Tesis MCIA María Del Carmen Cano Correa

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLÁS DE HIDALGO
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

FACULTAD DE BIOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA CIVIL
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERÍA AMBIENTAL
“Diversidad metabólica y genética de la comunidad bacteriana

en un reactor de lecho móvil
para el tratamiento de efluentes acuícolas”
TESIS
Para obtener el grado de:

MAESTRA EN CIENCIAS EN INGENIERÍA AMBIENTAL
Presenta
INGENIERA BIOQUÍMICA MARÍA DEL CARMEN CANO CORREA
Correo: came_1215@hotmailcom, Matricula:0838236E
Asesor
DOCTOR EN INGENIERÍA DE PROCESOS JULIO CÉSAR ORANTES ÁVALOS
(julio.orantes@gmail.com)
Morelia Michoacán, octubre de 2017

i
Agradecimientos
A mi mamá, por el apoyo incondicional que he recibido de su parte en cada una de

las decisiones que he tomado. Por su cariño y comprensión, por estar siempre
dándome ánimos y tenerme presente en cada una de sus oraciones. A mi papá que,
a pesar de nuestra distancia física, siento que siempre está conmigo y aunque nos
faltó tanto por vivir juntos, sé que este momento hubiera sido tan especial para él
como lo es para mí.
A mis hermanos por todo lo compartido desde pequeños. A mi hermana por siempre
estar aconsejándome y a mi hermano por siempre estar al pendiente de que esté
bien, por sus mensajes que siempre me recuerdan que no hay nada más importante
que la unión familiar para salir adelante.
Al laboratorio de biología Acuática de la UMSNH, así como al programa de Maestría

en Ciencias en Ingeniería Ambiental de la Universidad Michoacana de San Nicolás
de Hidalgo por permitirme formar parte de este programa y trabajar en estas
instalaciones.
Al programa CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología) por la beca

proporcionada durante estos dos años y por el apoyo para la realización de una
estancia de investigación.
A la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH, por el financiamiento

del proyecto: “Remoción de nitrógeno amoniacal, en sistemas acuícolas
recirculados de cultivo de peces”.
A la Coordinación General del Posgrado de la UMSNH, al “Programa del

Fortalecimiento de la Calidad Educativa” y a la DES de Ciencias biológico-
agropecuarias y a la facultad de ingeniería química, por el apoyo recibido para
realizar la estancia de Investigación en la Universidad de Chile.
Al Dr. Julio César Orantes, por aceptarme como parte de su equipo de investigación,
por su apoyo brindado y por todos sus conocimientos compartidos.
ii
A la Dra. Yvonne Herrerías, al Dr. Javier Ponce, al Dr. Gerardo Marrufo y al M.C.
Gabriel Martínez por formar parte de mi mesa tutoral y hacer que camináramos
juntos durante esta investigación.
Al Dr. Andrei Rosales por su apoyo brindado en este proyecto de investigación.
A la Dra. Soledad Vázquez y todo su equipo de trabajo, por la disponibilidad del

laboratorio de genética molecular microbiana UMSNH.
Al Dr. Hernando Rodríguez Correa y al laboratorio de genética molecular de la

ENES- UNAM campus Morelia por su apoyo incondicional en el acondicionamiento
de las muestras para la estancia.
A la Dra. Julieta Orlando y todo su equipo de investigación, que me acogieron como

parte de él durante mi estancia de investigación en el Laboratorio de Ecología
Microbiana de la Universidad de Chile.
A mis compañeros y amigos Diana, Víctor, Daniel y Alejandro, gracias por hacer
más amenas las largas jornadas de investigación.
iii
Tabla de contenido
Lista de Tablas…………………………………………………………………………...vii
Lista de Figuras…………………………………………………………………………...ix
Lista de símbolos abreviaturas o nomenclatura …………………………………. …xiii
Resumen …………………………………………………………………………….…. xiv
Abstract……… ……………………………………………………………………….…xv
l.-Introducción .......................................................................................................... 1
Il.- Justificación ........................................................................................................ 3
Ill- Marco teórico ...................................................................................................... 4
3.1.- La acuicultura .............................................................................................. 4
3.1.1.- Estado actual y problemas ambientales ................................................ 4
3.1.2.- Acuicultura mediante RAS .................................................................... 5
3.1.3.- Estructura de un RAS ........................................................................... 6
3.2.- RLM como herramienta en el tratamiento de efluentes acuícolas ............... 7
3.2.1.- Procesos biológicos de tratamiento de agua en un RAS ...................... 7
3.2.2.- Funcionamiento de un RLM .................................................................. 8
3.2.3.-Ventajas de los Reactores de lecho móvil (RLM) ................................ 10
3.2.4.-Parámetros de diseño y operación....................................................... 10
3.3.- Dinámica de comunidades bacterianas ..................................................... 12
3.3.1.- Composición de la biopelícula ............................................................ 13
3.3.2.- Remoción biológica de nitrógeno. ....................................................... 13
3.3.3.- Factores que intervienen en la remoción biológica de nitrógeno ........ 16
3.3.4.- Identificación de comunidades bacterianas ........................................ 17
3.3.5- Análisis de la diversidad metabólica de la comunidad mediante Biolog
Ecoplate ......................................................................................................... 18
3.3.6- Estructura genética de la comunidad a través del polimorfismo en la
longitud de los fragmentos de restricción terminales (TRFLP) ....................... 19
IV.- Marco conceptual de la investigación ............................................................. 20
4.1.- Hipótesis .................................................................................................... 20
iv
4.2.- Objetivo ..................................................................................................... 20
4.2.1.- Objetivo general .................................................................................. 20
4.2.2.- Objetivos específicos .......................................................................... 20
V.- Materiales y Métodos ....................................................................................... 21
5.1.- Plan experimental ...................................................................................... 21
5.2.- Preparación del efluente acuícola sintético ............................................... 21
5.3.- Descripción del RLM.................................................................................. 21
5.4.- Inoculación del RLM .................................................................................. 22
5.5.- Operación y medición de parámetros ........................................................ 22
5.6.- Análisis de muestras.................................................................................. 23
5.7.- Desprendimiento de la biopelícula ............................................................. 25
5.8.- Análisis del perfil metabólico (CLPP) de las comunidades bacterianas..... 25
5.9.- Estructura de la comunidad ....................................................................... 29
5.9.1.- Extracción de DNA .............................................................................. 29
5.9.2.- Amplificación por PCR ........................................................................ 30
5.9.3,- T-RFLP ............................................................................................... 32
VI.- Resultados ...................................................................................................... 34
6.1.- Seguimiento de parámetros fisicoquímicos del reactor ............................. 34
6.1.1.- Temperatura y pH. .............................................................................. 34
6.1.2.- Remoción de nitrógeno amoniacal y DQO. ......................................... 35
6.2.- Efecto de la relación C/N y los efluentes sobre el perfil metabólico .......... 38
6.3.- Análisis de degradación por grupos .......................................................... 40
6.4.- Análisis de la diversidad metabólica .......................................................... 41
6.5.- Efecto de la relación C/N sobre la estructura de la comunidad a través de
TRFLP con el gen 16S ...................................................................................... 47
TRFLP con el gen beta-amo .............................................................................. 51
6.7 - Efecto de la relación C/N sobre la estructura de la comunidad a través de
TRFLP con el gen nirS ...................................................................................... 55
VII. – Discusión de resultados ............................................................................... 59
7.1.- Remoción de contaminantes en el reactor de lecho móvil ......................... 59
7.1.1. Nitrificación ........................................................................................... 59
v
7.1.2. Desnitrificación ..................................................................................... 60
7.1.3. Remoción biológica de nitrógeno en el RLM del RAS .......................... 61
7.1.4. Remoción de materia orgánica ............................................................ 62
7.2.- Diversidad metabólica de la biopelícula del RLM ...................................... 62
7.2.1. Diversidad metabólica y relaciones C/N ............................................... 62
7.2.2. Degradación de los sustratos en la placa y su relación con el RLM..... 63
7.2.3. Diversidad y equitatividad de Shannon asociados a la capacidad
degradativa del RLM ...................................................................................... 65
7.2.4. Factores fisicoquímicos que influyeron en la capacidad degradativa ... 66
7.3.- Estructura de la comunidad de la biopelícula del RLM .............................. 67
7.3.1. Estructura de la comunidad y relaciones C/N ...................................... 67
7.3.2. Estructura de la comunidad y los procesos de remoción biológica de
nitrógeno en el RLM ....................................................................................... 68
VIII. – Conclusiones .............................................................................................. 70
lX. – Recomendaciones ........................................................................................ 71
X.- Referencias...................................................................................................... 72
Anexo A.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon de
la diversidad metabólica. ....................................................................................... 80
Anexo B.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon de
la estructura de la comunidad gen 16S. ................................................................ 82
Anexo C.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon
de la estructura de la comunidad gen beta-amo. .................................................. 84
Anexo D.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon
de la estructura de la comunidad gen NirS. .......................................................... 86
vi
Lista de Tablas
Tabla 3.1 Parámetros de operación para reactores de lecho móvil, usando

11
efluentes acuícolas y acuícolas sintéticos
Tabla 3.2 Parámetros típicos de diseño para reactores de lecho móvil para
12
aguas residuales domesticas (adaptado de Metcalf y Eddy, 2003).
Tabla 3.3 Parámetros fisicoquímicos que intervienen en la remoción de amonio 16
Tabla 5.1 Parámetros de diseño del reactor de lecho móvil 24
Tabla 5.2 Parámetros determinados y metodología usada 25
Tabla 5.3 Código de las muestras que se trabajaron con los dos sustratos y las
25
dos relaciones C/N
Tabla 5.4 Fórmulas para calcular los índices de diversidad metabólica 28
Tabla 5.5 Oligonucleótidos utilizados en la amplificación de los genes 31
Tabla 6.1 Parámetros de operación del reactor de lecho móvil a las diferentes
relaciones C/N con cada uno de los efluentes acuícolas (n=9) (media 34
± Desviación estándar)
Tabla 6.2 Concentraciones de DQO, N-NH3 Y N-NO4 en la entrada y salida del

35
reactor (media ± Desviación Estándar, n=3)
Tabla 6.3 Porcientos de remoción de CA (Carga Amoniacal) sin diferencia

estadísticamente significativa (p= 0.0647) y CO (Carga Orgánica) con
diferencia estadísticamente significativa (p= 0.0371*) para cada una 36
de las condiciones experimentales (media ± Desviación Estándar,
n=3).
Tabla 6.4 Resumen del ANOVA de dos vías comparando las condiciones
experimentales, correspondientes a las remociones de 37
contaminantes, y parámetros de respuesta del RLM
vii
Tabla 6.5 Valores del AWCD promedio con su desviación estándar en cada una
39
de las muestras (n=3)
Tabla 6.6 Resumen ANOVA de dos vías para el AWCD en los tres puntos para
40
cada condición experimental
Tabla. 6.7 Equitatividad y sustratos degradados de cada una de las muestras

43
con las diferentes condiciones experimentales (n=3)
Tabla. 6.8 índice de Shannon, equitatividad y TRFs para el gen 16S de cada
una de las condiciones experimentales trabajadas (n=3). Donde
Cada condición experimental corresponde a 1 (relación C/N=1), 49
10(C/N=10), AA (efluente a base de ácido acético) y G (efluente a
base de glucosa).
Tabla. 6.9 índice de Shannon, equitatividad y TRFs para el gen beta-amo de

cada una de las condiciones experimentales trabajadas (n=3). Donde
Cada condición experimental corresponde a 1 (relación C/N=1), 52
base de glucosa).
Tabla. 6.10 Equitatividad y sustratos degradados de cada una de las muestras

56
con las diferentes condiciones experimentales (n=3).
viii
Lista de Figuras
Figura 3.1 Operaciones unitarias que pueden conformar un sistema acuícola

6
con recirculación (RAS). Adaptado de (Timmons et al., 2012)
Figura 3.2 Principio de funcionamiento de los reactores de lecho móvil. 9

Tomada de (Rusten et al., 2006, Ødegaard, 1999)
Figura 3.3 Ciclo del nitrógeno en el agua tomado de Nature education (2010), 14
modificado y complementado de (Lüke et al., 2016; Madigan et al.,
2009).
Figura 5.1 Reactor de lecho móvil piloto, con capacidad de 40 L 22
Figura 5.2 Dilución de la biopelícula y siembra en agar de soya tripticasa para 26

estandarizar el volumen inoculado en las placas Biolog EcoplateTM
Figura 6.1 Desarrollo de color promedio (AWCD) de los sustratos 38

metabolizados por la biopelícula (n=3), medido por un tiempo de al
menos 120 h, con las diferentes condiciones experimentales a)
Efluente AA relación C/N=1, b) Efluente AA relación C/N=10, c)
Efluente G, relación C/N=1 d) Efluente G, relación C/N= 10
Figura 6.2 Análisis de componentes principales de las fuentes de carbono 41

aprovechadas por grupo por la comunidad de la biopelícula con las
diferentes condiciones experimentales a las diferentes horas (24, 64
y 120). Los grupos son significativamente diferentes (p<0.05,
PERMANOVA).
Figura 6.3 Índices de Shannon en cada de las condiciones experimentales en 42

los diferentes tiempos, 24, 64 y 120 (n=3).
Figura 6.4 Diversidad Beta, Formación de grupos, por efluentes, Bray-Curtis 44

(0.723)
ix
(0.7034)

(0.7045)
Figura 6.7 Análisis de correspondencia canónica entre el perfil metabólico de 46

la comunidad y los parámetros de operación del reactor de lecho
móvil, con los dos sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las
dos relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas
trabajadas.
Figura 6.8 Análisis de correspondencia canónica entre el perfil metabólico de 57

la comunidad por grupos y la respuesta del reactor de lecho móvil,
con los dos sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las dos
relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas trabajadas
Figura 6.9 Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido de 48

cada condición experimental (n=3). Se indica en la figura la enzima
de restricción utilizada para cada perfil obtenido (Ha, Haelll; Hh:
Hhal). Cada condición experimental corresponde a 1 (relación
C/N=1), 10(C/N=10), AA (efluente a base de ácido acético) y G
(efluente a base de glucosa).
Figura 6.10 Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la 49

biopelícula del reactor de lecho móvil, con los dos sustratos, ácido
acético (AA), glucosa (G) con las dos relaciones C/N, 1 y 10 durante
las diferentes semanas monitoreado. Se usaron como base los
perfiles de TRFs del gen 16S obtenidos con las dos enzimas de
restricción (Haelll y Hhal). El dendrograma fue construido usando el
índice de Bray-Curtis y el algoritmo UPGMA
Figura 6.11 Análisis de correspondencia canónica entre los perfiles de TRFLP 51

del gen 16S y los parámetros medidos de las comunidades
x
bacterianas de la biopelícula del reactor de lecho móvil, con los dos
sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las dos relaciones
C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreado. Se usaron
como base los perfiles de TRFs del gen 16S obtenidos con las dos
enzimas de restricción (Haelll y Hhal).
Figura 6.12 Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido para 52

el gen beta-amo (n=3). Se indica en la figura la enzima de restricción
utilizada para cada perfil obtenido (Ha, Haelll; Hh: Hhal). Cada
condición experimental corresponde a 1 (relación C/N=1),
base de glucosa).

perfiles de TRFs del gen beta-amo obtenidos con las dos enzimas
de restricción (Haelll y Hhal). El dendrograma fue construido usando
el índice de Bray-Curtis y el algoritmo UPGMA

del gen beta-amo y los parámetros medidos de las comunidades
C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreado. Se usaron
como base los perfiles de TRFs del gen beta-amo obtenidos con las
dos enzimas de restricción (Haelll y Hhal).
Figura 6.15 Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido para 56

el gen nirS. Se indica en la figura la enzima de restricción utilizada
para cada perfil obtenido (Ha, Haelll; Hh: Hhal). Cada condición
xi
experimental corresponde a 1 (relación C/N=1), 10(C/N=10), AA
(efluente a base de ácido acético) y G (efluente a base de glucosa).

perfiles de TRFs del gen nirS obtenidos con las dos enzimas de
restricción (Haelll y Hhal). El dendrograma fue construido usando el
índice de Bray-Curtis y el algoritmo UPGMA

del gen nirS y los parámetros medidos de las comunidades
C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreadas. Se
usaron como base los perfiles de TRFs del gen nirS obtenidos con
las dos enzimas de restricción (Haelll y Hhal).
xii
Lista de símbolos, abreviaturas o nomenclatura
Notación Descripción Unidades
RAS Sistemas acuícolas recirculados -
C/N Relación carbono nitrógeno kgDDO/ kgNH3
polimorfismo en la longitud de los fragmentos

T-RFLP -
de restricción terminales
RLM Reactor de lecho móvil -
TRH Tiempo de retención hidráulico h
TRC Tiempo de retención celular d
CH Carga hidráulica m3/m2.d
CO Carga Orgánica gDQO/m2.d
CA Carga Amoniacal gN-NH3/m2.d
DQO Demanda Química de Oxigeno mg/l
AOB Bacterias amonioxidantes
NOB Bacterias oxidantes de los nitritos
OD Oxígeno Disuelto mg/l
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
AWCD Desarrollo de color promedio Absorbancia
CCA Análisis de Correspondencia Canónica -
PCA Análisis de Componentes Principales -
TRFs Fragmentos de Restricción Terminal -
SVb Sólidos Volátiles en la biopelícula mg/L
xiii
Resumen
En este estudio se evaluó la influencia de la relación C/N sobre la estructura y la

diversidad metabólica de una comunidad microbiana en el proceso de tratamiento
de dos efluentes acuícolas sintéticos mediante un reactor de lecho móvil (RLM) a
escala laboratorio.
Se trabajó con un RLM operado en continuo, alimentado con dos efluentes
sintéticos completamente solubles y fácilmente biodegradables, cada uno con dos
relaciones C/N en el sustrato de alimentación. La diversidad metabólica de la
comunidad se midió mediante el uso de placas Ecoplate® de BIOLOGTM. La
estructura de la comunidad se analizó mediante la técnica TRFLP, para los genes
16S, beta-amo y nirS.
Primeramente, se aseguró la calidad del efluente tratado, ya que se
obtuvieron porcentajes superiores al 98 % de remoción de nitrógeno amoniacal y
superiores al 82 % de remoción de materia orgánica. La eficiencia de remoción tanto
de nitrógeno amoniacal como de materia orgánica aumentó al incrementar la
relación C/N, sin embargo, no existe una diferencia estadísticamente significativa
en el caso de la remoción del nitrógeno amoniacal entre las diferentes condiciones
experimentales.
Se concluye que tanto la relación C/N, como la fuente de carbono de los
efluentes tratados mostraron tener una influencia en la diversidad funcional de la
biopelícula y en la estructura de la comunidad bacteriana; así como también que a
través de la relación C/N se puede orientar la operación del RLM hacia los procesos
biológicos deseados en función del tipo de contaminante que se pretenda remover
en el efluente acuícola.
Palabras claves: biopelícula, remoción de contaminantes, nitrógeno amoniacal, actividad

metabólica, diversidad funcional, TRFLP.
xiv
Abstract
The aim of this study was to evaluate the influence of the C/N ratio on the
genetic and metabolic diversity of a microbial community, in the treatment process
of two synthetic aquaculture effluents through a lab-scale moving bed biofilm reactor
(MBBR).
A lab-scale MBBR was continuously operated and fed with two completely
soluble and easily biodegradable synthetic effluents, each with two C/N ratios in the
feed substrate. The metabolic diversity of the community was measured using
Ecoplate® by BIOLOGTM. The structure of the community was analyzed by the
TRFLP technique, for the 16S, beta-amo y nirS genes.
Firstly, the quality of the treated effluent was assured. Ammonia nitrogen and
organic matter removal rates were 98% and 82% and above, respectively. The
higher the C/N ratio, the higher both ammonia nitrogen, and organic matter removal
efficiencies, even though there was no statistically significant difference in the case
of the ammonia nitrogen removal efficiency between the different experimental
conditions.
It was concluded that both the C/N ratio and the carbon source showed a
positive influence on the functional diversity of the biofilm, and on the genetic
diversity of the bacterial community. It was also concluded that through the C/N ratio
can be controlled the biological processes in the MBBR, depending on the
contaminants to be removed from the aquaculture effluent.
Key words: biofilm, contaminants removal, ammonia nitrogen, metabolic activity,

functional diversity, TRFLP.
xv
l.-Introducción
Los sistemas acuícolas recirculados (RAS) se diseñaron para producir grandes

cantidades de organismos en volúmenes de agua relativamente pequeños (i.e.
producción intensiva). Sin embargo, la acumulación de residuos de alimento no
consumido y la liberación de productos metabólicos residuales, algunos de ellos
tóxicos, hace indispensable el tratamiento del agua para su reutilización (Jimenez
et al., 2015). El nitrógeno amoniacal es un subproducto de la digestión de las
proteínas suministradas en el alimento. Se estima que, por cada 45.75 kilogramos
de alimento suministrado, se produce un 1 kilogramos de nitrógeno amoniacal
(Masser et al., 1999).
Los reactores de lecho móvil se encuentran entre los biofiltros más utilizados
en la remoción de amonio debido a que en el material de empaque se favorece el
crecimiento tanto de bacterias autótrofas, que son las encargadas de llevar a cabo
el proceso de oxidación del amonio, como heterótrofas (Ebeling et al., 2006). Hay
varios estudios donde usan este tipo de reactores para el tratamiento de aguas
residuales urbanas con alto contenido de nitrógeno (Abzazou et al., 2016; Bassin et
al., 2015; Rejish et al., 2013) y para la remoción de amonio en el tratamiento de
efluentes acuícolas (Summerfelt et al., 2015; Terjesen et al., 2013; van Kessel et al.,
2010;Rusten et al., 2006) .
La oxidación biológica del amonio se lleva a cabo gracias a la transformación
de bacterias quimioautótrofas y ocurre en dos pasos: i) el nitrógeno amoniacal es
convertido en nitritos mediante las bacterias oxidantes del amonio (AOB por sus
siglas en inglés: Ammonia-Oxidizing Bacteria) (e.g. Nitrosomas, Nitrosococus,
Nitrosospira, Nitrosolobus y Nitrosovibrio), que obtienen su energía mediante el
catabolismo del amonio no ionizado; ii) La oxidación de los nitritos a nitratos ocurre
mediante las bacterias oxidantes de los nitritos (NOB por sus siglas en inglés Nitrite-
Oxidizing Bacteria) (e.g. Nitobacter, Nitrococcus, Nitrospira y Nitrospina). Por otro
lado, para llevar a cabo la remoción biológica de nitrógeno se requiere un proceso
de reducción de los nitratos, los cuales son convertidos en nitrógeno gas por
bacterias heterótrofas. La relación C/N es un factor claves en la estructura de la
1
comunidad de la biopelícula del biofiltro (Metcalf y Eddy, 2003), las relaciones bajas
favorecen la tasa de crecimiento de bacterias autótrofas, mientras que las altas
favorece el crecimiento de bacterias heterótrofas (Ebeling et al., 2006).
La estructura de una comunidad microbiana puede ser determinada al definir
la capacidad metabólica de los microorganismos (heterótrofos, nitrificantes,
desnitrificanes, etc.). Se denomina “grupo funcional” a cada unidad estructural de la
comunidad con una función degradativa específica (Hooper y Spehn, 2006). La
técnica de Ecoplate de BIOLOGTM ha sido ampliamente usada para estudiar la
capacidad degradativa de comunidades bacterianas (Garland, 1997; Weber y
Legge, 2010). Ha sido aplicada para evaluar comunidades en el tratamiento de
efluentes porcinos (Li et al., 2016), lodos activados (Hashimoto et al., 2014),
biofiltros para potabilización (Xiang et al., 2013) y en plantas de tratamiento de
aguas residuales urbanas (Button et al., 2016; Nivala et al.,2015; Aubron, 2015).
La técnica de polimorfismos en la longitud de fragmentos terminales
generados por restricción (T-RFLP, por sus siglas en inglés: Restriction Fragment
Length Polymorphism) ha sido utilizada para estudiar las comunidades microbianas
complejas sobre la base de la variación en el gen 16S rRNA (Madigan et al., 2009).
Se comparan patrones de bandeo para cada grupo de bacterias que contienen
algunos genes específicos, para estimar la riqueza y composición de la comunidad,
aplicando parámetros de diversidad (Boon et al., 2002). Esta técnica ha sido
ampliamente usada en el estudio de comunidades de suelos (Bustamante et al.,
2012; C. Li et al., 2014; Orlando et al., 2010; Peralta et al., 2013; Rotthauwe y Witzel,
1997) y aguas (Bassin et al., 2015; Li et al., 2015).
En el presente trabajo se estudió a escala laboratorio, la capacidad

degradativa y la estructura de la comunidad de la biopelícula de un reactor de lecho
móvil, alimentándolo en forma continua con dos efluentes acuícolas sintéticos, a
base de ácido acético y glucosa, con dos relaciones C/N (kgDDO/ kgNH3) (C/N = 1
y 10), para cada uno de los sustratos. El objetivo fue analizar la estructura de la
comunidad, así como la capacidad degradativa de la comunidad bacteriana, para
optimizar la degradación de contaminantes en los RLM y así poder obtener efluentes
tratados de mayor calidad, para su reúso en los sistemas RAS.
2
Il.- Justificación
Conocer la capacidad metabólica y la estructura de la comunidad de la biopelícula

en un reactor de lecho móvil para el tratamiento de efluentes acuícolas.
proporcionará datos para entender el comportamiento en la remoción de
contaminantes nitrogenados y materia orgánica con dos relaciones C/N y dos
diferentes efluentes con diferente fuente de carbono para con ello poder definir, cuál
de las relaciones C/N hace más eficiente el tratamiento de efluentes acuícolas,
proporcionando una mayor calidad en el agua tratada y poder ser reusada en los
sistemas acuícolas.
También con este estudio se podrán identificar los factores de operación del RLM
clave para la obtención de una mayor calidad de agua al tratar un efluente acuícola
y que así los acuicultores tomen en cuenta en su proceso de tratamiento.
Por otra parte, si se obtiene una mayor calidad en el agua tratada, habrá un beneficio
económico y social. Por la parte económica si al estanque de cultivo de peces llega
agua de buena calidad no pondrá en riesgo de estrés o intoxicación a las especies
cultivadas y se obtendrá una mayor producción, lo cual generará mayores
ganancias. Por la parte social, al existir una mayor producción estará más accesible
para la población, lo cual generará una mayor seguridad alimentaria.
3
Ill- Marco teórico
3.1.- La acuicultura
3.1.1.- Estado actual y problemas ambientales
La producción acuícola mundial de pescado representó el 44.1 % de la producción

total (incluidos los usos no alimenticios) de la pesca de captura y la acuicultura en
el 2014, una cifra superior al 42.1 % alcanzando en 2012 y al 31.1 % registrada en
2004 (FAO, 2016).
El estado de las poblaciones de peces marinos en el mundo no ha mejorado, a

pesar de haberse realizado progresos notables en algunas áreas, sobre la base del
análisis de la FAO de las poblaciones de peces comerciales examinadas, la
proporción de poblaciones de peces explotadas a niveles sostenibles desde el punto
de vista biológico disminuyó del 90 % en 1974 al 68.6 % en 2013. Así pues, se
estima que el 31.4 % de las poblaciones de peces tuvieron un nivel de explotación
no sostenible (FAO, 2016).
Lo anterior indica que cada vez más, se está optando por llevar a cabo la práctica
de la crianza de recursos acuícolas mediante la acuicultura. Sin embargo, el
crecimiento exponencial de la acuicultura ha provocado serias preocupaciones
entre los gobiernos, grupos de ambientalistas y la sociedad misma por los posibles
daños que estuviera generando sobre el medio, al ser considerada como una
actividad en proceso de expansión hay que tener cautela en cómo y dónde se
realiza ya que puede degradar la calidad del agua y afectar negativamente a los
ecosistemas, tanto en los ríos como en el mar (Bordehore, 2001).
Una estrategia importante en la acuicultura, sobre todo en países desarrollados,

donde los costos por el uso del agua son elevados, es la implementación de
sistemas de tratamiento y recirculación del agua dentro de las unidades productivas
(Ebeling et al., 2006). Los sistemas de recirculación en acuicultura en especial los
sistemas acuícolas recirculados (RAS), se diseñan para producir grandes
4
cantidades de organismos en volúmenes de agua relativamente pequeños. Sin
embargo, la acumulación de residuos metabólicos, algunos de ellos tóxicos, hace
indispensable el tratamiento del agua para su reutilización (Jiménez et al., 2015).
3.1.2.- Acuicultura mediante RAS
Los métodos convencionales de acuicultura, como los sistemas de estanques al aire

libre y los sistemas de malla negra, no serán sostenibles a largo plazo debido a
problemas ambientales significativos y su incapacidad para garantizar la seguridad
de sus productos al consumidor (Ebeling y Timmons, 2012). Sin embargo, la
producción en sistemas RAS es sostenible, puede extenderse fácilmente, es
compatible con el medio ambiente ya que utilizan de un 90 a un 99 % de agua
menos que los sistemas de acuicultura convencional y tiene la capacidad de
garantizar tanto la seguridad como la calidad de las especies cultivadas a lo largo
de todo el año (Ebeling y Timmons, 2012).
Los sistemas de recirculación son biológicamente intensos. Los peces suelen ser
criados intensivamente (0.06 kilogramos/litro o más) (Masser et al., 1999) para que
los sistemas de recirculación sean rentables. Entre los factores de vital importancia
que se deben de tomar en cuenta en los sistemas RAS se pueden considerar;
caudales uniformes (agua y aire/oxígeno), niveles fijos de agua y operación
interrumpida.
Durante las últimas décadas, numerosos diseños de sistemas de recirculación han

sido propuestos e investigados (Ebeling y Timmons, 2012). Muchos de estos
sistemas iniciales fueron diseñados usando conceptos tradicionales de tratamiento
de aguas residuales e ingenierías, o por simple enfoque de ensayo y error. Más
recientemente, la ingeniería de la acuicultura ha alcanzado la “mayoría de edad”, y
los sistemas han sido diseñados especialmente para acuicultura y las necesidades
únicas de un sistema acuático/biológico. Además, se dispone de numerosas fuentes
comerciales de equipos y suministros, especialmente diseñadas y comercializadas
para la acuicultura.
5
3.1.3.- Estructura de un RAS
La estructura de los RAS está integrada por varios procesos unitarios (Figura 3.1).
Existen muchas soluciones para cada una de las operaciones unitarias y aunque
algunas se han propuesto de una manera más compleja, eficientes o rentables en
comparación a otras, no existe una tecnología correcta o incorrecta. Todos los
estudios reportados sugieren que puede ser usada la tecnología propuesta o
estudiada, funcionando en cierta medida, algunas funcionan mejor en aplicaciones
a gran escala y otras a pequeña escala.
Aireación
(aire/oxígeno)
Tanque de
cultivo de
peces Desinfección
Separación de Biofiltración/
sólidos Nitrificación
Lodos
Figura 3.1.- Operaciones unitarias básicas de un RAS. (Adaptado de Timmons et al., 2012)
Cada una de las operaciones unitarias es importante para el proceso, y entre éstas
se encuentra el proceso de nitrificación. Para el proceso de nitrificación se utilizan
6
biofiltros, los cuales tienen la característica de que se adhieren las bacterias a un
material de soporte formando biopelículas. Esta biopelícula es la que se encarga de
llevar a cabo el proceso de oxidación del amonio. Entre los biofiltros comúnmente
usados en este tipo de sistemas se encuentran: filtros percoladores, filtros de lecho
flotante, reactores de lecho fluidizado, filtros de flujo descendente, tapetes
bacterianos (Jiménez et al., 2015) y reactores de lecho móvil (Ebeling y Timmons,
2012).
En un RAS el agua es desplazada desde el tanque de cultivo de peces y fluye a

través del sistema que elimina los sólidos sedimentables, posteriormente el agua
pasa a un proceso biológico en el que se convierte el amonio en nitratos y se
remueve el carbono, después pasa a un proceso de desinfección y, por último, el
agua tratada se oxigena para regresar al tanque de cultivo de peces. Este sistema
debe ser monitoreado para asegurar la calidad del agua que está regresando al
estanque y así evitar que enfermen y mueran las especies cultivadas (Ebeling y
Timmons, 2012).
3.2.- RLM como herramienta en el tratamiento de efluentes acuícolas
3.2.1.- Procesos biológicos de tratamiento de agua en un RAS
El amonio proviene principalmente de las excretas y de los residuos del alimento

suministrado a los peces que no es consumido. Se estima que del 25 al 50 % del
alimento suministrado a los peces no es aprovechado, por tanto, la rápida remoción
de los residuos sólidos es un punto clave en la acuicultura. Dado que este alimento
es una base nutrimental (carbohidratos y proteínas) para el crecimiento de
microorganismos. Esto residuos deben ser removidos para evitar su
descomposición y afectación al sistema de cultivo.
El tratamiento biológico permite, por medio de bacterias, que la materia orgánica

nitrogenada que ha sido desechada por los peces sea oxidada hasta nitratos por
7
bacterias de los géneros Nitrobacter y Nitrosomas (Madigan et al., 2009). Es
importante tener en cuenta la concentración de oxígeno disuelto presente en el
reactor y la alcalinidad, ya que los procesos biológicos, requiere de cantidades
elevadas de oxígeno. Para oxidar un gramo de amonio, se requiere 4.6 g de oxígeno
y 7.14 g de alcalinidad medida como carbonato de calcio (CaCO3 ) (Metcalf y Eddy,
2003). La alcalinidad se añade generalmente usando bicarbonato de sodio
(NaHCO3) o carbonato de calcio, cal apagada (CaO) o cal hidratada (Ca(OH)2).
3.2.2.- Funcionamiento de un RLM
Los RLM consisten en un proceso de mezclado completo y flujo continuo que

combina lo mejor del crecimiento adherido y biomasa en suspensión (Ødegaard,
1999). El funcionamiento de los reactores de lecho móvil está basado en el
crecimiento de la biomasa que forma una biopelícula sobre un medio de soporte
plástico que se encuentran en suspensión en el interior de un reactor biológico. La
capacidad de remoción de contaminantes va a depender, entre otros factores, de la
cantidad de área superficial disponible para la formación de la biopelícula
(Ødegaard, 1999) es por esto que uno de los biofiltros más usados en los RAS son
los reactores de lecho móvil.
Se considera que su costo de operación es bajo, debido a que no se requiere

recirculación de la biomasa, ni tratamiento de ella en periodos cortos de tiempo, así
como bajo costo de fabricación (Rusten et al., 2006; Orantes y González-Martínez
2003). Los soportes son movidos mediante un sistema de agitación, generado por
la aireación, (Reactores aerobios) o por sistemas de agitación mecánica (Reactores
anóxicos o anaerobios) (Figura 3.2).
8
Aerobio Anóxico y Anaerobio
Figura 3.2.- Principio de funcionamiento de los reactores de lecho móvil (Rusten et al., 2006,
Ødegaard, 1999).
En el tanque se introducen piezas de plástico con densidades ligeras inferiores a la

del agua (e.g. 0.96 g/cm3) especialmente diseñadas o algún medio plástico de bajo
costo, con características adecuadas (Orantes y González Martínez, 2003),
particularmente con alta densidad de área superficial (e.g. > 500 m2/m3), que sirva
como base para el crecimiento de los microorganismos. El medio más utilizado en
los RLM es Kaldnes K1 (Pfeiffer y Wills, 2011). Lo que permite el movimiento
continuo del empaque junto con el líquido y los contaminantes es el movimiento se
lleva a cabo gracias a la turbulencia generada por las burbujas de aire. El reactor
se empaca con un 30 a un 70 % del volumen del reactor, con material de soporte
(Metcalf y Eddy, 2003). Se debe de buscar que la turbulencia, sea la adecuada, para
evitar el desprendimiento de la biopelícula, la extracción de lodos en exceso se hace
a través de un sedimentador, el cual se diseña como un sedimentador primario
convencional. Por otro lado, estos reactores permiten la generación de una biomasa
característica de cada tipo de reactor (aerobio, anóxico o anaerobio) dando lugar a
la obtención de una biopelícula con una elevada actividad. Experimentalmente se
ha constatado que las tasas de nitrificación y desnitrificación en este tipo de
procesos son superiores a las obtenidas en los procesos convencionales, además
de que presentan una recuperación rápida del proceso ante inhibiciones por la
formación de una biopelícula estratificada.
9
3.2.3.-Ventajas de los Reactores de lecho móvil (RLM)
Entre las principales ventajas que presentan los reactores de lecho móvil son:
❖ Reducción de volumen de la instalación global en función del área superficial

específica del medio de soporte.
❖ Son de gran flexibilidad en cuanto al llenado del reactor. Para una operación
adecuada del reactor se recomienda un llenado de material de soporte del
30 al 70 %.
❖ En este sistema no es necesario un sistema de recirculación.
❖ Fácil operación y control del proceso
❖ Estos reactores permiten la generación de una biomasa característica de
cada tipo de reactor (aerobio, anóxico o anaerobio) dando lugar a la
obtención de una biopelícula con una elevada actividad. Experimentalmente
se ha constatado que las tasas de nitrificación y desnitrificación en este tipo
de procesos son superiores a las obtenidas en los procesos convencionales
❖ Recuperación rápida del proceso ante inhibiciones por la formación de una
biopelícula estratificada.
3.2.4.-Parámetros de diseño y operación
Para el correcto funcionamiento de los reactores, es importante controlar los

parámetros de diseño y operación como: tiempo de retención hidráulico, carga
orgánica y tiempo de retención celular (Tabla 3.1).
10
Tabla 3.1.- Parámetros de operación para reactores de lecho móvil, usando efluentes acuícolas y acuícolas sintéticos
Parámetro Formula Interpretación Reportados Referencias

Tiempo de 𝑉 TRH.- Tiempo de retención hidráulico (h)
𝑇𝑅𝐻 =
retención 𝑄 Q.- Caudal que entra al sistema (m3/h) De 5 min a 5 días máximo (Bassin et al., 2015;
hidráulico (TRH) V.- Volumen del reactor (m3) Pfeiffer Wills, 2011;
Rusten et al., 2006;
Terjesen et al., 2013)
Tiempo de 𝑆𝑇𝑏𝑖𝑜𝑝 ∗ 𝐴 𝑆𝑇𝑏𝑖𝑜𝑝 .- Sólidos en la biopelícula (mg/m2) *12 y 13 días, para lograr
𝑇𝑅𝐶 =
retención celular 𝑆𝑒𝑓 ∗ 𝑄 𝑆𝑒𝑓 .- Masa de sólidos del efluente (mg/L) concentraciones bajas de (González et al.,
(TRC) A Área del material de soporte (m2) amonio. 2002;
*4 a 6 días nitrificación Pfeiffer y Wills,
despreciable. 2011)
*4 a 13 días nitrificación
parcial.
Carga hidráulica 𝑄 C.H.- Carga hidráulica (m3/m2.d) - -
𝐶. 𝐻 =
𝐴 Q .-Caudal que entra al reactor (m3/d)
A .-Área específica superficial total del medio de
soporte (m2)
Carga Orgánica 𝑐𝑥𝑄 C.O.- Carga Orgánica (gDQO/m2.d) - -
𝐶. 𝑂 =
𝐴 Q.-Caudal que entra al reactor (m3/d)
A .-Área específica superficial total del medio de
soporte (m2)
𝑐𝑥 .-Concentración del sustrato que entra al
reactor (gDQO/m3)
Carga Amoniacal 𝑐𝑥𝑄 C.A.- Carga Amoniacal (gN-NH3/m2.d) Se encuentran reportes (Pfeiffer y Wills, 2011;
𝐶. 𝐴 =
𝐴 Q .-Caudal que entra al reactor (m3/d) que van desde los 0 a 1 g Rusten et al., 2006;
A .-Área específica superficial total del medio de NAT/m2. d Terjesen et al., 2013)
soporte (m2)
𝑐𝑥 .-Concentración del sustrato que entra al
reactor (g NAT/m3)
11
Se tienen valores recomendados para los parámetros de diseño de reactores de lecho
móvil para el tratamiento de aguas residuales municipales (Tabla 3.2.), sin embargo, para
el tratamiento de efluentes acuícolas, no se han estandarizado los valores, ya que los
datos reportados, son muy variados, debido a que dependen de los sistemas de cultivo.
Tabla 3.2.- Parámetros típicos de diseño para reactores de lecho móvil para aguas residuales
domésticas (Adaptado de Metcalf y Eddy, 2003).
PARÁMETROS RANGO DE VALORES UNIDAD

TRH anóxico 1.0–2.0 H
TRH aerobio 3.5-4.5 H
Área específica superficial 200-1200 m2·m-3
DBO 1.0-1.4 kg·m-3·d-1
Velocidad de aplicación hidráulica al sedimentador 0.5-0.8 m·h-1
secundario
3.3.- Dinámica de comunidades bacterianas
En los procesos de tratamiento de aguas residuales, las bacterias forman comunidades

de suma importancia en la degradación de contaminantes (Manahan, 2007). Las
comunidades bacterianas están definidas según Atlas y Corzo, (2002) como un conjunto
integrado de poblaciones microbianas que interaccionan entre ellas y coexisten en un
espacio determinado, denominado hábitat. En una comunidad, cada microorganismo que
ha logrado sobrevivir, desempeña un papel funcional que contribuye al mantenimiento de
estas comunidades (Atlas y Corzo, 2002). Las poblaciones de una comunidad que utilizan
los mismos recursos muestran a menudo una intensa competencia, donde en alguno de
los casos se produce una sucesión de poblaciones, en la cual la mejor adaptada
desplazan a las que ocupan el nicho original (Atlas y Corzo, 2002). Las biopelículas son
comunidades microbianas complejas que se desarrollan formando una sucesión que se
inicia con la colonización de la superficie (Atlas y Corzo, 2002; Madigan et al., 2009). El
tiempo en el que se da la fase inicial de la colonización superficial es relativamente corto;
puede ser desde unos cuantos minutos en que se puede formar la película molecular y
12
la colonización bacteriana ya es significativa a las 24 h (Atlas y Corzo, 2002; Characklis
et al., 1990).
Esta propiedad que tienen los microorganismos de formar biopelículas, ha sido

aprovechada por la biotecnología para ser usada en el tratamiento de aguas residuales,
donde se utilizan microorganismos soportados para conseguir una mayor eficiencia de
remoción de contaminantes, además de desarrollar procesos de degradación de
contaminantes muy específicos, tal es el caso de la remoción de nitrógeno en RLM
(Reboleiro et al., 2015).
3.3.1.- Composición de la biopelícula
La composición de la biopelícula está dada por el tipo de efluente que se esté tratando,
con base en esto se va a establecer una comunidad endémica que es la que se va
encarga de la degradación de los contaminantes (Hashimoto et al., 2014; Li et al., 2015;
Wang et al., 2015). Las biopelículas están conformadas principalmente de sustancias
poliméricas y bacterias (80-90%), aunque también en menor proporción se encuentran
presentes metazoarios y protozoarios (Metcalf y Eddy, 2003).
3.3.2.- Remoción biológica de nitrógeno.
Se han desarrollado diferentes alternativas para la remoción de nitrógeno en las plantas

tratadoras de efluentes acuícolas, donde los procesos biológicos de nitrificación
bacteriana autotrófica son los más eficientes y económicos (Ebeling et al., 2006). Este
proceso es llevado a cabo por un conjunto de especies bacterianas que forman parte del
ciclo del nitrógeno (Figura 4.3.2), miembros de la familia Nitrobacteriasceae, que son
microorganismos aerobios obligados que no tienen capacidad para desarrollarse en los
cultivos axénicos convencionales empleados para los microrganismos heterotróficos
13
(Ornelas et al., 2012) debido a sus requerimientos nutricionales especiales y su lenta
velocidad de desarrollo.
Autotrophs
bacteria
Figura 3.3. Ciclo del nitrógeno en el agua tomado de Nature education (2010), modificado y
complementado de (Lüke et al., 2016; Madigan et al., 2009).
Nitrificación
El proceso de nitrificación biológica ocurre en dos etapas, una es la amonificación aerobia

del nitrógeno amoniacal (NH3 y NH4+) a nitritos (NO2-), y el otro la oxidación de los nitritos
(NO2-) a nitratos (NO3-).
El proceso de nitrificación es generalmente realizado por bacterias quimiolitoautótrofas

que emplean el carbono inorgánico como fuente de carbono para la síntesis celular y el
nitrógeno inorgánico para obtener energía (Madigan et al., 2009). Los microorganismos
involucrados en este proceso se dividen en dos grupos bien diferenciados (Figura 3.3),
las bacterias amonioxidantes (AOB) que se encargan de la conversión del nitrógeno
amoniacal en nitritos formando hidroxilamina como producto intermediario en donde
14
intervienen, los genes amoC, amoA, amoB y hao, y las bacterias oxidantes de los nitritos
(NOB) que se encargan de la oxidación de los nitritos a nitratos (Timmons et al., 2012),
entre los genes más importantes tenemos a norA y norB (Zehr y Kudela, 2011).
Desnitrificación
El proceso de desnitrificación consiste en la reducción de los nitratos a nitritos y,

posteriormente, a compuestos de nitrógeno gaseoso (óxido nítrico NO, óxido nitroso N 2O
y nitrógeno diatómico N2) por medio de bacterias heterótrofas, con presencia de genes
narB, nirK, nirS y nosZ. La producción energética (ATP) a partir de los nitritos y los nitratos
es menor que la obtenida directamente a partir de oxígeno, pero mayor que la obtenida
a partir de la reducción de sulfato. Este potencial energético determina la preferencia por
parte de los microorganismos de emplear un aceptor de electrones u otro (Brock, 1994).
Cuando hay oxígeno, los microorganismos tendrán preferencia hacia éste frente a los
nitritos y nitratos, mientras que en ausencia de oxígeno disuelto los microorganismos
tendrán preferencia sobre el nitrito y el nitrato antes que sobre el sulfato disponible
(Madigan et al., 2009). La utilización de los aceptores de electrones está condicionada a
los cambios metabólicos ocurridos en la bacteria, generalmente a nivel de síntesis
enzimática. En sistemas de cultivo puro se ha encontrado que el oxígeno es responsable
de la supresión de la síntesis de enzimas para el proceso de desnitrificación (Cuervo-
López et al., 2009).
Las fuentes de carbono orgánico que pueden servir como sustrato para el proceso de
desnitrificación de aguas residuales incluyen compuestos orgánicos presentes en las
aguas residuales urbanas e industriales, o pueden ser compuestos adicionados durante
la etapa anóxica como metanol (CH3OH), etanol (C2H5OH) ácido acético (CH3-COOH),
glucosa, entre otros.
15
3.3.3.- Factores que intervienen en la remoción biológica de nitrógeno
Tabla 3.3.- Parámetros fisicoquímicos que intervienen en la remoción de amonio
Factor Efecto Optimo Referencias
Ph *Efecto en la 7-8 (Ebeling et al.,

respuesta de las 2006; Masser,
bacterias Rakocy y
Losordo, 1999;
*Cantidad de iones Summerfelt et
en el medio al., 2015)
Alcalinidad *Consumo en la 50- 100 mgL-1 CaCO3 (Ebeling et al.,

reducción de 2006; Masser et
amonio a nitratos al., 1999)
7.14 g CaCO3 por
cada g de amonio
Temperatura *Dinámica de los 16.1 – 28.3 °C, Rangos de estudio (Ebeling et al.,
microorganismos 2006; Zhang et
al., 2014)
*Eficiencia de los
microorganismos e
inhibición
OD *Factor limitante, > 2 mgL-1 (Ebeling et al.,

ya que, sin oxígeno 2006; Masser et
disuelto, hay al., 1999)
competencia con
bacterias
heterótrofas.
Relación C/N *Favorece el *0,5 a 8 la fracción de las bacterias (Barajas, 2002)

crecimiento de una nitrificantes disminuye frente a las
comunidad heterótrofas
especifica en la
biopelícula *> 5, el proceso puede considerarse
una combinación de procesos de
oxidación de carbono y nitrificación.
*<0,5, el proceso puede considerarse

dedicado exclusivamente a la
eliminación de nitrógeno.
16
3.3.4.- Identificación de comunidades bacterianas
Cuando se pretende realizar un análisis microbiano a nivel de comunidad, es muy difícil

determinar la estructura de la misma, debido a que esto implica la identificación genética
de sus integrantes. Esto implica un gran número de pruebas, tanto bioquímicas como
fisiológicas. Este tiempo puede ser tan largo que sobrepase la duración del estudio, o al
menos, el tiempo en el cual se puede dar respuesta a un problema determinado (Ramos,
1996). Además, la identificación a nivel de especie no siempre garantiza que una
determinada característica, por ejemplo la degradación de sustrato, sea característica de
la especie y no de una cepa en particular (Zamora, 2012), por tanto, el análisis metabólico
de una comunidad microbiana surge no sólo como una alternativa viable, si no también
poderosa, debido a que involucra el atributo funcional de la comunidad (Zamora, 2012).
La estructura funcional de la comunidad se puede considerar como una alternativa para

la estimación de la diversidad. Debido a que además de apoyar el desarrollo de la
identificación genética, se basa en las características metabólicas de los
microorganismos y constituyen una herramienta útil, pues es consecuencia de la
diversidad genética taxo-específica de los efectos ambientales sobre la expresión
genética y de las interacciones ecológicas con otros taxa (Zak et al., 2014). La diversidad
funcional comprende el conjunto de capacidades metabólicas presentes en un ambiente,
donde la información no solo repara en taxa y no requiere de conocimientos detallados
acerca de la identificación de los microorganismos involucrados, pero expresa su
actividad fisiológica dentro del ecosistema (Zamora, 2012), un ecosistema con una alta
diversidad funcional opera más eficientemente en términos de productividad, resiliencia
y resistencia (Ricotta, 2005).
Esta diversidad funcional resulta muy útil en los casos del estudio de comunidades de
microorganismos presentes en un sistema de tratamiento de aguas residuales, donde el
interés fundamental es la capacidad de degradación de los contaminantes que pudieran
estar presentes en el efluente a tratar. Se han realizado algunos estudios con base en el
perfil metabólico de comunidades, en muestras de efluentes de granjas porcinas y
17
humedales (Li et al., 2016; Nivala et al., 2015), con el fin de mejorar el entendimiento del
potencial de degradación de materia orgánica con diferente estructura molecular.
3.3.5- Análisis de la diversidad metabólica de la comunidad mediante Biolog

Ecoplate
Una de las herramientas que ha sido de gran importancia para el análisis de las
comunidades bacterianas en décadas recientes es el análisis funcional como indicador
de la estructura de las comunidades microbianas a través de la utilización de diferentes
fuentes de carbono, para poder así establecer su perfil metabólico (Button et al., 2016;
Garland, 1997; Weber y Legge, 2010).
El perfil fisiológico a nivel comunidad (CLPP por sus siglas en inglés: Community-Level
Physiological Profiling) es una técnica con un protocolo fácil de aplicar, que proporciona
una gran cantidad de información referente a la diversidad metabólica de una comunidad
determinada. Dos o más comunidades pueden ser comparadas con base en la utilización
de diferentes fuentes de carbono (Weber y Legge, 2010) ya que mientras la comunidad
tenga la capacidad de degradar un sustrato será útil para el proceso de tratamiento, sin
importar que se pudieran llegar a presentar cambios poblacionales en la estructura de la
comunidad.
Las microplacas Ecoplate de BIOLOG® constituyen una técnica ampliamente usada

(Button et al., 2016; Garland, 1997; Garland et al., 2001; Nivala et al., 2015) para
identificar el perfil metabólico de una comunidad. La placa contiene 31 fuentes de carbono
con diferente estructura molecular y un blanco, todas por triplicado. Esto hace un total de
96 pocillos que contienen una sal de tetrazolium que funciona como indicador por la
oxidación de las moléculas de NADH, producto del metabolismo de la comunidad
bacteriana, formando Formazan, un compuesto color violeta, que es cuantificado por
medio de un espectrofotómetro a 590 nm.
18
3.3.6- Estructura genética de la comunidad a través del polimorfismo en la
longitud de los fragmentos de restricción terminales (TRFLP)
Los métodos de detección de huellas genéticas basadas en el estudio del material

genético (ADN ó ARN), permiten conocer un perfil representativo de la estructura
poblacional en una comunidad bacteriana asociada a determinado hábitat, que incluye
tanto las poblaciones cultivables como las no cultivables (Muyzer et al. 1993, Huber et
al. 2004). Las técnicas moleculares asociadas a la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR por sus siglas en inglés: polymerase chain reaction) han permitido el estudio de la
composición de comunidades bacterianas en diferentes muestras. La identificación se
realiza a partir de un templado de ADN de la comunidad el cual es amplificado por PCR
(Liu et al., 1997) que posteriormente es tratado con enzimas de restricción específicas
para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restricción
hacen un proceso de digestión restrictiva en el cual reconocen secuencias cortas y
específicas en el ADN que cortan, dejando fragmentos de distintas longitudes. Los
fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa. Esto
proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular debido a la
diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de restricción
varían
19
IV.- Marco conceptual de la investigación
4.1.- Hipótesis
Al incrementar la relación C/N de alimentación de un reactor de lecho móvil, para el

tratamiento de efluentes acuícolas, aumentará la diversidad metabólica y se modificará
la estructura de la comunidad de la biopelícula.
4.2.- Objetivo
4.2.1.- Objetivo general
Analizar los cambios en la diversidad metabólica y la estructura de la comunidad

bacteriana en la biopelícula de un reactor de lecho móvil, para el tratamiento de un
efluente acuícola sintético, con el incremento de la relación C/N.
4.2.2.- Objetivos específicos
a) Evaluar la eficiencia de remoción de contaminantes en el biorreactor, alimentado

con dos relaciones C/N y con los dos efluentes tratados.
b) Comparar el perfil metabólico de la comunidad bacteriana de la biopelícula del

reactor de lecho móvil, con cada relación C/N y con los dos efluentes tratados.
c) Comparar la estructura de la comunidad bacteriana en la biopelícula del reactor de

lecho móvil, alimentado con dos relaciones C/N y con los dos efluentes tratados.
d) Determinar cómo influyen los parámetros operacionales del biorreactor, en el perfil

metabólico de la comunidad bacteriana de la biopelícula.
e) Determinar cómo influyen los parámetros operacionales del biorreactor, en la

estructura de la comunidad bacteriana de la biopelícula.
20
V.- Materiales y Métodos
5.1.- Plan experimental

Se trabajó con un diseño experimental 22, con dos efluentes acuícolas sintéticos y con
dos relaciones C/N (en términos de relación kgDQO/kgN-NH3) para cada efluente. Las
relaciones C/N a las cuales se trabajó fueron de 1 y 10. La Carga Amoniacal (CA) teórica
trabajada en el reactor fue de 0.11 gN-NH4/m2d. La carga orgánica teórica trabajada en
el reactor fue de 0.11 y 1.13 g/m2d para las relaciones C/N de 1 y 10 (kgDQO/kgN-NH3)
respectivamente.
5.2.- Preparación del efluente acuícola sintético
Se preparó el efluente acuícola sintético, con una relación C/N (DQO/N-NH3) de 1 y 10.
Para ajustar la DQO se adicionó ácido acético (85 %, Golden Bell®) ó D-Glucosa
(MEYER®) y para ajustar el N-NH3 a una concentración de (17 mg N-NH3/L) se llevó a
cabo con nitrato de amonio (Meyer®) y fosfato de amonio (Labessa®).
La preparación del sustrato se realizó cada 5 días en un bidón con capacidad de 200 L
manteniendo la solución en agitación constante.
5.3.- Descripción del RLM
Se trabajó con un reactor de lecho móvil a escala laboratorio, cilíndrico con fondo en
forma de un cono truncado, con un volumen útil de 40 L. El diámetro en la parte superior
fue de 0.5 m, en el fondo del cono trunco se colocó un difusor de aire circular (Ø d = 25
cm), con membrana, de burbuja fina (Øb ≤ 2 mm), que se encargó de proporcionar la
aireación y agitación al reactor (Figura 5.1). El Influente con un caudal de 1.7 L/h fue
bombeado dentro del RLM. El efluente salió del reactor por gravedad con apoyo de un
canal de sección semicircular, ranurado en la mitad superior del perímetro.
21
Figura 5.1.- Reactor de lecho móvil piloto, con volumen útil de 40 L
El material de soporte usado en el reactor de lecho móvil fue Kaldnes® K1, con densidad
especifica de 0.96 g/cm3 y densidad de área superficial de 500 m 2/m3. Sus medidas son
7.1 mm de longitud, 9.1 mm de diámetro. Se trabajó con un volumen aparente de llenado
del 30 % con respecto al volumen útil del reactor.
5.4.- Inoculación del RLM
Para la inoculación del RLM se usó biopelícula soportada del reactor del RAS del
laboratorio de Biología Acuática, de la Facultad de Biología de la UMSNH. Se realizó una
etapa de adaptación, que consistió en alimentar al reactor con una solución de ácido
acético (85 %, grado técnico, Golden Bell®), nitrato de amonio (grado técnico, Meyer®)
y fosfato de amonio (grado técnico, Labessa®). Esto se llevó a cabo durante 6 días,
alimentando con relaciones de C/N (kgDQO/kgN-NH3) de 10, 5 y 1 (kgDQO/kgN-NH3).
5.5.- Operación y medición de parámetros
El reactor se dejó estabilizar por un periodo de 12 semanas alimentándolo con el efluente

acuícola sintético con la relación C/N de 1 kgDQO/kgN-NH3. Después de la adaptación,
22
se realizó un seguimiento del reactor estabilizado con esta relación C/N durante dos
semanas y posteriormente se realizó el cambio de relación C/N de 1 kgDQO/kgN-NH3 a
10 kgDQO/kgN-NH3, con un tiempo de adaptación de dos semanas más entre ambas
condiciones experimentales, para realizar las determinaciones de los parámetros
fisicoquímicos y de diversidad metabólica y genética. Este procedimiento se repitió con
el segundo sustrato, incluyendo las dos semanas de adaptación entre ambos sustratos.
Los parámetros de diseño teóricos del reactor se muestran en la tabla 5.1.
Las condiciones experimentales no fueron controladas, es decir no se controló ni la

temperatura, ni el pH. Únicamente se llevó un control, tomando lecturas constantes
conforme a las metodologías citadas en la tabla 5.2.
Los parámetros de diseño teóricos del reactor se muestran en la tabla 5.1
Tabla 5.1.- Parámetros de diseño del reactor de lecho móvil
Parámetro Valor Unidad
TRH 24 h
V reactor 40 L
V llenado 30 %
Q 40 Ld-1
5.6.- Análisis de muestras

Se tomaron muestras en 4 puntos, que fueron; el efluente, el influente, el reactor y la
biopelícula soportada. Los análisis fisicoquímicos se realizaron según diferentes
metodologías (Tabla 5.2). Se realizaron mediciones cada 15 días, hasta la estabilización
del reactor y posteriormente de manera semanal, junto con la toma de la muestra de los
puntos anteriores, también se tomó muestra de la biopelícula para el análisis del perfil
metabólico de la comunidad del reactor y la Estructura de la comunidad.
23
Tabla 5.2.- Parámetros determinados y metodologías usada
Parámetro Afluente Reactor Efluente Biopelícula Método
SST (mg/L) ✓ ✓ Método por gravimetría (Métodos

estandarizados)a
SSV (mg/L) ✓ ✓ Método por gravimetría (Métodos

estandarizados)a
N-NO3 (mg/L) ✓ Método de reducción con cadmiob
N-NH3 (mg/L) ✓ ✓ Método del salicilato b
PH ✓ Thermo Scientific, Orion Star AZ11

potensiometro.
DQOT (mg/L) ✓ ✓ Método de digestión en reactor y

colorimetría, espectrofotómetro
DR800, Hach (0-1,500 mg/L).
Temperatura (°C) ✓ NMX-AA-007-SCFI-2013
OD (mg/L) ✓ Sonda para determinación de

oxígeno disuelto YSI125 modelo:
55-25 FT
DQOS (mg/L) ✓ Método de digestión en reactor y

colorimetría, espectrofotómetro
DR800, Hach (0-1,500 mg/L).
Perfil metabólico ✓ Ecoplate BIOLOG ®
SV (mg/L) ✓ Método por gravimetría (Métodos

estandarizados)a
ST (mg/L) ✓ Método por gravimetría (Métodos

estandarizados)a
a(APHA, 1992), bEspectrofotómetro DR2800 Hach Co.Colorado, US
Los análisis en la biopelícula, tanto para sólidos, como para el análisis del perfil
metabólico y Estructura de la comunidad de las comunidades bacterias se describe a
continuación: la toma de muestras se hizo en el periodo estable durante 3 semanas
consecutivas para cada relación C/N con cada uno de los sustratos, asignándoles un
código (Tabla 5.3).
24
Tabla 5.3.- Código de las muestras que se trabajaron con los dos sustratos y las dos relaciones
C/N
Relación C/N Semana Efluente acuícola 1 Efluente acuícola 2

1 1 1AA1 1G1
2 1AA2 1G2
3 1AA31 1G3
10 1 10AA1 10G1
2 10AA2 10G2
3 10AA3 10G3
5.7.- Desprendimiento de la biopelícula
Para los análisis de sólidos totales y volátiles en la biopelícula, así como para el análisis
del perfil metabólico, se desprendió la biopelícula del material de soporte. Se colocaron
muestras de 25 piezas de kaldnes del RLM, tomada al azar en un vaso estéril con 45 mL
de solución buffer de fosfatos ([pH 7,0], 0.1 M) estéril. Se sónico la muestra por 20 min
en un Sonicador Branson modelo 2510.
5.8.- Análisis del perfil metabólico (CLPP) de las comunidades bacterianas
Uno de los objetivos principales de la ecología microbiana para entender el papel de los
microorganismos en el ambiente, es comprender los procesos metabólicos que realizan
éstos (Characklis et al., 1990). Un acercamiento a esta problemática fue realizado con la
evaluación del perfil metabólico de la comunidad en la biopelícula. Este tipo de estudio
se espera que sólo detecte cambios drásticos en la comunidad microbiana de la
biopelícula, tal es el caso del cambio de relación C/N.
El perfil metabólico de la comunidad fue evaluado mediante las placas EcoplateTM de

BIOLOG. Después de haber desprendido la biopelícula del material de soporte (c.f.
subcap 5.7), se colocó la muestra en agitación durante 45 min. Se dejó reposar durante
30 min con la finalidad de que sedimente material de la biopelícula que no son bacterias
(EPS, arenas etc). Se tomaron 7.5 mL de la muestra, se colocaron en 5 tubos de
25
microcentrifuga de 1.5 mL y se centrifugaron por 10 min a 4 g. Se realizaron 4 diluciones
(1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000) en solución buffer de fosfatos ([pH 7,0], 0.1 M) estéril. Se
sembraron las últimas tres diluciones en agar de soya tripticaseina (AST) por triplicado
con la técnica de expansión con varilla (Figura 5.2). Se incubaron por 24 h a temperatura
ambiente. Se realizó una cuenta viable para determinar las UFC/mL contenidas en la
muestra. Se realizó una dilución de la muestra original en solución buffer de fosfatos ([pH
7,0], 0.1 M) estéril, con la finalidad de inocular 5000 UFC/mL en las EcoplateTM.
Figura 5.2- Dilución de la biopelícula y siembra en agar de soya tripticaseinaa para estandarizar
el volumen inoculado en las placas Biolog EcoplateTM
De la solución anterior se inocularon 150 µL en cada uno de los pozos de la placa

EcoplateTM. Se tomó lectura de la placa en el T0 y posteriormente cada 12 h en la estación
MICROLOGTM a 590 nm. Las placas fueron inoculadas a temperatura ambiente. La
absorbancia evaluada para cada uno de los 31 sustratos fue corregida por la resta del
blanco control y la lectura del tiempo 0 (Weber y Legge, 2010).
26
La observación del Promedio de Desarrollo del Color del Pozo (AWCD por sus siglas en
inglés: Average Well Color Development), se realizó para conocer el comportamiento del
aprovechamiento de los sustratos a través del tiempo. Para evaluarlo se eligieron 3
puntos en las cinéticas, correspondientes a las horas 24, 64 y 120. Fueron elegidas de
esa manera, dado que a la hora 24 es cuando en la mayoría de las cinéticas empezó la
fase exponencial, a la hora 64 todas las cinéticas se encontraban en fase exponencial
(Garland, 1997; Weber y Legge, 2010) y a la hora 120, se encontraban en fase estable.
Se determinó la diversidad de consumo de sustratos por la comunidad de la biopelícula,
se calculó la riqueza (número de sustratos metabolizados), la abundancia (Abs medida
en cada uno de los pozos) y la diversidad (índice de Shannon) (Tabla 5.4). Los índices
de diversidad son muy usados en ecología como una medida de evaluación de la
diversidad de los sitios. En el presente trabajo se utilizó el índice de Shannon y
equitatividad de Shannon para comparar la capacidad de degradación de los sustratos
en la placa, por la comunidad de la biopelícula del RLM.
Tabla 5.4.- Fórmulas para calcular los índices de diversidad metabólica
índice Definición Formula Significado

AWCD 𝐴𝑊𝐶𝐷 Ai= Absorbancia medida en el
1 pozo i y Ao representa la
= ∑(𝐴𝑖 − 𝐴0 ) absorbancia del blanco
31
Índice de Estima el grado 𝐻 = ∑ 𝑝𝑖(𝐿𝑛 𝑝𝑖) H= índice de diversidad de
Shannon de incertidumbre Shannon
Pi= proporcional al desarrollo
del color (Absorbancia) en
cada pocillo entre el total de
pocillos (Absorbancia total)
índice de Estima la 𝐻 S=Riqueza= Número de
𝐸=
Equidad o equidad en las 𝐿𝑛 𝑆 pocillos con desarrollo de
Equitatividad proporciones color (Sustrato utilizado)
de Shannon encontradas de
cada producto
en la comunidad
27
Los 31 sustratos contenidos en las Ecoplate se categorizaron en 5 grupos, que fueron;
carbohidratos, polímeros, aminoácidos, ácidos carboxílicos y aminas/amidas (Gryta y
Oszust, 2014). Se evaluó la dinámica de degradación de los grupos, a la hora 24, 64 y
120 con cada una de las condiciones experimentales.
5.10.- Análisis estadístico del perfil metabólico
Como análisis exploratorios del comportamiento metabólico de la comunidad, se realizó

un Análisis de Componente Principales (PCA por sus siglas en inglés) usando una matriz
de covarianza de la media (n=3) de los datos de las réplicas del patrón de utilización de
fuentes de carbono (CSUPs por sus siglas en inglés), con base en los 5 grupos
(Carbohidratos, polímeros, ácidos carboxílicos y cetónicos, aminas y amidas y
aminoácidos) en los que se clasificaron los sustratos en las tres horas evaluadas de
acuerdo con las recomendaciones de Weber y Legger, (2010).
El índice de Shannon puede ser evaluado de manera estadística mediante la prueba de

t modificada por Hutchenson, cuando se quiere comparar únicamente dos comunidades
(Moreno, 2001). Por tanto, en el presente trabajo se evaluó la diferencia estadística
mediante esta prueba.
Los índices de diversidad beta son usados para conocer el cambio de una comunidad
con respecto a un gradiente ambiental, a diferencia de la diversidad alfa o gama, que son
medidas fácilmente en función del número de especies. La diversidad beta está basada
en la diferencias o proporciones de una comunidad con respecto al gradiente ambiental
(Moreno, 2001). En este trabajo se evaluó la similitud que existió entre la comunidad del
RLM en cada una de las condiciones experimentales mediante el uso el índice de Bray-
Curtis (Moreno, 2001).
Los análisis de correlación canónica (CCA por sus siglas en inglés) tienen la finalidad de
buscar la relación que existe entre dos o más tipos de variables y la validez de las mismas.
En el presente estudio se realizó un CCA con el objetivo de encontrar la relación entre
los dos conjuntos de variables; degradación por grupos de sustratos en la placa de
28
EcoplateTM (Carbohidratos, Polímeros, Ácidos carboxílicos, aminoácidos y
aminas/amidas) y las variables de operación del reactor (DQO, N-NH3, SSV, T y pH).
Para conocer el efecto de la relación C/N sobre los resultados obtenidos, se evaluaron
estadísticamente tanto los parámetros fisicoquímicos como los metabólicos, mediante
análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, complementando con la prueba de
comparación múltiple de Tukey.
Los análisis de PCA y CCA se corrieron con PAST 3.0, mientras que las pruebas de
ANOVA y Tukey se hicieron en JMP v. 6.0 (SAS, 2005).
5.9.- Estructura de la comunidad

5.9.1.- Extracción de DNA
Se transfirieron 4.5 mL por partes de la biomasa desprendida de la biopelícula como se
describe previamente (Sub-capitulo 5.8) a un tubo de 1.5 mL y centrifugo por 5 minutos
a 4 g. Se desechó el sobrenadante, y se añadió 1mL de solución TE (10mM Tris-HCl pH8;
1mM EDTA; 100mM NaCl). Se agitó en un vortex hasta disolver la pastilla. Se centrifugó
5 min a 4 g. Se agregaron 200 µL de solución TE y se disolvió la pastilla agitando en el
vortex. Se centrifugó durante 2 minutos a 4 g y se agregaron 250 µL de solución
amortiguadora (40mM Tris pH 7.8; 20mM, acetato de sodio; 1mM EDTA; 1% SDS). Se
añadieron 66 µL de solución de NaCl 5 M y se mezcló bien la muestra por inversión.
Posteriormente se calentó la muestra por 10 min. a 65 ºC. Después se centrifugó la
muestra a 6 g por 10 min. y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 mL. Se
añadió 1 volumen de cloroformo:alcohol isoamilico 24:1 (v/v) y posteriormente se agitó el
tubo en el vortex. Se centrifugó la muestra durante 10 min. a 6 g, se tomó la fase acuosa
(de arriba) sin romper la interfase. Se agregó 0.6 mL de isopropanol y se agitó
manualmente por inversión (20 veces). Se centrifugó la muestra por 10 min. a 6 g, se
retiró el sobrenadante con mucho cuidado. Posteriormente se agregaron 400 µL de
alcohol etílico al 70%, se agitó en el vortex hasta que la pastilla se levantó. Se centrifugó
por 10 min. a 6 g. Después se tiró el sobrenadante sin llevarse la pastilla y se dejó secar.
Se disolvió la pastilla en 50 µL de agua destilada libre de endonucleasas.
29
5.9.2.- Amplificación por PCR
El gen que codifica el rRNA ribosomal 16S se usó para estimar la diversidad de la
comunidad bacteriana en la biopelícula del RLM. Para la amplificación de este gen, se
usaron los oligonucleótidos fD1 y rP2 (Tabla 5.5). La mezcla de reacción para el ensayo
de PCR contenía ambos oligonucleótidos a una concentración de 200 nM, se usó GoTaq®
Green Master Mix (GoTaq® DNA polimerasa en 1X Green GoTaq ® en amortiguador,
buffer [Ph8.5], 200 µM de cada NTP (Nucleósido Trifosfato) y 1.5 mM MgCl2) (Promega,
WI, USA) y amplificado en un termociclador Maxygene (Axigen, CA, USA), con un
volumen final de 50 µL.
Tabla 5.5 – Oligonucleótidos utilizados en la amplificación de los genes.
Gen Primer Secuencia (5’-3’) a Posición Tamaño Referencias

b c
rDNA fD1* AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8-27 1504 (Weisburg et

16S al., 1991)
rP2 ACGGCTACCTTGTTACGACTT 1492-
1512
β-amo β- TGGGGRATAACGCAYCGAAAG 141-161 1179 (McCaig,
amof* 1994)
β-amor AGACTCCGATCCGGACTACG 1301-

1320
NirS1F CCTA(C/T)TGGCCGCCRCART 763–780 980 (Braker y
NirS Fesefeldt,
NirS5R CGTTGAACTTRCCGGT 1638–1653 1998)
Cd3AF* GTSAACGTSAAGGARACSGG 916-935 425 ( Throbäck et
R3cd GASTTCGGRTGSGTCTTGA 1322- al., 2004)
1341
a R(A/G)
b Las posiciones son indicadas para el gen rDNA 16 S de Escherichia coli (AkiC000091), el gen nirS de pseudomonas
stutzeri ZoBell (X56813) y para el gen β-amo con Escherichia coli.
c El tamaño esta dado en pares de bases.
* Oligonucleótidos marcado con 6-FAM (6-Carboxifluoresceina)
30
El programa de amplificación consistió en una etapa inicial de desnaturalización de 3 min
a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 30 segundos a 57 °C y 2 min a 72 °C,
con una extensión final de 20 min a 72 °C.
El gen βeta-amo que codifica para la enzima amonio monoxigenasa se utilizó como
oligonucleótido molecular de las bacterias encargadas de oxidar el amonio, se amplificó
usando una estrategia de PCR anidado. Para la primera reacción se usaron
oligonucleótidos universales fD1 y rP2 a una concentración de 200 Nm. En la segunda
reacción se usaron los oligonucleótidos para el gen βeta-amo que fueron el β-amoF y β-
amoR (Bustamante et al., 2012), información en la tabla 5.5 La mezcla de reacción se
preparó de la misma manera que para el gen 16S. La primera reacción se realizó en las
condiciones descritas anteriormente (gen 16S). Para la segunda reacción el programa de
amplificación consistió en una etapa inicial de desnaturalización de 5 min a 95 °C, seguido
de 30 ciclos los cuales constaron de 30 segundos a 94 °C, 45 segundos a 57 °C, 1 min
30 seg a 72 °C y una extensión final de 20 min a 72 °C.
Para el gen nirS que codifica la enzima nitrato reductasa se utilizó como oligonucleótidos
de las bacterias encargadas de llevar a cabo la desnitrificación. Para la amplificación se
siguió la estrategia de un PCR anidado, en la primera reacción, se usaron el par de
oligonucleótidos nirS1F/6R, para la segunda reacción se usaron los oligonucleótidos
Cd3AF y R3cd (Tabla 5.5) La mezcla de reacción se realizó de la misma manera que
para el gen 16S. El programa usado para amplificar la primera reacción consistió en una
etapa inicial de desnaturalización de 5 min a 95 °C, seguido de 30 ciclos en los cuales en
los primeros 10 fueron de 30 s a 95 °C aplicando un touchdow de 45 decreciendo 0.5 °C
hasta 40 °C, seguido de una extensión de 40 segundos a 72 °C. Los siguientes 20 ciclos
fueron 30 segundos a 95 °C, 40 segundos a 43°C, seguido de 40 segundos a 72°C, para
finalizar con una extensión de 7 min a 72 °C (Braker y Fesefeldt, 1998). El programa de
amplificación de la segunda reacción consistió en una etapa inicial de 2 min a 94 °C,
seguido de 35 ciclos los cuales constaron de 30 segundos a 94 °C, 1 min a 57 °C, 1 min
a 72 °C y una extensión final de 20 min a 72 °C.
31
La integridad de los amplicones se determinó electroforéticamente, mediante geles de
agarosa al 1.2 % (p/v) teñidos con GelRedMT (Biotium). Los amplicones de los tres genes
se purificaron mediante el kit UltraClean PCR Clean-up (MoBio Lab. inc.) de acuerdo con
las especificaciones del fabricante.
5.9.3,- T-RFLP
Los productos de PCR purificados (250 ng) de los tres genes se digirieron en reacciones
separadas con 20 U de enzimas de restricción HhaI y HaeIII (Termo Scientific®). Los
fragmentos de digestión se purificaron por precipitación alcohólica. Posteriormente los
productos se resuspendierón en buffer TE. Los fragmentos de restricción terminal (T-RFs
por sus siglas en inglés, terminal restriction fragment) se separaron en un Analizador
Genético ABI3730XL (Applied Biosystems, Macrogen Inc., en Corea del Sur). La longitud
de los T-RFs marcados fluorescentemente se determinaron por comparación con el
estándar de tamaño GeneScanTM 1200 LIZ ® con el software GeneScan 3.71 (Applied
Biosystems, Macrogen Inc., en Corea del Sur).
Los picos con una fluorescencia superior a 30 U y superior a 30 pb se analizaron con

base en la altura del pico. Los patrones de diferentes muestras se normalizaron a
unidades de fluorescencia total idénticas mediante un procedimiento de normalización
iterativo. La abundancia relativa de TRFs, como porcentaje, se calculó con la relación
entre la altura de un pico dado y la altura de los picos total normalizada de cada muestra.
El índice de Shannon (H ') se calculó para cada muestra por medio del software PAST
(disponible en: http://nhm2.uio.no/ norlex / past / download.html).
5.10.- Análisis estadístico para la estructura de la comunidad
Con el objetivo de encontrar la relación entre los dos conjuntos de variables; Estructura
de la comunidad con base en los TRF’s y las variables correspondientes a las variables
fisicoquímicas del reactor (DQO, N-NH3, SSV, T y pH) se efectuó un análisis de
32
correlación canónica identificando los posibles efectos sobre las diferencias encontradas
en cada relación C/N con los diferentes efluentes sintéticos en el RLM.
Al igual que en la diversidad metabólica se evaluó el índice de Shannon mediante la

prueba t de Hutchenson y se obtuvieron dendrogramas con base en la diversidad beta
(índice de Bray-Curtis) para conocer las diferencias presentadas en la comunidad
bacteriana en los diferentes tiempos evaluados con las diferentes condiciones
experimentales.
Para conocer el efecto de la relación C/N sobre los resultados obtenidos, se evaluó
estadísticamente tanto los parámetros fisicoquímicos como los de estructura de la
comunidad mediante ANOVA de dos vías, complementando con pruebas de Tukey.
Los análisis de PCA, CCA se corrieron por medio del software PAST 3.0 mientras que
las pruebas de ANOVA y Tukey se hicieron en JMP v. 6.0 (SAS, 2005).
Los análisis estadísticos anteriores se realizaron para cada uno de los genes estudiados.
33
VI.- Resultados
6.1.- Seguimiento de parámetros fisicoquímicos del reactor
6.1.1.- Temperatura y pH.

Los parámetros fisicoquímicos monitoreados en el RLM se presentan en la tabla (Tabla
6.1). El oxígeno disuelto se mantuvo en una concentración > 2 mg/L durante toda la fase
experimental, condición mínima necesaria para que se pueda llevar a cabo tanto la
oxidación de la materia orgánica, como del amonio.
Tabla 6.1.- Parámetros de operación del reactor de lecho móvil a las diferentes relaciones C/N
con cada uno de los efluentes acuícolas (n=9) (media ± Desviación estándar).
Efluente acuícola 1 Efluente acuícola 2
Muestras 1AA 10 AA 1G 10 G
T (°C) 19.82 ± 0.67 a 17.30 ± 0.63 b 17.30 ± 0.63 b 16.78 ± 0.25 b
pH 8.59 ± 0.07a 8.47 ± 0.005ab 8.38 ± 0.037b 8.23 ± 0.054 c

Nota: Los valores seguidos por letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo con
la prueba de Tukey.
La fase experimental se corrió entre los meses de agosto y febrero. Se tuvo una
temperatura entre 16.5 y 20.5 °C. La más alta fue con el efluente 1AA y la menor con el
efluente 10G, mostrando una diferencia estadísticamente significativa (p=0.0008) entre
cada una de las condiciones experimentales trabajadas. La desviación estándar
mostrada en cada condición experimental trabajada no fue mayor a 0.67 °C.
Durante la fase experimental, se observó que el pH se mantuvo constante (Tabla 6.1)

con cada una de las relaciones C/N, sin embargo, el comportamiento entre las diferentes
relaciones C/N si mostró una variación estadísticamente significativa (p=0.0001).
34
6.1.2.- Remoción de nitrógeno amoniacal y DQO.
En la tabla 6.2 se muestran las concentraciones de nitrógeno amoniacal en la entrada y

salida del reactor, así como las del nitrógeno de nitratos.
Tabla 6.2- Concentraciones de DQO, N-NH3 y N-NO4 en la entrada y salida del reactor (media ±
Desviación Estándar, n=3)
Efluente acuícola Efluente del reactor
Muestras 1AA 10 AA 1G 10G 1AA 10 AA 1G 10G
DQO 17.66 ± 170.66 ± 15.66 ± 161.66 ± 2.67 ± 11.67 ± 1.33 ± 7.66 ±

(mg/L) 1.15 5.77 0.57 1.52 1.15 7.76 0.57 1.52
N-NH3 16.93 ± 17.16 ± 16.16 ± 16.2 ± 0.19 ± 0.35 ± 0.213 ± 0.25 ±

(mg/L) 1.62 1.47 0.55 0.55 0.14 0.035 0.005 0.04
N-NO4 20.5 ± 21.63 ± 14.3 ± 19.16 ± 36.43 ± 34.83 ± 25.66 ± 32.5 ±

(mg/L) 1.77 1.06 0.43 0.43 3.15 1.45 6.76 8.52
El porcentaje de amonio removido en términos de CA (Carga amoniacal) en la fase

estable de cada una de las relaciones C/N con los dos efluentes acuícolas sintéticos, se
evaluó para cada relación C/N, así como para los sustratos. Se encontró que la relación
C/N, si presentó un efecto estadísticamente significativo con respecto a la remoción de
CA (p=0.0192) entre cada efluente evaluado. Sin embargo, no se observó ningún efecto
para los efluentes evaluados (p=0.1837). El mayor porcentaje de remoción se obtuvo
cuando se trabajó con el efluente 1G, mientras que la menor remoción fue cuando se
trabajó con el efluente 10AA (Tabla 6.3).
35
Tabla 6.3.- Porcientos de remoción de CA (Carga Amoniacal) sin diferencia estadísticamente
significativa (p= 0.0647) y CO (Carga Orgánica) con diferencia estadísticamente significativa (p=
0.0371*) para cada una de las condiciones experimentales (media ± Desviación Estándar, n=3).
Efluente acuícola 1 Efluente acuícola 2

Muestras 1AA 10 AA 1G 10 G
% Remoción de CA 98.823± 0.473a 98.00± 0.482 a 99.07 ± 0.031 a 98.46 ± 0.501 a
% Remoción de CO 82.755± 6.789 b 93.304 ± 4.459 ab 91.41± 3.129 ab 95.268 ± 0.932 a
La materia orgánica removida del efluente acuícola, medida como DQO a la salida del
RLM con cada una de las condiciones experimentales, mostro tener un efecto significativo
para las relaciones C/N (p=0.0107). El mayor porcentaje de remoción en términos de CO
(Carga Orgánica), se obtuvo cuando se trabajó con la condición 10G, presentando una
diferencia estadísticamente significativa (p=0.0371). Cabe destacar que en la remoción
de los contaminantes de interés (CA y CO) el efluente evaluado no presento diferencia
estadísticamente significativa (Tabla 6.4). Sin embargo, la relación C/N, si mostró tener
diferencia estadística.
36
Tabla 6.4.- Resumen del ANOVA de dos vías comparando las condiciones experimentales,
correspondientes a las remociones de contaminantes, y parámetros de respuesta del RLM
Respuesta del RLM R p (ANOVA) p (Efluente) p (C/N) Efluente *C/N
% remoción de carga 0.58 0.0647 0.1837 0.0192* 0.6775

amoniacal
% remoción de carga 0.63 0.0371* 0.0701 0.0239* 0.2208

Orgánica
pH 0.91 0.0001* <0.001* 0.0017* 0.6402
DQO (mg/L) 0.61 0.0462* 0.2827 0.0107* 0.5805
N-NH3 (mg/L) 0.49 0.1317 0.3985 0.0563 0.2177
SV (g/m2) 0.61 0.0462* 0.4206 0.3069 0.0113*
37
6.2.- Efecto de la relación C/N y los efluentes sobre el perfil metabólico
Las EcoplateTM de Biolog fueron usadas para medir cualitativa y cuantitativamente, el
perfil metabólico de la comunidad del RLM. En la Figura 6.1 se muestran las curvas
obtenidas para el AWCD en las placas después de realizar un seguimiento por al menos
120 h.
Relación C/N= 1 Relación C/N= 10
2 2
a) b)
1.5 1.5
AWCD
AWCD
1 1
Efluente AA
0.5 0.5
T0 1AA1 1AA2 1AA3 T0 10AA1 10AA2 10AA3
0 0
0 100 200 300 0 100 200 300
h h
2 c) 2 d)
1.5 1.5
AWCD
AWCD
Efluente G
1 1
0.5 0.5
1G1 1G2 1G3 T0 10G1 10G2 10G3 T0

0 0
0 100 200 300 0 100 200 300
h h
Figura. 6.1 - Desarrollo de color promedio (AWCD) de los sustratos metabolizados por
la biopelícula (n=3), medido por un tiempo de al menos 120 h, con las diferentes
condiciones experimentales a) Efluente AA relación C/N=1, b) Efluente AA relación
C/N=10, c) Efluente G, relación C/N=1 d) Efluente G, relación C/N= 10.
En donde se observó que el aprovechamiento promedio de la comunidad fue diferente,

cuando se trabajó con las diferentes condiciones experimentales.
38
En la tabla 6.5, se puede apreciar que conforme incrementó el tiempo, el AWCD también
fue incrementando. Éste fue mayor entre la hora 24 y 64, cuando los sustratos contenidos
en las placas son provechados por la comunidad bacteriana de la biopelícula. Se encontró
que el AWCD para las diferentes condiciones experimentales trabajadas, fue mayor el
AWCD cuando se trabajó con la condición 10G.
Tabla 6.5- Valores del AWCD promedio con su desviación estándar en cada una de las
muestras (n=3)
Muestras 24 h 64 h 120 h
1AA1 0.0527 ± 0.0109 0.4345 ± 0.0210 0.783 ± 0.029
1AA2 0.092 ± 0.0261 0.6165 ± 0.0275 0.898 ± 0.079
1AA3 0.0353 ± 0.0205 0.453 ± 0.0407 0.734 ± 0.025
10AA1 0.0499 ± 0.0088 0.6559 ± 0.04995 1.029 ± 0.063
10AA2 0.0503 ± 0.0190 0.5544 ± 0.1120 0.868 ± 0.099
10AA3 0.0635 ± 0.0202 0.4668 ± 0.0189 0.895 ± 0.023
1G1 0.1673 ± 0.0182 0.8851 ± 0.055 1.237 ± 0.016
1G2 0.0678 ± 0.0144 0.7513 ± 0.0424 1.151 ± 0.068
1G3 0.0761 ± 0.0084 0.7274 ± 0.0074 1.059 ± 0.055
10G1 0.3340 ± 0.0164 1.2946 ± 0.0516 1.534 ± 0.106
10G2 0.2057 ± 0.0352 1.28 ± 0.0551 1.488 ± 0.106
10G3 0.3422 ± 0.0176 1.2494 ± 0.0438 1.529 ± 0.100
En la Tabla 6.6 se muestra que sí existió una diferencia estadísticamente significativa.

Con el análisis de ANOVA se pudo comprobar que tanto el efluente como la relación C/N
mostraron un efecto significativo en el perfil metabólico de la comunidad.
39
Tabla 6.6.- Resumen ANOVA de dos vías para el AWCD en los tres puntos para cada condición
experimental
R p (ANOVA) p p (C/N) Efluente

(Efluente) *C/N
AWCD (24 h) 0.83 <0.001* <0.001* <0.001* <0.001*
AWCD (64 h) 0.93 <0.001* <0.001* <0.001* <0.001*
AWCD (120 h) 0.89 <0.001* <0.001* <0.001* <0.001*
6.3.- Análisis de degradación por grupos
Los resultados fueron evaluados mediante un análisis de componentes principales (PCA)

(Figura 6.2) en donde en los primeros dos componentes está representada más del 90 %
de la variación explicada, componente 1 (61.278 %) y componente 2 (29.892 %). En el
PCA se muestra que la degradación de los sustratos agrupados cuando se trabajó con el
efluente a base de glucosa (1G y 10G) no mostró una dinámica de degradación diferente
con respecto al tiempo degradándose principalmente carbohidratos con la relación
C/N=10, mientras que las comunidades con la relación C/N=1 degradaron carbohidratos
y ácidos carboxílicos.
En la Figura 6.2 se aprecia que el grupo 10AA a la hora 24 degradaron principalmente

sustratos correspondientes al grupo de los polímeros y los carbohidratos, a la hora 64 la
degradación fue de aminoácidos y aminas/amidas y a la hora 120, se degradaron
polímeros y aminoácidos.
40
Figura. 6.2.-Análisis de componentes principales de las fuentes de carbono agrupadas
aprovechadas por la comunidad de la biopelícula con las diferentes condiciones
experimentales a las diferentes horas (24, 64 y 120). Los grupos son significativamente
diferentes (p<0.05, PERMANOVA).
El grupo de muestras correspondientes 1AA (24, 64 Y 120), degradaron polímeros a la

hora 24, aminas y amidas a la hora 64 y a la hora 120 aminoácidos.
6.4.- Análisis de la diversidad metabólica

La evaluación del índice de Shannon en los diferentes tiempos, con las diferentes
condiciones experimentales no mostró ser estadísticamente diferente (p> 0.05) en todos
los casos cuando se realizó una evaluación, con la prueba t de Huchenson.
En la figura 6.3, se observa que la variación fue poca, lo cual indica la homogeneidad de
la degradación de sustratos de la placa por la comunidad de la biopelícula con las
diferentes relaciones C/N y los dos efluentes.
41
4
3.5
2.5
1.5
0.5
0
1AA1 1AA2 1AA3 10AA1 10AA2 10AA3 1G1 1G2 1G3 10G1 10G2 10G3
24 h 64 h 120 h
Figura. 6.3.-Indices de Shannon en cada de las condiciones experimentales en los

diferentes tiempos, 24, 64 y 120 (n=3).
En la figura 6.3 se observa que cuando se evaluó el índice de Shannon a las diferentes
horas, éste fue aumentando, lo cual demuestra un incremento gradual en la degradación
de sustratos.
La evaluación del índice de Shannon a la hora 64 mediante la prueba t de Huchenson no

mostró diferencia estadísticamente significativa en ninguna de las semanas evaluadas
entre las diferentes relaciones C/N para el efluente a base de ácido acético, a base de
glucosa y tampoco para la diferencia entre las relaciones C/N=1 de ambos sustratos (AA
y G), ni relación C/N=10 (c.f. Anexo A).
Aunque no se mostró diferencia estadísticamente significativa. El mayor índice de

diversidad de Shannon medido en las placas se obtuvo cuando se trabajó con 10G y el
menor se obtuvo cuando se trabajó con las condiciones experimentales de 1AA.
42
En la hora 24 la equitatividad de Shannon estuvo arriba del 0.5 (Tabla 6.7), a la hora 120
se aprecia que todos los valores fueron superiores al 0.66 y alcanzaron valores de 0.88.
Tabla. 6.7.- Equitatividad y sustratos degradados de cada una de las muestras con las
diferentes condiciones experimentales (n=3).
Equitatividad Sustratos degradados
Muestras 24 h 64 h 120 h 24 h 64 h 120 h
1AA1 0.424 ± 0.027 0.515±0.015 0.7132±0.034 26.6 0± 0.6 26.67 ± 1.5 26.33 ± 3.1
1AA2 0.548 ± 0.022 0.561±0.010 0.708±0.017 25.30± 3.2 29.33 ± 0.6 30.00 ± 0.0
1AA3 0.6288 ± 0.011 0.548±0.062 0.634±0.008 16.00 ± 6.1 23.67 ± 3.2 28.67 ± 1.5
10AA1 0.587 ± 0.039 0.662±0.035 0.752±0.018 22.33 ± 2.3 26.33 ± 3.7 29.67 ± 0.6
10AA2 0.513 ± 0.089 0.618±0.099 0.666±0.029 20.00 ± 9.5 25.67 ± 6.6 28.00 ± 3.4
10AA3 0.615 ± 0.091 0.669±0.043 0.752±0.008 22.33 ± 7.0 23.33 ± 3.2 28.67 ± 0.6
1G1 0.618 ± 0.017 0.691±0.006 0.855±0.008 24.6 0± 3.2 29.67 ± 0.5 29.67 ± 0.6
1G2 0.627 ± 0.180 0.649±0.027 0.772±0.024 23.67 ± 3.2 28.33 ± 2.1 29.00 ± 1.0
1G3 0.690 ± 0.019 0.716±0.067 0.785±0.032 23.00 ± 2.6 24.67 ± 3.5 27.67 ± 2.4
10G1 0.586 ± 0.038 0.789±0.015 0.867±0.012 25.67 ± 3.2 29.67 ± 0.5 30.00 ± 0.0
10G2 0.588 ± 0.020 0.797±0.009 0.883±0.017 24.33 ± 1.1 30.00 ± 0.0 30.00 ± 0.0
10G3 0.569 ± 0.014 0.777±0.013 0.884±0.021 27.00 ± 0.0 30.00 ± 0.0 29.67 ± 0.6
En cuanto a la cantidad de sustratos degradados a partir de la hora 64 existe una

degradación de más del 90 % de los que se degradarían hasta la hora 120. La tendencia
de la degradación, al igual que en el índice de Shannon y Equitatividad, fue mayor cuando
se trabajó con el sustrato más complejo y a una mayor relación C/N.
43
Figura 6.4.- Diversidad Beta, formación de grupos, por efluentes mediante el índice de
Bray-Curtis (0.723) a las 24 h
Figura 6.5. - Diversidad Beta, formación de grupos, por efluentes, Bray-Curtis

(0.7034) a la hora 64.
Figura 6.6.- Diversidad Beta, formación de grupos, por efluentes, Bray-Curtis (0.7045)
a las 120 h
44
El dendrograma elaborado con base en el coeficiente de similitud de Bray-Curtis mediante
un análisis jerárquico mostró una separación marcada entre los efluentes trabajados. En
el dendrograma se observan dos agrupaciones consistentes similares en las tres horas
evaluadas. Esta agrupación se dio con base en el sustrato del efluente sintético (AA Y G)
y de manera menos marcada se presentó un agrupamiento por relación C/N trabajada
(Figuras 6.4, 6.5 y 6.6).
La similitud incrementó con el tiempo. A la hora 24 se obtuvo una similitud mayor al 50 %

mientras que a la hora 120, todas las muestras presentaron un porcentaje de similitud
mayor al 80 %. Cuando se trabajó con el efluente a base de glucosa, se obtuvo un mayor
porcentaje de similitud entre las muestras trabajadas con las diferentes relaciones C/N
en comparación al efluente a base de ácido acético.
Dado que no se observó diferencia entre las horas evaluadas, únicamente se correlaciona
las variables de respuesta del reactor con las variables metabólicas a la hora 64 que es
cuando se encontraban en fase exponencial las cinéticas. El análisis de correspondencia
canónica entre el perfil metabólico de la comunidad y los factores de operación del reactor
medidos con las diferentes condiciones experimentales reveló que las muestras
trabajadas con las mismas condiciones experimentales se comportaron de manera muy
similar (Figura 6.7). Los agrupamientos obtenidos mostraron que los parámetros de
operación del reactor, que determinaron la separación de las muestras de cada uno de
los tratamientos fueron temperatura y pH, así como la DQO.
Los dos primeros ejes del agrupamiento representaron el 90.21 % de la varianza total.
Se observó una clara diferencia en la actividad metabólica de ambos efluentes trabajados
a lo largo del primer eje canónico 1. A su vez se confirmó mediante este ordenamiento la
separación de las muestras de acuerdo con las semanas trabajadas a lo largo del eje
canónico 2.
45
Figura 6.7.- Análisis de correspondencia canónica entre el perfil metabólico de la
comunidad y los parámetros de operación del reactor de lecho móvil, con los dos
sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las dos relaciones C/N, 1 y 10 durante las
diferentes semanas trabajadas.
Para relacionar la capacidad metabólica de la comunidad obtenida en las diferentes

condiciones experimentales trabajadas y la degradación de los contaminantes en el
reactor de lecho móvil se realizó un análisis de correspondencia canónica donde se
observó que las muestras se separan a lo largo de los diferentes ejes (Figura 6.8). El
primer eje canónico, estuvo influenciado directamente por los SVb (Sólidos volátiles en
la biopelícula) (0.063) y % de remoción de CO (-0.296) mientras que el eje canónico 2
estuvo influenciado por la relación C/N (0.413) y por el % de remoción de CA (-0.499).
También se puede apreciar que él % de remoción de CA, estuvo relacionado con una
mayor degradación de aminas-amidas, mientras que el % de remoción de CO, mostró
una fuerte correlación con la degradación de carbohidratos.
46
Figura 6.8.- Análisis de correspondencia canónica entre el perfil metabólico de la
comunidad por grupos y la respuesta del reactor de lecho móvil, con los dos sustratos,
ácido acético (AA), glucosa (G) con las dos relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes
semanas trabajadas.

TRFLP con el gen 16S
En el análisis del perfil de restricción del marcador rRNA 16S (Figura 6.9) se obtuvo un
total de 15 TRFs de éstos, 7 fueron generados con la enzima Haelll (Ha) y 8 con la enzima
Hhal (Hh). Las condiciones experimentales en la biopelícula del RLM fueron
determinantes para la presencia de ciertos TRF ya que existe una mayor similitud cuando
se trabajó con el mismo efluente. En el caso del TRF 307-Ha únicamente estuvo presente
cuando se trabajó con la condición experimental 10AA, mientras que el 70-Ha cuando se
trabajó con 1G. Para la enzima Hhal únicamente se encontró diferencia entre las
condiciones 1AA y 10AA. Por tanto, los TRFs encontrados en las diferentes condiciones
experimentales variaron con respecto a la relación C/N con el efluente a base de ácido
acético, pero no es así con el efluente a base de glucosa.
47
100% 100%
90% 90%
80% 80%
70% 70%
60% 60%
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
1AA 10AA 1G 10G 1AA 10AA 1G 10G
31-Ha 39-Ha 70-Ha 192-Ha 31-Hh 39-Hh 53-Hh 84-Hh

214-Ha 307-Ha 326-Ha 199-Hh 210-Hh 220-Hh 361-Hh
Figura 6.9.- Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido de cada condición
experimental (n=3). Se indica en la figura la enzima de restricción utilizada para cada perfil
obtenido (Ha, Haelll; Hh: Hhal). Cada condición experimental corresponde a 1 (relación
C/N=1), 10(C/N=10), AA (efluente a base de ácido acético) y G (efluente a base de glucosa).
Al estimar la riqueza, diversidad y equitatividad de las comunidades bacterianas (Tabla

6.8), se observa que la riqueza de TRFs fue significativamente diferente en cada una de
las condiciones trabajadas (p=0.001). Sin embargo, al evaluar el índice de Shannon
mediante la prueba t de Hutchenson se observa que no existió una diferencia
estadísticamente significativa (c.f. Anexo B) cuando se evaluó con las dos relaciones C/N
trabajadas con cada uno de los efluentes, ni tampoco cuando se evaluó con la misma
relación C/N trabajada con los diferentes efluentes. No hay que perder de vista que este
índice se ve influenciado tanto por el número de TRFs presentes como la abundancia
(tamaño del pico) de estos.
48
Tabla. 6.8.- índice de Shannon, equitatividad y TRFs para el gen 16S de cada una de
las condiciones experimentales trabajadas (n=3). Donde Cada condición experimental
corresponde a 1 (relación C/N=1), 10(C/N=10), AA (efluente a base de ácido acético) y
G (efluente a base de glucosa).
1AA 10AA 1G 10G

Diversidad de la comunidad
Shannon 1.86 ± 0.11 1.97 ± 0.08 2.32 ± 0.07 2.17 ± 0.04
Equitatividad 0.74 ± 0.04 0.65 ± 0.05 0.79 ± 0.06 0.8 ± 0.04
TRFs 8.67 ± 0.58 d 11 ± 0.00 c 13 ± 0.00 a 12 ± 0.00 b
El análisis de agrupamiento de los perfiles de TRFLP mediante el índice de Bray-Curtis y

usando un método jerárquico mostró de manera clara que para el gen 16S, las
comunidades bacterianas se separaron primero por el efluente trabajado y
posteriormente por la relación C/N trabajada (Figura 6.10). Todas las muestras de cada
una de las condiciones mostraron un porcentaje de agrupamiento mayor al 80 % con
excepción de 1G, que presento menos porcentaje de similitud.
Figura 6.10.- Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la

biopelícula del reactor de lecho móvil, con los dos sustratos, ácido acético (AA), glucosa
(G) con las dos relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreado. Se
usaron como base los perfiles de TRFs del gen 16S obtenidos con las dos enzimas de
restricción (Haelll y Hhal). El dendrograma fue construido usando el índice de Bray-
Curtis y el algoritmo UPGMA, usando un método jerárquico.
49
El análisis de correspondencia canónica entre los perfiles de TRFLP correspondientes al
gen 16S y los factores de operación del reactor medidos en cada una de las condiciones
experimentales trabajadas se muestran en la figura 6.11. Este análisis permitió corroborar
el agrupamiento obtenido en el dendrograma pero a su vez determinar qué factores de
operación se relacionaron con el ordenamiento observado. Los dos primeros ejes del
agrupamiento representaron el 91.51 % de la varianza total. Se puede observar una clara
separación con las diferentes condiciones trabajadas, donde en el eje 1 negativo se
agruparon las muestras correspondientes al efluente a base de ácido acético y en el eje
1 positivo se agruparon las muestras trabajadas con el efluente a base de glucosa. El
ordenamiento de la comunidad bacteriana en la biopelícula del reactor estuvo
determinado por el pH (-0.719394) y la temperatura (-0.666115). Estos factores influyeron
fuertemente sobre el eje canónico 1. Siendo los responsables de la separación observada
entre las comunidades de ambos efluentes trabajados a lo largo del eje canónico 1. En
cuanto al eje canónico 2, estuvo determinado tanto por la DQOs (0.897471) y la
temperatura (-0.619172).
Figura 6.11.- Análisis de correspondencia canónica entre los perfiles de TRFLP del gen
16S y los parámetros medidos de las comunidades bacterianas de la biopelícula del
reactor de lecho móvil, con los dos sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las dos
relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreado. Se usaron como 50
base los perfiles de TRFs del gen 16S obtenidos con las dos enzimas de restricción
(Haelll y Hhal).
TRFLP con el gen beta-amo
En el análisis del perfil de restricción para el gen beta-amo (Figura 6.12) se obtuvo un
total de 9 TRFs. De éstos, 2 fueron generados con la enzima Haelll (Ha) y 7 con la enzima
Hhal (Hh). Las condiciones experimentales en la biopelícula del RLM fueron
determinantes para la presencia de ciertos TRFs a diferencia del gen 16S se tiene que
los TRFs determinados para el gen beta-amo, existe una mayor similitud cuando se
trabajó con la misma relación C/N, que cuando se trabajó con el mismo efluente. En el
caso de los 2 TRFs obtenidos con la enzima Haelll, están presentes en las 4 condiciones
experimentales trabajadas, solo que, en diferentes porcentajes. Con la relación C/N= 10
se obtuvo un mayor porcentaje de el TRF 62-Ha tanto para el efluente a base de glucosa
(G) como para el efluente a base de ácido acético (AA). El TRF 86-Ha se obtuvo un
porcentaje mayor al 80 % cuando se trabajó con la relación C/N=1 en ambos efluentes.
Para los TRFs obtenidos con la enzima Hhal, se encontró que para la relación C/N=1, en
ambos efluentes, se obtuvo un porcentaje mayor al 70 %, para el TRF 434-Hh. Sin
embargo, cuando se trabajó con la relación C/N= 10, el TRF encontrado en mayor
porcentaje fue el 71-Hh.
100% 100%
90% 90%
80% 80%
70% 70%
60%
60%
50%
50%
40%
40% 30%
30% 20%
20% 10%
10% 0%
0% 1AA 10AA 1G 10G
1AA 10AA 1G 10G
71-Hh 92-Hh 103-Hh 199-Hh
62-Ha 86-Ha 224-Hh 235-Hh 434-Hh
Figura 6.12.- Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido para el gen
beta-amo (n=3). Se indica en la figura la enzima de restricción utilizada para cada perfil
obtenido (Ha, Haelll; Hh: Hhal). Cada condición experimental corresponde a 1 (relación
C/N=1), 10(C/N=10), AA (efluente a base de ácido acético) y G (efluente a base de glucosa). 51
Tabla. 6.9.- índice de Shannon, equitatividad y TRFs para el gen beta-amo de cada una
de las condiciones experimentales trabajadas (n=3). Donde Cada condición
experimental corresponde a 1 (relación C/N=1), 10(C/N=10), AA (efluente a base de
ácido acético) y G (efluente a base de glucosa).
1AA 10AA 1G 10G
Shannon 1.26 ± 0.515 1.54 ± 0.07 1.02 ± 0. 32 1.11 ± 0.406
Equitatividad 0.86 ± 0.12 0.79 ± 0.10 0.88 ± 0.17 0.61± 0.04
TRFs 4.66± 2.51 6 ± 1.00 3.33 ± 1.15 5.33 ± 2.30
Al estimar la riqueza, diversidad y equitatividad de las comunidades bacterianas (Tabla

6.9), se encontró que existe poca diferencia entre estos tres parámetros de diversidad
evaluados. El mayor número de TRFs fue cuando se trabajó con la relación C/N=10, pero
esta diferencia, no fue estadísticamente significativa (p= 0.399).
Al evaluar el índice de Shannon mediante la prueba t de Hutchenson se observa que no

existió una diferencia estadísticamente significativa (c.f. Anexo C) cuando se evaluó con
las dos relaciones C/N trabajadas con cada uno de los efluentes. Ni tampoco cuando se
evaluó con la misma relación C/N trabajada con los diferentes efluentes.
El análisis de agrupamiento de los perfiles de TRFLP mediante el índice de Bray-Curtis

mostró de manera clara que para el gen beta-amo, las comunidades bacterianas se
separaron por la relación C/N trabajada y no por el efluente como fue el caso del gen 16S
(Figura 6.13).
52
Figura 6.13.- Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la biopelícula
del reactor de lecho móvil, con los dos sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las
dos relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreado. Se usaron como
base los perfiles de TRFs del gen beta-amo obtenidos con las dos enzimas de restricción
(Haelll y Hhal). El dendrograma fue construido usando el índice de Bray-Curtis y el
algoritmo UPGMA, usando un método jerárquico.

gen beta-amo y los factores de operación del reactor medidos en cada una de las
condiciones experimentales trabajadas se muestran en la figura 6.14. El análisis de
correspondencia canónica permitió corroborar el agrupamiento obtenido en el
dendrograma pero a su vez determinar qué factores de operación se relacionaron con el
ordenamiento observado. Los dos primeros ejes del agrupamiento representaron el
98.232 % de la varianza total. Se puede observar una clara separación con las diferentes
condiciones trabajadas, donde en la Axis 1 negativa se agruparon las muestras
correspondientes a la relación C/N=1 tanto del efluente a base de ácido acético (AA), así
como para el efluente a base de glucosa (G) y en la Axis 1 positiva se agruparon las
muestras trabajadas con la relación C/N=10. El ordenamiento de la comunidad bacteriana
en la biopelícula del reactor estuvo determinado por la DQOs (0.8858) y el pH (-0.5254).
53
Estos factores influyeron fuertemente sobre el eje canónico 1. En cuanto al eje canónico
2, estuvo determinado únicamente por el nitrógeno amoniacal (0.6258).
beta-amo y los parámetros medidos de las comunidades bacterianas de la biopelícula
base los perfiles de TRFs del gen beta-amo obtenidos con las dos enzimas de restricción
(Haelll y Hhal).
54
6.7 - Efecto de la relación C/N sobre la estructura de la comunidad a través de
TRFLP con el gen nirS
100% 100%
90% 90%
80% 80%
70% 70%
60% 60%
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
1AA1 10AA 1G 10G 1AA1 10AA 1G 10G

Figura 6.15.- Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido para el gen
nirS. Se indica en la figura la enzima de restricción utilizada para cada perfil obtenido (Ha,
Haelll; Hh: Hhal). Cada condición experimental corresponde a 1 (relación C/N=1),
10(C/N=10), AA (efluente a base de ácido acético) y G (efluente a base de glucosa).
En el análisis del perfil de restricción para el gen nirS (Figura 6.15) se obtuvo un total de
16 TRFs. De éstos, 8 fueron generados con la enzima Haelll (Ha) y 8 con la enzima Hhal
(Hh). Los perfiles de TRFLP de las diferentes condiciones experimentales mostraron
diferencias en la diversidad de los filotipos de nitrificantes, aun cuando hubo TRFs
comunes en los dos efluentes, con las dos relaciones tales como 78-Ha, 133-Ha y 118-
Hh que presentaron diferentes abundancias relativas.
A diferencia de los otros dos genes analizados, aquí se encontró una mayor variabilidad
de los TRFs, únicamente compartiendo 3 en todas las condiciones trabajadas.
El mayor número de TRF encontrados fue con las dos relaciones C/N=1 (Tabla 6.22), sin
embargo, no se encontró una diferencia estadísticamente significativa (p=0.1019).
55
En el análisis de la diversidad de la comunidad (Tabla 6.10) para el gen nirs se observa
que la menor diversidad para este gen fue cuando se trabajó con el efluente a base de
ácido acético y la relación C/N=10 (10AA).
Cuando se compara de manera estadística el índice de Shannon no se encuentran

diferencias estadísticamente significativas (c.f. Anexo D).
Tabla. 6.10.- Equitatividad y sustratos degradados de cada una de las muestras con las
diferentes condiciones experimentales (n=3).
1AA 10AA 1G 10G
Shannon 1.45 ± 0.19 0.95 ± 0.18 1.51 ± 0.26 1.36 ± 0.26
Equitatividad 0.76 ± 0.05 0.71 ± 0.07 0.72 ± 0.05 0.75 ± 0.05
TRFs 5.67± 1.15 3.67± 0.58 6.33 ± 1.15 5.33 ± 1.5330
El análisis de agrupamiento de los perfiles de TRFLP mediante el índice de Bray-Curtis

mostró de manera clara que para el gen nirS, las comunidades bacterianas se separaron
de manera muy general por la relación C/N trabajada (Figura 6.16). Se observa que la
diversidad para el gen nirS, trabajada con las diferentes condiciones experimentales, es
mayormente afectada por la relación C/N.
56
Figura 6.16.- Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la biopelícula
base los perfiles de TRFs del gen nirS obtenidos con las dos enzimas de restricción
(Haelll y Hhal). El dendrograma fue construido usando el índice de Bray-Curtis y el
algoritmo UPGMA, usando un método jerárquico.

gen nirS y los factores de operación del reactor medidos en cada una de las condiciones
experimentales trabajadas se muestran en la figura 6.17. Este análisis permitió corroborar
el agrupamiento obtenido en el dendrograma pero a su vez determinar qué factores de
operación se relacionaron con el ordenamiento observado. Los dos primeros ejes del
agrupamiento representaron el 86.41 % de la varianza total. Se puede observar una clara
separación con las diferentes condiciones trabajadas, donde en el eje 1 negativa se
agruparon las muestras correspondientes a la relación C/N=1 del efluente a base de
glucosa (G) y en el eje 1 positiva se agruparon las muestras trabajadas con la relación
C/N=1 y 10 del efluente a base de ácido acético y de la relación C/N=10 del efluente a
base de glucosa. El ordenamiento de la comunidad bacteriana en la biopelícula del
reactor estuvo determinado por la DQOs (0.729) y el pH (-0.1016). Estos factores
influyeron fuertemente sobre el eje canónico 1, generando dos comunidades separadas
57
con ambas relaciones C/N trabajadas. En cuanto al eje canónico 2, estuvo determinado
tanto por la temperatura (0.7248) así como por la DQOs (-0.395).
nirS y los parámetros medidos de las comunidades bacterianas de la biopelícula del
reactor de lecho móvil, con los dos sustratos, ácido acético (AA), glucosa (G) con las dos
relaciones C/N, 1 y 10 durante las diferentes semanas monitoreadas. Se usaron como
base los perfiles de TRFs del gen nirS obtenidos con las dos enzimas de restricción
(Haelll y Hhal).
58
VII. – Discusión de resultados
En general, hay escasa información sobre la estructura y la diversidad metabólica de las

comunidades bacterianas en la biopelícula de los reactores de lecho móvil en el
tratamiento de efluentes acuícolas, ya que la mayoría de los estudios se han enfocado
en estudiar únicamente que tan eficientes son en la remoción de los contaminantes. Sin
embargo, es de suma importancia, conocer la diversidad metabólica y estructura genética
de la comunidad para con ello poder relacionar qué microorganismos y qué mecanismos
se llevan a cabo durante la remoción de los contaminantes, así como también conocer
qué factores ambientales o de operación influyen en la conformación de las comunidades
bacterianas.
7.1.- Remoción de contaminantes en el reactor de lecho móvil
La remoción de contaminantes (i.e. materia orgánica y el nitrógeno amoniacal) depende

de varios factores, entre ellos los abióticos, como la temperatura y el pH.
7.1.1. Nitrificación
El rango de temperatura reportado como adecuado para que se lleve a cabo el proceso
de nitrificación va de 14 a 17 °C (Zhu y Chen, 2002) cuando no se tiene limitación de
oxígeno (Ebeling et al., 2006). En el presente estudio, la temperatura se mantuvo dentro
de ese rango adecuado para que se pudiera llevar a cabo la remoción de contaminantes
(Tabla 6.1). Sin embargo, la velocidad de nitrificación sí está delimitada por la temperatura
( Zhu y Chen, 2002). El proceso de nitrificación también depende del pH, y la relación
C/N del sustrato de alimentación.
59
El proceso de nitrificación se lleva a cabo en un rango de pH de entre 7.0 y 9.0 (Ebeling
et al., 2006). Cuando hay cambios bruscos de 0.5 o más unidades de pH, los
microorganismos se deben adaptar a las nuevas condiciones ambientales (Ebeling et al.,
2006). Este proceso de adaptación afecta la actividad metabólica y la velocidad de los
procesos bacterianos, sin que se altere la estructura genética de la comunidad
bacteriana, ni la diversidad a corto plazo en el reactor (Zamora, 2012). En este estudio
no se presentaron variaciones mayores a 0.07 unidades de pH entre la misma condición
(Tabla 6.1), por lo tanto, se considera que la diversidad metabólica y estructura de la
comunidad no fue afectada por este factor. Sin embargo, se puede observar que entre
cada una de las condiciones experimentales sí existió una variación mayor a 0.5
unidades, lo cual se ve reflejado en el cambio en la capacidad metabólica y estructura de
la comunidad, entre las diferentes condiciones experimentales trabajadas.
7.1.2. Desnitrificación
El proceso de desnitrificación se puede llevar a cabo con un rango más amplio de

temperatura, que va desde los 5 ºC hasta los 50 °C (Reboleido-Rivas et al, 2012). Sin
embargo, en aplicaciones prácticas de acuicultura, la temperatura con la que opera el
reactor es normalmente determinada por el requerimiento de la especie de cultivo y no
necesariamente por las necesidades de las bacterias en el reactor (Ebeling y Timmons,
2012). Estas temperaturas afectan directamente tanto la remoción de los contaminantes,
como a la tasa de nitrificación. En caso de que la temperatura permita que se lleven a
cabo los procesos de remoción de contaminantes, la estructura genética de la comunidad
sí puede ser afectada. También hay que tener presente que los cambios de temperatura
pueden reducir las tasas de remoción de contaminantes y consecuentemente la
capacidad de degradación de los contaminantes en el reactor.
60
7.1.3. Remoción biológica de nitrógeno en el RLM del RAS
La remoción biológica de nitrógeno se da de manera completa cuando se presentan los

dos procesos (i.e. nitrificación y desnitrificación) de manera simultánea al interior de la
biopelícula o bien de manera secuencial en dos etapas de un reactor biológico. En esta
experimentación únicamente se llevó a cabo el proceso de nitrificación (Tabla 6.2), como
se puede constatar con el incremento de la concentración de nitratos a la salida del
reactor. La desnitrificación en contraparte no se llevó a cabo debido a la baja densidad
de bacterias heterótrofas, que se encargan de llevar a cabo el proceso de desnitrificación
cuando el reactor se encuentra en condiciones anóxicas (Ebeling et al., 2006) y
consecuentemente se tengan bajas concentraciones de oxígeno disuelto al interior de la
biopelícula.
La presencia de los nitratos es menos tóxica para los peces que la del nitrógeno
amoniacal, ya que algunas especies son capaces de soportar hasta 200 mg/L de N-NO3,
mientras que concentraciones de dos órdenes de magnitud menores de NAT ya se
reportan tóxicas para algunas especies (Ebeling y Timmons, 2012). En este sentido
resulta más conveniente y seguro para el cultivo acuícola garantizar al menos la oxidación
del NAT a nitratos. Aun así, se sugiere que después de la fase aerobia de tratamiento en
el RLM se acople otra etapa anóxica para completar el proceso de remoción biológica de
nitrógeno, por medio de la desnitrificación.
El agua obtenida en el efluente tiene una calidad tal (Tabla 6.2) que puede ser reusada
en un sistema RAS. Las concentraciones de NAT permitidas en los tanques de cultivo de
peces son muy variadas, en función de la especie de cultivo. Ebeling et al., (2012),
reportan que el límite máximo permitido de nitrógeno amoniacal en el agua usada para
acuicultura es de 1mg/L. Sin embargo existen otros reportes donde se cita que
concentraciones mayores a 2.3 mg NH3/L resultaron ser tóxicas para 32 especies de agua
dulce (Eddy, 2005). Las concentraciones de nitrógeno amoniacal obtenidas en este
estudio, sin excepción están por debajo de las concentraciones tóxicas reportadas.
61
7.1.4. Remoción de materia orgánica
La remoción de materia orgánica es favorecida por el incremento de la relación C/N del

influente (Fu et al., 2010), ya que una relación C/N alta favorece el crecimiento de las
bacterias heterótrofas (Ebeling et al., 2006) que son las que se encargan de la remoción
de este contaminante. Se ha reportado que la remoción de materia orgánica aumenta al
incrementar la relación C/N, de un 91 % de remoción con una relación C/N= 4.5 a 95. 7
% de remoción con una la relación C/N= 13.4 (Fu et al., 2010). En este trabajo, también
se encontró que el incremento en la relación C/N, favoreció la remoción de la carga
orgánica (Tabla 6.3). La remoción de un contaminante en el agua residual va a estar dada
por la estructura de la comunidad en la biopelícula. También se encontró en este trabajo
que, con el efluente a base de glucosa, la remoción fue mayor, que con él efluente a base
de ácido acético (Tabla 6.3). Lo anterior se debe a que la complejidad del sustrato
también va a favorecer una estructura físicamente diferente de la biopelícula, que a su
vez puede afectar las tasas de difusión de nutrientes al interior de la biopelícula y por
tanto afecta la capacidad de degradación de los contaminantes.
7.2.- Diversidad metabólica de la biopelícula del RLM
La capacidad metabólica de la biopelícula va a estar dada por las condiciones

fisicoquímicas (Nivala et al., 2015) y las condiciones del efluente (Li et al., 2016).
7.2.1. Diversidad metabólica y relaciones C/N
En este trabajo la actividad metabólica asociada a la degradación de sustratos de carbono

en las placas fue mayor en el caso del sustrato más complejo y la relación C/N = 10
(Figura 6.1). Lo anterior se puede explicar por el hecho de que a mayores relaciones C/N,
se tienen más materia orgánica disponible. De hecho, la relación C/N corresponde, en
términos generales, a la proporción teórica que normalmente requeriría una bacteria de
estos nutrientes, dada su composición química teórica y por tanto sus requerimientos
62
anabólicos (Metcalf y Eddy, 2003). Es normal que un sustrato con esta relación C/N
favorezca un mayor desarrollo de las bacterias heterótrofas en la biopelícula (Bassin et
al., 2015; Ebeling et al., 2006; Ferrara y Ramírez, 2010; Zhu et al., 2015), que son las que
van a usar estas fuentes de carbono orgánico como sustrato. En cambio, dado que la
estimación de la actividad en las placas EcoplateTM corresponde a la actividad de las
bacterias heterótrofas y no de las autótrofas y, tomando en cuenta que cuando un reactor
biológico es operado con relaciones C/N = 1 las comunidades están estructuradas
principalmente por bacterias autótrofas (Bassin et al., 2015; Ebeling et al., 2006), se
explica el bajo aprovechamiento de sustratos carbonáceos, con las relaciones C/N = 1,
pues el reactor estaría mayoritariamente poblado por bacterias autótrofas que pueden
estar realizando un proceso de nitrificación en el RLM, pero no una degradación de la
materia orgánica del sustrato suministrado.
7.2.2. Degradación de los sustratos en la placa y su relación con el RLM
La oxidación de los sustratos en la placa por la comunidad medido como AWCD se ha

usado para evaluar el estrés oxidativo que se tiene sobre la comunidad con metales
pesados (Gryta y Oszust, 2014), para comparar la capacidad metabólica de degradación
de las comunidades presentes en las diferentes capas de un humedal usado en el
tratamiento de aguas residuales (Nivala et al., 2015) entre otros trabajos, donde se
reporta que entre mayor sea la disponibilidad del sustrato, la comunidad presente en el
sistema de tratamiento también tiene una mayor capacidad de degradación de los
diversos sustratos orgánicos de las placas. Esto se puede considerar como un incremento
en el potencial degradativo de la comunidad bacteriana, dado que aun cuando los
sustratos de las placas no son los contaminantes que componen el efluente acuícola, si
las bacterias tienen mayor poder metabólico estas van a ser capaces de metabolizar la
materia orgánica contenida en ellos. Esta es una capacidad importante ya que la
composición de las aguas residuales en general presenta variaciones tanto en
concentración, como en composición.
63
En el caso de la acuicultura estas variaciones pueden estar derivadas del estado
fisiológico de los peces de acuerdo a su talla y de las estrategias de alimentación acuícola
de acuerdo a la fase de crecimiento de los peces (Ebeling et al., 2006). Por lo tanto, es
importante que las comunidades bacterianas tengan esta capacidad de metabolizar otros
sustratos orgánicos cuando por alguna razón operativa del RAS haya variaciones en la
calidad del efluente acuícola.
La dinámica de degradación por grupo en las placas se vio marcado por iniciar a la hora
24 degradando carbohidratos y polímeros (Figura 6.2) lo cual puede estar dada debido a
que la comunidad de la biopelícula del reactor de lecho móvil inoculadas en las placas
ECOPLATE iniciaron degradando los sustratos simples para posteriormente degradar los
sustratos más complejos.
En esta dinámica de degradación el grupo amino fue mayor en la mayoría de las

condiciones experimentales probadas (i.e. 1AA, 10AA, 1G y 10G) y en todos los tiempos
en los que se estimó la actividad metabólica (i.e. 24, 64 y 120 h), aunque este grupo sólo
está representado por dos de los 31 sustratos de la placa por lo tanto, el grupos amino
representan menos del 7 % de los sustratos de la placa y el sustrato que fue mayormente
degradado fue la feniletilamina en las horas 24 y 64. Debido al bajo porcentaje de
representación de este grupo se recomienda tener cuidado en la interpretación de los
resultados del gremio por grupos (Nivala et al., 2015), además, al hablar de la actividad
de degradación de la feniletilamina se debe tener presente que la degradación de ésta
comienza con la desaminación por la monoamino oxidasa, que va a liberar el grupo amino
dando como resultado el aldehído y el amonio. Por lo tanto, aunque estamos analizando
la actividad derivada de un compuesto orgánico que libera amonio el proceso degradativo
no está asociado al proceso de oxidación del amonio realizado por bacterias autótrofas
en el tratamiento del efluente acuícola, sino más bien en la degradación del compuesto
orgánico y en donde el amonio desprendido de la feniletilamina puede coadyuvar a la
actividad degradativa de estos pocillos de cultivo en las placas ya que al liberarse se
convierte en una fuente de nitrógeno asimilable para las bacterias. Por otro lado se
64
observó poca o nula degradación de los ácidos carboxílicos en los cultivos en placa, lo
que concuerda con otros estudios previos (Nivala et al., 2015; Gryta et al., 2014).
7.2.3. Diversidad y equitatividad de Shannon asociados a la capacidad

degradativa del RLM
El mayor índice de Shannon se obtuvo cuando se trabajó con la condición 10G (Figura
6.3). Este resultado confirma que tanto la capacidad de degradación de los sustratos de
la placa, como el índice de diversidad de Shannon, dependen de las condiciones
experimentales en las que se encontraba la comunidad. Cabe destacar que este índice
de diversidad de degradación de sustratos en la placa no puede ser mayor a 3.43 que es
cuando se han degradado los 31 sustratos en la placa. El valor de este índice está
asociado a la capacidad degradativa de la comunidad y disminuye cuando la comunidad
bacteriana está expuesta a sustancias tóxicas (e.g. metales pesados) que reducen H a
valores inferiores a la unidad (Gryta et al., 2014).
La equitatividad de Shannon arroja información respecto a la manera de distribución de

las abundancias relativas en una comunidad (Magurran, 1988). En el presente estudio se
encontró que los valores de equitatividad asociados al consumo de los sustratos, a las
diferentes horas evaluadas llegaron a un valor máximo de 0.88 (Tabla 6.11). Estos
valores del índice de equitatividad muestran la homogeneidad del potencial degradativo
de los sustratos en las placas. Esta homogeneidad indica que para los TRC normales de
diseño de un RLM, deberían ser de al menos 7 días (i.e. 168 h) (Metcalf y Eddy, 2003),
dado que se requiere el crecimiento de bacterias nitrificantes, el reactor tendría una
capacidad de adaptación suficientemente amplia para poder degradar compuestos
presentes en un cambio de condiciones de operación en el RAS. Los índices de
equitatividad de 0.88 se alcanzaron a las 120 h, que serían menores al TRC de diseño
del RLM, pero que corresponde a un TRC suficientemente amplio para el desarrollo de
una biomasa heterótrofa (Metcalf y Eddy, 2003).
65
7.2.4. Factores fisicoquímicos que influyeron en la capacidad degradativa
El comportamiento que se presentó en el perfil metabólico de la comunidad agrupándose

por efluentes trabajados y después por grupos se puede deber a la ruta metabólica de
los componentes de los efluentes. Este agrupamiento fue incrementando en similitud, con
el paso del tiempo. Los factores de operación del reactor que fueron determinantes en
este agrupamiento fueron temperatura, pH y concentración de DQO del influente del
reactor (Figura 6.7) que como ya se discutió en esta primera parte influyen directamente
sobre el tipo de bacterias que conforman la comunidad (c.f. subcap 7.1) dando lugar al
crecimiento de bacterias autótrofas o heterótrofas de acuerdo con la variación en la
concentración de la DQO (Ebeling y Timmons, 2012) o afectando de manera directa su
capacidad metabólica global por la afectación a las tasas de degradación, en el caso de
las variaciones del pH y la temperatura.
Cuando se busca realizar una correlación directa entre los sustratos degradados en las
placas ECOPLATE y los contaminantes del reactor, se encuentra que el porcentaje de
remoción de la CA estuvo directamente relacionada con la degradación del grupo de las
aminas/amidas. Mientras que el porcentaje de remoción de la CO se relacionó de manera
directa con la degradación de carbohidratos. Esta relación, está dada por el tipo de
microorganismos que son capaces de llevar a cabo la degradación de moléculas de
contaminantes de la misma estructura.
Con base en los resultados obtenidos, también se puede afirmar que entre mayor sea la
complejidad del efluente (proteínas, alimento sin degradar, productos de desecho de los
peces) se puede favorecer el crecimiento de biopelícula que sea capaz de degradar los
contaminantes presentes en el efluente y a su vez, tendrá una mayor capacidad de
degradación, en virtud de que las bacterias están más adaptadas a metabolizar sustratos
más complejos. Esta capacidad de degradación puede mejorar el desempeño del
biorreactor, en caso de que exista algún cambio en las características del efluente a tratar,
ya que se tendrá un biorreactor con mayor capacidad de resiliencia (Zamora, 2012).
66
7.3.- Estructura de la comunidad de la biopelícula del RLM
En el estudio de la estructura de la comunidad se encontró que tanto la temperatura como

el pH influyeron en la dinámica de la comunidad, así mismo en el estudio de la estructura
donde se observó influencia de estos parámetros y no sólo la de la relación C/N y de las
fuentes de carbono presentes en el efluente, por lo que será importante tomarlos en
cuenta para el diseño y la operación de un RLM en un RAS.
7.3.1. Estructura de la comunidad y relaciones C/N
En este estudio se encontró que la estructura genética de la comunidad analizada

mediante el gen 16S al igual que en el perfil metabólico, se vio afectada directamente
tanto por la fuente de carbono, como por la relación C/N del sustrato suministrado. Las
relaciones C/N = 10 de ambos efluentes sintéticos presentaron una mayor diversidad de
TRFs obtenidos. Lo anterior se puede deber a que a mayor relación C/N favorece el
crecimiento de bacterias heterótrofas y debido a que la tasa de crecimiento de éstas es
mayor que el de las autótrofas (Ebeling et al., 2006), y esto puede favorecer a su vez el
crecimiento de diferentes tipos de filotipos en la biopelícula. Sin embargo, como ya se
comprobó con este estudio y algunos otros reportados con anterioridad, cuando la
relación C/N es alta, favorece el crecimiento de una mayor cantidad de filos en la
biopelícula. Lo cual puede llevar a que la densidad de estos sea mayor y propicie que la
biopelícula sea más gruesa (Ebeling y Timmons, 2012) lo cual debido a las condiciones
hidrodinámicas del reactor de lecho móvil, haga que se desprenda del medio de soporte
(Metcalf y Eddy, 2003) y requiera de un proceso de sedimentación el efluente antes de
ser recirculado al sistema RAS (Ebeling et al., 2006). Cabe destacar que el grosor de la
biopelícula no solo va a propiciar zonas anóxicas que favorezcan el proceso de
nitrificación-desnitrificación simultanea (Fu et al., 2010), sino que también esta biopelícula
67
desprendida puede ser usada como alimento para los propios peces que se estén
cultivando, consumiéndose como un biofloc (Crab et al., 2007).
El análisis de la estructura de la comunidad mediante TRFLP revela a las especies

más abundantes, por lo tanto la información que brinda sobre la riqueza total es hasta
cierto punto parcial ( Zhou, y Brown, 2004). La ausencia de un TRF no confirma la
ausencia de una especie (Dickie et al., 2002); más aún, la presencia de un TRF tampoco
asegura la existencia de una especie, ya que se ha demostrado la presencia de pseudo-
TRFs. Por otro lado, el proceso de estandarización de los datos elimina aquellas señales
que se encuentran por debajo de cierto valor de fluorescencia, dejando solo aquellos
TRFs que se encuentran altamente representados, lo que podría conducir a eliminar
TRFs reales que se encuentran poco representados en la muestra, por encontrarse en el
límite de discriminación del método (Dunbar, 2001). Se ha descrito también, que
secuencias estrechamente relacionadas presentan diferentes tamaños de TRF y que
secuencias de diferentes filos produjeron tamaños de TRF similares (Hartmann y Widmer,
2006). Sin embargo, a pesar de las limitaciones mencionadas que podrían homogenizar
los resultados, el TRFLP es una técnica muy poderosa y reproducible, además de que
las técnicas moleculares entre ellas el TRFLP son capaces de detectar cambios a nivel
fisiológico y así detectar probablemente cambios menores en la estructura de la
comunidad (Kirk et al., 2004).
7.3.2. Estructura de la comunidad y los procesos de remoción biológica de

nitrógeno en el RLM
En el análisis de la estructura de la comunidad para el gen beta-amo relacionado con el

proceso de nitrificación (Bustamante et al., 2012) y el gen nirS presente en las bacterias
encargadas de llevar a cabo el proceso de desnitrificación (Braker y Fesefeldt, 1998;
Orlando et al., 2010). Se encontró que la relación C/N de los dos efluentes trabajados
fueron determinantes para el número de filotipos (TRFs) encontrados en las muestras.
68
Las relaciones C/N = 10 favorecieron la presencia de una mayor cantidad de filotipos,
pero consecuentemente con una menor densidad relativa (Figura 6.12), sin embargo, las
diferencias en cuanto a la presencia de los filotipos de estos dos grupos de bacterias no
fueron estadísticamente significativas entre las diferentes condiciones experimentales, lo
cual también concuerda con lo analizado en los porcentajes de remoción de CA.
Cuando se analizó el gen nirS, se encontró que las relaciones C/N = 1, favorecieron a un
mayor número de filotipos, sin embargo, debido a que las concentraciones de oxígeno
dentro del reactor eran mayores a 2 mg/L y esto no permitió el establecimiento de zonas
anóxicas en la biopelícula, no se pudo llevar a cabo el proceso de desnitrificación. Ya se
había señalado que las relaciones C/N altas favorecen el crecimiento de bacterias
heterótrofas, entre ellas las desnitrificantes, sin embrago no hay que perder de vista que
no se están analizando todos los microrganismos heterótrofos con este gen, ni tampoco
que todos los que se encuentran presentes estén funcionalmente activos para realizar
funciones de degradación de contaminantes en el reactor, es por ello que en este caso
las relaciones C/N =1 favorecieron un mayor número de filotipos, que seguramente están
asociados a la presencia de nitratos en el reactor, aun cuando no pudieron ser reducidos,
dadas las condiciones de aireación del RLM y el bajo grosor de la biopelícula. Esto implica
que la posible implementación de una etapa anóxica con objeto de desnitrificar en un
RLM asociado a un RAS, sería conveniente trabajar con volúmenes aparentes altos de
material de soporte que permitiera el crecimiento de más biomasa, para abatir las
concentraciones de oxígeno al interior de la biopelícula. También sería importante diseñar
los reactores con condiciones hidrodinámicas que permitan el crecimiento de biopelículas
gruesas que permitan el establecimiento de zonas anóxicas al interior de la biopelícula y
así poder lograr la desnitrificación, trabajando con relaciones C/N bajas.
69
VIII. – Conclusiones
• Entre mayor relación C/N se tiene en el efluente a tratar, se tiene una mayor
diversidad metabólica, aunque no se encontraron diferencias significativas,
derivada de los cambios que se dan en la estructura de la comunidad en la
biopelícula del reactor de lecho móvil.
• Los cambios en el perfil metabólico y en la estructura de la comunidad bacteriana,

derivada la influencia de la relación C/N del efluente a tratar, pueden usarse para
orientar los procesos degradativos en el RLM hacia la remoción de determinados
contaminantes, en función de las características del efluente.
• En el reactor de lecho móvil se obtuvieron porcentajes de remoción de nitrógeno

amoniacal y material orgánica lo suficientemente aceptables para alcanzar un nivel
de descontaminación tal en el efluente, que éste podría ser reusado en un RAS.
70
lX. – Recomendaciones
• Para el diseño y operación de un RLM acoplado a un RAS:
a).- Si se va a tratar un efluente en el que no se van a tener concentraciones importantes

de materia orgánica, ni variabilidad en la composición de esta materia orgánica, se
recomienda trabajar con relaciones C/N = 1 en las que se pueda dar un proceso de
nitrificación desnitrificación simultánea o bien, establecer una etapa de desnitrificación
para asegurar una mayor calidad del agua tratada. Para esto será necesario tener
condiciones hidrodinámicas que permitan el crecimiento de una biopelícula gruesa con
una capa anóxica y alta densidad celular en el reactor.
b).- Si se va a trabajar con un reactor que esté expuesto a posibles cambios en la

composición de la materia orgánica del efluente a tratar, derivado de las condiciones de
cultivo, trabajar con relaciones C/N=10 o mayores que permitan el desarrollo de una
biopelícula con mayor capacidad degradativa de estos ante las posibles variaciones en
el tipo de contaminantes, además de que se puede tener el potencial de que la biopelícula
desprendida sea usada como alimento complementario (i.e. biofloc) para peces.
c).- Tomar en cuenta las condiciones de pH y temperatura, ya que afectan directamente

la capacidad metabólica y estructura de la comunidad bacteriana en la biopelícula
afectando así la eficiencia de remoción de contaminantes en el reactor.
• Para la investigación:
a).- Continuar con la investigación trabajando con sustratos más complejos, incluyendo
los efluentes acuícolas reales.
b).- Estudiar todos los genes funcionales asociados a los procesos de transformación del
nitrógeno por otras vías.
c).- Realizar una cuantificación de cada uno de los transcritos funcionales en tiempo real
para conocer cuántos genes están activos y son funcionales.
71
X.- Referencias
Abzazou, T., Araujo, R. M., Auset, M. y Salvadó, H. (2016). Tracking and

quantification of nitrifying bacteria in biofilm and mixed liquor of a partial nitrification MBBR
pilot plant using fluorescence in situ hybridization. Science of the Total Environment, 541,
1115-1123.
Atlas R. y R. Bartha. 2002. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental. Cuarta

Edición. Editorial Pearson Educación, SA. Madrid. 677 p
Bassin, J. P., Abbas, B., Vilela, C. L. S., Kleerebezem, R., Muyzer, G., Rosado, A.
S. y Dezotti, M. (2015). Tracking the dynamics of heterotrophs and nitrifiers in moving-
bed biofilm reactors operated at different COD/N ratios. Bioresource technology, 192,
131-141.
Boon, N., De Windt, W., Verstraete, W. y Top, E. M. (2002). Evaluation of nested

PCR–DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group-specific 16S rRNA
primers for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment
plants. FEMS Microbiology Ecology, 39(2), 101-112.
Bordehore, C. (2001). Problemas ambientales, problemas humanos. Sociología

Ambiental, S/N, 321-355
Braker, G., Fesefeldt, A. y Witzel, K. P. (1998). Development of PCR primer

systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying
bacteria in environmental samples. Applied and environmental microbiology, 64(10),
3769-3775.
Braun, B., Böckelmann, U., Grohmann, E. y Szewzyk, U. (2010). Bacterial soil

communities affected by water-repellency. Geoderma, 158(3), 343-351.
Bustamante, M., Verdejo, V., Zúñiga, C., Espinosa, F., Orlando, J. y Carú, M.
(2012). Comparison of water availability effect on ammonia-oxidizing bacteria and
archaea in microcosms of a Chilean semiarid soil. Frontiers in microbiology, 3, 1–10.
72
Button, M., Weber, K., Nivala, J., Aubron, T. y Müller, R. A. (2016). Community-
level physiological profiling of microbial communities in constructed wetlands: effects of
sample preparation. Applied biochemistry and biotechnology, 178(5), 960-973.
Button, M., Nivala, J., Weber, K. P., Aubron, T. y Müller, R. A. (2015). Microbial
community metabolic function in subsurface flow constructed wetlands of different
designs. Ecological Engineering, 80, 162-171.
Characklis, W. G. y Marshall, K. C. (1990). Biofilms: a basis for an interdisciplinary

approach. Biofilms, 3.
Chen, W. H., Chen, S. Y., Khanal, S. K. y Sung, S. (2006). Kinetic study of biological
hydrogen production by anaerobic fermentation. International Journal of Hydrogen
Energy, 31(15), 2170-2178.
Crab, R., Avnimelech, Y., Defoirdt, T., Bossier, P. y Verstraete, W. (2007). Nitrogen
removal techniques in aquaculture for a sustainable production. Aquaculture, 270(1), 1-
14.
Cuervo-López, F., Martínez-Hernández, S., Texier, A. C., & Gómez, J. (2009).

Principles of denitrifying processes. Environmental technologies to treat nitrogen
pollution: principles and engineering. IWA, London, S/N, 41-65.
Dickie, I. A., Xu, B. y Koide, R. T. (2002). Vertical niche differentiation of

ectomycorrhizal hyphae in soil as shown by T‐RFLP analysis. New Phytologist, 156(3),
527-535.
Dunbar, J., Ticknor, L. O. y Kuske, C. R. (2001). Phylogenetic specificity and

reproducibility and new method for analysis of terminal restriction fragment profiles of 16S
rRNA genes from bacterial communities. Applied and Environmental Microbiology, 67(1),
190-197.
Ebeling, J. M. y Timmons, M. B. (2012). Recirculating aquaculture

systems. Aquaculture Production Systems,1, 245-277.
73
Ebeling, J. M., Timmons, M. B. y Bisogni, J. J. (2006). Engineering analysis of the
stoichiometry of photoautotrophic, autotrophic, and heterotrophic removal of ammonia–
nitrogen in aquaculture systems. Aquaculture, 257(1), 346-358.
Eddy, F. B. (2005). Ammonia in estuaries and effects on fish. Journal of Fish

Biology, 67(6), 1495-1513.
FAO (2016). El estado mundial de la pesca y la acuicultura. ISBN: 978-92-5-

308276-6. Roma. 253 pp.
Ferrara de Giner, G. (2016). Influencia de la relación C: N en la remoción de

nitrógeno usando un sistema combinado de reactores por carga secuencial. Revista de
la Facultad de Ingeniería, 25(4), 41–51.
Forney, L. J., Zhou, X. y Brown, C. J. (2004). Molecular microbial ecology: land of

the one-eyed king. Current opinion in microbiology, 7(3), 210-220.
Fu, B., Liao, X., Ding, L. y Ren, H. (2010). Characterization of microbial community
in an aerobic moving bed biofilm reactor applied for simultaneous nitrification and
denitrification. World Journal of Microbiology and biotechnology, 26(11), 1981-1990.
Garland, J. L. (1997). Analysis and interpretation of community-level physiological

profiles in microbial ecology. FEMS microbiology ecology, 24(4), 289-300.
Garland, J. L., Mills, A. L. y Young, J. S. (2001). Relative effectiveness of kinetic

analysis vs single point readings for classifying environmental samples based on
community-level physiological profiles (CLPP). Soil Biology and Biochemistry, 33(7),
1059-1066.
González Martínez, S., Maldonado Orozco, L. E. y González Barceló, O. (2002).

Tratamiento de aguas residuales utilizando biopelículas sobre un material poroso.
In Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental, 28 , 1-8.
Gryta, A., Frąc, M. y Oszust, K. (2014). The application of the Biolog EcoPlate
approach in ecotoxicological evaluation of dairy sewage sludge. Applied biochemistry and
biotechnology, 174(4), 1434-1443.
74
Hartmann, M. y Widmer, F. (2006). Community structure analyses are more
sensitive to differences in soil bacterial communities than anonymous diversity
indices. Applied and Environmental Microbiology, 72(12), 7804-7812.
Hashimoto, K., Matsuda, M., Inoue, D. y Ike, M. (2014). Bacterial community

dynamics in a full-scale municipal wastewater treatment plant employing conventional
activated sludge process. Journal of bioscience and bioengineering, 118(1), 64-71.
Hooper, D. U., Solan, M., Symstad, A., Diaz, S., Gessner, M. O., Buchmann, N. y
Roy, J. (2002). Species diversity, functional diversity and ecosystem
functioning. Biodiversity and Ecosystem Functioning: Syntheses and Perspectives, 17,
195-208.
Jiménez-Montealegre, R., Zamora-Castro, J. y Zúñiga-Calero, G. (2015).

Determinación del flujo de agua para la biorremediación en sistemas recirculados
acuaculturales utilizando tapetes microbianos construidos. Latin american journal of
aquatic research, 43(1), 234-247.
Kirk, J. L., Beaudette, L. A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J. N., Lee, H. y
Trevors, J. T. (2004). Methods of studying soil microbial diversity. Journal of
microbiological methods, 58(2), 169-188.
Li, C., Ren, H., Xu, M. y Cao, J. (2015). Study on anaerobic ammonium oxidation
process coupled with denitrification microbial fuel cells (MFCs) and its microbial
community analysis. Bioresource technology, 175, 545-552.
Li, C., Zhang, Z., Li, Y. y Cao, J. (2015). Study on dyeing wastewater treatment at
high temperature by MBBR and the thermotolerant mechanism based on its microbial
analysis. Process Biochemistry, 50(11), 1934-1941.
Li, L., Liu, M., Li, Y., Ma, X., Tang, X. y Li, Z. (2016). Changes in dissolved organic
matter composition and metabolic diversity of bacterial community during the degradation
of organic matter in swine effluent. Environmental Science and Pollution
Research, 23(13), 13498-13507.
75
Liu, W. T., Marsh, T. L., Cheng, H. y Forney, L. J. (1997). Characterization of
microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of
genes encoding 16S rRNA. Applied and environmental microbiology, 63(11), 4516-4522.
Lüke, C., Speth, D. R., Kox, M. A., Villanueva, L. y Jetten, M. S. (2016).

Metagenomic analysis of nitrogen and methane cycling in the Arabian Sea oxygen
minimum zone. PeerJ, 4, e1924.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Dunlap, P. V. y Clark, D. P. (2009). Brock Biología

de los microorganismos (No. 576 MADbE 12a. ed.). Pearson.
Magurran, A. E. (1988). Why diversity? In Ecological diversity and its

measurement (pp. 1-5). Springer Netherlands.
Masser, M. P., Rakocy, J. y Losordo, T. M. (1999). Recirculating aquaculture tank

production systems. Management of recirculating systems. SRAC Publication, 452.
McCaig, A. E., Embley, T. M. y Prosser, J. I. (1994). Molecular analysis of

enrichment cultures of marine ammonia oxidisers. FEMS Microbiology Letters, 120(3),
363-367.
Metcalf y Eddy, Burton, F. L., Stensel, H. D. y Tchobanoglous, G.

(2003). Wastewater engineering: treatment and reuse. McGraw Hill. 218 pp.
Moreno, C. E. 2001. Métodos para medir la biodiversidad. M&T–Manuales y Tesis

SEA, vol. 1. Zaragoza, 84 pp.
Ødegaard, H. (1999). The moving bed biofilm reactor. Water environmental

engineering and reuse of water, 575314, 205-305.
Orlando, J., Alfaro, M., Bravo, L., Guevara, R. y Carú, M. (2010). Bacterial diversity
and occurrence of ammonia-oxidizing bacteria in the Atacama Desert soil during a “desert
bloom” event. Soil Biology and Biochemistry, 42(7), 1183-1188.
76
Ornelas, D. J., Ruiz, Y. J. y Medina, L. F. (2012). Bacterias Nitrificantes y su Utilidad
Para el Tratamiento de Aguas Residuales: Desarrollo de un Enriquecimiento del
Inóculo. Informe Médico, 14(3), 141-14.
Peralta, R. M., Ahn, C., Voytek, M. A. y Kirshtein, J. D. (2013). Bacterial community

structure of nirK-bearing denitrifiers and the development of properties of soils in created
mitigation wetlands. Applied soil ecology, 70, 70-77.
Pfeiffer, T. J. y Wills, P. S. (2011). Evaluation of three types of structured floating

plastic media in moving bed biofilters for total ammonia nitrogen removal in a low salinity
hatchery recirculating aquaculture system. Aquacultural engineering, 45(2), 51-59.
Reboleiro-Rivas, P., Martín-Pascual, J., Juárez-Jiménez, B., Poyatos, J. M.,

Vílchez-Vargas, R., Vlaeminck, S. E. y González-López, J. (2015). Nitrogen removal in a
moving bed membrane bioreactor for municipal sewage treatment: Community
differentiation in attached biofilm and suspended biomass. Chemical Engineering
Journal, 277, 209-218.
Kumar, V. R., Sukumaran, V., Achuthan, C., Joseph, V., Philip, R. y Singh, I. B.
(2013). Molecular characterization of the nitrifying bacterial consortia employed for the
activation of bioreactors used in brackish and marine aquaculture systems. International
Biodeterioration and Biodegradation, 78, 74-81.
Rotthauwe, J. H., Witzel, K. P. y Liesack, W. (1997). The ammonia monooxygenase

structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural
ammonia-oxidizing populations. Applied and environmental microbiology, 63(12), 4704-
4712.
Rusten, B., Eikebrokk, B., Ulgenes, Y. y Lygren, E. (2006). Design and operations
of the Kaldnes moving bed biofilm reactors. Aquacultural engineering, 34(3), 322-331.
Summerfelt, S. T., Zühlke, A., Kolarevic, J., Reiten, B. K. M., Selset, R., Gutierrez,
X. y Terjesen, B. F. (2015). Effects of alkalinity on ammonia removal, carbon dioxide
stripping, and system pH in semi-commercial scale water recirculating aquaculture
systems operated with moving bed bioreactors. Aquacultural Engineering, 65, 46-54.
77
Terjesen, B. F., Summerfelt, S. T., Nerland, S., Ulgenes, Y., Fjæra, S. O., Reiten,
B. K. M. y Takle, H. (2013). Design, dimensioning, and performance of a research facility
for studies on the requirements of fish in RAS environments. Aquacultural
engineering, 54, 49-63.
Throbäck, I. N., Enwall, K., Jarvis, Å. y Hallin, S. (2004). Reassessing PCR primers
targeting nirS, nirK and nosZ genes for community surveys of denitrifying bacteria with
DGGE. FEMS microbiology ecology, 49(3), 401-417.
Van Kessel, M. A., Harhangi, H. R., van de Pas-Schoonen, K., van de Vossenberg,
J., Flik, G., Jetten, M. S. y den Camp, H. J. O. (2010). Biodiversity of N-cycle bacteria in
nitrogen removing moving bed biofilters for freshwater recirculating aquaculture
systems. Aquaculture, 306(1), 177-184.
Wang, H., Tao, Y., Gao, D., Liu, G., Chen, C., Ren, N. y de Kreuk, M. (2015).
Microbial population dynamics in response to increasing loadings of pre-hydrolyzed pig
manure in an expanded granular sludge bed. Water research, 87, 29-37.
Wang, J., Ni, L., Song, Y., Rhodes, G., Li, J., Huang, Q. y Shen, Q. (2017). Dynamic
response of ammonia-oxidizers to four fertilization regimes across a wheat-rice rotation
system. Frontiers in microbiology, 8, s/p.
Weber, K. P. y Legge, R. L. (2010). Community-level physiological

profiling. Bioremediation: methods and protocols, s/n, 263-281.
Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A. y Lane, D. J. (1991). 16S ribosomal

DNA amplification for phylogenetic study. Journal of bacteriology, 173(2), 697-703.
Xiang, H., Lu, X., Yin, L., Yang, F., Zhu, G. y Liu, W. (2013). Microbial community
characterization, activity analysis and purifying efficiency in a biofilter process. Journal of
Environmental Sciences, 25(4), 677-687.
Zak, D. R., Holmes, W. E., White, D. C., Peacock, A. D. y Tilman, D. (2003). Plant
diversity, soil microbial communities, and ecosystem function: are there any
links?. Ecology, 84(8), 2042-2050.
78
Zamora, A., Malaver, N. y Ramos, J. (2012). Análisis funcional de
microorganismos: un estimador de diversidad y estructura comunitaria. Acta Biológica
Venezuelica, 32, 1.
Zehr, J. P. y Kudela, R. M. (2011). Nitrogen cycle of the open ocean: from genes
to ecosystems. Annual Review of Marine Science, 3, 197-225.
Zhang, S., Wang, Y., He, W., Wu, M., Xing, M., Yang, J. y Pan, M. (2014). Impacts
of temperature and nitrifying community on nitrification kinetics in a moving-bed biofilm
reactor treating polluted raw water. Chemical Engineering Journal, 236, 242-250.
Zhu, S. M., Deng, Y. L., Ruan, Y. J., Guo, X. S., Shi, M. M. y Shen, J. Z. (2015).
Biological denitrification using poly (butylene succinate) as carbon source and biofilm
carrier for recirculating aquaculture system effluent treatment. Bioresource
technology, 192, 603-610.
Zhu, S. y Chen, S. (2002). The impact of temperature on nitrification rate in fixed

film biofilters. Aquacultural Engineering, 26(4), 221-237.
Zhu, Y., Zhang, Y., Ren, H. Q., Geng, J. J., Xu, K., Huang, H. y Ding, L. L. (2015).
Physicochemical characteristics and microbial community evolution of biofilms during the
start-up period in a moving bed biofilm reactor. Bioresource technology, 180, 345-351.
79
Anexo A.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon de
la diversidad metabólica.
Tabla. A.1.-Valores p de la prueba de t de Hutchenson para el índice de Shannon

evaluado a la hora 64, para el efluente a base de ácido acético (AA) con las dos
relaciones C/N (1 y 10).
T0 1AA1 1AA2 1AA3 10AA1 10AA2 10AA3

T0 0.86979 0.11936 0.70418 0.19423 0.17825 0.19381
1AA1 0.86979 0.72453 0.93782 0.53219 0.63145 0.71387
1AA2 0.11936 0.72453 0.64738 0.75385 0.87827 0.96655
1AA3 0.70418 0.93782 0.64738 0.45502 0.55567 0.64269
10AA1 0.19423 0.53219 0.75385 0.45502 0.88088 0.80978
10AA2 0.17825 0.63145 0.87827 0.55567 0.88088 0.92137
10AA3 0.19381 0.71387 0.96655 0.64269 0.80978 0.92137

evaluado a la hora 64, para el efluente a base de glucosa (G) con las dos relaciones C/N
(1 y 10).
T0 1G1 1G2 1G3 10G1 10G2 10G3

T0 0.27624 0.14302 0.10877 0.46898 0.53721 0.5083
1G1 0.27624 0.88088 0.55989 0.60005 0.55484 0.58163
1G2 0.14302 0.88088 0.89576 0.33178 0.30519 0.32235
1G3 0.10877 0.55989 0.89576 0.26358 0.2417 0.25627
10G1 0.46898 0.60005 0.33178 0.26358 0.92669 0.96495
10G2 0.53721 0.55484 0.30519 0.2417 0.92669 0.96277
10G3 0.5083 0.58163 0.32235 0.25627 0.96495 0.96277

evaluado a la hora 64, para el efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con
la relación C/N=1
1AA1 1AA2 1AA3 1G1 1G2 1G3
80
1AA1 0.72453 0.93782 0.33867 0.52739 0.59167
1AA2 0.72453 0.64738 0.47643 0.75503 0.845
1AA3 0.93782 0.64738 0.26737 0.26737 0.50918
1G1 0.33867 0.47643 0.26737 0.65559 0.55989
1G2 0.52739 0.75503 0.26737 0.65559 0.89576
1G3 0.59167 0.845 0.50918 0.55989 0.89576

evaluado a la hora 64, para el efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con
la relación C/N=10
10AA1 10AA2 10AA3 10G1 10G2 10G3
10AA1 0.88088 0.80978 0.39356 0.36573 0.38285
10AA2 0.88088 0.92137 0.34239 0.31949 0.33355
10AA3 0.80978 0.92137 0.34008 0.31977 0.33195
10G1 0.39356 0.34239 0.34008 0.92669 0.96495
10G2 0.36573 0.31949 0.31977 0.92669 0.96277
10G3 0.38285 0.33355 0.33195 0.96495 0.96277
81
Anexo B.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon de
la estructura de la comunidad gen 16S.
Tabla. B.1.-Valores p de la prueba de t de Hutchenson para el índice de Shannon

evaluado para el gen 16S. Efluente a base de ácido acético (AA).
1AA1 1AA2 1AA3 10AA1 10AA2 10AA3
1AA1 0.96897 0.92331 0.99709 0.92218 0.9664
1AA2 0.96897 0.8899 0.96846 0.95042 0.99515
1AA3 0.92331 0.8899 0.93257 0.84769 0.89349
10AA1 0.99709 0.96846 0.93257 0.9247 0.96588
10AA2 0.92218 0.95042 0.84769 0.9247 0.95816
10AA3 0.9664 0.99515 0.89349 0.96588 0.95816

evaluado para el gen 16S. Efluente a base de glucosa (G).
1G1 1G2 1G3 10G1 10G2 10G3
1G1 0.93613 0.9751 0.93218 0.94185 0.96746
1G2 0.93613 0.96161 0.99778 0.99244 0.96689
1G3 0.9751 0.96161 0.95842 0.96804 0.99339
10G1 0.93218 0.99778 0.95842 0.98995 0.96367
10G2 0.94185 0.99244 0.96804 0.98995 0.97367
10G3 0.96746 0.96689 0.99339 0.96367 0.97367
82
evaluado para el gen 16S. Efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con la
relación C/N=1
1G1 1AA2 1AA3 1G1 1G2 1G3
1AA1 0.96897 0.92331 0.78137 0.85238 0.81146
1AA2 0.96897 0.8899 0.80572 0.87782 0.83606
1AA3 0.92331 0.8899 0.7092 0.78196 0.74093
1G1 0.78137 0.80572 0.7092 0.93613 0.9751
1G2 0.85238 0.87782 0.78196 0.93613 0.96161
1G3 0.81146 0.83606 0.74093 0.9751 0.96161

evaluado para el gen 16S. Efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con la
relación C/N=10
1G1 10AA2 10AA3 10G1 10G2 10G3
10AA1 0.9247 0.96588 0.85713 0.84677 0.82037
10AA2 0.9247 0.95816 0.92819 0.91765 0.89047
10AA3 0.96588 0.95816 0.88818 0.87764 0.85065
10G1 0.85713 0.92819 0.88818 0.98995 0.96367
10G2 0.84677 0.91765 0.87764 0.98995 0.97367
10G3 0.82037 0.89047 0.85065 0.96367 0.97367
83
Anexo C.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon de
la estructura de la comunidad gen beta-amo.
Tabla. C.1.-Valores p de la prueba de t de Hutchenson para el índice de Shannon

evaluado para el gen beta-amo. Efluente a base de ácido acético (AA).
1AA1 1AA2 1AA3 10AA1 10AA2 10AA3
1AA1 0.83927 0.41528 0.92545 0.86948 0.95417
1AA2 0.83927 0.4832 0.92105 0.96293 0.87677
1AA3 0.41528 0.4832 0.57544 0.56637 0.52782
10AA1 0.92545 0.92105 0.57544 0.96438 0.97431
10AA2 0.86948 0.96293 0.56637 0.96438 0.93545
10AA3 0.95417 0.87677 0.52782 0.97431 0.93545
Tabla. C.2.-Valores p de la prueba de t de Hutchenson para el índice de Shannon evaluado para

el gen beta-amo. Efluente a base de glucosa (G).
1G1 1G2 1G3 10G1 10G2 10G3
1G1 0.81838 0.79 0.7509 0.96997 0.88579
1G2 0.81838 0.59339 0.89602 0.78831 0.70394
1G3 0.79 0.59339 0.58458 0.82253 0.91449
10G1 0.7509 0.89602 0.58458 0.72712 0.66147
10G2 0.96997 0.78831 0.82253 0.72712 0.91582
10G3 0.88579 0.70394 0.91449 0.66147 0.91582
84
evaluado para el gen beta-amo. Efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con
la relación C/N=1
1AA1 1AA2 1AA3 1G1 1G2 1G3
1AA1 0.87929 0.52249 0.69488 0.84196 0.52249
1AA2 0.87929 0.59583 0.79715 0.96515 0.59583
1AA3 0.52249 0.59583 0.79 0.59339 1
1G1 0.69488 0.79715 0.79 0.81838 0.79
1G2 0.84196 0.96515 0.59339 0.81838 0.59339
1G3 0.52249 0.59583 1 0.79 0.59339

evaluado para el gen beta-amo. Efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con
la relación C/N=10
10AA1 10AA2 10AA3 10G1 10G2 10G3
10AA1 0.96438 0.97431 0.98855 0.72757 0.65848
10AA2 0.96438 0.93545 0.95361 0.7412 0.66419
10AA3 0.97431 0.93545 0.98704 0.68921 0.61771
10G1 0.98855 0.95361 0.98704 0.72712 0.66147
10G2 0.72757 0.7412 0.68921 0.72712 0.91582
10G3 0.65848 0.66419 0.61771 0.66147 0.91582
85
Anexo D.- Valores p para la prueba t de Hutchenson, para el índice de Shannon de
la estructura de la comunidad gen NirS.
Tabla. D.1.-Valores p de la prueba de t de Hutchenson para el índice de Shannon
evaluado para el gen nirS. Efluente a base de ácido acético (AA).
1AA1 1AA2 1AA3 10AA1 10AA2 10AA3
1AA1 0.79058 0.86138 0.60286 0.49786 0.69812
1AA2 0.79058 0.91524 0.77918 0.64881 0.90201
1AA3 0.86138 0.91524 0.69193 0.55769 0.81016
10AA1 0.60286 0.77918 0.69193 0.87172 0.86156
10AA2 0.49786 0.64881 0.55769 0.87172 0.71726
10AA3 0.69812 0.90201 0.81016 0.86156 0.71726
Tabla. D.2.-Valores p de la prueba de t de Hutchenson para el índice de Shannon evaluado

para el gen beta-amo. Efluente a base de glucosa (G).
1G1 1G2 1G3 10G1 10G2 10G3
1G1 0.97695 0.76073 0.68611 0.98191 0.86242
1G2 0.97695 0.73212 0.65517 0.95875 0.83455
1G3 0.76073 0.73212 0.92285 0.78148 0.88143
10G1 0.68611 0.65517 0.92285 0.70789 0.79747
10G2 0.98191 0.95875 0.78148 0.70789 0.88317
10G3 0.86242 0.83455 0.88143 0.79747 0.88317
86
evaluado para el gen nirS. Efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con la
relación C/N=1
1AA1 1AA2 1AA3 1G1 1G2 1G3
1AA1 0.79058 0.86138 0.99187 0.98508 0.75065
1AA2 0.79058 0.91524 0.8006 0.77214 0.95251
1AA3 0.86138 0.91524 0.87128 0.84311 0.8678
1G1 0.99187 0.8006 0.87128 0.97695 0.76073
1G2 0.98508 0.77214 0.84311 0.97695 0.73212
1G3 0.75065 0.95251 0.8678 0.76073 0.73212

evaluado para el gen nirS. Efluente a base de glucosa (G) y ácido acético (AA) con la
relación C/N=10
10AA1 10AA2 10AA3 10G1 10G2 10G3
10AA1 0.70789 0.79747 0.89527 0.63452 0.70826
10AA2 0.70789 0.88317 0.7552 0.53062 0.57742
10AA3 0.79747 0.88317 0.96625 0.73115 0.82595
10G1 0.89527 0.7552 0.96625 0.70789 0.79747
10G2 0.63452 0.53062 0.73115 0.70789 0.88317
10G3 0.70826 0.57742 0.82595 0.79747 0.88317
87

Tesis MCIA María Del Carmen Cano Correa

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Tesis MCIA María Del Carmen Cano Correa

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Tesis MCIA María Del Carmen Cano Correa

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLÁS DE HIDALGO

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERÍA AMBIENTAL

“Diversidad metabólica y genética de la comunidad bacteriana

Para obtener el grado de:

Morelia Michoacán, octubre de 2017

A mi mamá, por el apoyo incondicional que he recibido de su parte en cada una de

Al laboratorio de biología Acuática de la UMSNH, así como al programa de Maestría

Al programa CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología) por la beca

A la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH, por el financiamiento

A la Coordinación General del Posgrado de la UMSNH, al “Programa del

Al Dr. Andrei Rosales por su apoyo brindado en este proyecto de investigación.

A la Dra. Soledad Vázquez y todo su equipo de trabajo, por la disponibilidad del

Al Dr. Hernando Rodríguez Correa y al laboratorio de genética molecular de la

A la Dra. Julieta Orlando y todo su equipo de investigación, que me acogieron como

Lista de símbolos abreviaturas o nomenclatura …………………………………. …xiii

Resumen …………………………………………………………………………….…. xiv

Tabla 3.1 Parámetros de operación para reactores de lecho móvil, usando

Tabla 3.3 Parámetros fisicoquímicos que intervienen en la remoción de amonio 16

Tabla 5.1 Parámetros de diseño del reactor de lecho móvil 24

Tabla 5.2 Parámetros determinados y metodología usada 25

Tabla 5.4 Fórmulas para calcular los índices de diversidad metabólica 28

Tabla 5.5 Oligonucleótidos utilizados en la amplificación de los genes 31

Tabla 6.2 Concentraciones de DQO, N-NH3 Y N-NO4 en la entrada y salida del

Tabla 6.3 Porcientos de remoción de CA (Carga Amoniacal) sin diferencia

Tabla. 6.7 Equitatividad y sustratos degradados de cada una de las muestras

Tabla. 6.9 índice de Shannon, equitatividad y TRFs para el gen beta-amo de

Tabla. 6.10 Equitatividad y sustratos degradados de cada una de las muestras

Figura 3.1 Operaciones unitarias que pueden conformar un sistema acuícola

Figura 3.2 Principio de funcionamiento de los reactores de lecho móvil. 9

Figura 5.1 Reactor de lecho móvil piloto, con capacidad de 40 L 22

Figura 5.2 Dilución de la biopelícula y siembra en agar de soya tripticasa para 26

Figura 6.1 Desarrollo de color promedio (AWCD) de los sustratos 38

Figura 6.2 Análisis de componentes principales de las fuentes de carbono 41

Figura 6.3 Índices de Shannon en cada de las condiciones experimentales en 42

Figura 6.4 Diversidad Beta, Formación de grupos, por efluentes, Bray-Curtis 44

Figura 6.6 Diversidad Beta, Formación de grupos, por efluentes, Bray-Curtis 44

Figura 6.7 Análisis de correspondencia canónica entre el perfil metabólico de 46

Figura 6.8 Análisis de correspondencia canónica entre el perfil metabólico de 57

Figura 6.9 Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido de 48

Figura 6.10 Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la 49

Figura 6.11 Análisis de correspondencia canónica entre los perfiles de TRFLP 51

Figura 6.12 Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido para 52

Figura 6.13 Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la 54

Figura 6.14 Análisis de correspondencia canónica entre los perfiles de TRFLP 55

Figura 6.15 Abundancia relativa de la fluorescencia de cada TRF obtenido para 56

Figura 6.16 Análisis de agrupamiento de las comunidades bacterianas de la 58

Figura 6.17 Análisis de correspondencia canónica entre los perfiles de TRFLP 58

Notación Descripción Unidades

RAS Sistemas acuícolas recirculados -

C/N Relación carbono nitrógeno kgDDO/ kgNH3

polimorfismo en la longitud de los fragmentos

RLM Reactor de lecho móvil -

TRH Tiempo de retención hidráulico h

TRC Tiempo de retención celular d

CH Carga hidráulica m3/m2.d

CO Carga Orgánica gDQO/m2.d

CA Carga Amoniacal gN-NH3/m2.d

DQO Demanda Química de Oxigeno mg/l

Relación C/N Favorece el 0,5 a 8 la fracción de las bacterias (Barajas, 2002)