de prepararse el Westernblot. Para el Western-blot el gel revelado por tincin inversa, fue desteido por incubacin
por 5 min con tampn de corrida Laemli 10X, antes de ser transferido el gel a una
membrana de PVDF. Las protenas que se unieron fueron bloqueadas con 5% (m/v) de
leche descremada, por 1,5 h a 37C. Las protenas inmunoreactivas fueron detectadas con
un anticuerpo policlonal de curiel contra la IH, incubndolo por 1,5 h a 37C. Un

46

anticuerpo conjugado-peroxidasa anti-curiel fue empleado como anticuerpo secundario y

se detect con 3,3 diamino-bencidina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EEUU).
2.3.5 Determinacin de la Concentracin de Mini-proinsulina

La concentracin del monmero de la MPI se determin por cromatografa lquida de alta

resolucin en fase reversa (RP-HPLC) utilizando un patrn internacional de insulina
humana (1er Estndar Internacional de Insulina 1986, NIBSC, cdigo 850/500) como
material de referencia externo. El RP-HPLC consisti en una instalacin experimental
Merck-Hitachi (Merck KgaA, Darmstadt, Alemania) equipada con una columna analtica C8
(Vydac (208TP5415), 5,4 x 150 mm, 5 m) (Hesperia, CA, EEUU) mantenida a 45C. Fue
empleado un gradiente de 20 a 40% de tampn B en 30 min a un flujo de 0,62 mLmin-1.
Los tampones A y B, estn constituidos por 0,1% (v/v) de cido trifluoroactico (TFA) y
acetonitrilo (Acetonitrile-212, Caledon Laboratories Ltd., Georgetown, ON, Canad) ms
0,05% (v/v) de TFA, respectivamente.

2.4 Caracterizacin del Monmero de Mini-proinsulina

Las muestras que se aplicaron en la columna C8 analtica, para la cuantificacin por RPHPLC de la MPI en el sobrenadante de cultivo, fueron colectadas en un recipiente nico,
que se almacen a 4C. Posteriormente se hicieron alcuotas en varios tubos eppendorff
de 1,5 mL y se separ el acetonitrilo y el TFA que contenan, en un concentrador
centrfugo al vaco SC 210 Speed-Vac Savant (GMI, Albertville, MN, EEUU). Las muestras
fueron reanalizadas en una columna C18 analtica Symmetry W92871H036 (4,6 x 250
mm, 5-m, 100 ) (Waters Co., Milford, MA, EEUU), utilizndose los mismos tampones,
gradiente y flujo, descritos en el acpite anterior.
Con el objetivo de tener mayores cantidades de MPI para los estudios de caracterizacin,
se aplic 1,5 mL de sobrenadante de cultivo de la muestra No.10 del experimento C27F08
(en 14-L) a una columna semi-preparativa C8 (Vydac (208TP1010), 10 x 150 mm, 5 m)

47

mantenida a 45C, en la misma instalacin descrita arriba. En este caso se utiliz un

gradiente de 10 a 40% de tampn B, en 30 min, a un flujo de 2,93 mLmin-1.
Una muestra, de aproximadamente 50 g de protena, aislada de la columna semipreparativa arriba descrita, fue concentrada a sequedad en un evaporador centrfugo al
vaco Speed-Vac Savant. Se resuspendi en bicarbonato de amonio 1% (m/v) pH 8 y se
digiri con la endoproteasa sernica de Staphilococcus aureus V8 - endoproteinasa Glu-C
(Roche Diagnostics GmbH, Mannhein, Alemania) en una relacin enzima/sustrato 1:100,
durante 4 h a 37oC. Un tercio de esta solucin, fue desalada en ZipTip (Millipore, Billerica,
MA, EEUU), eluda en solucin de acetonitrilo 60%/cido frmico 1%. La solucin se
introdujo en un nanocapilar para la medicin en el espectrmetro de masas (EM). En la
figura A-2, del Anexo, se muestran los pptidos y la talla que se debieran obtener de la
digestin enzimtica arriba descrita.
Los espectros de masas fueron obtenidos en un EM hbrido con geometra ortogonal
QTOF-2TM (Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con una fuente de ionizacin
nanospray. Los voltajes del capilar de borosilicato y el cono de entrada fueron fijados a
900-V y 35-V, respectivamente. El EM fue calibrado con una mezcla de yoduro de sodio y
cesio en el rango de 50 - 2 000 Da. El software de procesamiento de los espectros de
masas empleado fue el MassLinx 3.5 (Micromass, Manchester, Reino Unido).

2.5 Otras Herramientas y Metodologas Empleadas

Los experimentos fueron estadsticamente analizados a travs de una versin de prueba
del paquete Design-Expert 7.1.6, 2008 (Stat-Easy Inc., Minneapolis, MN, EEUU) y el
StatGraphics Plus 5.0 (Statistical Graphics Co., Rockville, MD, EEUU).
Para la evaluacin del riesgo se emple el anlisis modal de fallas y efectos (FMEA) [195].
Para el anlisis de factibilidad econmica se utiliz la metodologa empleada por Holland y
Wilkinson [196]. Con dicha metodologa, se elabor el flujo efectivo de caja y se calcularon
la tasa interna de retorno (TIR) y el valor actual neto (VAN).
48

CAPTULO 3
RESULTADOS Y DISCUSIN

49

CAPTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 Espacios de Diseo y Operacin del Proceso de
Fermentacin

para

la

Obtencin

de

la

Mini-

proinsulina en Pichia pastoris

En la figura 5 se presenta una propuesta de
diagrama de flujo de proceso para la
obtencin del IFA empleando la MPI objeto
de este trabajo.
La fermentacin constituye la etapa inicial
de este proceso. Comienza a partir de un
vial del BT y su siembra en Erlenmeyers, los
cuales servirn de pre-inculo a los
fermentadores, tipo tanque agitado, segn
se explica en el captulo anterior.
Para poder garantizar la estructura de IH
intacta en el IFA al final del proceso, es
necesario que la molcula de la MPI,
precursor de la IH, sea correctamente
expresada y secretada en la levadura P.
pastoris en la etapa de fermentacin.
Figura 5. Diagrama de Flujo del Proceso de
produccin del IFA de Insulina humana a partir de la
MPI expresada en P. pastoris y algunos de los equipos
relevantes en cada etapa.

50

De manera que, el principal atributo de

calidad (CQA) de la etapa de fermentacin es la obtencin del precursor de la IH, la MPI,

de manera completa o intacta, y con los puentes de disulfuro correctamente plegados;
condicin con la cual se garantiza una molcula de IH activa al final del proceso.
Por otro lado, se conoce que la intensa actividad proteoltica que es capaz de desplegar
este hospedero da al traste con su elevada capacidad de sntesis y secrecin de protenas
heterlogas, como ha sido reportado por numerosos autores [11, 27, 33, 35, 74, 94, 108,
114, 121, 197, 198].
En la Tabla 1 se resumen algunos de los atributos de calidad de la MPI, como producto
intermedio de salida de la etapa de fermentacin. stos se agruparon en dos tipos de
atributos, los que estn asociados a la integridad y calidad de la molcula, y los que se
asocian a los contaminantes acompaantes de la MPI. Los primeros, son los atributos
crticos de calidad (CQA), pues constituyen los que garantizan la obtencin de la IFA al final
del proceso. Los segundos, si bien son muy importantes para la concrecin del proyecto,
admiten cierta variabilidad de lote a lote, sin afectar la calidad final de la IFA.
Tabla 1. Atributos de calidad de la MPI obtenida de la etapa de fermentacin.
Tipo
Asociado a la Integridad y
Calidad de la Molcula
Asociado a los
contaminantes
acompaantes

Atributo de Calidad
Correcta Estructura Primaria,
secundaria y terciaria del precursor
Protenas del hospedero (HCP)
cidos nucleicos (ADN y ARN)
Otros contaminantes (virus,
micoplasmas, lpidos, pigmentos,
etc.)

Comentario
Son atributos crticos.
Garantizan el CQA de la IFA.
Determinan los pasos de
purificacin necesarios y la
factibilidad econmica del
proceso, pero admiten cierta
variabilidad de lote a lote.

Es preciso conocer cmo se enlaza los CQA de la MPI que presumiblemente se obtendr
en esta etapa con los parmetros de operacin del proceso fermentativo.
3.1.1 Anlisis de Riesgo del Proceso Fermentativo de Obtencin de la
Mini-proinsulina Recombinante en Pichia pastoris

En la figura A-3, del Anexo, se ilustra los diferentes aspectos involucrados en la etapa de
fermentacin para la obtencin de la MPI en P. pastoris. El diagrama de Ishikawa o
diagrama de causa y efecto (o de espina de pescado) ilustra los aspectos que pudieran ser
51

relevantes sobre el CQA de la MPI en la etapa fermentativa, la correcta estructura

primaria, secundaria y terciaria del precursor corto del monmero de la IH, tal y como se
recomienda en la ICH Q8 [143]. El diagrama de Ishikawa ha sido empleado para
complementar un anlisis de riesgo por FMEA para un proceso de intercambio inico
[158] y un cultivo celular [199], mostrando en ambos casos su utilidad.
El proceso fermentativo puede subdividirse en cuatro etapas: el inculo, la disponibilidad
tcnica del fermentador, la fase de crecimiento y la fase produccin. Cada una de ellas
cuenta con operaciones crticas que en su conjunto pueden garantizar o no el objetivo
final, la obtencin de la MPI.
La etapa del Inculo, cuenta, a su vez, con la del pre-inculo que es obtenido a partir de la
siembra de un vial del BCT en un tubo con medio YPD, el cual es crecido en un roller a 28C
por 24 h, primero, y con lo cual despus es sembrado un Erlenmeyer y es crecido por otras
24 h en una zaranda orbital en un cuarto a 28C. Se incluye, cualquier crecimiento
adicional requerido en algn fermentador. Aqu las operaciones crticas son las referidas a
garantizar un vial del BCT fiable, y a la preparacin y esterilizacin del medio YPD, as
como garantizar el tiempo de cultivo, la agitacin y la temperatura durante el crecimiento
del inculo.
El BCT empleado en este trabajo fue elaborado y debidamente chequeado por Mansur y
col. [11], mientras que el resto de los elementos arriba mencionados se garantizan a
travs del cumplimiento de los protocolos elaborados y se chequean mediante
inspecciones peridicas que son realizadas por la Direccin de Aseguramiento de la
Calidad de la institucin a sus laboratorios de I+D, como parte de las buenas prcticas de
laboratorio vigentes.
La Disponibilidad Tcnica del Fermentador, se refiere a la fiabilidad de operacin del
equipo. Esta puede ser garantizada si se selecciona adecuadamente el fabricante y s se
asegura la correcta calificacin (IQ, OQ y PQ), y el cumplimiento de los programas de
52

mantenimiento y aseguramiento del fermentador, comnmente implementados por el

Grupo de Aseguramiento Ingeniero.
La Fase de Crecimiento, por su parte, cuenta con el Medio de Cultivo Batch y con las
Condiciones y Adiciones para el cultivo Batch. El medio de cultivo debe estar
correctamente balanceado y su preparacin y esterilizacin deben ser las adecuadas. Lo
primero se garantiza revisando crticamente los medios existentes y corrigiendo los
desbalances, excesos o dficits que puedan existir de alguno de los elementos que
componen el medio. La posterior preparacin y esterilizacin del medio puede
garantizarse con la adecuada calificacin del personal tcnico involucrado y la validacin
adecuada de la autoclave, todo lo cual debe ser garantizado por las buenas prcticas de
laboratorio vigentes y puede ser chequeado por el sistema de Aseguramiento de la
Calidad de la institucin. Por otra parte las condiciones de cultivo y las adiciones que
puedan hacrsele a ste deben ser determinadas experimentalmente, puesto que
dependen de la protena heterloga que se est expresando.
La Fase de Produccin tiene un comportamiento similar a la de la Fase de Crecimiento, con
la adicin del flujo de alimentacin de metanol, que sirve simultneamente como fuente
de carbono y de induccin, y con la peculiaridad de que en esta fase se sintetiza y secreta
al medio extracelular la MPI.
Para realizar la gestin del riesgo de la etapa de fermentacin por FMEA se sugiere definir
las escalas de severidad, ocurrencia y no-detectabilidad, desglosar el proceso de
fermentacin en sus eventos relevantes y completar la tabla de anlisis por FMEA y
calcular a partir de ella el RPN [157]. Se recomienda as mismo, cotejar los eventos en
dependencia de su RPN y analizar las posibles acciones ulteriores a tomar para minimizar
el riesgo y finalmente, documentar los resultados del anlisis y las decisiones que se
tomarn para disminuir o mitigar el riesgo [157].

53

En la Tabla 2 se presentan los rangos para la severidad, ocurrencia y no-detectabilidad que

se emplearn en este trabajo. Con los valores de los rangos de severidad ( ), ocurrencia
( ) y no-detectabilidad (

), se calcula en nmero de prioridad del riesgo (

), como el

producto de estos tres valores:

En el caso de inters, se observa que valor mximo de
es de 64 (

) y el menor es de 1 (

que puede alcanzar un evento

). Se tomar como umbral para el

anlisis aqullos eventos que superen el valor de

Tabla 2. Escalas de severidad, ocurrencia y detectabilidad utilizados en el anlisis FMEA.

Escala
Severidad (S)

Ocurrencia (O)

No-Detectabilidad (ND)

Valor
4
3
2
1
4
3
2
1
4
3
2
1

Definicin
Excede los lmites de las especificaciones
Excede otros lmites no especificados. Se investiga el caso
Se observa la tendencia, pero no se investigan las causas
Esta dentro de los rangos
Evento de alta ocurrencia, > 50% de las veces
Evento ocasional, >10% y 50% de las veces
Evento de baja frecuencia, >1% y 10% de las veces
Evento raro, 1% de las veces
No hay modo de realizar la deteccin
No se detecta hasta casi completarse el proceso en curso
Detectable durante el paso en curso
Detectable antes del comienzo del paso posterior

En la Tabla 3 se presentan los eventos adversos relevantes que pueden ocurrir durante el
40

100%

32

80%

proceso de fermentacin

RPN

24

RPN 7
94% del impacto
(mayor riesgo)

60%

16

40%

Porciento Acumulado, %

para la obtencin de la MPI

en P. pastoris. Estos eventos
se agruparon en aqullos
que partan de problemas

20%

con el inculo, en los que los

0

0%
3.4 3.3 2.3 2.4 2.5 2.1 2.2 3.1 1.5 1.1 1.2 1.6 1.3 3.2 1.4

problemas se relacionan con

Evento

Figura 6. Grfico de Pareto que muestra el nmero de prioridad de

riesgo (barras verticales, RPN) y porciento acumulado del RPN (lnea,
Porciento Acumulado) para los diversos eventos de la etapa
fermentativa de obtencin de la MPI en P. pastoris. La lnea discontinua
muestra el umbral de RPN 7.

54

la fase de crecimiento, o
aqullos que se asocian a la
fase de produccin de la

MPI. Los valores que adoptan la severidad, la ocurrencia y la no-detectabilidad se

asignaron como la moda de los valores asignados por tres expertos en el tema*****.
Con los resultados de los valores de RPN de la Tabla 3 se construye un grfico de Pareto
sealando los eventos y sus valores de RPN (Fig. 6).
Segn este anlisis, los eventos ms riesgosos para el atributo crtico de calidad (CQA) de
la MPI en la fase de la fermentacin en P. pastoris son:
Prdida del casete de expresin del vial del BCT (evento 1.1, Tabla 3)
Baja viabilidad del vial del BCT (evento 1.2, Tabla 3)
Contaminacin del medio YPD (evento 1.5 , Tabla 3)
Insuficiente calificacin del personal tcnico (evento 2.1, Tabla 3)
Desbalances en el medio basal salino inicial (evento 2.2, Tabla 3)
Deficiente esterilizacin del medio basal salino (evento 2.3, Tabla 3)
Baja disponibilidad tcnica del fermentador (evento 2.4, Tabla 3)
Inadecuada seleccin de los parmetros del proceso fermentativo (Batch) (evento
2.5, Tabla 3)
Desbalances en el medio de incremento (evento 3.1, Tabla 3)
Baja disponibilidad tcnica de la bomba de incremento (evento 3.3, Tabla 3)
Inadecuada seleccin de los parmetros del proceso fermentativo (Fed-batch)
(evento 3.4, Tabla 3)

*****

La encuesta se realiz de modo independiente, y en el caso en que fuesen diferentes los tres valores asignados al
mismo evento, se escogi el valor intermedio (N. del A.).

55

Tabla 3. Tabla del anlisis de riesgo segn la metodologa FMEA realizado al proceso de fermentacin de la MPI en P. pastoris.
Modo de Fallo
1. En el Inculo

2 En la Fase de Crecimiento

3 En la Fase de Produccin

Causa potenciales
1.1 Prdida del casete de expresin del vial del BCT
1.2 Baja viabilidad del vial del BCT
1.3 Contaminacin del vial del BCT
1.4 Insuficiente calificacin del personal de apoyo

S
4
4
3
3

O
1
1
2
1

ND
3
3
1
1

RPN
12
12
6
3

%
5,8
5,8
2,9
1,4

1.5 Contaminacin del medio YPD

12

5,8

1.6 Insuficiente crecimiento de los inculos

3,9

2.1 Insuficiente calificacin del personal tcnico

16

7,7

2.2 Desbalances en el medio basal salino inicial

12

5,8

2.3 Deficiente esterilizacin del medio basal salino

18

8,7

2.4 Baja disponibilidad tcnica* del fermentador

2.5 Inadecuada seleccin de los parmetros del proceso
fermentativo** (Batch)
3.1 Desbalances en el medio de incremento

4
4

2
2

2
2

16
16

7,7
7,8

12

5,8

3.2 Deficiente microfiltracin del medio de incremento

1,9

3.3 Baja disponibilidad tcnica* de la bomba de

incremento
3.4 Inadecuada seleccin de los parmetros del proceso
fermentativo** (Fed-Batch)

24

11,6

36

17,4

Consideraciones a tener en cuenta

Realizar Southern-Blot y Q-PCR
Chequeo visual en microscopio y placa control
Chequeo visual en microscopio y placa control
Calificar o recalificar al personal. Verificar
calificacin mediante pruebas y encuestas.
Verificar calificacin de los tcnicos, y la fiabilidad
de la autoclave
Verificar la preparacin del medio YPD, y la
fiabilidad del roller, la zaranda y el cuarto 28C
Calificar o recalificar al personal. Verificar
calificacin mediante pruebas y encuestas.
Verificar que se opere dentro del Espacio de Diseo
adecuado.
Verificar calificacin de los tcnicos, y la fiabilidad
de la autoclave
Verificar la fiabilidad del fermentador
Verificar que se opere dentro del Espacio de Diseo
adecuado.
Verificar que se opere dentro del Espacio de Diseo
adecuado.
Verificar calificacin de los tcnicos y de la
operacin de microfiltracin.
Verificar la fiabilidad de la bomba
Verificar que se opere dentro del Espacio de Diseo
adecuado.

Total 207
*Aqu se interpreta por disponibilidad tcnica al conjunto de acciones que permiten el correcto funcionamiento del equipo, e incluye las conocidas calificaciones de la instalacin,
la operacin y el desempeo del equipo, y adems, presupone que se tenga todos los elementos de aseguramiento de las buenas prcticas de ingeniera como son el programa de
calibracin y recalibracin, los mantenimientos generales y preventivos, el aseguramiento logstico, etc.
**Dentro de los parmetros del proceso se incluyen la seleccin de las condiciones de cultivo (temp., pH, agitacin, aireacin), as como el medio de cultivo y las adiciones que se
realicen durante el cultivo.

56

Al analizar en detalle los eventos de mayor riesgo, puede notarse que los riesgos de un grupo
de ellos (eventos 1.1, 1.2, 1.5, 2.1, 2.3, 2.4 y 3.3) pueden ser minimizados o controlado con el
adecuado cumplimiento de las buenas prcticas de laboratorio (GLP), de desarrollo (GDP) e
ingeniera (GEP) y pueden estar sometidos a la verificacin rutinaria por el Grupo de
Aseguramiento de la Calidad de la Institucin.
Por otro lado, existe un grupo de eventos (2.2, 2.5, 3.1 y 3.4), cuyos riesgos pueden ser
mitigados, si se garantiza que los mltiples parmetros del proceso fermentativo operen
dentro de ciertos lmites, conocido como espacio de diseo (DS). Puesto que cada protena
tiene sus peculiaridades, para encontrar el DS es preciso acudir a la experimentacin.
El trmino de condiciones de cultivo comprender aqu al espacio multidimensional formado
por los parmetros de cultivo: temperatura (T), pH, agitacin (N) y aireacin (Q, expresado
como la relacin entre el flujo volumtrico de aire por unidad de volumen de cultivo, VVM).
Este espacio, junto a las adiciones y su esquema de adicin conformarn los parmetros del
proceso fermentativo (Fig. A-4, Anexo).
En lo adelante se establecern los espacios del conocimiento y diseo, y se buscar dentro de
ste ltimo, el espacio de operacin de los parmetros del proceso fermentativo, dentro de
cuyo espacio, se garantizar los CQA de la MPI.
A continuacin se analizar en detalle la composicin del medio de cultivo inicial del proceso
fermentativo, con el objetivo de dar solucin a algunos de los inconvenientes que presenta el
medio de cultivo ms empleado en la actualidad, el medio BSM de Invitrogen, a pH 5 [94].
3.1.2 Antecedentes con el Clon M44 Productor de la Mini-proinsulina

El clon multicopia M44 con 5 copias del gen de expresin, fue el clon de partida para el
nuevo clonaje en el que se obtuvo, despus de realizar un chequeo de clones, el clon C27 de
11 copias [11].

57

Por compartir la misma maquinaria gentica, los resultados de la fermentacin del clon M44
fueron de mucha utilidad para establecer los parmetros de proceso crticos y el espacio de
diseo de stos para el clon C27.
Se observ que justo despus de la
induccin empezaba a producirse y
acumularse

la

MPI

en

el

sobrenadante de cultivo, pero que

alrededor de las 60 h de induccin el
proceso de acumulacin de la MPI
no
Figura 7. Perfiles de crecimiento (dos fermentaciones: ) y de
expresin de MPI () del clon M44 de P. pastoris.

slo

se

detena

sino

que

comenzaba un proceso de deterioro

de la MPI, muy probablemente

asociado al incremento de la actividad proteoltica extracelular en el cultivo, principalmente

al alcanzarse altas densidades celulares.
Los mejores resultados con este clon se obtuvieron al reducir la temperatura del cultivo por
debajo de los 28C y suplementando el cultivo con una fuente rica en aminocidos como el
hidrolizado de casena (HC). Esto permiti reducir la magnitud de la degradacin y extender
el cultivo hasta ms all de las 72 h de induccin (Fig. 7).
A pesar de la mejora, nunca se logr obtener valores de concentracin de la MPI superiores a
los 120 mgLS-1, valor insuficiente para intentar establecer un proceso de produccin de IH a
escala industrial.
3.1.3 Establecimiento del Medio Basal Salino Modificado (MBSM)

En la Tabla 4 se muestra el rango estudiado por Wegner [100] para cada elemento qumico
del medio de cultivo y los valores que adopta cada elemento en los medios BSM
(Invitrogen) [93], FM22 [99] y otro propuesto por Daugulis y col. [97, 98]. En la ltima
58

columna se presenta el valor que alcanza cada elemento en el medio basal salino modificado
(MBSM) empleado en este trabajo.
Tabla 4. Comparacin de los medios BSM [84], de Daugulis [88], FM22 [90] y el propuesto en el presente trabajo,
el medio MBSM, con el rango propuesto por Wegner [92].
Comp.
Wegner
BSM
Daugulis
FM22
MBSM
-1
Macro Elementos [gL ]
P
2,2 10,0
7,17
2,73
0,98
2,27
K
1,5 10,0
11,04
3,44
1,23
2,87
Mg
0,3 1,2
1,47
0,46
0,31
0,31
Ca
0,08 0,8
0,27
0,10
0,07
0,10
S
0,2 5,0
5,56
0,66
0,46
2,57
-1
Elementos Trazas [mgL ]
Fe
9,0 80,0
56,83
65,05
65,05
56,59
Zn
3,0 40,0
41,73
22,66
22,66
19,71
Cu
1,0 10,0
6,64
7,61
7,61
6,62
Mn
0,9 8,0
4,24
4,87
4,87
4,24
Na
0,22
0,95
0,95
0,83
I
0,29
1,61
1,61
1,40
Mo
0,35
1,98
1,98
1,72
B
0,015
0,09
0,09
0,08
Co
0,99
Cl
46,45
173,29
173,29
168,48
Control de NH4OH y
KOH y
NH4OH y
NH4OH y
pH
H3PO4
H3PO4
H3PO4
H3PO4

Como se aprecia en dicha tabla, para los medios BSM [93] y FM22 [99], determinados
elementos exceden o se quedan por debajo que los valores que recomienda Wegner [100],
mientras que para los medios propuestos por Daugulis [97] y el presente trabajo, todos los
elementos qumicos caen dentro del rango propuesto por Wegner. El MBSM es ms simple
que el propuesto por Daugulis, pues slo el azufre excede en el MBSM la cantidad que
adiciona Daugulis en su medio. Al igual que con el resto de los medios, con el MBSM se logra
alcanzar altas densidades celulares (>300 gL-1, base hmeda). Adems, en un amplio rango
de combinaciones de pH (entre pH 2,5 y 6,5) y temperaturas (entre 20 y 32C), no se observ
la formacin de ningn precipitado.
El MBSM propuesto aqu es relativamente ms sencillo que el resto de los medios con los
que se compara en la Tabla 4, y por ende, ms barato. Los elementos del MBSM al
combinarse dan un medio de composicin sencilla de preparar (Tabla 5).
El MBSM aprovecha al amonaco como elemento de regulacin de pH y a su vez como fuente
de nitrgeno, como lo hacen tambin los medios BSM y FM22. Adems, no se observ
59

cambios en el MBSM al ser suplementado con aditivos, como fuentes de aminocidos y

protenas, EDTA o diversas sales.
El MBSM ha sido empleado exitosamente para la expresin de otras protenas
recombinantes en P. pastoris, logrndose en todos los casos, altos niveles de crecimiento y
expresin de la protena de inters [200-202].
Tabla 5. Composicin del MBSM empleado en este trabajo.
Sustancia (Para 1 L)
Cantidad
C3H8O
50 g
KH2PO4
10 g
MgSO47H2O
3,2 g
CaCl22H2O
0,35 g
Sol. Trazas
4,3 mL
Sol. Vitaminas
2,5 mL
Sol. Trazas* (Para 1 L)
FeSO47H2O
65 g
CuSO45H2O
6g
ZnSO47H2O
20 g
MnSO4H2O
3g
KI
0,42 g
H3BO3
0,1 g
Na2MoO4 2H2O
1g
H2SO4 98% (v/v)
10 mL
Sol. Vitaminas* (Para 1 L)
pantotenato de calcio
0,8 g
myo-inositol
8g
dicloruro de tiamina
0,8 g
hidrocloruro de piridoxina
0,8 g
cido nicotnico
0,2 g
D(+)-biotina
0,8 g
K2HPO4
4g
* La solucin de sales trazas y la solucin de vitaminas se aaden antes de la
inoculacin y se preparan y esterilizan por separado, por filtracin estril a 0,2-m.

Seguidamente se analizar la influencia que pudieran ejercer las condiciones de cultivo (pH, T,
N, Q), las adiciones y suplementos realizados al cultivo, sobre la integridad de la molcula de
la MPI, que constituye el CQA del proceso de fermentacin.
3.1.4 Establecimiento del Espacio del Conocimiento y la Propuesta de
Espacio de Diseo

De los cuatro parmetros que componen las condiciones de cultivo, la agitacin y la aireacin
estn ntimamente relacionados con la transferencia de oxigeno. La transferencia de oxigeno
resulta vital para los cultivos aerbicos, y dada a su baja solubilidad en los medios acuosos,
resulta muy importante garantizar su suministro continuo, en especial para lograr cultivos de
60

altas densidades celulares (>300 gL-1, base hmeda). Los diseos estndares de
fermentadores de laboratorio que construyen los fabricantes actuales, avalados por dcadas
de experiencias y un intenso desarrollo, garantizan las velocidades de transferencia de
oxgeno requeridas que permiten a los cultivos alcanzar sus metas de crecimiento.
Como se corrobora ms adelante, la combinacin de agitacin-aireacin parece influir
principalmente sobre el crecimiento, pero no sobre la velocidad especfica de produccin de
MPI, ni su concentracin. Este fenmeno ha sido reportado para otras protenas expresadas
en este hospedero. Enfors y col. [203] compararon dos estrategias de cultivo fed-batch una
donde establecieron como reactivo limitante al oxgeno y otra, que empleaban la va
tradicional, limitando con metanol el cultivo, y observaron incrementos en la produccin de
la protena extracelular recombinante (-glucosidasa) cuando se compar la estrategia de
limitacin por oxgeno con la estrategia convencional. En el propio trabajo no se observ
diferencias apreciables en la actividad intracelular de la alcohol oxidasa entre ambas
estrategias [203, 204], lo que sugiere que dentro de ciertos lmites la concentracin de
oxgeno y con esta magnitud, los parmetros que la controlan, la agitacin y la aireacin, no
inciden de manera decisiva en la sntesis y secrecin de protenas heterlogas.
En lo que respecta a la temperatura y el pH, su influencia sobre la expresin de protenas
forneas en P. pastoris ha sido demostrada por numerosos reportes. De manera similar
ocurre con la adicin de fuentes ricas de pptidos y aminocidos, como el YE, HC y la
peptona; as como con la presencia en exceso del in amonio.
Segn se recomienda en los lineamientos de la ICH [138, 139, 143, 153], es necesario
establecer el rango o espacio donde se buscar encontrar los parmetros de operacin del
proceso fermentativo, estableciendo un rango ms amplio como espacio del conocimiento,
uno ms estrecho, llamado espacio de diseo. Y, dentro de ste ltimo, se buscar el espacio
de operacin (vea Fig. 3).

61

El espacio del conocimiento se estableci a partir de una revisin de numerosos reportes en

la literatura, mientras que para establecer el espacio de diseo es preciso conocer un poco
ms exhaustivamente las caractersticas de la protena de inters. En este sentido pudiera
establecerse un DoE, tipo factorial completo o fraccional, o recurrirse a experiencias previas
estrechamente relacionadas con la expresin de la protena de inters.
La seleccin del pH se establece teniendo en cuenta el punto isoelctrico (pI) de la MPI, la
cual segn modelos tericos debe tener un valor de pI 6,9. Por esa razn, no se utiliz
valores cercanos a pH 7. Se estableci un valor central a pH 5,1, a partir de trabajos y
experiencias previas realizadas con clones de menor nmero de copias que expresaban la
MPI [39], y otros dos niveles a 1,2 unidades de pH (los valores de pH 3,8 y pH 6,3).
Para seleccionar la temperatura se tuvo en cuenta trabajos previos relacionados con clones
de menor nmero de copias [39], que demostraban que la MPI se expresaba correctamente
a 28C aunque se observaba una disminucin de su acumulacin en el cultivo despus de las
60 h de induccin, lo que demostraba la presencia de proteasas extracelulares y la existencia
contrapuesta de dos cinticas, una de produccin de la MPI y otra de degradacin de la
misma por la presumible accin de las proteasas del hospedero. Esto, unido a los numerosos
reportes que existen sobre el empleo de temperaturas por debajo de los 25C para controlar
la accin de las proteasas del hospedero, sugiri inicialmente proponer como espacio de
diseo un rango entre los 20 y 28C (Tabla 6).
En cuanto a los suplementos y adiciones que permitan ejercer un mejor control sobre las
proteasas del hospedero que degradan a la MPI, se tuvo en cuenta la disponibilidad y la
seguridad de la fuente, partiendo del hecho de que si bien estos suplementos pueden
beneficiar la produccin de la MPI durante la fermentacin, posteriormente, durante las
etapas de purificacin, sus restos constituirn contaminantes que necesitan ser removidos.

Calculado on-line en el sitio http://www.embl-heidelberg.de/cgi/pi-wrapper.pl

62

Adicionalmente, pudiera existir preocupaciones desde el punto de vista regulatorio con la

adicin de fuentes ricas de pptidos y aminocidos de origen vacuno, como el hidrolizado de
casena (HC) y, en especial, la peptona bacteriolgica (Pept.), pues eventualmente dichas
fuentes pudieran estar contaminadas con priones u otros agentes adventicios. Por todas
estas razones se decidi explorar un conjunto de fuentes de nitrgeno como el sulfato de
amonio, el HC, el extracto de levadura (YE) y la YE + Pept.
Tabla 6. Espacio del Conocimiento y Espacio de Diseo Propuesto para la obtencin de la MPI por fermentacin
de P. pastoris.
Espacio del Conocimiento
Espacio de Diseo Propuesto
Parmetros
Min
Max
Referencia
Min
Max
Referencia
Condiciones de cultivo
Temperatura (C)
20
37
[35, 102]
20
28
[39]
pH
2,8
7,0
[35, 103]
3,8
6,3
[39, 205]
Materiales de Entrada
Medio Inicial
Rangos de Wegner
[100, 101]
MBSM, BSM, FM22, Tabla 4
Daugulis
[93, 97-99]
Fte. N orgnico
YE, HC, Pept., etc.
[29, 129]
YE, HC, YE+Pept.
Fte. N inorgnico
(NH4)2SO4, NH4OH
[105]
(NH4)2SO4, NH4OH
Otras adiciones
EDTA, cido oleico, inhib. [11, 104,
EDTA
proteasas
118, 132]

En cuanto a otras suplementos como el EDTA, sales y cidos orgnicos e inorgnicos,

inhibidores de proteasas, etc.; si bien constituyen una posibilidad demostrada a escala de
laboratorio, representan por su elevado costo (en especial los inhibidores de proteasas) una
opcin poco atractiva desde el punto de vista industrial [129]. De este conjunto se explorar
los beneficios del empleo del EDTA por ser un reconocido inhibidor de metalo-proteasas, y
adems porque posiblemente contribuya a evitar la agregacin de la MPI.
En la Tabla 6 se propone el espacio del conocimiento para el conjunto de variables que
componen los parmetros de la fermentacin de produccin de MPI en P. pastoris, dentro
del cual se propone otro espacio ms reducido el espacio de diseo propuesto, en donde se
explorar la existencia de un ptimo, dentro de una zona ms restringida conocida como
espacio de operacin.

63

3.1.5 Experimentos en los Fermentadores de 2,5 L

Con el objetivo de estudiar la influencia que ejerce sobre la cantidad y calidad de la MPI
secretada por P. pastoris la adicin de EDTA en el medio de cultivo, as como la temperatura
y el pH de la fermentacin se realiz un grupo de fermentaciones a escala de 2,5 L
empleando el medio MBSM suplementado con 10 gL-1 de HC.
3.1.5.1 Efecto de la Adicin del EDTA

La adicin de un agente quelante como el EDTA, es capaz de acomplejar los iones metlicos
divalentes y poseer un efecto inhibidor sobre las metaloproteasas, lo que puede favorecer la
expresin de la MPI (Fig. 8).
Al analizar tres parmetros importantes
como son la MPImx, la PT, y YPX
mximos, se tiene valores como los
mostrados en la Tabla 7. Si se adoptara
el mismo coeficiente de variacin de las
variantes con EDTA, para la variante
que no tuvo este aditivo, y se realizara
un ANOVA simple, se tendra que los
valores de la muestra con EDTA son
significativamente (p < 0,1) superiores a
los de la muestra sin EDTA,
Figura 8. Influencia del EDTA sobre la expresin de la MPI
en P. pastoris.

lo que

sugiere que la presencia del EDTA

mejora la expresin de la MPI en P. pastoris. En el resto de los experimentos de

fermentacin, por esta razn, se adicion este reactivo como parte del medio de cultivo.
Tabla 7. Valores mximos de la MPI, YPX y PT de los experimentos
realizados con y sin EDTA. *(Promedio desv. Estndar, n=2)
Corrida
Con Na2-EDTA*
Sin Na2-EDTA

MPImax[mg]
180,50 57,28
62,71

64

-1

YPX[mgg ]
0,349 0,071
0,135

-1

PT[mgh ]
1,134 0,371
0,565

Otros autores han reportado el efecto estabilizador del EDTA sobre las protenas heterlogas
[104] y el incremento de la porosidad de la membrana celular facilitando la secrecin en las
levaduras [136], que ejerce este aditivo, aunque esto ltimo no fue corroborado en este
trabajo. Adicionalmente, la presencia del EDTA, puede contribuir a disgregar los dmeros y
hexmeros de MPI, que eventualmente puedan formarse a altas concentraciones de MPI en
la ruta de secrecin de la levadura [135].
3.1.5.2 Influencia de la Temperatura

En la figura 9 se muestra las cinticas

de crecimiento y expresin de la MPI,
con diferentes temperaturas en la fase
productiva. Se observa que a las
temperaturas ms bajas se alcanzan las
expresiones mayores de la MPI.
Los valores alcanzados para la MPImx,
la PT y el YPX se muestran en la Tabla 8.
Puede notarse, que si se tomara el
mismo coeficiente de variacin de la
variante a 22C, para todos los
Figura 9. Influencia de la temperatura sobre la expresin de
MPI en P. pastoris. Experimentos realizados a pH 6,3.

experimentos;

un

ANOVA

simple

mostr que no existen diferencias significativas (p < 0,1) entre las temperaturas de 20 y 22C,
y s, entre stas y el experimento efectuado a 28C.
Tabla 8. Valores mximos de la MPI, YPX y PT de los experimentos
realizados a 20, 22 y 28C. *(Promedio desv. Estndar, n=2)
Corrida
A 22C*
A 20C
A 28C

MPImax[mg]
180,50 57,28
240,96
1,17

65

-1

YPX[mgg ]
0,349 0,071
0,455
0,004

-1

PT[mgh ]
1,134 0,371
1,446
0,019

Por esta razn, en lo sucesivo se decidi establecer como temperatura de cultivo los 22C.
Existen diversos reportes que sealan la conveniencia de realizar los cultivos por debajo de
los 30C en la fase productiva, sobre la base de que las temperaturas bajas favorecen ms
que las altas, la estabilidad de la protena heterloga [14, 33, 35, 102, 206] o sobre el efecto
benfico que ejerce la baja temperatura sobre la cintica de la degradacin por las proteasas
de la cepa hospedera [33]. Ms recientemente, Dragosits y col. [207] realizaron estudios de
protemica con una cepa recombinante de P. pastoris que expresa un anticuerpo Fab y
encontraron un incremento de tres veces en la productividad especfica a temperaturas de
20oC, al tiempo que disminua notablemente el flux al ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo
TCA), lo que sugieren un menor estrs en el plegamiento de la protena heterloga cuando se
cultivan a temperaturas cercanas a los 20oC.
Todo indica pues, que la temperatura de cultivo juega un papel importante en la presencia
de proteasas solubles en el medio de cultivo, puesto que la casi totalidad de los
experimentos realizados a temperatura reducida (20 o 22C), mostraron un nivel de actividad
proteoltica muy escaso o nulo.
3.1.5.3 Influencia del pH

El pH del cultivo tiene una influencia

importante sobre la expresin de
protenas heterlogas y la P. pastoris
puede tolerar un rango relativamente
amplio de valores desde muy cidos
hasta neutros sin cambios apreciables
en su crecimiento. Por esta razn se
realizaron experimentos donde se vari
el pH desde pH 5,1 hasta pH 3,8; pH 5,1
Figura 10. Influencia del pH sobre la expresin de la MPI en
P. pastoris. Experimentos realizados a 22C.

66

y pH 6,3. Como se observa en la figura 10, en todos los pH probados se observ expresin de
la MPI, aunque a valores de pH 6,3 se obtuvieron los mejores resultados. Al parecer los pH
elevados inciden favorablemente en la estabilidad de la molcula, favoreciendo la
conformacin monomrica de la MPI.
En la Tabla 9 se muestran los valores alcanzados para los valores mximos de la MPImx, la PT
y el YPX, observndose que los valores obtenidos a pH 6,3 son significativamente (p < 0,1)
superiores al resto, si se adoptara en todos los experimentos el mismo coeficiente de
variacin que el observado en los experimentos a pH 6,3.
Tabla 9. Valores de la MPI, YPX y PT de los experimentos realizados a
pH 3,8; 5,1 y 6,3. *(Promedio desv. Estndar, n=2).
Corrida
pH 6,3*
pH 3,8
pH 5,1

MPImax[mg]
180,50 57,28
63,48
87,51

-1

YPX[mgg ]
0,349 0,071
0,209
0,212

-1

PT[mgh ]
1,134 0,371
0,381
0,525

Por esta razn se estableci como mejor condicin la combinacin de 22C y pH 6,3; y
suplementando el medio con EDTA.
3.1.5.4 Influencia de la Fuente de
Nitrgeno

Todos los experimentos anteriores

fueron realizados suplementando el
medio de cultivo con hidrolizado de
casena (HC), que si bien es una fuente
compleja de composicin variable, se
tiene certeza de que proviene de la
casena de la leche, que es una
protena

bien

estudiada

caracterizada; y a pesar de provenir

Figura 11. Influencia de la fuente de Nitrgeno sobre la
expresin de la MPI en P. pastoris. Las flechas negras muestran
los momentos donde se adicion 50 mL de suplemento de
fuente de nitrgeno.

67

del ganado vacuno, existe un riesgo

muy bajo de que contenga los peligrosos priones [208]; todo lo cual hace que pueda ser
catalogada como segura. Sin embargo, existe la necesidad de explorar otras fuentes de
nitrgeno, que eventualmente puedan sustituir al HC y que puedan ser empleadas con los
mismos propsitos de contrarrestar el efecto de la degradacin proteoltica.
En el presente trabajo se realizaron experimentos donde no se suministr ninguna fuente
adicional de amonio, o se utiliz una de las siguientes combinaciones: HC, YE, YE+Pept. y
sulfato de amonio (Fig. 11).
La variante con mejores resultados fue aqulla en que se adicion sulfato de amonio
(C27F13), no slo desde el comienzo de la fermentacin (20 gL-1) sino que se le realizaron
cuatro adiciones de 50 mL durante la etapa de produccin.
Ghosalkar y col. [209] han obtenido los ms elevados crecimientos celulares, empleando
7,5 gL-1 de sulfato de amonio, en un medio completamente definido y teniendo como
objetivo la produccin de biomasa celular.
Al parecer, la levadura P. pastoris es capaz de resistir altas concentraciones de in amonio sin
que se afecte su capacidad secretora, a diferencia de los resultados obtenidos por MendozaVega y col. [129] en la expresin de hirudina en S. cerevisiae. Los valores de protena total del
cultivo, en cada una de las variantes examinadas, no mostr una diferencia apreciable entre
ellas, aumentando en la medida que aumentaba el tiempo de cultivo (vea la Fig. 13).
Al parecer, el exceso de in amonio slo parece incidir en la estabilidad de la MPI, al
interactuar con los sitios hidroflicos e hidrofbicos de la molcula. Todo indica que su exceso
desfavorece la agregacin de la MPI y tambin, pudiera inhibir la accin de proteasas de
membrana, asociadas a las clulas de levadura, y que aqu no han sido cuantificadas.
La ausencia total de una fuente externa de nitrgeno provoca, tal vez, cierto grado de
asociacin de la molcula MPI que logra ser disociada a su forma monomrica con el
aumento de temperatura, como ocurri en el experimento C27F23.

68

En los dos experimentos realizados con medio suplementado con YE+Pept., no se observ
expresin de MPI (Fig. 11). Todo indica que con la presencia de la peptona se induce la
expresin de proteasas en la levadura P. pastoris, pues en el experimento C27F25, se
obtuvieron valores de AP ms de 6 veces superiores que en el resto de los experimentos.
Cuando se aadieron como suplementos el HC o YE se observ que ambos ejercen un efecto
benfico sobre la expresin de MPI, aunque en el experimento con este ltimo una cada
significativa de la expresin se hizo apreciable despus de las 85 h de induccin.
En la Tabla 10 se muestra los valores alcanzados por la MPImx, la PT y el YPX, para las diversas
fuentes de nitrgeno analizadas. Puede notarse que existe diferencias significativas para la
MPImax y el YPX de las muestras suplementadas con HC y YE+Pept. (p < 0,10), y no existe tal
diferencia para la PT, lo que quizs est asociado al hecho del repunte inicial observado sobre
las 15 h de induccin en uno de los dos experimentos con YE+Pept. (Fig.11), que despus
decay sobre las 60 h de induccin.
Tabla 10. Valores de la MPI, YPX y PT de los experimentos realizados con diferentes
fuentes de Nitrgeno. *(Promedio desviacin Estndar, n=2).
Corrida
HC*
YE+Pept.*
YE
(NH4)2SO4
Nada

MPImax[mg]
180,50 57,28
25,95 32,52
171,66
383,24
266,02

-1

YPX[mgg ]
0,349 0,071
0,078 0,101
0,309
0,616
0,527

-1

PT[mgh ]
1,134 0,371
0,400 0,538
1,271
2,420
1,599

En la Tabla 11 y las figuras 12 y 13, se presentan los resultados obtenidos de doce

experimentos

AP [UA/mLmin]

0.80

C27F11
C27F12
C27F13
C27F14
C27F16
C27F23
C27F25
C27F08
C27F17
C27F24

0.60
0.40
0.20
0.00
-0.20
0

28

realizados

en

fermentadores de 2,5 L. Para la

etapa de crecimiento, se obtuvo un
rendimiento biomasa - sustrato
promedio de 1,55 0,16 g de
biomasa hmeda por gramo de

56

84
112
140
tind [h]
Figura 12. Perfil del comportamiento de la actividad proteoltica en glicerol. El tiempo de duracin de
el sobrenadante de cultivo en dependencia del tiempo de
induccin. Los experimentos no mostrados no tuvieron actividad esta etapa fue de 50,95 2,73 h y
proteoltica en ninguna de sus muestras.

69

se alcanz una velocidad especfica de crecimiento de 0,061 0,009 h -1; valor bajo, que se
cree asociado a las limitaciones existentes en la transferencia de O2.
En la figura 12 se observa que el

10,000

Prot. Total [mg]

experimento C27F16, el realizado a

1,000

28C, fue donde se detect una

significativa actividad proteoltica

100

(AP) en el sobrenadante de cultivo.

10
0

35

70

105

140

tind [h]
C27F09
C27F13
C27F23
Promedio

C27F10
C27F14
C27F24

C27F11
C27F15
C27F25

C27F12
C27F16
C27F27

Figura 13. Perfil de protenas totales en el sobrenadante del

medio de los experimentos a escala de 2,5-L.

Slo los experimentos llevados a

cabo

(C27F16)
YE+Pept

temperatura
y

con

constante

adiciones

(C27F25)

de

mostraron

valores apreciables de AP. En el resto de los experimentos mostrados slo se detect AP en

algunas de las muestras y en los experimentos C27F09, C27F10, C27F15 y C27F27 no se
observ AP en ninguna de las muestras.
En la figura 13 se muestra el perfil de protenas totales para las mismas muestras y
experimentos de la figura 12.
Tabla 11. Tabla resumen de los experimentos realizados a la escala de 2,5 L.
-1 a

Experim.

Tiempo [h]
Conc. Celular [gL ]
Inc. 1 Inc. 2 Fase 2
Inicial
Induc.
Final
C27F09
24,68 43,00
53,62
18,84 249,88 228,00
C27F10
24,62 43,00
53,77
18,84 281,25 288,00
C27F11
24,68 43,00
53,58
18,84 264,37 362,00
C27F12
24,13 37,95
48,52
12,88 270,17 390,50
C27F13
24,13 37,95
48,53
9,50 228,00 363,14
C27F14
24,12 37,95
48,53
12,75 265,50 407,50
C27F15
24,12 37,95
48,55
10,00 258,75 341,21
C27F16
24,12 37,97
48,57
9,25 241,67 279,29
C27F23
24,30 44,72
56,43
13,60 245,90 370,00
b
C27F24
24,23 44,72
50,28
15,20 200,60 323,75
C27F25
24,23 44,73
50,42
12,90 228,00 331,00
C27F27
24,78 45,10
50,62
16,70 217,80 303,50
c
Promedio
24,35 41,21
50,95
14,11
245,99 332,32
0,26 3,20
2,73
3,59
23,83 51,28
a
b
c
Base hmeda; Sin Na2-EDTA; Promedio Desviacin estndar

VFinal [L]

T [C]

pH

1.42
1.50
1.60
1.57
1.85
1.79
1.80
1.60
1.40
1.80
1.70
1.80
1.65
0.16

22
22
22
22
22
22
22
28
22
22
22
20

3,8
5,1
6,3
6,3
6,3
6,3
6,3
6,3
6,3
6,3
6,3
6,3

[MPI]mx
-1
[mgL ]
44,70
58.34
87.50
140,76
207,16
27,34
95,37
0,73
190,01
34,84
1,74
133,87

Al parecer temperaturas bajas o reducidas de cultivo desfavorecen la produccin de

proteasas extracelulares. No obstante no se pueden hacer conjeturas acerca de la ausencia
70

total de AP en dichos experimentos pues no se cuantific la actividad proteoltica a nivel

intracelular, ni la actividad asociada a la membrana de las clulas de levadura.
Estos resultados ratifican la ventaja de

207,5 91
190,0 84

300

efectuar la fermentacin con (NH4)2SO4 y

[MPI], mgL -1

240
180

adiciones peridicas que permitan cierto

113,9 50
95,4 42

exceso de iones amonio. En la figura 14 se

120
60

muestra la concentracin mxima que se

27,3 25

alcanz en los experimentos con diversas

fuentes de nitrgeno. Excepto para el caso de

Figura 14. Concentracin mxima obtenida en los

experimentos con diversas fuentes de Nitrgeno.

YE+Pept., los valores de concentracin

mxima resultaron ser similares entre s

(p<0,1), suponiendo el mismo coeficiente de variacin para los experimentos realizados con
YE, (NH4)2SO4 y Nada, que el obtenido para el experimento con HC. El valor obtenido con el
(NH4)2SO4 no difiere del previamente reportado por Mansur y col. [11].
3.1.5.5 Anlisis para el Establecimiento del Espacio de Diseo

Los resultados de todos los experimentos fueron analizados en su conjunto en relacin a los
tres parmetros de cultivo ya mencionados con los que se conform la matriz de los
experimentos en los fermentadores de 2,5 L (Tabla 12).
Con dichos resultados, se busca encontrar el modelo matemtico que mejor represente los
resultados experimentales [210, 211], para posteriormente, con el modelo obtenido, puede
buscarse la zona donde se optimice la funcin objetivo. sta ltima pudiera ser una variable
simple (rendimiento, productividad, etc.) o pudiera incluir a un grupo de variables [211].
Al analizar la Tabla 12 se observa que la relacin entre los valores mximos y mnimos de las
variables respuesta para la MPImax, YPX y PT exceden de 100 unidades (383,24/1,17 = 327,5;
0,614/0,004 = 153,5 y 2,420/0,019 = 127,4; respectivamente); mientras que para el

71

rendimiento total biomasa-sustrato (YXST) la relacin es igual a 2,218/1,700 = 1,3. Y puesto

que, para las variables respuestas MPImax, YPX y PT los valores de la relacin mx/mn son
mayores a las 10 unidades, se recomienda que dichas variables de respuesta deban ser
transformadas antes de ser procesadas para buscar el modelo del mejor ajuste [212].
Tabla 12. Variables respuesta de los experimentos ejecutados en los fermentadores de laboratorio.
Corrida
C27F09
C27F10
C27F11
C27F12
C27F13
C27F14
C27F15
C27F16
C27F23
C27F24
C27F25
C27F27

pH [A]
Real
Cod.
3,8
-1,00
5,1
0,04
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00
6,3
1,00

Temp.,C [B]
Real
Cod.
22,0
-0,50
22,0
-0,50
22,0
-0,50
22,0
-0,50
22,0
-0,50
22,0
-0,50
22,0
-0,50
28,0
1,00
22,0
-0,50
22,0
-0,50
22,0
-0,50
20,0
-1,00

Fte. N [C]
Real
Codificada
HC
(0 0 0 1)
HC
(0 0 0 1)
HC
(0 0 0 1)
HC
(0 0 0 1)
(NH4)2SO4
(0 1 0 0)
YE+Pept
(-1 -1 -1 -1)
YE
(0 0 1 0)
HC
(0 0 0 1)
Nada
(1 0 0 0)
HC
(0 0 0 1)
YE+Pept
(-1 -1 -1 -1)
HC
(0 0 0 1)

EDTA [D]
Real
Cod.
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
Si
(1)
No
(-1)
Si
(1)
Si
(1)

MPImax
[mg]
63,48
87,51
140,00
221,00
383,24
48,94
171,66
1,17
266,02
62,71
2,95
240,96

YPX
[mgg-1]
0,209
0,212
0,299
0,399
0,614
0,149
0,309
0,004
0,527
0,135
0,006
0,455

YXST
PT
[C-molC-mol-1] [mgh-1]
1,700
0,381
2,051
0,525
n.d.
0,872
2,148
1,396
1,937
2,420
2,218
0,780
2,074
1,271
1,879
0,019
2,003
1,599
1,786
0,565
2,042
0,019
1,902
1,446

Para transformar las variables respuestas se utiliz una transformacin de potencia, del tipo:
; donde

es la variable respuesta transformada,

respuesta sin transformar,

es el valor de la variable

y son las constantes del modelo de potencia.

Para determinar los valores de la potencia () se analiz la grfica de Box-Cox para cada
modelo, la cual sugiere el empleo de valores de

de 0,76; 1,05 y 0,81; para los modelos

transformados de la MPImax, YPX y PT, respectivamente (Fig. A-5, Anexo). Las constantes

en

los tres casos se adoptaron iguales a cero, pues su nico objetivo es no permitir que los
valores del modelo transformado se hagan cero, lo que no ocurre en ninguno de los casos.
En los tres casos la variable respuesta transformada se ajust a un modelo lineal, opcin que
result la recomendada por el programa en todos los casos.
Ec.(2)

Ec.(3)

Ec.(4)

En la Tabla 13, se muestra el anlisis de varianza (ANOVA) realizado. Un valor de F del

modelo de 13,61 implica que el modelo es significativo. Existe slo un 1,20% de oportunidad
72

de que el modelo exceda a estos valores debido al ruido. Trminos de Prob > F menores a
0,050 indican que dichos trminos son significativos (p > 95%), mientras que valores mayores
a 0,100 indican que los trminos no son significativos en el modelo. En este caso el pH [A], la
temperatura [B] y la fuente de nitrgeno [C] son trminos significativos en el modelo.
Tabla 13. Anlisis de Varianza (ANOVA) del modelo de la MPImax [ Ec.(2)].
Fuente
Suma de
Grados de Media cuadrada
Valor de F
cuadrados Libertad (dF)
Modelo
8377,93
7
1196,85
13,61
pH [A]
697,65
1
697,65
7,93
t [B]
2324,49
1
2324,49
26,43
Fte N [C]
5184,98
4
1296,25
14,74
EDTA [D]
547,69
1
547,69
6,23
Residuales
351,82
4
87,96
Falta de ajuste
50,65
2
25,33
0,17
Error Puro
301,17
2
150,58
Correl. Total
8729,76
11

Valor de p
Prob > F
0,0120
0,0480
0,0068
0,0116
0,0671
0,8560

El valor de F = 0,17 indica que la falta de ajuste no es significativa con respecto al error puro y
existe un 85,60% de oportunidad de que la falta de ajuste pudiera ser debida al ruido. Una
falta de ajuste no significativa es un resultado satisfactorio e indica que el modelo escogido
puede ser adecuado para ajustar los valores experimentales.
En la Tabla 14 se describen los coeficientes del modelo (Ec. (2)), as como el intervalo bajo y
alto de confianza (p > 0,95). El VIF indica en cuanto la varianza del modelo se ve inflada por la
falta de ortogonalidad en el diseo del experimento. Si el factor es ortogonal al resto de los
factores del modelo, el VIF es igual a 1,0; si el VIF excede a 10,0 significa que el factor
analizado est muy correlacionado con uno o ms del resto de los factores.
Tabla 14. Caractersticas del modelo transformado de la MPI max [Ec.(2)].
a
Trmino
Coeficiente
df
Error Estndar
95%-IC
del modelo
Bajo
Intercepto
10,77
1
9,43
-15,41
pH [A]
14,42
1
5,12
0,20
t [B]
-32,05
1
6,23
-49,36
C[1]
15,30
1
8,12
-7,26
C[2]
37,57
1
8,12
15,01
C[3]
-4,43
1
8,12
-26,98
C[4]
-4,84
1
5,20
-19,28
EDTA [D]
13,14
1
5,27
-1,48
Desv. Estndar:
Media:
Coef. Variacin:
a

9,38
39,88
23,51%

R =
R ajustada =
Adecuacin de la Precisin:

95%-IC
Alto
36,95
28,63
-14,74
37,85
60,13
18,13
9,60
27,77
0,9597
0,8892
11,817

Intervalo de confianza (IC); Factor de Inflacin de la Varianza (VIF, variance inflation factor).

73

VIF

1,25
1,07

1,16

Llama la atencin que en el presente caso, a pesar del limitado nmero de experimentos, los
valores del VIF no exceden mucho a la unidad y slo el pH, demuestra tener alguna
dependencia con el resto de los factores. La adecuacin de la precisin indica la relacin
entre la seal y el ruido. Una relacin superior a 4 es lo deseable.
El valor de esta relacin de 11,817 indica que la seal es adecuada y que este modelo es
adecuado para explorar dentro del espacio de diseo.
En la Tabla 15, se muestra el ANOVA realizado al modelo lineal de la respuesta transformada
de la YPX. Un valor de F del modelo de 12,81 implica que el modelo es significativo, existiendo
slo un 1,34% de probabilidad de que el modelo exceda a estos valores debido al ruido. En
este caso la temperatura [B] y la fuente de N [C] son trminos significativos en el modelo (p >
95%), mientras que el pH [A] y el EDTA [D] lo fuesen pero con p > 90%.
Tabla 15. ANOVA del modelo de la YPX [Ec.(3)].
Fuente
Suma de
Grados de
cuadrados Libertad (dF)
Modelo
0,38
7
pH [A]
0,020
1
t [B]
0,10
1
Fte N [C]
0,24
4
EDTA [D]
0,032
1
Residuales
0,017
4
-3
Falta de ajuste
3,57910
2
Error Puro
0,014
2
Correl. Total
0,40
11

Media cuadrada
0,055
0,020
0,10
0,060
0,032
-3
4,27310
-3
1,79010
-3
6,75610

Valor de F
12,81
4,70
24,38
14,06
7,48
0,26

Valor de p
Prob > F
0,0134
0,0960
0,0078
0,0126
0,0522
0,7906

El valor de F = 0,26 indica que la falta de ajuste no es significativa con respecto al error puro y
existe >79% de oportunidad de que la falta de ajuste pudiera ser debida al ruido, indicando
que el modelo escogido puede ser adecuado para ajustar los valores experimentales.
En la Tabla 16 se describen los coeficientes del modelo (Ec. (3)), as como el intervalo bajo y
alto de confianza para un 95% de probabilidad. En el presente caso, de acuerdo al VIF,
nuevamente slo el pH, demuestra tener alguna dependencia con el resto de los factores.
Un valor de la Adecuacin de la Precisin de 11,221 indica que este modelo puede ser
utilizado para explorar dentro de su espacio para encontrar posibles valores ptimos.

74

Tabla 16. Caractersticas del modelo transformado de la Y PX [Ec.(3)].

a
Trmino
Coeficiente
df
Error Estndar
95%-IC
del modelo
Bajo
Intercepto
0,074
1
0,066
-0,11
pH [A]
0,077
1
0,036
-0,022
t [B]
-0,21
1
0,043
-0,34
-3
C[1]
0,15
1
0,057
-5,31910
C[2]
0,24
1
0,057
0,084
C[3]
-0,067
1
0,057
-0,22
C[4]
-0,036
1
0,036
-0,14
-3
EDTA [D]
0,10
1
0,037
-1,54110
Desv. Estndar: 0,065
R =
Media: 0,26
R ajustada =
Coef. Variacin: 24,86%
Adecuacin de la Precisin:
a
b
Intervalo de confianza (IC); Factor de Inflacin de la Varianza (VIF).

95%-IC
Alto
0,26
0,18
-14,74
0,31
0,40
0,090
0,064
0,20

VIF

1,25
1,07

1,16

0,9573
0,8826
11,221

Otra de las respuestas analizadas fue el rendimiento total biomasa-sustrato. Aqu por
haberse utilizado para el crecimiento dos fuentes de carbono diferentes (glicerol y metanol),
se expres como la suma de los rendimientos biomasa-glicerol ms biomasa-metanol, y
ambos expresados en C-mol de biomasa por C-mol de sustrato. Aqu se tom una frmula
molecular para la biomasa: CH1,8O0,5N0,2 y un peso molecular de 25,8 gC-mol-1 (base seca)
como sugiere Roels [213], y como la relacin base seca/base hmeda se tom el valor
experimental 0,269. Al analizar esta respuesta se observa que en el espacio experimental
analizado el valor es constante e igual a 1,98 0,11 C-mol C-mol-1, lo que indica que todos
los experimentos tuvieron un crecimiento que no difiere apreciablemente uno de otro.
En la Tabla 17 se muestra el ANOVA realizado al modelo lineal de la respuesta transformada
de la productividad total PT. Un valor de F del modelo de 5,07 implica que el modelo es
significativo, y existe menos de un 5% de probabilidad de que el modelo exceda a estos
valores debido al ruido. Para este caso la temperatura [B] es el nico trmino claramente
significativo en el modelo.
Tabla 17. ANOVA del modelo de la PT [Ec. (4)].
Fuente
Suma de
Grados de
cuadrados Libertad (dF)
Modelo
3,39
6
pH [A]
0,27
1
t [B]
0,92
1
Fte N [C]
2,00
4
Residuales
0,56
5
Falta de ajuste
0,17
3
Error Puro
0,39
2
Correl. Total
3,95
11

75

Media cuadrada
0,57
0,27
0,92
0,50
0,11
0,056
0,19

Valor de F
5,07
2,45
8,21
4,48

Valor de p
Prob > F
0,0477
0,1782
0,0352
0,0656

0,29

0,8336

En la Tabla 18 se describen los coeficientes del modelo (ver Ec.(4)), notndose de acuerdo al
VIF, que nuevamente slo el pH, demuestra tener alguna dependencia con el resto de los
factores analizados. Una Adecuacin de la Precisin de 7,963 indica que que el modelo es
adecuado para explorar dentro de su espacio en la bsqueda de ptimos. Ntese que para la
productividad total, el modelo propuesto no incluye a la variable D (EDTA).
Tabla 18. Caractersticas del modelo transformado de la P T [Ec. (4)].
a
Trmino
Coeficiente
df Error Estndar
95%-IC
del modelo
Bajo
Intercepto
0,63
1
0,24
0,014
pH [A]
0,28
1
0,18
-0,18
t [B]
-0,63
1
0,22
-1,19
C[1]
0,24
1
0,29
-0,50
C[2]
0,82
1
0,29
0,081
-3
C[3]
-7,62510
1
0,29
-0,75
C[4]
-0,26
1
0,17
-0,71
Desv. Estndar: 0,33
R =
Media: 0,90
R ajustada =
Coef. Variacin: 36,91%
Adecuacin de la Precisin:
a
b
Intervalo de confianza (IC); Factor de Inflacin de la Varianza (VIF).

95%-IC
Alto
1,25
0,73
-0,065
0,98
1,57
0,73
0,19

VIF

1,17
1,05

0,8588
0,6894
7,963

En las figuras A-5 y A-6 de los Anexos, se muestran la grfica normal de los residuos y la
relacin entre los valores experimentales y del modelo, para los tres modelos (Ecs.(2)-(4)), y
se observa, que los modelos ajustan adecuadamente los valores experimentales.
Al analizar los modelos de la MPImax,YPX y PT se nota que la temperatura (B) y el (NH4)2SO4
(C[2]) constituyen los factores ms influyentes en los tres modelos (Tablas 14, 16 y 18).
Estos modelos permiten buscar, dentro de ellos, las condiciones de los factores con los cuales
se pueda maximizar la variable respuesta. Dado que los tres modelos, como se vi resultan
adecuados para estos fines, puede escogerse uno de ellos, dos o los tres a la vez, para
encontrar las condiciones ptimas dentro de las condiciones experimentales analizadas.
En el caso que se combinen varias respuestas, surge cierta respuesta deseable, en forma de
funcin, en la que se combinan varias de las respuestas analizadas [210]. Esta funcin ha sido
utilizada con xito en numerosos problemas multivariados con varias respuestas, en lo que se
desea es encontrar un ptimo dentro de un conjunto de respuestas [210, 211].
La funcin de deseabilidad

[211]se puede definir como:

76

Donde

MPImax, YPX y PT (Ecs. (2-4));

constituyen las respuestas transformadas de las respuestas de

,

son los factores de importancia relativa de cada

respuesta transformada en la funcin de deseabilidad.

En la prctica sera ms beneficioso acotar el problema escogiendo un escenario donde de
antemano se fije como fuente de nitrgeno al sulfato de amonio y se incluya la adicin del
EDTA; y se explore el espacio donde se maximice la funcin de deseabilidad (funcin D).
El sulfato de amonio se prefiere por encima del resto de las fuentes, por dos razones,
primero porque al tratarse de una sustancia definida se puede tener la certeza de su
composicin qumica. Esto no es as para las fuentes ricas de aminocidos como el YE, la
Peptona y el HC, donde los fabricantes de estas fuentes slo brindan anlisis promedios de
sus composiciones, las cuales estan sujetas a las variaciones lgicas de la composicin de los
productos provenientes de fuentes naturales. La peptona bacteriolgica y el HC tienen el
inconveniente adicional de provenir del ganado vacuno, y unido a ello existe la preocupacin
sobre la posible contaminacion de estas fuentes con los priones causantes de las mortferas
enfermedades de las vacas locas (encefalopata espongiforme bovina), trasmisible a
humanos, y del mal de CreutzfeldtJakob. Sin embargo, entre estas dos fuentes provenientes
del ganado vacuno, el HC, que especficamente proviene de la casena de la leche tiene un
innegable menor riesgo de contagio con los priones, en comparacin con la peptona que es
un derivado de los tejidos del animal [208, 214, 215]. En segundo lugar, el sulfato de amonio
supera al resto de las fuentes de nitrgeno en cuanto a precio, lo que redunda
favorablemente en la economa del proceso. Mientras que en el caso del EDTA, su presencia
pudiera contribuir a evitar la posible agregacin de la MPI a elevadas concentraciones.
En la Tabla 19 se muestran las condiciones empleadas en la funcin D. En este caso se busca
maximizar la cantidad de MPI, su productividad y el rendimiento producto-biomasa. Se le
77

asign niveles de importancia de 5, 3, 1 para las tres respuestas antes mencionadas, lo que le
confiere a estas respuestas niveles de importancia alta, media y baja, respectivamente.
Tabla 19. Condiciones de contorno empleadas
ptimas de la funcin de deseabilidad (Ec.(4)).
Nombre
Objetivo
Lmite bajo
pH
En rango
3,8
T
En rango
20
Fte. N
Igual a:
(NH4)2SO4
EDTA
Igual a:
Si
Maximizar
1,129
Maximizar
0,0032
Maximizar
0,0396

para encontrar las condiciones

Lmite alto
6,3
28

91,927
0,5997
2,0458

Importancia
3
3
3
3
5
1
3

Para estas condiciones se encontr 13 soluciones (Tabla 20). Al analizar los valores de la
Tabla se observ que la temperatura ptima se encuentra entre los 20 y 22C.
Tabla 20. Soluciones encontradas en la que se busca maximizar la funcin D, formada por las
respuestas: la cantidad de MPI (i=5), la productividad (i=3) y el rendimiento producto-biomasa (i=1).
#Soluc. pH
t [C]
Fte. N
EDTA
D
1
6,3 22,00 (NH4)2SO4
Si
91,927
0,600
2,046
1,000
2
5,0 20,07 (NH4)2SO4
Si
92,753
0,625
2,070
1,000
3
5,5 20,38 (NH4)2SO4
Si
95,209
0,634
2,115
1,000
4
5,8 20,16 (NH4)2SO4
Si
100,828
0,667
2,224
1,000
5
5,7 20,19 (NH4)2SO4
Si
99,131
0,658
2,191
1,000
6
5,3 20,25 (NH4)2SO4
Si
94,763
0,633
2,107
1,000
7
5,2 20,35 (NH4)2SO4
Si
92,373
0,620
2,061
1,000
8
6,0 21,31 (NH4)2SO4
Si
93,717
0,617
2,083
1,000
9
6,0 20,55 (NH4)2SO4
Si
99,771
0,657
2,202
1,000
10
5,9 20,13 (NH4)2SO4
Si
102,845
0,678
2,262
1,000
11
6,1 20,83 (NH4)2SO4
Si
99,145
0,651
2,189
1,000
12
5,8 20,64 (NH4)2SO4
Si
97,390
0,643
2,156
1,000
13
6,2 21,45 (NH4)2SO4
Si
95,148
0,623
2,110
1,000

En la figura 15 se muestran las grficas de contorno y en 3-D de la funcin de deseabilidad. Se

puede apreciar que la isolnea de deseabilidad igual a uno intercepta la ordenada del pH en
los valores de pH 4,9 para t = 20C y pH 6,3 para t = 22C. Este hecho conlleva a que se pueda
seleccionar como espacio de operacin, una combinacin de pH y temperatura, tales que la
funcin de deseabilidad sea mxima (e igual a uno).
La temperatura de operacin podr adoptar valores en el rango estrecho de temperaturas
de:
temperatura (

y el pH adoptar valores que caigan entre cierta funcin, lineal con la

), y el valor mximo probado:

78

Zona de
deseabilidad
mxima

Figura 15. (A) Grfico de contorno y (B) en 3-D de la funcin de deseabilidad analizada.

En este particular, habra que decir que puesto que no se explor en detalle a valores
superiores de pH, en realidad no se conoce con certeza el comportamiento del cultivo, en la
zona entre

(recordar que pI terico estimado para la MPI es pI 6,9).

Experimentos futuros, podran explorar en esta zona y ampliar el espacio de diseo, para
buscar dentro de l, valores de pH que resulten ms ventajosos para la funcin de
deseabilidad. Sin embargo, experimentos realizados con otros clones de P. pastoris que
expresan la MPI a pH 6,5 no mostraron precipitacin de la protena (resultado no mostrado).
Los resultados y anlisis de los experimentos realizados a escala de laboratorio en los
fermentadores de 2,5 L permiten ajustar el espacio de diseo inicialmente sugerido y
proponer el espacio de operacin para ser establecido en las escalas subsiguientes.
En la Tabla 21 se muestran estos espacios. Ntese que se restringi el espacio de diseo
propuesto originalmente (vea la Tabla 6), eliminando a la peptona bacteriolgica y el medio
FM22 [99].
Tabla 21. Espacio de Diseo y Espacio de Operacin escogidos para la produccin a escala de laboratorio
de la MPI en la levadura P. pastoris.
Espacio de Diseo
Espacio de Operacin
Parmetros
Min
Max
Min
Max
Observacin
Temperatura (C)
20
28
20
22
Tabla 12
pH
3,8
6,3
4,9
6,3
Medio Inicial
BSM, Daugulis, MBSM
MBSM
Tabla 5
Fte. N orgnico
con/sin YE, HC
Fte. N inorgnico
con/sin (NH4)2SO4,
(NH4)2SO4,
Tabla 12
NH4OH (control pH)
NH4OH (control pH)
Otras adiciones
con/sin EDTA
EDTA

79

Con la adicin de YE+Pept. (5 gL-1 YE + 10 gL-1 Pept.) se increment los niveles de actividad
proteoltica en el sobrenadantes de cultivo (Fig. 12), trayendo como resultado una pobre
respuesta en la expresin de la MPI. Este hecho ms las posibles imputaciones regulatorias
por su empleo, inclinaron la decisin de eliminarlo del espacio de diseo original. En cuanto
al medio FM22 [99], se elimin del espacio de diseo por los dficits notados en su
composicin de potasio y calcio, respecto a los rangos de Wegner [100], y porque con su
empleo se not menores crecimientos de la levadura que los obtenidos con el empleo del
medio MBSM sugerido en este trabajo (resultado no mostrado).
3.1.6 Experimentos en el Fermentador de 14 L

En este caso, a una escala 10 veces mayor que la anterior, se dispuso de un fermentador
equipado con una sonda de oxgeno disuelto y la posibilidad de medir la composicin del
oxgeno y el dixido de carbono en los gases de salida (EA-O2 y EA-CO2). Adems, se le
incorpor una lnea directa de suministro de O2 puro (>99,5%), capaz de suplementar con O2
la lnea de adicin de aire.
En los experimentos, se mantuvo los niveles de oxgeno disuelto (DO) por encima del 25%, y
en correspondencia se fue manipulando manualmente, primero, la agitacin del
fermentador, segundo, el flujo de aire, y finalmente, el flujo de metanol en la fase
productiva. Un esquema similar, pero automtico, ha sido empleado con xito en la
expresin y secrecin de otras protenas heterlogas en P. pastoris [94].
Con el objetivo de comprobar en la nueva escala la influencia del pH y la temperatura del
cultivo sobre la expresin e integridad de la MPI, se concibi un experimento en que vari la
temperatura y el pH durante la fermentacin.
En la figura 16 se muestra la grfica de las cinticas de crecimiento y expresin de la MPI del
experimento No.1 realizado en el fermentador de 14 L (C27F08), donde se altern periodos
donde se control la temperatura del cultivo (a 28C en la fase de crecimiento y a 22C en la
fase productiva), con periodos donde se dej fuera de control esta variable.
80

Producto del calor metablico durante los perodos en que no se control la temperatura del
cultivo, sta se increment hasta valores entre los 29 y 34C. Luego de lo cual se activ
nuevamente el sistema de control y se restableca la temperatura de control (28 o 22C).
En la etapa de crecimiento en glicerol se
alcanz 375,64 gL-1 de biomasa hmeda,
para un rendimiento biomasa-glicerol igual
a 2,21 C-molC-mol-1, valor superior a la
media de los valores obtenidos en los
fermentadores de 2,5 L que fue de 1,82
0,14 C-molC-mol-1, lo que pudiera ser
atribuido a un mejor control de la
transferencia de O2 existente en el
fermentador de 14 L, lograda gracias a la
existencia de un adecuado lazo de control,
con la posibilidad de enriquecer con
oxgeno el aire de suministro, unido a
niveles mayores de agitacin y aireacin,
que

propician

mejores

coeficientes

volumtricos de transferencia de oxgeno.

En la fase de produccin, se impuso un
Figura 16. Resultado del experimento No.1 (C27F08) a
escala piloto en el fermentador de 14 L.

flujo constante de adicin de medio con

metanol de 109 mLh-1, valor superior al recomendado por Invitrogen [93], a pesar de lo cual,
no se detect acumulacin ni de etanol ni de metanol en el medio de cultivo, en muestras
analizadas por cromatografa gaseosa (resultado no mostrado).
Alrededor de las 92 h de induccin, ante el declive en la concentracin de MPI en el medio,
se baj bruscamente a pH 3, mantenindolo por unas 14 h, con el objetivo de inactivar las
81

proteasas del medio, detectadas en la muestra tomada a las 60 h de induccin (muestra

C27F08 en la Fig. 12). La accin, sin embargo, no logr evitar la casi completa degradacin de
la MPI, a pesar de que la actividad proteoltica extracelular en las muestras de cultivo casi
desapareci despus de efectuado el shock de pH (Fig. 12), lo que posiblemente est
asociado a la accin degradativa que ejercen las proteasas de la levadura sobre la MPI.
Las manipulaciones realizadas sobre la temperatura y el pH no afectaron el crecimiento del
cultivo, el cual alcanz > 400 gL-1 (base hmeda) de densidad celular.
Sin embargo, el experimento No.1 demostr que la temperatura de cultivo juega un rol
primordial en el control de la actividad proteoltica. Adicionalmente, se comprob que la
manipulacin del pH ejerce pocos resultados para revertir la accin degradante de las
proteasas del hospedero, puesto que al parecer resulta ineficaz para evitar la degradacin
ejercida por las proteasas intracelulares y de membrana.
Este fenmeno ha sido reportado por diferentes autores [91, 105, 108, 133, 134] en la
expresin de protenas forneas en P. pastoris, los cuales sealan como a pesar de que los
cultivos continan su crecimiento, se deja de acumular la protena secretada en el
sobrenadante de cultivo.
Con estas premisas se ejecut el experimento No.2 (C27F17), en el cual la temperatura se
mantuvo en 22C durante toda la fase productiva (Fig. 17), en el que se logr un valor
mximo de 460,1 mgLs-1 de MPI a las 128,8 h de induccin.
En la fase de crecimiento se alcanz una densidad celular de 350,0 gL-1 (en base hmeda),
alcanzando un rendimiento biomasa-glicerol de 1,95 C-molC-mol-1, menor que en el
experimento No. 1, aunque an mayor que la media de los experimentos realizados en los
fermentadores de 2,5 L.

82

Al comenzar la induccin se impuso un flujo constante de adicin de medio con metanol

menor que el empleado en el experimento No. 1, de 61 mLh -1, aunque mayor al flujo
recomendado por Invitrogen [93] para el fenotipo MutS que es de 48 mLh-1. En este caso,
tampoco se detect ni metanol, ni etanol, en ninguna de las muestras.
Sin embargo, al suministrar un flujo menor,
A

se logr que prcticamente no cayera la

concentracin de oxgeno disuelto por
debajo del 25% durante todo el cultivo y no
fuese necesario, por tanto, enriquecer el

aire alimentado con oxgeno puro.

En este experimento se consumi 7,2 L de
metanol,

logrndose

un

rendimiento

biomasa-substrato total de 2,04 C-molCC

mol-1, similar al promedio obtenido en los

fermentadores de 2,5 L (1,98 0,11 CmolC-mol-1),

lo

que

sugiere

que

el

crecimiento celular se comport de manera

D

similar en ambas escalas.

Las condiciones probadas fueron replicadas
en otros dos experimentos, donde se
obtuvo resultados similares de crecimiento
y expresin (Fig. 17D).
Al parecer, la combinacin ms efectiva

Figura 17. Resultado del experimento No.2 (C27F17) y

sus rplicas (Exp. No.3 y No.4) realizados en el
fermentador de 14 L. De (A) a (C): perfiles de DO, O2,
CO2, N, VF y de la t y el pH, tpicos de estos experimentos.
(D) Perfiles de crecimiento, concentracin y cantidad de
MPI de los tres experimentos realizados en el
fermentador de 14 L.

83

para favorecer la expresin de MPI en este

clon de P. pastoris, es aqulla, en que se
logre comenzar la fase productiva con

concentraciones celulares altas, y en las que se tenga un sistema que garantice la

temperatura, el pH, y el oxgeno disuelto adecuados (22C, pH 6,3 y DO > 25%) y en donde los
flujos de adicin de metanol sean los mnimos requeridos como para lograr dirigir el flux de
metanol a las rutas anablicas de sntesis y menos hacia el metabolismo energtico [14, 190].
Los experimentos realizados confirman la validez de los espacios de diseo y operacin
propuestos en la escala de laboratorio (Tabla 21) y sugieren que puedan ser implementados
en el escalado del proceso de produccin de MPI.

3.2 Caracterizacin de la Mini-proinsulina

Con el objetivo de conocer si la MPI obtenida dentro del espacio de diseo propuesto cumple
con los atributos crticos de calidad de la MPI, se caracteriz la molcula obtenida en los
experimentos realizados en los fermentadores de 2,5 y 14 L.
3.2.1 Anlisis por Tricina-SDS-PAGE y Western-blot

La MPI fue observada y su talla aproximada se comprob al aplicarse y separarse las

1

9 10

protenas de las muestras finales de los

experimentos realizados en los fermentadores de
2,5 L (excepto en el experimento C27F15 que se
escogi la penltima muestra), en un gel de

Figura 18. Tricina-SDS-PAGE de muestras de los

experimentos de los fermentadores de 2,5 L.
Carriles 1-10: Muestras finales de los experimentos
C27F09, C27F10, C27F12, C27F13, C27F15, C27F16,
C27F23, C27F24, C27F25 y C27F27.

poliacrilamida para bajo peso molecular (Fig. 18).

En la figura 19, se presenta un anlisis por
Tricina-SDS-PAGE del experimento C27F13. Los

experimentos realizados en el fermentador de 14 L, C27F17 y C27F08, tambin fueron

analizados por Tricina-SDS-PAGE y los resultados se muestran en las figuras 20 y 21A.

84

En el Western-blot mostrado en la figura 21B, pueden

observarse bandas por encima de la MPI, que pudieran
representar isomerizaciones de la MPI o que se est
secretando junto a la MPI, la pro-factor--MPI, por
Figura 19. Tricina-SDS-PAGE del C27F17
revelado por tincin inversa. PM: Marcador
de prot. BioLabs (6-175 kDa). Carril 1: 4-L
er
del 1 Estndar Intern. reducido. Carriles 26: 4-L a los tiempos de induccin: 0; 39,2;
59,8; 82,6 y 131,9 h. Carril 7: 4-L de
muestra final C27F13. Carril 8: 4-L de MPI
repurificada por RP-HPLC. Carril 9: 4-L de
+
control negativo GS115(pAO815) His .

incapacidad de la enzima anloga a la KEX2 de la P.

pastoris, de procesar correctamente el pro-Factor- en
su paso a travs de la ruta de secrecin de la levadura.
Kjeldesen y col. [9], reportaron en su estudio que no
observaron ni retencin intracelular de

10

la MPI, ni la presencia del pro-factor-MPI, en la expresin de la MPI (B1-29AAK-A) en P. pastoris, en un estudio

comparativo entre esta levadura y la S.
Figura 20. Tricina-SDS-PAGE del C27F13. Carriles 1-6: 4 L
Muestras a tiempos de induccin: 0; 14,2; 62,2; 86,4; 109,9
y 117,3 h; Carril 7: 4 L de MPI repurificado por HPLC-RP
er
semiprep.; Carril 8: 4 L-1 Estndar Intern. 1986,
er
reducido; Carril 9: 4 L-1 Estndar Intern. 1986, sin
reducir; Carril 10: 4-L de ferm. negativo GS115(pAO815)
+
His .
1

10

cerevisiae. Este hecho, segn explica

puede demostrar una mayor capacidad
secretora
3

o
5

una
6

ms
8

eficiente
10

Figura 21. (A) Tricina -SDS-PAGE del experimento C27F08 revelado por tincin inversa. (B) Western-blot.
Carriles 1-7: 4-L de sobrenad. a los tiempos de induccin: 0; 39,2; 59,8; 75,3; 82,6; 90,3 y 131,9 h. Carriles
er
-1
8 y 9: 4-L del 1 Estndar Intern. (0,5 gL ). Carril 10: 4-L de sobrenad. cepa control negativo
+
GS115(pAO815) His .

degradacin vacuolar de la MPI en la P. pastoris.

Finalmente, no se observa ni degradacin de la molcula ni procesamiento parcial por
enzimas del hospedero, pues no se aprecian bandas por debajo de la MPI.
85

3.2.2 Repurificacin de las Muestras Colectadas de los Experimentos de

Fermentacin

En los cromatogramas de la cuantificacin de la MPI, se observ que los tiempos de

retencin de la MPI diferan de un experimento a otro, correspondiendo un valor de 47,67
2,41 min para los experimentos en los fermentadores de 2,5 L y 48,1 3,7 min para los
experimentos en el fermentador de 14 L.
A pesar de la dispersin observada en los tiempos de retencin de la MPI, en los diferentes
experimentos, la cual puede estar motivada por las condiciones dismiles de pH, fuerza inica
y temperatura, en que transcurrieron los experimentos, stos se colectaron en un recipiente
nico. Despus de separarle el acetonitrilo y el cido trifluoroactico en el Speed-Vac, se
aplic nuevamente una muestra de 100 L, en una columna C18 analtica. En la figura 22 se
muestra el cromatograma obtenido donde se
puede
MPI

observar

un

pico

nico

IH

correspondiente con la MPI, demostrndose

que

las

muestras

colectadas

de

los

experimentos de fermentacin, a pesar de las

pequeas diferencias observadas en los

tiempos de retencin, correspondan a la

a

misma especie molecular.

0

10
a)
b)

20
insulina
insulina

30
Pai
Pai

40

50

Retention Time (min)

Vial 1 Inj 1 std - Channel
Vial 1 Inj 1 std - Channel

60

70

80

1
1

Figura 22. Cromatogramas de C18 RP-HPLC de la

er
MPI (seal superior) e IH (1 Estndar Intern. 1986,
seal inferior). Los tiempos de retencin fueron de
46 y 51 min, para la MPI y la IH, respectivamente.

Este hecho demuestra que dentro del espacio

de diseo originalmente propuesto para el

proceso fermentativo en los que se condujeron los experimentos en los fermentadores de

laboratorio de 2,5 L y piloto de 14 L, se obtiene una especie molecular homognea, la cual
sugiere que se trata del precursor corto de la insulina humana, la MPI.

86

En los siguientes acpites del presente trabajo se demuestra que la molcula colectada y
repurificada se trata nicamente de la MPI y que con ella puede obtenerse la IH-r.
3.2.3 Conversin Enzimtica

La cintica del tratamiento enzimtico de la MPI con tripsina y CpB, hasta los 40 min de
iniciada la reaccin se muestra en la figura 23A, destacndose tres fracciones que fueron
colectadas y analizadas.
En el instante cero de la reaccin, aparece la seal de la MPI (fraccin 1) y se observa como a
medida que aumenta el tiempo de exposicin a las enzimas, la intensidad de sta disminuye,
a medida que aparecen 2 nuevas seales (fraccin 2 y 3), a un tiempo de retencin mayor. La
seal correspondiente a la fraccin 2 de mayor intensidad que la de la fraccin 3.
Esto hace suponer, que la fraccin 2, sea el precursor intermedio de IH de 2 cadenas, el
B1-30R-A [36], y que la fraccin 3 corresponda a la molcula de insulina en formacin.
Quedando bien definidas a los 40 min, las seales de las fracciones 1, 2 y 3, las que fueron
colectadas y luego caracterizadas por espectrometra de masas (figura 23B). Apareciendo en
la fraccin 1 la MPI (B1-30-KR-A), en la fraccin 2: dos especies no deseadas: el precursor
intermedio BRA (B1-30R-A) y la des-treonina B1-29R-A, especie sta que presenta la cadena B
sin la treonina C-terminal, y la insulina (B1-30A). Y en la fraccin 3, contiene la insulina (B1-30A)
y la des-treonina insulina (B1-29A). Pudindose observar que la fraccin 3 es la que contiene
mayoritariamente al producto de inters (IH, masa molecular terica 5804,63 Da).

87

B
65

100

0 m in

B1-30-K-R-A
6071.093
(6070.82)

Fraction 1

65

51

80

51

100

23

37

60

5
-

41

46

51

23

40

20

Gradient [%B]

Intensity [mV]

37

%
6072.403

-5
65

0
0

10

20 30 40 50 60
10 m in
Retention tim e [m in]

70

80

mass

5400

100

5600

5800

80

23

37

60

5
-

41

46

51

23

40

B1-30---A
-- (HI)
5804.565
(5804.63)

B1-29---R-A
-5859.836
(5859.68)

20

-5
65 0

10

20 30 40 50 60
40 m in
Retention tim e [m in]
1

65

51

70

0
80 100

23

37

60

5
-

41

46

51

23

40

20

mass

5400

5600

5800

6000

6200

6000

6200

B1-30---A
-- (HI)
5804.708
(5804.63)

Fraction 3

80

51

37

Intensity [mV]

100

Gradient [%B]

Intensity [mV]

37

Gradient [%B]

51

6200

B1-30---R-A
-5960.664
(5960.73)

Fraction 2

65

51

6000

100

B1-29---A
-5703.779
(5803.63)
%

-5

5806.350

0
0

10

20

30

40

50

60

70

5807.013
5701.669

80
0

Retention tim e [m in]

5400

mass
5600

5800

Figura 23. Conversin enzimtica de la MPI a IH-r. (A) Cintica del tratamiento enzimtico hasta los 40 min de
reaccin, seguida por el perfil cromatogrfico en una columna C18 analtica RP-HPLC. (B) Espectros ESI de las 3
fracciones separadas por RP-HPLC (los valores de las masas son monoisotpicos y corresponden a los iones
+
moleculares protonados MH ). Entre parntesis aparecen los valores de masa tericos.

La presencia de la des-treonina insulina (B1-29A) debe su existencia a la frecuente

contaminacin de la CpB con carboxipeptidasa A (CpA) [36]. Esto puede evitarse, purificando
la CpB por cromatografa de afinidad o por intercambio inico. Adems de existir la
alternativa de la adicin de inhibidores de CpA, tales como: cidoamino-n-caprnico o
carbobenzoxiglicina para digerir la mezcla. En el caso de la tripsina es una enzima bien
caracterizada disponible en elevada pureza.
3.2.4 Caracterizacin por Espectrometra de Masas

Dos muestras de 1,5 mL de los experimentos en el fermentador de 14 L, No.1 (C27F08) a las

59,8 h de induccin, y No.2 (C27F17) a las 128,8 h de induccin, fueron mezcladas y
88

desecadas en el Speed-Vac y posteriormente aplicadas a una columna de fase reversa C8

semipreparativa, colectndose la seal resultante (Fig. 24) obtenida a un tiempo de
retencin de 42 min.

850

800

750

MPI

700

650

Despus de concentrar la muestra, se someti a

600

( m V )

550

una digestin con la serinoproteasa de S. aureus

I n t e n s i t y

500

450

400

350

V8 (endoproteinasa Glu-C). Los productos de tal

300

250

200

150

digestin despus de ser desalados en un ZipTip

100

50
a
b

10
a)
b)

20
insulina
insulina

30
Pai
Pai

40

Retention Time
Vial 1 Inj 1 std
Vial 1 Inj 1 std

50
(min)
- Channel
- Channel

60

70

80

1
1

Figura 24. Perfil cromatogrfico C8 de la muestra

mezclada de C27F08 (59,8 h de ind.) y C27F17
(128,8 h de ind.) (lnea roja) y de la muestra final
de la fermentacin negativa, GS115 (pAO815)
+
His (lnea amarilla).

fueron aplicados en un EM hbrido con geometra

ortogonal QTOF-2.
En la figura 25A se muestra el espectro de masas

obtenido para la mezcla de pptidos derivados de la digestin proteoltica con

endoproteinasa Glu-C. Como se observa la digestin no ocurri totalmente, pues an
aparecen seales de la protena intacta.

Masa molecular
Observada 6069.80
Calculada 6069.82

MiniproIns

Diferencia: 0.02
Error: 0.0003%

p1p3
p1
p3
3+

p3

p2

3+

p1

p1

p1p3

4+

2+

p3

4+
6+

p2

5+

p3

2+

Figura 25. (A) Espectro de masas de la digestin de la MPI con endoproteinasa Glu-C, (B) Espectro de masas
deconvolucionado que muestra las masas moleculares de las especies presentes.

Esto permiti determinar la masa molecular de la MPI con muy buena exactitud, 6069,80 Da
(terica 6069,82 Da). Los pptidos cubren la secuencia completa de la protena (Tabla 22).
En la figura 25B aparece el espectro de masas deconvolucionado. Los valores de masas
detectados coinciden con los esperados para las cinco especies mayoritarias detectadas. No
se encontraron seales de pptidos conteniendo los puentes disulfuros incorrectamente
89

formados. Las seales minoritarias que aparecen en la figura 25B parecen corresponder a
cortes inespecficos de la enzima. Las seales 1377,58 Da y 689,29 Da permiten demostrar la
formacin correcta de los puentes disulfuros entre las cistenas 19 y 52 (Cys B19 CysA20) (ver
Fig. A-2, Anexo).
Tabla 22. Secuencia de los pptidos de la digestin de la MPI con endoproteinasa Glu-C
y las masas obtenidas experimentalmente y las masas esperadas (tericas).
Secuencias
Asignacin
m/z
m/z terica,
experimental,
Da (carga)
Da (carga)
p1
2968,28 (1+)
2968,31 (1+)
1484,66 (2+)
1484,66 (2+)
990,10 (3+)
990,11 (3+)
742,82 (4+)
742,83 (4+)
p2
1377,58 (1+)
1377,58 (1+)
689,29 (2+)
689,29 (2+)
p3
RGFFYTPKTKRGIVE

p1p3

1798,97 (1+)
900,00 (2+)
600,33 (3+)
450,49 (4+)
792,21 (6+)
950,45 (5+)

1799,00 (1+)
900,00 (2+)
600,34 (3+)
450,51 (4+)
792,21 (6+)
950,46 (5+)

Se intent determinar la localizacin de los puentes disulfuros restantes por disociacin

inducida por colisiones y por digestin con aminopeptidasa M, pero no se alcanzaron
resultados concluyentes. Kjeldsen y col. [1], tampoco pudieron dar solucin a este problema.
Por ltimo una muestra de la mezcla de la MPI, Tripsina y CpB a los 40 min de la digestin
enzimtica (Fig.24) fue analizada por EM. Antes la muestra fue reducida por DTT (ditiotreitol)
y bloqueadas sus cistenas, y posteriormente fue desecada por ZipTip y aplicada a un nanocapilar, con lo cual se obtuvo los espectrogramas de las cadenas A y B de la IH. Estas cadenas
fueron completamente secuenciadas, corroborndose que pertenecen a la secuencia
esperada de la IH (Fig. 26). Estos resultados demuestran que la secuencia de la MPI es la
correcta y corresponde con la secuencia esperada. Se logr demostrar que la MPI expresada
poda ser convertida a IH por la accin combinada de la Tripsina y la CpB. Adicionalmente, la
la actividad biolgica de la IH-r obtenida por el clon C27 de P. pastoris fue confirmada por
Mansur y col. [11] por un ensayo de convulsin en ratones Balb/c, segn recomienda la
Pharmacopea Britnica [216].
90

100

100

1178.818

858.594

1186.827 1188.078

1177.796

1179.126

1175.445

m/z
1176

1178

1180

1182

1184

1186

1188

1190

1014.047
833.083
859.342

686.868
666.659 687.469
579.050

425.056
0
400

100

500

600

821.576

700

900

1000

1100

1200

1192

1194

1196

RA1-21
1269.952 (2+)

1216.859
1144.133
1014.874
1145.1301217.659
1011.109
1110.447

884.105

800

1193.398
1195.061

1189.751
1186.448
1183.878

1180.737

858.842

A1-21
1191.905 (2+)

1187.656
1187.052
1187.867

1178.454

858.342

1187.445

x77

1520.836

1300

1400

m/z

1500

x4

B1-30
3428.338

MPI reducida
6076.256

B1-23
2543.990

B1-29
3327.300

B1-24

B1-25

2538.8952691.056 2838.106
3281.286
2023.840

3531.398
3984.432
4113.975

5998.337
4681.8654953.012 5140.754 5556.157
5676.253

6077.169
6477.291
mass

2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 5800 6000 6200 6400

Espectros de masas ESI (A) y deconvolucionado (B) de la miniproinsulina luego de 40 min de tratamiento con
tripsina/CpB. La protena fu previamente reducida con DTT.
100

Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

m/z 858.34 (4+)

226.186

<F>

1123.583

120.147

L V

y
1095.578

446.292
200

400

G, I

626.351

600

800

1000

Y
V

1200

SGC

1648.947
2094.146
1781.016
1965.123

1400

Q, N

1600

1800

2000

2200

2400

2940.606
2803.608
2690.518
3050.778
3281.821

2600

2800

3000

3200

3400

mass

Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN m/z 1192.00 (2+)

E

(G, E, R) G

2193.289

Y
S

755.350

236.094278.138
%

V C

2306.3452571.975
2443.427

513.202

877.4261047.633

100

L A

3182.804

1464.808
1335.740

y
0

1535.844

1236.657

345.243

A L

1046.516
883.417

399.161

133.115

642.259
136.135

381.143

1016.493

229.135
87.118 153.046

555.228
733.337
471.208
623.278

357.178

834.389921.450
999.512

1319.679
1349.635

1114.573

1246.613
1350.776

1500.756
1549.837

mass
100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

Secuenciacin mediante ESI-MS/MS de las cadenas A (abajo) y B (arriba) de la Insulina Humana obtenida por
conversin enzimtica de la MPI recombinante.

Figura 26. Anlisis por EM de una muestra de MPI incubada por 40 min con Tripsina y CpB. (A) Espectro de masa
ESI; (B) Espectro deconvolucionado; (C) Seceuenciacin de las cadenas B (superior) y A (inferior) de la IH-r.

91

3.3 Anlisis de Factibilidad Econmica de la Produccin

de Insulina Recombinante en los pases de La
Alianza Bolivariana para las Amricas (ALBA)
En la dcada de los 90 del siglo pasado, en el CIGB se desarroll una construccin en E. coli
que tena la ventaja de no requerir el uso del CNBr (sumamente txico) para separar el
extremo N-terminal de la protena [69]. El proceso se llev hasta el final a escala de
laboratorio y tena como desventaja la necesidad de mantener una relativamente baja
concentracin de la molcula durante el plegamiento, lo que dificulta el escalado de la
tecnologa hasta los niveles de produccin necesarios para satisfacer la demanda nacional de
aquel entonces, de unos 30 kg IHao-1.
Existen algunos trabajos precedentes donde se realizan estudios de factibilidad econmica
de la produccin de IH-r [217, 218], incluido uno realizado por el fallecido Dr. Enrquez [219]
del CIGB, donde se analizaba la variante de proinsulina e interleucina fusionada, construccin
realizada por Castellanos y col. [69] del CIGB. Estos trabajos analizan, en todos los casos
tecnologas que emplean a la E. coli como hospedero en la sntesis de la IH-r.
El objetivo de este acpite es realizar un estudio actualizado sobre la factibilidad de la
produccin de la IH-r en las condiciones del ALBA, utilizando el clon C27 que expresa a la MPI
en la levadura metilotrfica P. pastoris.
3.3.1 Algunas Consideraciones sobre el Mercado Mundial, Regional y
Nacional de la Insulina Humana

La insulina es uno de los frmacos que presenta un desarrollo ms dinmico en la actualidad.

El mercado de insulina a escala mundial creci de US$ 2-500 a US$ 4-000 millones en el
periodo 1998-2005.

State of the Science & Strategic Opportunities, http://www.bioportfolio.com/cgi-bin/

92

La demanda mundial en el ao 2000 fue fijada en el rango de 15 25 ton IH al ao y se

considera que es un mercado que posee un crecimiento anual de entre 2-6% [217, 218]. Se
sabe, sin embargo, que la distribucin de la demanda no es homognea alrededor del mundo
y que pases ms desarrollados aportan valores de crecimientos mayores. El acceso al
frmaco se ve limitado en muchos pases subdesarrollados, bsicamente por problemas de
costo y disponibilidad [16].
El precio de venta de la insulina vara en dependencia de la regin y las caractersticas de los
mercados [19]. El precio promedio de un vial de 10 mL con 100 UImL-1 vara desde los
US$4,30 - US$4,50 para algunos pases de frica, el Mediterrneo y Medio Oriente [16, 19],
hasta los US$50,0 en algunas regiones de los EEUU [21].
Por estas razones, la mayora de los pacientes insulino-dependientes que residen en los
llamados pases en vas de desarrollo reciben este medicamento a precios subsidiados, por
donaciones caritativas obtenidas por organizaciones filantrpicas, Organizaciones No
Gubernamentales, personalidades, etc.
En el ao 2003 la compaa danesa Novo Nordisk A/K implement una iniciativa para
suministrar este producto a los 50 pases, clasificados por la ONU, como los ms pobres del
mundo, a precios que no superaran el 20% de valor a que se comercializa la insulina en
Norteamrica, Europa y Japn [220]. Con esta iniciativa se ha paliado en parte las
necesidades de al menos 19 000 diabticos de tipo 1 en esos pases, y las entidades pblicas
de dos de los pases, como Mozambique y Zambia, por ejemplo, han recibido el vial de 10 mL
con 100 UImL-1 a US$4,30 y US$4,60, respectivamente [19].
En Cuba, en el 2001 y 2002 se consumi 660 y 720 millones de Unidades Internacionales
(MUI), respectivamente. Esto represent un crecimiento de 9% de un ao a otro. Para el
ao 2008, se consuma en Cuba unos 34 kg IH (980 MUI).

93

En el ao 2002, la empresa Novo Nordisk A/K ofreci a Cuba, en el marco de un acuerdo de

transferencia de tecnologa, un precio preferencial del IFA de alrededor de US$ 3 000MUI -1,
y ya para el ao 2005, se acord un nuevo precio (vigente por 10 aos) de US$ 4 100MUI-1
(Dr. Arturo Toledo Rivero, comunicacin personal). Si se le adiciona el costo de la
formulacin y el envase, el valor del bulbo de 10 mL con 100 UImL-1 rondara los US$ 4,50.
Segn un estudio realizado por la IDF [4], se pronostica para este ao unos 2,9 millones de
diabticos, de entre 20 y 79 aos, dentro de los pases miembros del ALBA, y alrededor de
4,7 millones para el 2030, lo que representa un crecimiento promedio del 66% (Fig. 27).

Figura 27. Cantidad estimada de pacientes con DM entre 20-79 aos, entre los pases del ALBA y entre
parntesis la tasa de crecimiento 2010/2030 [4].

Llama la atencin que la tasa ms baja estimada de incremento de la enfermedad la tiene

Cuba, con slo un 26%, la que quizs est asociada a la baja natalidad existente en los
ltimos aos, mientras que en Nicaragua, otros de los pases del ALBA, se prev que casi se
duplique la cantidad de pacientes con DM en el mismo perodo.
Para estimar la cantidad necesaria de insulina se parti de la informacin disponible en la IDF
[4]. Primero se determin la cantidad total de diabticos dentro de todos los pases del ALBA,

Informacin obtenida en junio del 2010 del Dr. Arturo Toledo Rivero, especialista en Gestin de la Calidad del Centro
de Inmunologa Molecular (CIM), quien fuera Jefe de Investigacin y Desarrollo de LIORAD (La Habana, Cuba), entre los
aos 1991-2007.

94

buscando los comprendidos entre 0-14 aos, y a stos se les sum 1/3 de esa propia
cantidad (aproximadamente los pacientes diabticos entre los 15-19 aos), ms toda la
poblacin restante de diabticos que se encuentran entre los 20-79 aos (Fig. 27 y Tabla A-2
del Anexo).
Para estimar la cantidad de insulina requerida se consider el indicador de
0,55 UIpaciente-1kg-1da-1, suponiendo que el peso promedio del grupo de pacientes de 014 es de 30 kg, y de 65,1 kg****** para el resto de los pacientes. La cantidad de insulina
necesaria, expresada en bulbos de 10 mL con 100 UImL-1 (lo que representa 1 000 UI por
bulbo) para cada pas miembro del ALBA, se determina como la suma de la cantidad de
insulina requerida para el 100% de los pacientes de 0-19 aos, ms el 10% (para el Escenario
No.1) o el 20% (para el Escenario No.2) de los pacientes de 20-79 aos:

Donde:

- diabticos de los grupos de edades de 0-14, 15-19 y de 20-

79 aos, datos obtenidos del IDF [4] para cada pas;

10 mL a 100 UImL-1, bbosao-1;

- es la cantidad anual de bulbos de

- es el porciento de cobertura.

En el Escenario No.1 se garantiza la cobertura a todos los diabticos tipo 1 (DMID), mientras
que en el Escenario No.2 se adiciona a la cifra anterior, un 10% de los diabticos tipo 2
(DMNID). La Ec. (6) fue empleada por la firma de estudios de mercado IMS Health para
demostrar que la cobertura de insulina por regiones slo era garantizada para Europa y
Norteamrica [18].
Con esta expresin y los datos reportados por el IDF [4], se estim la cantidad de bulbos
requeridos dentro de los ocho pases que forman el ALBA para ambos escenarios (Fig. 28).

******

Es el peso corporal de un cubano promedio, segn el Anuario Estadstico de Cuba, del 2007.

95

Puede observarse que para el 2025, los pases del ALBA demandarn en su conjunto
alrededor de 5,51 millones de bulbos de 10 mL con 1 000 UI en el Escenario No.1 u 11
millones de bulbos, segn el
estimado del Escenario No.2.
Para el Escenario No.1, la
demanda perspectiva de Cuba
en el 2025 es de 1,42 millones
de bulbos (Fig.28), mientras
que

alcanzara

los

2,83

-1

Figura 28. Cantidad de viales de 10 mL a 100 UImL requeridos dentro

de cada uno de los pases del ALBA, segn el Escenario No.1.

millones de bulbos, si se

adoptara el Escenario No.2 (no mostrado).

En un posible escenario inversionista se pudiera prever la

DMA
ATG

construccin de tres plantas similares, cada una con una

capacidad de produccin nominal de 2 millones de bulbos

VCT

CUB

al ao (Fig. 29), que erigidas en tres de los pases del ALBA

NIC

(Venezuela, Cuba y Ecuador), permitieran satisfacer la

VEN
BOL

ECU

Figura 29. Propuesta de Localizacin

de las tres plantas de produccin de IH
de 2 millones de bulbos anuales.

demanda estimada, de este vital frmaco para todos los

pases del bloque. La planta de Cuba, suministrara el
producto a los miembros caribeos del ALBA y en parte a
Nicaragua; la de Ecuador garantizara el producto a los

pases andinos miembros del ALBA y contribuira con el suministro a Nicaragua y Venezuela;
mientras que la planta de Venezuela, se dedicara fundamentalmente a satisfacer su
demanda interna.
La inversin en tres plantas idnticas tiene como ventaja, que se abaratan los costos de
proyecto (pues seran similares las etapas de ingeniera conceptual y bsica, y muy parecidas
la etapa de ingeniera de detalle), se pudieran tener rebajas sustanciales de los
96

suministradores de equipos y sistemas tecnolgicos, todo lo cual reduce los costos de

inversin. Adicionalmente, ya en la etapa de operacin de las plantas, al poseer similares
tecnologas, se facilita la transferencia del know-how productivo entre los equipos tcnicos,
facilitando la introduccin rpida de cualquier mejora tecnolgica.
Estas tres plantas, pudieran formar una empresa Gran-Nacional la cual posibilitara
suministrar a un precio significativamente ms bajo que el existente en el mercado, toda la
insulina requerida por los pacientes diabticos del ALBA. Las cantidades que excedan a la
demanda del ALBA pudieran ser comercializadas entre los pases de la regin no miembros
del ALBA, a un precio solidario, significativamente menor que a los que se encuentran en el
mercado mundial, y con cuyas ventas se amortizara una parte de la inversin.
3.3.2 Descripcin y Dimensionamiento de los Equipos del Proceso
Propuesto

En la figura A-8, del Anexo, se representa el diagrama del flujo de proceso (DFP) que se
propone para la produccin del ingrediente farmacutico activo (IFA) de la tecnologa de
produccin de IH-r a partir de la levadura P. pastoris [39]. El proceso que se describir a
continuacin tiene cinco etapas, que se nombran por ese orden: Etapa de Fermentacin y
Cosecha, Etapa de Captura y Concentracin de la MPI, Etapa de Tratamiento Enzimtico,
Etapa de Purificacin Final y la Etapa de Cristalizacin.
3.3.2.1 Etapa de Fermentacin y Cosecha

A partir de un vial del Banco de Clulas de Trabajo que se almacena a 70C se estran dos
placas con un medio slido selectivo como el conocido YNB por unas 72-96 h en un cuarto de
incubacin a 28C. Una vez crecidas las colonias se siembran 5 x 1 L Erlenmeyers con MBSM
suplementado con 5 gL-1 YE que se incubarn a 28C por 12 h en zaranda a 150-200 rpm.

En contraposicin con las Transnacionales, las empresas Gran-Nacionales que propone el ALBA tienen un
marcado sentido social, solidario y humano para nuestros pueblos.

97

Una vez crecidos los Erlenmeyers se chequearn microbiolgicamente antes de inocular el

fermentador de inoculacin.
Para la P. pastoris la fermentacin durar 100 h, que incluir unas 30 h en su etapa de
crecimiento en glicerol y alrededor de 66 h en su fase de produccin, creciendo y expresando
a la MPI en metanol. En las restantes 4 h se vaciar el contenido de la fermentacin hacia el o
los tanques de cosecha y se limpiar el fermentador de produccin in situ de acuerdo a un
protocolo pre-establecido y aprobado.
A partir de estos datos es posible calcular el volumen de fermentacin requerido para
satisfacer la demanda. La cantidad total anual de IH-r que se puede lograr ser igual a:

Donde

es la cantidad anual de IH-r producida (kg IH);

(kg IHkg MPI-1);

(kg MPI(m sobr.)-3);

es el recobrado global del proceso

es la concentracin de MPI en el sobrenadante de cultivo

es la relacin entre el volumen de sobrenadante (libre de clulas)

y el volumen total de cultivo (m3 sobr.(m cult.)-3),

es el volumen total de cultivo (m3 cult.) y

NL es el nmero de lotes anuales tiles (Lotesao-1).

Este valor debe ser al menos igual a la demanda, de modo que

, de

donde se puede calcular el volumen mnimo necesario de fermentacin por lote:

En la figura 30 se muestra cmo vara el volumen necesario de fermentacin con el

incremento de la concentracin de MPI en el sobrenadante de cultivo para capacidades de
produccin de 2 y 6 millones de bulbos al ao. Se sealan los volmenes efectivos de
fermentacin por lotes para una concentracin de 0,46 gLs-1 (460 mg MPILs-1, concentracin
similar a la obtenida en el fermentador de 14 L). Para una planta de 2 x 106 de bulbos anuales

98

se requerir un volumen de 25 m3 por semana, lo cual puede ser logrado con diversos
esquemas (1x25 m3, 2x12,5 m3, 4x6,25 m3 o 5x5 m3, etc.). El esquema ms adecuado, debe
sopesar adecuadamente todos estos elementos, minimizando alguna funcin de costo
durante la vida til o maximizando la ganancia esperada, como ha sido propuesto por
Simpson y col. [221].
Para un fermentadores de
produccin 5 m3 se emplearn
fermentadores de pre-inculo e
inculo desechables de 0,05 y
0,5 m, los cuales abaratan
considerablemente el costo de
inversin (el costo de los
Figura 30. Dependencia entre el volumen efectivo de fermentacin por
lote necesario y la concentracin de MPI en el sobrenadante.

fermentadores

excede

por

mucho al del resto de los

equipos) y que ya se emplean con xito en los cultivos microbianos [222].

Para el esquema formado por cinco fermentadores de produccin de 5 m3 (5 x 5 m3); lo que
permitira que se montasen y se explotasen escalonadamente a lo largo de la semana, se
contar con dos fermentadores desechables de inculo de 0,5 m3 y otros dos de 0,05 m3 de
pre-inculo. stos ltimos, considerando que operen cada 24 h, entregando el inculo
requerido para la subsiguiente escala. Cada fermentador de 0,05 m3 sera inoculado con 5 L
de inculo proveniente de Erlenmeyers incubados en una zaranda orbital a 28C.
El proceso fermentativo se pudiera organizar de modo tal que se escalonasen las cosechas,
para lograr conformar sub-lotes de 5 m3 de caldo fermentativo, aprovechando el hecho de
que la duracin de ninguna de las operaciones de purificacin excede de 24 h.

99

A precios del ao 1990, un fermentador de 7,5 m3, completamente automatizado, costaba

unos US$ 750-000 [223]. Los ndices de costo de equipos (chemical engineering plant cost
index, CEPCI) para los aos 1990 y enero del 2010 son 357,6 y 532,9, respectivamente; de
modo que el costo actual estimado de uno de estos fermentadores en la actualidad es de:
.
Para los fermentadores de pre-inculo e inculo se pueden emplear las variantes
desechables [222]. A partir de precios reportados para el ao 2005, para fermentadores
desechables de 20 y 200 L, que costaban US$80 000 y US$200 000 [184], y conociendo que el
costo y el volumen del fermentador tienen una relacin de potencia (

, donde

a = US$24 286 y b = 0,398) se pudo extrapolar para estimar el costo de fermentadores

desechables de 75 y 750 L, de US$ 135 369 y US$ 338 423. Estos ltimos valores fueron
actualizados para el 2010 (CEPCI2005 de 468,2), dando valores actuales de US$ 154 076 y
US$ 385 189, para los fermentadores desechables de 75 y 750 L, respectivamente.
Despus de la descarga del fermentador de produccin hacia los reservorios desechables de
cosecha, se comienza a centrifugar el contenido del caldo fermentativo en una centrfuga
continua de discos para separar el sobrenadante de cultivo de las clulas de levadura.
Una vez separada la biomasa del caldo fermentativo comienza la etapa de captura y
concentracin de la MPI. La cantidad de centrfugas y su capacidad estarn de acuerdo a la
escala de operacin a que se est produciendo.
De manera que, los equipos tecnolgicos principales de la Etapa de Fermentacin son: cinco
fermentadores de produccin de 5 m3, dos fermentadores de inculo de 0,5 m3, dos
fermentadores de pre-inculo de 0,05 m3, tres reservorios de cosecha para 5 m3, y una
centrfuga de disco de 50,000 m y una zaranda orbital termostatada.
Adicionalmente, en dicha rea se deber contar con otros equipos de medicin rutinarios
para el control del proceso fermentativo, como son un cuarto de incubacin a 28C, un
100

microscopio convencional, un flujo laminar, una centrfuga de mesa, balanzas analtica y

tcnica, un pH/conductmetro y un refrigerador 4C.
Las materias primas fundamentales de esta etapa sern las fuentes de carbono, nitrgeno,
macro- y micro-nutrientes, las vitaminas y los grandes volmenes de agua, calidad de agua
para inyeccin (WFI), que son requeridos. Los volmenes por supuesto dependern de la
escala de operacin de la planta.
3.3.2.2 Etapa de Captura y Concentracin de la Mini-proinsulina

El objetivo de esta etapa es separar la MPI del resto de las protenas contaminantes del
hospedero y en especfico de las proteasas que la degradan. Colateralmente se necesita
concentrar la MPI, disminuyendo el volumen de agua, hasta niveles adecuados para la etapa
subsiguiente del tratamiento enzimtico.
Para el proceso de captura, se asign unas 8 h de operacin total, despus de separar la
biomasa con una centrfuga de discos. Las operaciones de limpieza, regeneracin y
preparacin de la columna no se incluyen dentro del tiempo asignado de 8 h.
Se aplicar unos 3 m3 de sobrenadante, libre de clulas, a un flujo lineal de 300 cmh -1 a dos
columnas de 84 x 51 cm cargadas con una resina de intercambio inico de 2 gL-1 de
capacidad de pegada (unos 225 L de resina por columna) durante unas 6 h, despus se lavar
durante 1 h a ese mismo flujo con el tampn de equilibrio y se despegar la MPI con 2
volmenes de columna (3 x 450 L = 1 350 L) a un flujo lineal de 100 cmh -1 durante 1 h. El
rendimiento previsto para esta etapa es del 85%, previndose una concentracin de
850 mg MPIL-1, lo que representa una reduccin del volumen en 3,7 veces (5 000 L/1 350 L).
Segn Petrides [224] una columna con sus perifricos como la mencionada anteriormente
costaba en el ao 1998 alrededor de US$ 150 000.
Despus de la captura se concentrar y diafiltrar por 4 h en una unidad de ultrafiltracin con
una membrana plana de 1-kDa de cut-off hasta alcanzar la concentracin requerida de
101

>1 g MPIL-1 para llevar a cabo la conversin enzimtica de la MPI a IH-r. En este paso primero
se concentra y despus se diafiltra con un tampn adecuado (100 mM Tris-HCl, pH 8) para
comenzar el tratamiento enzimtico. Se estima que se obtendr un 90% de recobrado
alcanzndose 850 L de solucin de MPI con una concentracin de 1,2 g MPIL-1.
Se tomar un UF de 20 m2 de rea de membrana. A precios del ao 1998 una unidad de stas
costaba unos US$ 25 000 [224], sin contar los precios de las membranas, que se cotizan a
precios de unos US$ 200m-2, tiles hasta las 2-000 h de operacin [224].
En esta etapa se necesitarn un grupo de materias primas asociadas a la preparacin de los
tampones de la cromatografa de intercambio inico (IEC) y la ultrafiltracin. Se tendrn
tambin gastos anuales de insumos asociados a las membranas de UF y la resina para la
cromatografa IEC.
3.3.2.3 Etapa de Tratamiento Enzimtico

Una vez diafiltrada y concentrada, la corriente de MPI, es enviada hacia el reactor de

tratamiento enzimtico donde tiene lugar su conversin definitiva a monmero de IH.
Existen varias alternativas para realizar la conversin enzimtica de MPI a IH cuando se
emplea el espaciador K-R-, para unir las cadenas A y B humanas. En el esquema ms
sencillo, se prev un primer paso donde se incuba la solucin concentrada de MPI con las
enzimas tripsina y CpB juntas. En este caso la reaccin tiene lugar rpidamente ( 10 min) y se
logra obtener cerca de un 50% de conversin de MPI a IH, transformndose el resto de la
MPI a una variante que tiene unida la arginina del espaciador original, al extremo N-terminal
de la cadena A, denominada Arg(Ao)-IH. Despus de separada la IH obtenida, la arginina
remanente en la molcula Arg(Ao)-IH, puede ser convertida a IH, tratndola con la enzima
arginina-aminopeptidasa (AAP) obtenida de S. cerevisiae.
Las reacciones enzimticas tendrn lugar en dos sublotes de 425 L, cada uno en un reactor
enzimtico desechable de 0,5 m3 de volumen total. Se le adicionar sbitamente las
102

soluciones concentradas de Tripsina y CpB hasta lograr concentraciones de estas enzimas de

1 y 4 mgL-1, respectivamente. Al cabo de los 10 min se adiciona 40 mL de 1 N HCl, para
detener el curso de la reaccin enzimtica.
El contenido de este sub-lote se trasegar hacia el UF-2 de 10 m2 de rea de membrana y
membrana de 10 o 30-kDa de cut-off. Una vez completados los dos sub-lotes se filtrar con el
objetivo de separar las enzimas Tripsina-CpB de los productos de la reaccin enzimtica.
Estos ltimos son enviados nuevamente al reactor enzimtico de 0,5 m 3 en dos sub-lotes
para efectuar la ltima reaccin enzimtica con la AAP y convertir a la Arg(Ao)-IH en IH.
Una vez concluida esta reaccin (en unos minutos) se filtrar nuevamente por el UF-2 para
separar a la AAP1 del producto de las reacciones enzimticas. Las eficiencias de cada uno de
los pasos son del 80, 90 y 90% para el primer procesamiento enzimtico, la ultrafiltracin y el
segundo procesamiento, respectivamente. En su conjunto la eficiencia esperada es del 65%.
Como parte de este proceso se tendr un equipo de ultrafiltracin (UF-2) para separar los
productos de la reaccin enzimtica de las enzimas en solucin. El UF-2 tendr una
membrana de 10 o 30 kDa cut-off, suficiente para permitir el paso de la IH-r obtenida del
tratamiento enzimtico de la MPI y retener a las enzimas Tripsina/CpB o AAP. Si se estima
necesario, pudiera emplearse el equipo UF-1, para concentrar y diafiltrar los productos de las
reacciones enzimticas antes de su separacin en el paso de la cromatografa preparativa de
alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC).
Junto a las ya mencionadas enzimas (Tripsina, CpB y AAP), como parte de las materias primas
de esta etapa, tambin se tendrn el 1 N HCl y los tampones requeridos para equilibrar la
muestra previa su entrada en la etapa de purificacin final. Entre los insumos se tendr las
membranas para el UF-2 de 10 o 30 kDa.

103

3.3.2.4 Etapa de Purificacin Final

El objetivo fundamental de esta etapa es lograr alcanzar los niveles de pureza y
concentracin adecuados de la IH-r para obtener una IFA de calidad ptima para su
suministro en humanos. Para lograr estos objetivos se emplearn consecutivamente las
cromatografas preparativas de RP-HPLC que permitir separar a la IH-r obtenida de otros
sub-productos de la reacciones enzimticas y una cromatografa por Gel-filtracin que
permitir eliminar el acetonitrilo (AcN) y al cido actico empleados en el RP-HPLC y cambiar
el tampn que contiene a la IH-r previo a su paso final de la cristalizacin.
Los 510 L de solucin por lote, con una concentracin de 1,35 g IHL-1 se pasan en tres sublotes, a travs de una conexin sanitaria, hacia un reservorio mvil sanitario, estril y
desechable de 300 L cada uno. Cada sublote de 170 L se equilibra con cerca de 53 L de AcN
con 2% de CH3COOH hasta lograr un 24% (v/v) de AcN en la muestra.
Se utilizar una columna preparativa de RP-HPLC de dimensiones 62 x 5 cm, empacada con
15 L de resina C-18, con capacidad de pegada de 20 mg IHmL-1. Cada sublote ( 223 L) se
aplicar durante 1 h y despus se lavar durante 0,5 h con el propio tampn de equilibrio
(24% AcN + 2% CH3COOH), despus de lo cual comenzar la elusin de la IH (que contendr
junto a la IH, 33% AcN y 1,5% CH3COOH). El volumen de elusin corresponder con el 0,5 del
volumen por columna ( 23 L) y tendr una concentracin de 25,5 g IHL-1, lo que equivale a
unas 981 UI de IH. A precios del ao 1998, una columna de RP-HPLC como la arriba descrita
costara cerca de US$ 18 000 y sus perifricos (mdulo de control, bombas, detector, etc.)
unos US$ 210 000 [224].
Despus de colectar en condiciones estriles los 23 L de la elusin del RP-HPLC, es necesario
eliminarle los solventes que contiene. Esta operacin se realiza en una cromatografa de Gel
Filtracin. Para ello se utilizar unos 60 L de gel G-25, colocado en una columna de vidrio,
donde se pasar el total del contenido de los 23 L de la elusin del RP-HPLC divididos en 4
104

sub-lotes. Esta operacin diluye la muestra que se aplica obtenindose unos 56 L a la salida
de la GF, que es necesario concentrar y diafiltrar unas 10 veces, con el UF de 1-kDa de cut-off.
Finalmente se obtienen 18,5 L de solucin de concentracin de 26 g IHL-1.
Las materias primas de esta etapa sern las requeridas para la confeccin de los tampones
que se emplearn en las cromatografas de RP-HPLC y GF, a saber grandes volmenes de AcN
(calidad HPLC) y WFI, y cantidades menores de cido actico. Entre los insumos se tendrn
las resinas de las propias columnas preparativas de RP-HPLC y GF.
Una vez equilibrada la IH-r en un tampn adecuado se trasegar va conexin estril hacia el
reactor de cristalizacin, en la etapa final del proceso de obtencin de la IFA.
3.3.2.5 Etapa de Cristalizacin

El objetivo de esta etapa es lograr cristales hexamerizados de IH-r de una alta pureza, aptos
para ser formulados posteriormente y utilizados en el tratamiento de la DMID. Para lograr
esto la solucin de IH-r en un tampn adecuado es vertida dentro del reactor de
cristalizacin donde ocurre, bajo la adicin de ZnCl2 y la accin controlada del pH y la
temperatura, la formacin de un dmero de IH-r y su posteriormente hexamerizacin al
unirse tres dmeros alrededor de dos tomos de Zn2+.
Uno o ms lotes de esta solucin concentrada de IH son posteriormente sometidos a un
proceso de cristalizacin por la adicin controlada de ZnCl2 en un pequeo reactor donde se
formarn los cristales de IH6-Zn2, que sirven como IFA. Al reactor se le asignar un volumen
total de 35 L. Una columna de GF como la mencionada arriba costaba en el ao 1998 unos
US$ 15 000, sin incluir los perifricos que costaban unos US$ 95 000 adicionales.
Finalmente, varios lotes se centrifugan para separar los cristales formados y se liofilizan antes
de ser envasados en recipientes adecuados. Se considerar una ultracentrfuga tubular de
2,5 kg y una liofilizadora (10 L hielociclo-1) para los ltimos pasos del IFA. A precios del ao
1990, estos equipos costaban US$ 70 000 y US$ 60 000, respectivamente [223].
105

3.3.3 Anlisis Econmico

El anlisis que se realizar a continuacin permitir conocer con datos financieros del orden
de magnitud el comportamiento econmico esperado del proceso arriba descrito.
Diferentes autores sitan la precisin de estos estimados entre un 25-30% para una planta de
un costo de inversin situado en el entorno de los US$ 50 millones [225]. No obstante, estos
estimados, podrn constituir una herramienta til para la toma de decisiones estratgicas
con respecto a este proyecto y la posibilidad de producir este estratgico frmaco en el
ALBA.
Seguidamente se proceder a estimar todos los costos de una planta de 2 millones de bulbos
de capacidad anual (una de las tres similares que se proyectan), y con las cuales se cubrira la
demanda perspectiva del ao 2025 de todos los pases miembros del ALBA (Fig. 28).
En la Tabla 23 se muestran los recobrados estimados para el DFP (Fig. A-8, del Anexo). Segn
estos, se tendr un recobrado global del proceso del 25%, debido a la complejidad del
proceso y el gran nmero de pasos de purificacin que son necesarios acometer.
Tabla 23. Etapas del proceso y su recobrado.
Etapas
Fermentacin
Cosecha & Centrifugacin
Cromatografa IEC (Captura)
Ultrafiltracin UF-1
Conversin Enzimtica
Ultrafiltracin UF-2
RP-HPLC
Gel Filtracin
Ultrafiltracin
Cristalizacin
Ultracentrifugacin
Liofilizacin

1,00
0,98
0,85
0,90
0,65
0,90
0,85
0,90
0,90
0,90
0,95
0,98

Para la tecnologa en E. coli, Petrides y col. [218]

obtuvieron al operar 330 das al ao comenzando un nuevo
lote cada 2 das, 160 Lotesao-1, con un recobrado global
del 32%.
La etapa de fermentacin es la que ms dura de todo el
proceso, pudiendo llegar a 6 das y operando en el modo

0,25

de cultivo incrementado. La duracin del lote completo es

de 10 das y se puede comenzar un nuevo lote cada semana. De manera que en una planta
dedicada, pudieran efectuarse un mximo de 45 lotes al ao, totalizando 321 das de
operacin, lo que contabiliza unas 45 semanas anuales de labor. Si se adoptara un ndice de
rechazo del 7%, se tendran unos 42 Lotesao-1 tiles (Tabla 24).
106

En la Tabla 25 (pg. 108) se muestra el listado del equipamiento tecnolgico de una planta de
2 millones de bulbos, con los precios estimados para el ao 2010, despus de extrapolar
costos obtenidos de diversas fuentes [184, 223, 224]. El costo estimado del equipamiento
tecnolgico para una de las plantas ser de US$ 7,8 millones (x 3 = US$ 23,4 millones).
Tabla 24. Datos Generales.
(-) =
W
-1
X (g WWL ) =
-1
CMPI (mg MPILs ) =
Vs/V (-) =
Duracin de un Lote (das):
Tiempo de inicio de un Lote nuevo (das):
Das anuales laborados (das):
ndice de rechazo (%):
-1
NLotes tiles (Lotesao ):

0,25
380
460
0,6
10
7
322
7
42

En la Tabla 26 (pg. 108), se representa la

estimacin

del

costo

total

de

inversin

empleando la metodologa de los factores de

Lang

[226]

adecuados

para

la

Industria

Biotecnolgica [224] y para el caso del empleo de equipos y accesorios desechables como lo
recomiendan diversos autores [184, 186, 227, 228].
En este caso se supuso que el costo fijo capital es cinco veces el costo del equipamiento,
como sugieren algunos autores [183, 184, 227, 229] para plantas hbridas. El monto total de
la inversin ser de unos US$ 46,7 millones.
Costos de Produccin. Los costos de produccin se estimaron a partir de los costos de las
materias primas que se tendr en cada lote. En la Tabla 27 (pg. 109), se muestra todas las
materias primas que se emplean por lote y su costo.
Del listado se observa que el 58% de los gastos por concepto de materias primas se realiza en
la etapa de Fermentacin y Cosecha, mientras que el 42% se eroga en las diversas etapas de
Purificacin. Por tipo de materia prima, el WFI (debido al gran volumen empleado de
40 m3Lote-1), las enzimas (tripsina, CpB y AAP1) y los reactivos qumicos contabilizan el 55,
23 y 22% de los gastos por lote en materias primas, respectivamente. Si se comenzaran unos
45 lotes al ao, el costo anual de las materias primas rondara los
. Segn diferentes autores las materias primas pueden representar
entre el 10 y el 80% del costo total de produccin [224, 230].
107

Tabla 25. Precios estimados del equipamiento tecnolgico de una planta de 2 x 10 bulbos anuales, actualizados
para el primer trimestre del 2010 (se adopt un Chemical Engineering Plant Cost Index (CEPCI) de 532,9 de
enero de 2010). El precio unitario para el 2010 se calcula como:
Equipo
Cant. Precio Unit. Ao CEPCI Precio Unit. Costo Total
Ferm. Pre-inculo
Ferm. Inculo
Ferm. Prod.
Pallet-TK Cosecha
Centr. Discos
IEX
UF-1, 1 kDa
Reactor Enz.
UF-2, 30 kDa
RP-HPLC Prep.
GF
Reactor Crist.
Ultra-Centrfuga
Liofilizadora
Pallet-TK Purif.
Pallet-TK Pur. Fin.

75 L (Desechable)
750 L (Desechable)
7 500 L
2 500 L (Desechable)
50,000 m
84 x 51 cm
20 m
300 L (Desechable)
10 m
62 x 5 cm
60 L
35 L (Desechable)
2,5 kg
10 L Hielo/ciclo
1000 L (Desechable)
100 L (Desechable)

2
2
5
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
6

$ 135 369
$ 338 423
$ 750 000
$ 16 000
$ 60 000
$ 150 000
$ 25 000
$ 10 000
$ 20 000
$ 228 000
$ 110 000
$ 6 000
$ 70 000
$ 60 000
$ 6 500
$ 3 000

2005
2005
1990
2010
1998
1998
1998
1990
1998
1998
1998
1990
1990
1990
2010
2010

468,2
468,2
357,6
532,9
389,5
389,5
389,5
357,6
389,5
389,5
389,5
357,6
357,6
357,6
532,9
532,9

$ 154 076
$ 385 189
$ 1 117 660
$ 16 000
$ 82 090
$ 205 225
$ 34 204
$ 14 902
$ 27 363
$ 311 941
$ 150 498
$ 8 941
$ 104 315
$ 89 413
$ 6 500
$ 3 000
X1=
X3=

$ 308 151
$ 770 379
$ 5 588 297
$ 48 000
$ 82 090
$ 205 225
$ 34 204
$ 14 902
$ 27 363
$ 311 941
$ 150 498
$ 8 941
$ 104 315
$ 89 413
$ 19 500
$ 18 000
$ 7 781 219
$23 343 657

Tabla 26. Estimado del capital de inversin de una planta de 2 x 10 bulbos de

capacidad anual, de acuerdo al mtodo de Lang actualizado [181].
N Elementos de Costo
Factor
Costo, US$
1
Costo del Equip. (CE)
1xCE
$ 7 781 219
2
Instalacin
0,5xCE
$ 3 890 609
3
Tuberas
0,3xCE
$ 2 334 366
4
Instrumentacin
0,35xCE
$ 2 723 427
5
Aislamiento
0,01xCE
$ 77 812
6
Electricidad
0,10xCE
$ 778 122
7
Construccin Civil
0,22xCE
$ 1 711 868
8
Mov. del Terreno
0,10xCE
$ 778 122
9
Facilidades Auxiliares
0,45xCE
$ 3 501 549
Sub-Total - CTDP
$ 23 577 093
10 Ingeniera
0,20xCTDP
$ 4 715 419
11 Construccin
0,30xCTDP
$ 7 073 128
Sub-Total - CTIP
$ 11 788 547
CTP = CTDP + CTIP
$ 35 365 640
12 Pagos Contratista
0,03xCTP
$ 1 060 969
13 Contingencia
0,07xCTP
$ 2 475 595
Costo Capital Fijo (CFC),
5 x CE
$ 38 902 204
CTC (1.10 x CFC)
$ 46 682 645

108

-1

Tabla 27. Elementos de los gastos por lote en Materias Primas para el Caso Base 2 millones de bulbosao .
Etapa
Fermentacin y Cosecha

Glicerol

Concentracin
40,0 g/L

CH3OH

Precio
$0,40 /kg

Gasto
$ 480

2,5 m

$258 /m

$ 645

(NH4)2SO4

20,0 g/L

600,0 kg

$0,30 /kg

$ 180

KH2PO4

12,0 g/L

360,0 kg

$1,75 /kg

$ 630

MgSO4H2O

3,6 g/L

108,0 kg

$0,30 /kg

$ 32

CaCl22H2O
Trazas
Vitaminas
WFI

0,35 g/L
4,5 mL/L
2,5 mL/L
-

10,5 kg
135,0 L
75,0 L
30 000,0 L

$0,40 /kg
$1,10 /L
$1,50 /L
$0,20 /L

1,0 g/L
-

30,0 kg
7 000,0 L
15,0 kg

$1,00 /kg
$0,20 /L
$6,00 /kg

1 mg/L
4 mg/L
4 mg/L
30 mg/L
-

0,7 g
3,0 g
3,0 g
25,0 g
1 000,0 L

500,00 $/g
500,00 $/g
500,00 $/g
1,50 $/g
0,20 $/L

100%
100%
-

250,0 L
16,0 L
1 000,0 L

2,50 $/L
2,00 $/L
0,20 $/L

1,5 kg
15,0 L

12,00 $/kg
0,20 $/L

130,0 kg
16,0 kg

0,50 $/kg
0,75 $/kg

$4
$ 149
$ 113
$ 6 000
$ 8 233
$ 30
$ 1 400
$ 90
$ 1 520
$ 330
$ 1 500
$ 1 500
$ 38
$ 200
$ 3 568
$ 625
$ 32
$ 200
$ 857
$ 18
$3
$ 21
$ 65
$ 12
$ 77
$ 14 276

Captura y Concentracin

Sales
WFI
Tris

Tratamiento Enzimtico

Tripsina
CPB
AAP1
HCl
WFI

Purificacin Final

Acetonitrilo
Ac. Actico
WFI

Cristalizacin

ZnCl2
WFI

Otros

Cantidad/Lote
1 200,0 kg

NaOH
H3PO4

Total

Para el estudio realizado por Petrides y col. [218, 224] para una gran planta de produccin de
IH-r (1 800 kg IHao-1) las materias primas representaban el 51% del ATE.
Se adoptar en este trabajo que las materias primas representan el 50% del costo total de
produccin. De manera que:

. Se supondr

adems, un horizonte de 15 aos, en correspondencia con una planta dedicada en la que se

prev una produccin estable de este producto.
En la Tabla A-3, del anexo, se muestra el flujo efectivo de caja para el caso base, tres plantas
similares, de 2 millones de bulbos anuales cada una, en donde se distribuye el bulbo entre los

109

pases miembros del ALBA a un precio preferencial de US$ 4,50 y la cantidad de produccin
que exceda a la demanda del ALBA, se comercializar a un precio solidario de US$ 6,75
(recurdese que el bulbo puede costar en los mercados privados ms de US$ 15,0). En este
anlisis, se tom una tasa de descuento del 10% y se adopt 15 aos de horizonte de
proyecto.
Para estimar el gasto en que habra que incurrir si se decidiese comprar todos los bulbos
necesarios para cubrir las necesidades de los pases del ALBA, se tom, conservadoramente,
un precio de adquisicin promedio del bulbo de US$ 6,87; para ello se adopt un precio de
U$ 5,10, para cuatro de los pases caribeos miembros del ALBA (los localizados en el Caribe,
excepto Cuba y Venezuela; se tom de referencia el precio al que adquiere
preferencialmente Nicaragua el bulbo). Para el caso de Cuba, se consider un precio de
US$ 4,42 hasta el 2015, y de US$5,10 del 2016 al 2025. En cuanto a los pases suramericanos
del ALBA (Venezuela, Ecuador y Bolivia), se adopt un precio de US$ 8,00 tomando de
referencia el precio con que la empresa BioBras (Belo Horizonte, MG, Brasil) comercializa
este producto en amplias regiones del Brasil y Suramrica.
En la figura 31 se muestra el VAN
obtenido desde el ao en curso
hasta el 2025, para los casos en que
se adquiera solamente el producto
(Sin inversin, Fig. 31) y en otro
donde
Figura 31. Valor Actual Neto del proyecto. Se comparan el VAN de
adquirir los bulbos de IH necesarios para los pases del ALBA a un
precio promedio de US$6,87 (Sin inversin) con el caso que se
6
acometiera una inversin para 3 plantas de 2 x 10 bulbos y se
comercializaran a US$4,50 y $US6,75 entre los pases dentro y
fuera del ALBA, respectivamente.

se

decida

acometer

la

inversin en tres planta de 3 x 2 MM

de bulbos (Con inversin, Fig. 31).
Al comparar las dos alternativas se

nota un ahorro neto a partir de los 4 aos del inicio de la inversin.

110

A pesar de que los precios empleados en el anlisis son bajos, pues el objetivo principal es el
de garantizar el acceso al vital medicamento, se logra un VAN15 y un TIR de US$ 6 356 468 y
10,85%, respectivamente (Fig. 31).
Los valores del VAN15 y el TIR dependen de diversos factores externos, como se demuestra
en el anlisis de sensibilidad de las variables tcnico-econmicas ms relevantes.
3.3.3.2 Anlisis de Sensibilidad

Entre los variados parmetros

que influyen sobre el VAN y el
TIR, la concentracin de MPI en
el sobrenadante de cultivo (pS),
el rendimiento global del proceso
(), el costo capital (CTC) , el
precio (sCoG) y el gasto anual (ATE)
y juegan un papel fundamental.
Figura 32. Anlisis de Sensibilidad. Variaciones del VAN respecto al
caso base, para variaciones del 10% de los diversos parmetros.

Si se analizan variaciones en un

10% de estos factores se puede tener idea de cun sensible es el VAN (el TIR tiene un
comportamiento similar) con estos parmetros (Fig. 32).
La concentracin de MPI en el
sobrenadante de cultivo y el
recobrado

global

son

los

parmetros que ms influyen

sobre

el

VAN

el

TIR,

obtenindose que si disminuyesen

tan slo en un 2,95% (hasta
Figura 33. Valor Actual Neto en dependencia de la concentracin de MPI en
el sobrenadante de cultivo.

111

valores de 446,4 mgLs-1 y 24,55%)

no se obtendra ningn beneficio. Le sigue en importancia el costo de capital total,

alcanzndose un VAN = 0 si el CTC aumentara en 4,97% (hasta US$ 153 670 119). El precio
unitario le sigue en importancia, aunque aqu se analiz solamente la variacin del precio del
bulbo destinado al mercado regional, no a los pases del ALBA. Si este precio cayera en un
12,18% (alcanzando un valor de US$ 5,93) se obtendra un VAN = 0. El gasto anual total es el
menos sensible, siendo el VAN = 0 si el ATE se incrementara en 16,94% (hasta US$ 7 472 835).
Estos resultados concuerdan con los de otros autores [186, 231, 232] que muestran que
tanto la concentracin de la protena de inters, como el recobrado constituyen los
parmetros que ms influyen sobre los indicadores econmicos del VAN y el TIR.
La concentracin en el sobrenadante de cultivo es el parmetro que, presumiblemente, tiene
ms posibilidades de ser mejorado, si se seleccionara una cepa adecuada y se optimizara el
casete de expresin de la MPI; esto ltimo, introduciendo un pequeo espaciador cargado
entre la seal de secrecin y el gen de la MPI, y se optimizara el uso de codones para esta
levadura, estrategias que han sido empleadas, con mucho xito, por otros autores [68, 233].
En la figura 33 se muestra cmo vara el VAN en dependencia de pS. Se aade la cantidad
erogada para satisfacer la demanda interna conjunta de todos los pases del ALBA (Fig. 33,
Sin inversin).
En conclusin, el anlisis de factibilidad muestra que los valores del VAN y el TIR, mejoraran
sustancialmente, si se incrementara pS, lo que debe constituirse en el objetivo prioritario del
grupo de desarrollo de este proyecto en el contexto de la mejora continua del proceso
durante todo el ciclo de vida del producto, tal y como lo recomiendan los conceptos
emanados de la Calidad por Diseo.

112

CONCLUSIONES
1. De un anlisis de riesgo realizado al proceso de fermentacin se obtuvo que el atributo
crtico de calidad de la mini-proinsulina en la fase fermentativa (su correcta estructura
primaria, secundaria y parte de la terciaria) se pone en riesgo si existen desbalances o
carencias en el medio de cultivo (medio de cultivo y adiciones suplementarias de
fuentes de nitrgeno), si existe contaminacin en el cultivo, y si son inadecuadas las
condiciones de cultivo (pH y temperatura), tanto en la fase de crecimiento, como en la
fase de produccin.
2. La seleccin de un medio de cultivo qumicamente definido y la bsqueda de los
parmetro crticos del proceso fermentativo (pH, temperatura y adiciones de fuentes
suplementarias de nitrgeno) a travs de un conjunto de experimentos, sirvieron para
establecer el espacio de diseo a escala de laboratorio del proceso de fermentacin de
la mini-proinsulina en Pichia pastoris.
3. Dentro del espacio de diseo propuesto se obtiene la mini-proinsulina con el atributo
crtico de calidad esperado y como resultado de la conversin enzimtica se obtiene la
insulina humana, todo lo cual fue demostrado por los estudios realizados de
espectrometra de masas, la cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa y
los anlisis de la molcula en electroforesis en geles de policrilamida y Western-blot.
4. La demanda nacional perspectiva de insulina en Cuba para el ao 2025, expresada en
bulbos de 10 mL con 100 UImL-1, se sita entre los 1,42 2,83 x 106 bbosao-1,
mientras que para los pases del ALBA est entre 5,51 11,00 x 106 bbosao-1.
5. El Anlisis de Pre-factibilidad Econmica realizado muestra que se puede cubrir, de
modo econmicamente viable (VAN = US$ 6,35 millones y TIR = 10,85%), las
necesidades de insulina a todos los pacientes diabticos que residen en los pases
miembros del ALBA. Adems, se podran beneficiar tambin pacientes diabticos, que
residen en la regin que podran acceder a este vital frmaco a un precio solidario.
I

RECOMENDACIONES
1. Establecer los espacios de diseos de las diferentes etapas de purificacin del proceso
de obtencin de la insulina humana.
2. Escalar el proceso de fermentacin para corroborar los resultados obtenidos en este
estudio.
3. Continuar elevando los niveles de expresin de la MPI a travs, principalmente, de
mejoras en la construccin gentica y de la cepa productiva.

II

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ANEXOS
Tablas
Tabla A - 1. Especificaciones para la insulina humana biosinttica segn la Farmacopea Europea [234] y
especificaciones de la Novo Nordisk A/S.
Pruebas

Especificacin
Polvo blanco o casi
blanco,
prcticamente insoluble en agua,
etanol y ter. Se disuelve en cidos
minerales
diluidos
y
con
descomposicin en soluciones diluidas
de hidrxidos alcalinos.

Caractersticas

Identificacin
(A) HPLC-RP
(B) Trazado de Pptidos
(C) Composicin de aminocidos
Prdida durante secado
Cenizas sulfatadas
Nitrgeno
Zinc
Protenas de la clula husped (HCP)
Impurezas con masas moleculares
mayores que la Insulina:
Polmeros
Dmeros
Desamido Insulina A21
Otras protenas relacionadas
Metil ster de Insulina
Precursor de insulina
(1)

Cumple
Cumple
(1)
Cumple
10.0 %
(2)
2,0 %
(2)
14,5 16,0 %
(2)
0,3 0,6 %
< 1 ppm

[234] pg. 1371

(3)
Anl. aminocidos
dem pg. 1372
dem pg. 1372
(3)
Mtodo Kjeldahl
dem pg. 1372
dem pg. 1371

0,4 %
0,1 %
0,3 %
1,0 %
1,0 %
< 0,2 %
< 0,1 %

dem pg. 1371

dem pg. 1372
dem pg. 1372
(3)
Impureza adicional
dem pg. 1372

Lmites de especificacin para la composicin de aminocidos:

Ala
Arg
Asp
Cys
Glu
Gly

0.9 1.1
0.9 1.1
2.9 3.1
4.9 6.0
6.6 7.3
3.8 4.1

His
Ile
Leu
Lys
Phe
Pro

1.9 2.1
1.4 2.0
5.6 6.2
0.9 1.1
2.9 3.3
0.7 1.3

(2)

Calculado en base seca

(3)

Segn tcnica del fabricante Novo Nordisk A/S

- 26 -

Ser
Thr
Tyr
Val

Referencia
[234] pg. 1371

2.4 3.0
2.7 3.0
3.4 4.0
3.4 4.0

Tabla A - 2. Cantidad estimada de pacientes con DM entre el 2010 y el 2030, para los pases miembros del ALBA [4].

Pacientes con DM (0-14)

Ao
2010
2011
2012
2013
2014
2015
2016
2017
2018
2019
2020
2021
2022
2023
2024
2025
2026
2027
2028
2029
2030

ATG
5
6
7
7
8
9
10
11
11
12
13
14
15
15
16
17
18
19
19
20
21

DMA
6
7
8
9
10
11
12
13
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

VCT
4
5
6
6
7
8
8
9
10
10
11
12
12
13
14
14
15
16
16
17
18

NIC
187
218
248
278
308
339
369
399
429
460
490
520
550
581
611
641
671
702
732
762
792

BOL
111
129
147
165
183
201
219
237
255
273
291
309
327
345
362
380
398
416
434
452
470

ECU
340
395
449
504
559
614
669
724
778
833
888
943
998
1 052
1 107
1 162
1 217
1 272
1 327
1 381
1 436

- 27 -

Pacientes con DM (20-79)

CUB
284
330
377
423
469
515
561
607
653
700
746
792
838
884
930
977
1 023
1 069
1 115
1 161
1 207

VEN
84
96
107
118
130
141
152
164
175
186
198
209
221
232
243
255
266
277
289
300
311

ATG
3 084
3 158
3 234
3 312
3 392
3 473
3 557
3 643
3 730
3 820
3 912
4 006
4 103
4 202
4 303
4 407
4 513
4 621
4 733
4 847
4 963

DMA
5 161
5 252
5 345
5 439
5 535
5 632
5 732
5 833
5 935
6 040
6 147
6 255
6 365
6 477
6 591
6 708
6 826
6 946
7 068
7 193
7 320

VCT
5 524
5 672
5 824
5 981
6 142
6 307
6 476
6 650
6 829
7 013
7 201
7 395
7 593
7 798
8 007
8 222
8 443
8 670
8 903
9 143
9 388

NIC
248 129
256 797
265 769
275 053
284 663
294 607
304 900
315 551
326 575
337 984
349 792
362 012
374 659
387 748
401 294
415 314
429 823
444 839
460 380
476 463
493 109

BOL
274 085
282 322
290 807
299 547
308 550
317 823
327 375
337 214
347 348
357 788
368 541
379 617
391 026
402 778
414 883
427 352
440 195
453 425
467 052
481 089
495 547

ECU
443 438
455 335
467 550
480 094
492 974
506 199
519 779
533 724
548 043
562 746
577 843
593 345
609 263
625 609
642 392
659 626
677 323
695 494
714 152
733 312
752 985

CUB
903 298
913 972
924 772
935 700
946 757
957 945
969 264
980 718
992 307
1 004 033
1 015 897
1 027 902
1 040 048
1 052 338
1 064 773
1 077 355
1 090 086
1 102 968
1 116 001
1 129 188
1 142 532

VEN
1 033 688
1 063 916
1 095 027
1 127 049
1 160 007
1 193 929
1 228 843
1 264 777
1 301 763
1 339 830
1 379 010
1 419 337
1 460 842
1 503 561
1 547 529
1 592 783
1 639 361
1 687 300
1 736 641
1 787 425
1 839 695

Tabla A - 3. Flujo Efectivo de Caja para el caso base.

Ao
2010
2011
2012
2013
2014
2015
2016
2017
2018
2019
2020
2021
2022
2023
2024
2025

Bbos.*
No ALBA
0
0
0
0
0
0
4 109 078
1 890 922
4 209 886
1 790 114
4 313 382
1 686 618
4 419 639
1 580 361
4 528 734
1 471 266
4 640 754
1 359 246
4 755 783
1 244 217
4 873 904
1 126 096
4 995 208
1 004 792
5 119 789
880 211
5 247 737
752 263
5 379 156
620 844
5 514 140
485 860
ALBA

AS
No ALBA
$
$
$
$ 10 849 165
$ 10 874 943
$ 11 384 672
$ 10 667 437
$ 9 931 045
$ 9 174 910
$ 8 398 465
$ 7 601 148
$ 6 782 346
$ 5 941 424
$ 5 077 775
$ 4 190 697
$ 3 279 555

$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$

15
17
19
19
20
20
21
21
22
23
23
24
24

ALBA
ATE**
ACI
ATC
ACF
- $
- $
- $ 21 958 517 $ -21 958
- $
- $
- $ 36 597 528 $ -36 597
- $
- $
- $ 87 834 068 $ -87 834
717 223 $ 6 390 061 $ 20 176 327 $
$ 20 176
050 038 $ 6 390 061 $ 21 534 920 $
$ 21 534
410 219 $ 6 390 061 $ 24 404 829 $
$ 24 404
888 376 $ 6 390 061 $ 24 165 751 $
$ 24 165
379 303 $ 6 390 061 $ 23 920 287 $
$ 23 920
883 393 $ 6 390 061 $ 23 668 242 $
$ 23 668
401 024 $ 6 390 061 $ 23 409 427 $
$ 23 409
932 568 $ 6 390 061 $ 23 143 655 $
$ 23 143
478 436 $ 6 390 061 $ 22 870 721 $
$ 22 870
039 051 $ 6 390 061 $ 22 590 414 $
$ 22 590
614 817 $ 6 390 061 $ 22 302 531 $
$ 22 302
206 202 $ 6 390 061 $ 22 006 838 $
$ 22 006
813 630 $ 6 390 061 $ 21 703 124 $ -2 847 926
$ 24 551
TIR = 10,85%

-1

-1

517
528
068
327
920
829
751
287
242
427
655
721
414
531
838
050

fD
1,000
0,909
0,826
0,751
0,683
0,621
0,564
0,513
0,467
0,424
0,386
0,350
0,319
0,290
0,263
0,239

ADCF
$ -21 958
$ -33 270
$ -72 590
$ 15 158
$ 14 708
$ 15 153
$ 13 640
$ 12 274
$ 11 041
$ 9 927
$ 8 922
$ 8 016
$ 7 198
$ 6 460
$ 5 795
$ 5 877

517
480
139
773
640
479
936
890
410
882
881
048
002
249
088
326

-1

VAN
Con Inversin
Sin Inversin
$ -21 958 517 $ -25 340 670
$ -55 228 997 $ -48 976 650
$ -127 819 136 $ -71 023 290
$ -112 660 362 $ -91 588 104
$ -97 951 723 $ -110 771 294
$ -82 798 244 $ -128 666 268
$ -69 157 307 $ -145 848 522
$ -56 882 418 $ -161 871 707
$ -45 841 008 $ -176 814 563
$ -35 913 126 $ -190 750 445
$ -26 990 245 $ -203 747 684
$ -18 974 197 $ -215 869 950
$ -11 776 195 $ -227 176 566
$ -5 315 946 $ -237 722 801
$
479 142 $ -247 560 161
$ 6 356 468 $ -256 736 631

VAN
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$
$

-71 023 290

-21 072 259
12 819 571
45 868 025
76 691 215
104 989 290
130 973 555
154 837 319
176 757 440
196 895 753
215 400 372
232 406 855
248 039 303
263 093 099

*Capacidad Total: 6 x 10 bbosao ; Con un precio unitario de US$ 4,50bbo ; Con un precio unitario solidario de US$ 6,75bbo ; Empleando una tasa de descuento de i=10%; El CTC se
**
desglos en tres aos, con el 15, 25 y 60% del total y el capital salvable totaliz el 10% del costo del equipamiento y la edificacin; El gasto total anual se estim a partir del gasto anual de las
materias primas, como:
.

- 28 -

Figuras
Iniciar
Proceso de Manejo del Riesgo en Calidad

Evaluacindel
delRiesgo
Riesgo
Valoracin

Identificacin del Riesgo

Anlisis de Riesgo

Comunicacin del Riesgo

Control del Riesgo

Reduccin del Riesgo

Aprobacin del Riesgo

inaceptable

Herramientas para el Manejo del Riesgo

Evaluacin del Riesgo

Salida/Resultado del Proceso de Manejo del

Riesgo en Calidad

Revisin del Riesgo

Revisin de los Eventos

Figura A - 1. Perspectiva general de un proceso tpico de manejo de riesgo en

calidad [128].

- 29 -

46

45
44

A14
A13 Tyr
Leuu

47
A15
Gln

A6
Cys
A7
Cys

31
B28
Pro

B27
Thr

39

B5
His

7
6
5

B4
Gln

B9
Ser
9

8
4
B3
Asn

3
B2
Val

B10
His
10

2
B1
Phe

29

25
B25
Phe

B8
Gly

B29
Lys
28

27
26

B26
Tyr
B6
Leu

32

37
38

B7
Cys

A1
Gly
34 33

35

B24
Phe

Arg
Lys

B30
Thr
30

23
B23
Gly

B19
Cys

20
B20
Gly
22

24

B22
Arg

B12
Val
12

B21
Glu

18

B17
Leu

21

B16
Tyr

2
B14
Ala

B13
Glu
13

19
B18
Val

1797,99 Da
B11
Leu
11

50

A19 51
Tyr
52
53
A20
A21
Cys
Asn

A2
Ile

A3
Val

36

A5
Gln

40

A18
Asn
A4
Glu

42 Ile

A9
Ser
41
A8
Thr

A17
Glu

A16
Leu

A12
Ser

43
A11
A10 Cys

49

48

B15
Leu

17

16

15
14

1376,57 Da

2967,30 Da

Figura A - 2. Secuencia y masa molecular de los pptidos tericos de la MPI obtenidos por digestin con
una serino-endoproteasa de S. aureus V8- endoproteinasa Glu-C.

- 30 -

Figura A - 3. Diagrama de Ishikawa o de causa y efecto, del proceso de fermentacin de la MPI en P. pastoris.

- 31 -

Condiciones de
cultivo
(T, pH, N, Q)

FERMENTATIVO

Materiales de Entrada:
Inculo
MBSM
Supl. Fte. N
Medio Fed-batch
Fed-batch SUPL.

PROCESO

Espacio de Diseo
(parmetros del
proceso fermentativo)

Atributos
de calidad

Material de Salida:
MPI
Contaminantes
(HCP, ADN/ARN,
restos de medio,
pigmentos, etc.)

PAT

Control
Automtico

Monitoreo de
los parmetros
y Atributos

Figura A - 4. Interrelacin que se establece en el Proceso Fermentativo entre los materiales de entrada y salida,
el monitoreo del proceso y su control de acuerdo a la QbD.

- 32 -

Figura A-4. Grfico de Box-Cox para las

transformaciones de potencia obtenido al utilizar
el programa Design-Expert.

- 33 -

Figura A - 5. Grfica normal de los residuos para los

modelos de la MPImax, YPX y PT (Ecs. 2-4).

Figura A - 6. Relacin entre los valores experimentales

y los brindados de las respuestas transformadas de la
MPImax, YPX y PT (Ecs.2-4).

- 34 -

Figura A - 7. Diagrama de Flujo de Proceso (DFP) propuesto para la produccin de la IFA de la IH.

- 35 -

Fotos

Foto 1. Uno de los fermentadores de 2,5 L

empleado.

(2)

(1)
(4)

(3)

Foto 2. Fermentador de 14 L empleado. (1): Bioreactor 14 L; (2): Mdulo

de control; (3): Analizador de Gases de salida; (4): Suministro de oxgeno.

- 36 -