Biorremediacion Suelos

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Universidad del Bo-Bo.

Red de Bibliotecas - Chile

UNIVERSIDAD DEL BIO-BIO


FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO INGENIERIA CIVIL Y AMBIENTAL

Profesor Patrocinante : Carmen Gonzlez L.

Profesor comisin : Ricardo Riveros V.

Cristian Chavarra M.

BIORREMEDIACION DE SUELOS
CONTAMINADOS CON
HIDROCARBUROS

PROYECTO DE TITULO PRESENTADO EN CONFORMIDAD A LOS REQUISITOS


PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO CIVIL

DANIELA SOLEDAD PONCE CONTRERAS

CONCEPCIN, ENERO 2014


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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero agradecer a Dios, por su infinito amor hacia m, por bendecirme da
a da poniendo su mano para realizar todos mis sueos de la mejor forma posible. Espero
ser la profesional que l espera.

En segundo lugar, quiero agradecerles principal y fundamentalmente a mis padres, Daniel


Ponce y Gladys Contreras, me faltara vida para agradecer el hecho de siempre haber credo
en m, en jugrselas por mi felicidad y bienestar. A mis hermanos, Christian, Rodrigo y
Roco, por siempre animarme y darme una palabra de aliento cuando las cosas salan mal y
por alegrarse de mis triunfos. A Toms, mi hijo querido, el motor que mueve mi vida y gua
mis pasos, por l hago esto, es la razn principal de todo mi esfuerzo. A Mauricio Rivera,
mi pololo y compaero de vida, ha sido fundamental en mi vida universitaria, gracias por
ayudarme siempre, por tu positivismo, por creer en m, por tu paciencia y por ayudarme en
avanzar en mi proyecto de ttulo a pesar de tu cansancio. Espero que me sigas
acompaando en mi vida.

En tercer lugar quiero agradecer a dos grandes amigos que hice en la universidad: a mi
mejor amigo, Cristian Romero, fuiste fundamental en mi vida universitaria, en los
momentos difciles en que todo se pona cuesta arriba lloramos juntos y reste conmigo en
los momentos de victoria. Gracias por tu amistad incondicional y siempre estar dispuesto a
ayudar. A Omar Zurita, por su eterna amistad, por su alegra, por hacerme rer, por ser mi
eterno compaero de trabajos.

Y por ltimo, a todos los buenos compaeros que hice durante mi vida estudiantil, cada uno
ayud para que hoy sea una profesional, siempre los llevar en mi corazn. Al personal del
Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental, profesores y secretarias, se convirtieron en
una segunda familia.

Estudiar, no para saber ms, sino para servir mejor (Santo Domingo de Guzmn)
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INDICE GENERAL

1. INTRODUCCION ........................................................................................................... 3
1.1 Contexto ........................................................................................................................ 3
1.2 Identificacin y justificacin del problema .................................................................. 4
1.3 Alcances de la investigacin ......................................................................................... 4
1.4 Objetivos de la investigacin ........................................................................................ 5
1.4.1. Objetivo general. ................................................................................................... 5
1.4.2. Objetivos especficos. ............................................................................................ 5
2. REVISION BIBLIOGRAFICA. .................................................................................... 6
2.1 CONTAMINACIN DEL SUELO CON HIDROCARBUROS. ............................... 6
2.2 EL PETROLEO Y SUS HIDROCARBUROS .......................................................... 11
2.3 COMPOSICION POR FAMILIAS DE HIDROCARBUROS. (3) ............................. 12
3. METODOLOGIA.......................................................................................................... 16
3.1 BIORREMEDIACION .............................................................................................. 16
3.2 FUNDAMENTACION BIOQUIMICA DE LA BIODEGRADACION .................. 18
3.3 FACTORES QUE CONDICIONAN LA BIORREMEDIACIN DE UN SUELO . 19
3.3.1. Temperatura ........................................................................................................ 20
3.3.2. pH ........................................................................................................................ 20
3.3.3. Humedad ............................................................................................................. 21
3.3.4. Necesidad de nutrientes inorgnicos ................................................................... 21
3.3.5. Aceptores de electrones. ...................................................................................... 22
3.3.6. microorganismos. ................................................................................................ 22
3.3.7. Estructura del suelo. ............................................................................................ 23
3.3.8. Estructura del contaminante. ............................................................................... 23
3.4 MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIN ......................................... 24
3.4.1. Bacterias .............................................................................................................. 24
3.4.2. Hongos ................................................................................................................ 26
3.5 TIPOS DE BIORREMEDIACIN ........................................................................... 27
3.5.1. Bioaireacin o Bioventeo .................................................................................... 29
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3.5.2. Bioestimulacin ................................................................................................... 30


3.5.3. Bioaumentacin. .................................................................................................. 31
3.5.4. Atenuacin natural. ............................................................................................. 32
3.5.5. Tratamiento del terreno o Landfarming. ............................................................. 34
3.5.6. Biopilas................................................................................................................ 35
3.5.7. Tratamiento de biosuspensin. ............................................................................ 37
3.7 ETAPAS DEL TRABAJO PARA UNA BIORREMEDIACIN MS EFICAZ .... 38
3.7.1. Investigacin y caracterizacin de la contaminacin y del emplazamiento........ 38
3.7.2. Anlisis y eleccin de las medidas biocorrectivas. ............................................. 38
3.7.3. Diseo y evaluacin del sistema. ........................................................................ 39
3.7.4. Anlisis e interpretacin de resultados. ............................................................... 40
4. RESULTADOS .............................................................................................................. 41
4.1 ENSAYOS DE TRATABILIDAD EN SUELOS CONTAMINADOS. ................... 41
4.2 PROTOCOLO DEL ENSAYO DE TRATABILIDAD ............................................ 42
4.3 MATERIALES Y METODOS .................................................................................. 44
4.3.1. Materiales. ........................................................................................................... 44
4.3.2. Ensayos con mesocosmos. .................................................................................. 44
4.3.3. Anlisis fisicoqumico del suelo. ........................................................................ 47
4.3.4. Caractersticas microbiolgicas........................................................................... 50
4.3.5. Caractersticas de la actividad metablica .......................................................... 50
5. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 54
6. COMENTARIOS .......................................................................................................... 55
7. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 57
8. REFERENCIAS ............................................................................................................ 58
9. ANEXOS ........................................................................................................................ 60
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INDICE DE FIGURAS

Figura 1: Estructuras qumicas de componentes de un crudo de petrleo. ......................... 14

Figura 2: Apariencias fsicas generales de las bacterias ..................................................... 25

Figura 3: Tipos de biorremediacin. ................................................................................... 28

Figura 4: Fases en el estudio de tratabilidad de un suelo contaminado. ............................. 42

INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Industrias que generan contaminacin de suelos con hidrocarburos. ..................... 7

Tabla 2: Ventajas y desventajas de la biorremediacin....................................................... 18

Tabla 3: Tipos de reacciones en los procesos aerbicos y anaerbicos. ............................. 19

Tabla 4: Bacterias y hongos ms usados en biorremediacin. ............................................ 27

Tabla 6: Rangos ptimos para procesos de biorremediacin. ............................................. 46

Tabla 7: Anlisis de caractersticas fsicas. ......................................................................... 46

Tabla 8: Cantidad de agua aplicada y volteos manuales por semana. ................................. 47


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BIORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

Autor: Daniela Ponce Contreras


Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental, Universidad del Bo-Bo
Correo Electrnico: dponce@alumnos.ubiobio.cl

Profesor Patrocinante: Carmen Gonzlez Labb

Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental, Universidad del Bo-Bo


Correo Electrnico: cgonzal@ubiobio.cl

RESUMEN

La contaminacin por hidrocarburos est ampliamente distribuida en el mundo y nuestro


pas no es la excepcin. La industria petrolera y petroqumica son el eje principal en la
produccin de hidrocarburos y derivados destinados a satisfacer nuestros requerimientos
energticos de combustibles y productos lubricantes para la industria y el transporte. Se
describe un problema medioambiental de amplio alcance, como es la degradacin de los
suelos por la contaminacin debida a los hidrocarburos, y los nuevos instrumentos de
biorremediacin existentes. La degradacin de suelos es un proceso que disminuye la
capacidad real y/o potencial del suelo para producir bienes o prestar servicios. Las causas
del deterioro pueden ser tanto naturales como antrpicas.
Por este motivo, en la presente investigacin, se pretende realizar una revisin bibliogrfica
de la biorremediacin y los mtodos ms conocidos de dicha tcnica, ya que a travs de la
biorremediacin se puede dar solucin a la problemtica de suelos contaminados con
hidrocarburos de manera ms limpia. Se tienen en cuenta los factores que condicionan la
biorremediacin, ventajas, desventajas y caractersticas de cada uno de sus mtodos.
Adems se dise un protocolo de ensayo a escala en laboratorio para biorremediar suelos
contaminados con hidrocarburos.

Palabras claves: Contaminacin con hidrocarburos, biorremediacin, protocolo de ensayo


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ABSTRACT

Oil pollution is widespread in the world and our country is no exception. The oil and
petrochemical industry are the main focus in the production of hydrocarbons and
derivatives designed to meet our energy requirements of fuels and lubricants for industry
and transportation. We describe a comprehensive environmental problem, as is the
degradation by pollution due to hydrocarbons, and new instruments existing
bioremediation. Soil degradation is a process that decreases the actual capacity and / or
potential soil to produce goods or provide services. The causes of deterioration may be both
natural and anthropogenic.

For this reason, in this research aims to review the literature of bioremediation and methods
of the technique known as bioremediation through it can solve the problem of soil
contaminated with hydrocarbons more cleanly. It takes into account the factors affecting
bioremediation, advantages, disadvantages and characteristics of each of its methods.

Also designed a protocol for laboratory scale test for soils contaminated with hydrocarbons
bioremediate.

Keywords: hydrocarbon contamination, bioremediation test protocol


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1. INTRODUCCION

1.1 Contexto

En la naturaleza existe una amplia variedad de microorganismos que se encuentran en el


medio de forma natural y que descomponen sustancias, incluidos los hidrocarburos, en
formas menos complejas. Este proceso de biodegradacin es caracterstico de todos los
sistemas ambientales. La introduccin de hidrocarburos, por ejemplo durante un vertido,
concede a estos organismos la oportunidad de proliferar si las condiciones son adecuadas.
La biodegradacin de los hidrocarburos puede producirse en presencia de oxgeno
(condiciones aerbicas) o en ausencia del mismo (condiciones anaerbicas). Sin embargo,
en condiciones anaerbicas el proceso se produce de forma mucho ms lenta y, desde el
punto de vista operacional, tiene poco inters para la biorremediacin. Las bacterias,
hongos, levaduras y algas que son responsables del proceso de biodegradacin, requieren
adems fuentes de alimento en forma de nitrgeno (N) y fsforo (P), elementos que se
encuentran de forma habitual en el medio ambiente.

En consecuencia, los productos del proceso de biodegradacin son: dixido de carbono,


agua y biomasa de microorganismos. Esta reaccin metablica de origen natural puede
emplearse como mecanismo de remediacin de una contaminacin por derrame de
hidrocarburos, y es en este punto cuando se habla de Biorremediacin.

Es necesario, inicialmente, distinguir entre los siguientes conceptos:


Biodegradacin, se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros
microorganismos alteran y convierten molculas orgnicas en otras sustancias, como cidos
grasos y CO2.
Biorremediacin, adicin de materiales a ambientes contaminados para producir una
aceleracin del proceso natural de biodegradacin.
Fertilizacin, mtodo de biorremediacin de adicin de nutrientes, como Nitrgeno
Fsforo a un medio contaminado para estimular el crecimiento de microorganismos
nativos.
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Inoculacin, adicin de microorganismos a un sitio contaminado, los cuales pueden


adicionarse junto con nutrientes.

1.2 Identificacin y justificacin del problema

La obtencin de energa que posibilita el desarrollo de las actividades humanas, proviene en


su mayora de la explotacin del petrleo - extraccin, refinacin, distribucin y
almacenamiento - lo que le confiere a los hidrocarburos, un papel protagnico en la
problemtica ambiental a escala global.

En este sentido, los daos ocasionados por los derrames de hidrocarburos en las fuentes
hdricas, el suelo, el aire, la fauna y la vegetacin son difcilmente reversibles, pues los
procesos de descontaminacin no alcanzan a cubrir todas las reas afectadas y en ocasiones
se realizan mucho tiempo despus de que el crudo ha hecho trnsito y alterado el
ecosistema.

Los hidrocarburos afectan las propiedades fsicas y qumicas del suelo, como el pH, textura,
permeabilidad, prdida de capacidad de soporte al crecimiento vegetal y causan un impacto
paisajstico. Para limpiar zonas afectadas con hidrocarburos existen tratamientos fsicos,
qumicos y biolgicos, siendo stos ltimos ambientalmente seguros y econmicamente
accesibles a la hora de realizar tratamientos de biorremediacin de hidrocarburos. Los
tratamientos biolgicos emplean microorganismos (bacterias y hongos), los cuales transforman
los contaminantes presentes en una matriz slida o liquida y recuperan la matriz original.

1.3 Alcances de la investigacin

Este proyecto tiene como objetivo principal disear un protocolo o metodologa de ensayo
en laboratorio para biorremediar suelos contaminados con hidrocarburos, de modo que
stas cumplan con los requerimientos y exigencias de las normativas ambientales, para as
generar inters por estas reas, recuperando el uso de estos suelos, ya sea para cultivo,
urbanizar o para recreacin. Adems, debido a que existen una gran variedad de parmetros
fisicoqumicos y biolgicos que condicionan el proceso de biorremediacin, es necesario
evaluar la influencia de los factores que afectan al proceso de la biodegradacin. Para ello
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se disea la metodologa o protocolo, que se definen como conjunto de experimentos


realizados a escala de laboratorio, previos a la implementacin de cualquier tecnologa de
biorremediacin a un suelo contaminado. (1)

1.4 Objetivos de la investigacin

1.4.1. Objetivo general.

Proponer un protocolo de ensayos de tratabilidad a escala de laboratorio previos a la


eleccin de una tcnica de biorremediacin de suelos contaminados con
Hidrocarburos.

1.4.2. Objetivos especficos.

Comparar tcnicas de biorremediacin para mejorar suelos contaminados.


Definir factores que condicionan la biorremediacin en un suelo.
Identificar y seleccionar los parmetros de estudio en laboratorio necesarios a
considerar para biodegradar suelos contaminados con hidrocarburos.
Disear protocolo de ensayo de tratabilidad que permitir caracterizar tanto las
poblaciones microbianas como la biodegradabilidad de los contaminantes del suelo.
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2. REVISION BIBLIOGRAFICA.

2.1 CONTAMINACIN DEL SUELO CON HIDROCARBUROS.

Generalidades

La contaminacin por hidrocarburos es una problemtica de carcter mundial y amplia


distribucin geogrfica, teniendo en cuenta que independiente de la zona afectada (lagos,
suelos, zonas freticas, ros y playas) por procesos biolgicos y fsicos, los hidrocarburos
tienen como destino final el ocano.

En la actualidad existe un creciente inters por la contaminacin del suelo con


hidrocarburos, por parte de los pases dedicados a la explotacin de petrleo,
organizaciones e instituciones afines al medio ambiente, debido a los riesgos directos que
ocasionan a la salud humana y el entorno, adems los altos costos que implican los
procesos de limpieza y mitigacin de los lugares afectados. Los antecedentes descritos
estn direccionando sus polticas hacia la disminucin y la remediacin de la
contaminacin por hidrocarburos.

As un suelo contaminado se define como todo aquel cuyas caractersticas fsicas, qumicas
y biolgicas naturales, han sido alteradas debido a actividades antropognicas y representa
un riesgo para la salud humana o el medio ambiente. (2)

La contaminacin de suelo por hidrocarburos es dinmica, los componentes individuales


pueden separarse de la mezcla original como se detalla a continuacin: (2)

Los Compuestos Orgnicos Voltiles (COVs) se evaporan.

Algunos se solubilizan gracias a la polaridad de sus molculas.

Otros se absorben en la superficie de la fase slida del suelo por reacciones


qumicas o debido a fuerzas fsicas, (siendo la primera la que fija los contaminantes,
limita el transporte y disminuye la biodisponibilidad para los microorganismos).

Mientras otros son degradados por microorganismos en el suelo.


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Como resultado de estas transformaciones los hidrocarburos se enriquecen en compuestos


pesados, ms difciles de degradar.

En la Tabla 1 se presentan las industrias que generan contaminacin del suelo por
hidrocarburos.

Tabla 1: Industrias que generan contaminacin de suelos con hidrocarburos.

TIPO DE INDUSTRIA PRINCIPALES CONTAMINATES DEL SUELO


Industria petrolera Hidrocarburos aromticos y alifticos.
Fbrica de gas Alquitran, benceno fenoles, hidrocarburos aromticos policclicos, cianuros.
Industria textil Hidrocarburos y metales pesados.
Estaciones de servicio Hidrocarburos y derivados del petrleo.
Centrales termoelctricas Hidrocarburos, derivados del petrleo y metales pesados.
Minera Hidrocarburos aromticos, metales pesados, cianuro.
Industria agropecuaria Hidrocarburos, pesticidas, plagicidas.
Floricultura Pesticidas, plaguicidas e hidrocarburos.
Lavadoras de vehculos Hidrocarburos.
Mecnicas automotrices Hidrocarburos, aceites.

Fuente: Elaboracin propia.

Efectos de los hidrocarburos en el suelo. (2)

Los efectos de los hidrocarburos tienen una variedad de escenarios potenciales, debido a la
difusin lenta de los contaminantes, los cuales se redistribuyen por toda la superficie del
suelo y hacia el interior de este. Cuando los hidrocarburos se filtran, se produce una
separacin natural de los distintos constituyentes, por la exposicin de la fase no acuosa a
las fases, slida, gaseosa y acuosa del suelo, permaneciendo los compuestos de alto peso
molecular cerca de la fuente, debido a que tienen menor movilidad, mientras que los
compuestos ms livianos migran hacia porciones profundas del perfil por su mayor
solubilidad en agua.

Cuando la cantidad de hidrocarburos disminuye ya sea por disolucin u otro mecanismo de


remocin, se reduce la fraccin del espacio poroso ocupado por los hidrocarburos, los
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conductos de comunicacin entre los poros se tornan ms pequeos y tortuosos, reduciendo


la capacidad de la fase orgnica de desplazarse y cuando ya no existe suficiente volumen
para que continu la migracin, la fase no acuosa en el suelo se denomina saturacin
residual. Los espacios degradados pierden algunas de sus funciones, caractersticas fsico
qumicas y por lo tanto un manejo inadecuado de los hidrocarburos puede causar problemas
de gran envergadura socio-ambiental. Los principales efectos que los hidrocarburos causan
en el suelo, dependen del tipo, volumen de hidrocarburo, caractersticas fsicas, qumicas y
microbiolgicas del suelo, y los factores ambientales (humedad, temperatura, factores
climatolgicos), todas las variables en su conjunto definen el tamao en la distribucin de
la contaminacin en una zona especfica, entre los efectos ms perjudiciales que sufre el
suelo tenemos:

Disminucin del rendimiento de los cultivos y prdida de calidad de los productos


obtenidos.

Impide o retarda el crecimiento de la vegetacin en el rea contaminada.

Alteraciones en la poblacin microbiana del suelo.

Contaminacin de aguas superficiales a travs de la escorrenta.

Contaminacin de aguas subterrneas a travs de lixiviados.

Contaminacin del aire por combustin, evaporacin, sublimacin o arrastre por el


viento.

Envenenamiento a travs de la cadena alimenticia.

Cuando la concentracin de los contaminantes sobrepasa la capacidad de aceptacin


del suelo, se produce una disminucin o anulacin de su poder autodepurante.

Impacto paisajstico en el sector en que se encuentra la matriz contaminada.

Se impide el intercambio gaseoso con la atmsfera iniciando una serie de procesos


fsicos qumicos simultneos.
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Los elevados desniveles de salinidad pueden destruir la estructura terciaria de las


protenas, desnaturalizar enzimas y deshidratar clulas.

Los hidrocarburos ligeros penetran ms en el suelo llegando a las capas freticas y resultan
txicos para la microflora del suelo, en cambio los ms pesados son menos txicos a corto
plazo, pero permanecen en el ambiente por mucho ms tiempo. Los compuestos solventes se
filtran y los slidos, permanecen en la superficie o son llevados hacia tierras ms bajas. En la
siguiente tabla se presentan los parmetros que influyen en el transporte de los contaminantes.

Efectos de los hidrocarburos en los seres vivos. (2)

Debido a la variedad de la composicin de los hidrocarburos, los efectos en los seres vivos
son muy diversos, y dependen de factores como, el tipo de compuesto qumico, la cantidad
vertida y el tiempo de exposicin. Segn el tipo de hidrocarburo se puede estimar la
intensidad de los daos y efectos, as combustibles ligeros como la gasolina y el queroseno
resultan ms txicos que los medianos y pesados como el Diesel o Fuel Ol, debido a que
contiene grandes cantidades de hidrocarburos saturados y bajo contenido de compuestos
polares, ya que su mayor volatilidad aumenta el contacto fsico entre el contaminante y las
clulas microbianas.

Efectos de la contaminacin por hidrocarburos en el ser Humano. (2)

Las vas de ingreso de los hidrocarburos al cuerpo de las personas pueden ser, por va
respiratoria cuando se los inhala y cuando se los ingiere con los alimentos (cadena trfica),
a travs del agua y por contacto directo. Cuando ingresan por va drmica los
contaminantes son absorbidos ms lentamente que cuando son inhalados o ingeridos.
Luego de ingresar estos son ampliamente distribuidos por la sangre y se transforman
rpidamente en compuestos qumicos, pudiendo resultar ms dainos as como menos
peligrosos, esto en funcin de factores como el tipo, composicin y la cantidad expuesta de
hidrocarburos; la mayora de los hidrocarburos abandonan el cuerpo a travs de la orina o
con el aire exhalado. Los constituyentes de los hidrocarburos, de bajo peso molecular
(benceno, tolueno, xileno) afectan el sistema nervioso central, causan irritacin de la piel,
dolores de cabeza, nuseas, hormigueos en manos y pies, cuando la exposicin es alta
pueden provocar la muerte.
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Los principales peligros provenientes de elevadas concentraciones de hidrocarburos en


general, estn relacionados a los hidrocarburos Aromticos Policclicos (HAPs)
principalmente por sus efectos cancergenos. Se ha demostrado que el benceno es
responsable de causar cncer (leucemia) en los seres humanos, adems la gasolina y
benzopirenos son considerados como cancergenos para humanos. El n-hexano afecta el
sistema nervioso central de una forma diferente, causando un desorden nervioso llamado
neuropata perifrica caracterizada por el entumecimiento de las extremidades y en casos
graves, parlisis. Cuando se ingiere gasolina y kerosene, se produce irritacin en la garganta y
estmago, depresin del sistema nervioso central, dificultad para respirar y neumona.
Compuestos como el Antraceno, Pireno, Fenanteno, benzopirenos, causan la irritacin de la
piel, cncer de piel, testculos y pulmones, siendo los alcanos presentes en las gasolinas
depresores del sistema nervioso central. Los metales pesados (cadmio, cromo, plomo,
magnesio, cobalto, cobre) pueden originar enfermedades diferentes cada uno, se bioacumulan
en los seres vivos y entran a formar parte de las cadenas alimenticias, producen la irritacin de
piel, problemas reproductivos y cncer. Es fundamental tener en cuenta los procesos de
intemperizacin, ya que estos cambian la composicin de los productos y pueden afectar los
resultados, la capacidad para biorremediar y la toxicidad del producto liberado al ambiente.
Segn algunos estudios realizados en las poblaciones aledaas a instalaciones petroleras y
zonas donde existe contaminacin por hidrocarburos en el Ecuador, se afirma que existe una
relacin directa entre la exposicin a los hidrocarburos con una mayor prevalencia de
enfermedades, las mismas que se pueden manifestar a corto y largo plazo en la poblacin. A
continuacin se presentan los estudios epidemiolgicos realizados.

Daos a la fauna y flora. (2)

La contaminacin por hidrocarburos afecta a los animales desde los mamferos, aves,
peces, las almejas, los moluscos e insectos, cuando los derrames de petrleo son sobre
cursos de agua afectan de manera especial a la aves y fauna acutica, impidindoles nadar,
alimentarse y con frecuencia volar. Numerosos estudios realizados tanto en animales (de
laboratorio y animales libres) demuestran que la exposicin al petrleo causa lesiones en
distintos rganos, cncer, defectos en la reproduccin e incluso su muerte, en los estudios
realizados a los animales se presentan los siguientes efectos.
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En las aves se ha presentado efectos negativos sobre la capacidad reproductiva.

En estudios realizados en patos que han ingerido crudo se ha observado anemia


hemoltica.

Algunos estudios en ratas han confirmado la presencia de tumores en la piel, por la


exposicin al crudo, adems se han presentado cambios funcionales en las clulas
hepticas de las ratas.

Tambin se produce destruccin de los hbitats, de especies endmicas, prdida de la


diversidad de las comunidades faunsticas que habitan cerca de lugares contaminados con
hidrocarburos. En cuanto a la afeccin a la flora se producen los siguientes daos:

Efectos negativos en la reproduccin y propagacin de la flora.

Destruccin de las fuentes alimenticias de las especies superiores.

Incorporacin de carcingenos en la cadena alimentaria.

La fauna puede verse afectada por varios factores: la persistencia de una mancha de
crudo limita el paso de la luz y por tanto reduce la actividad fotosinttica de muchas
plantas, si la mancha las cubre dificulta tambin su funcin reproductora y la
fijacin.

Prdida de parajes con valor natural, recreativo o vacacional.

2.2 EL PETROLEO Y SUS HIDROCARBUROS

El petrleo es un combustible natural compuesto de varios tipos de hidrocarburos, es decir,


de molculas que contienen bsicamente, carbono e hidrgeno. Estas molculas pueden
estar formadas de cadenas de tomos de carbono largas o cortas y que pueden adoptar
diferentes estructuras. Los hidrocarburos del petrleo pueden dividirse en cuatro categoras
de compuestos:
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I. Los saturados: los alcanos como el hexano, el octano, el decano, el hexadecano, los
isoalcanos y los cicloalcanos como el ciclohexano.

II. Los aromticos: benceno, tolueno, xileno y naftaleno agrupados tambin bajo la
apelacin BTEX y los poliaromticos o PAHs (Rittman, 1994).

III. Las resinas: slidos polares amorfos disueltos que contienen nitrgeno, azufre y
oxgeno.

IV. Los asfaltenos: grandes molculas polares coloidales sin disolver que son ms
resistentes a la biodegradacin (Balba ; Al-Awadhi ; Al-Daher, 1998).

En trminos generales, de un 70 a un 97% de los hidrocarburos del petrleo es degradable


(la fraccin de hidrocarburos saturados y aromticos) y el resto representa los asfaltenos y
las resinas esencialmente inertes (Prince et al., 1999).

Cada una de las categoras agrupa compuestos con caractersticas de solubilidad, volatilidad
y toxicidad propias. Desde un punto de vista de biodegradabilidad, los hidrocarburos
pueden ordenarse de mayor a menor biodegradabilidad en: alcanos lineales > alcanos
ramificados > aromticos ligeros > alcanos cclicos > aromticos pesados > compuestos
polares (Olson, et al., 1999 ; Harris, 1997).

2.3 COMPOSICION POR FAMILIAS DE HIDROCARBUROS. (3)

El estudio ms detallado de los hidrocarburos de un crudo de petrleo agrupa estos


compuestos en las siguientes familias:

Parafinas voltiles: Representan hasta un 30% del crudo de petrleo. Son n alcanos e
isoprenoides (alcanos ramificados) de un tamao C1 a C106. Es la fraccin ms voltil del
crudo y por lo tanto la ms susceptible de prdidas abiticas por volatilizacin. La fraccin
gas natural contiene, principalmente C1 a C5. Los isoprenoides voltiles, estn
representados principalmente por el isobutanoe isopentano. Los isoprenoides voltiles
tambin pueden llegar hasta C10 (2,6 dimetil octano) (Howe-Grant, 1996).
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Parafinas no voltiles: Se definen como aquellos n alcanos e isoprenoides entre C11y


C40. Los n-alcanos oscilan entre C11y C40, aunque se han descrito cadenas ms largas y
pueden constituir entre el 15 y 20% de crudos no degradados; mientras que los isoprenoides
varan de C12 a C22 y constituyen entre 1-2% del crudo, llegando a 15% en crudos
degradados. Los componentes entre C11 y C15 son de volatilidad intermedia.

Naftenos: Esta familia est compuesta por las cicloparafinas o cicloalcanos. Los
compuestos ms abundantes de esta familia son los ciclopentanos alquilados
(fundamentalmente metilados), que pueden llegar a representar un 31% del crudo. Los
compuestos mono y dicclicos corresponden entre el 50 y 55% de esta fraccin, los
tricclicos al 20% y los tetracclicos al 25%. Esta familia engloba a los hopanos.

Oleofinas: Son alquenos, los cuales estn poco presentes en el crudo de petrleo,
encontrndose en concentraciones traza. Adquieren importancia en los productos
resultantes del refinado, ya que se generan durante el proceso decracking , existiendo hasta
un 30% en gasolinas y un 1% en fueles.

Aromticos: El crudo de petrleo contiene una mezcla muy compleja de hidrocarburos


aromticos. Esta fraccin la componen molculas que contienen uno o varios anillos
bencnicos en su estructura. As se encuentran hidrocarburos monoaromticos (un anillo
bencnico), diaromticos (2 anillos bencnicos) y poliaromticos (HAPs, con ms de dos
anillos bencnicos).

Hidrocarburos monoaromticos: Se encuentran el benceno y sus alquilados


(monoalquilados como el tolueno y dialquilados como los xilenos), formando la
familia de los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) de gran importancia
ambiental debido a su volatilidad y toxicidad.

Hidrocarburos poliaromticos: Entre los hidrocarburos diaromticos,


encontramos el naftaleno y sus alquilados (mono, di, tri y tetrametilnaftalenos).
Constituyen la familia mayoritaria de hidrocarburos aromticos presentes en un
crudo.
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Entre los hidrocarburos poliaromticos de tres anillos, encontramos el fenantreno,


antraceno, fluoreno, y sus derivados alquilados. El fenantreno y los metilfenantrenos,
representan los componentes mayoritarios de los triaromticos.

Entre los hidrocarburos poliaromticos de ms de tres anillos, encontramos el fluoranteno


(3 anillos bencnicos y uno no bencenico), pireno y criseno (4 anillos aromticos), pireno y
benzo(a) pireno (5 anillos aromticos) y coroneno (un HAP pericondensado con 6 anillos).

Resinas y asfaltenos: Se trata de mezclas complejas, integradas por ncleos policclicos o


naftenoaromticos. Contienen cadenas hidrocarbonadas con heterotomos de oxgeno,
nitrgeno y azufre (componentes NOS del petrleo) y a veces estn asociadas con pequeas
concentraciones de metales como el vanadio y el nquel. Constituyen entre un 10% en
crudos poco degradados o ligeros, hasta un 60% en crudos muy degradados. Es la fraccin
que presenta una mayor recalcitrancia de un crudo de petrleo. Se trata de agregados de
piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfxidos, amidas, HAP, sulfuros, cidos
naftnicos, cidos grasos, metaloporfirinas y fenoles polihidratados. (Howe-Grant,1996).

Figura 1 : Estructuras qumicas de diferentes componentes mayoritarios de un crudo de


petrleo. (Fuente: Marc Vias Canals)
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Hidrocarburos Totales de Petrleo (TPH).

El trmino TPH se usa para describir a un grupo de sustancias qumicas, derivadas del
petrleo crudo, debido al gran nmero de hidrocarburos involucrados generalmente no es
prctico medir cada uno de ellos, sin embargo es til medir la cantidad total del conjunto de
hidrocarburos que se encuentran en una muestra de suelo contaminada que sirve como
indicador general del tipo de contaminacin.

Uno de los factores que limita la eliminacin de los hidrocarburos contaminantes es la


tranferencia de masa. Los tratamientos de limpieza del suelo utilizan usualmente mtodos
que permitan el arrastre de los hidrocarburos, pero deben vencer para ello, las fuerzas de
adsorcin sobre las partculas del suelo por modificacin de temperatura, de las
interacciones qumicas (extraccin, emulsificacin) o de la tensin de vapor. En el caso de
la contaminacin con hidrocarburos, se proponen tratamientos fsicos, qumicos y
biolgicos que pueden ser utilizados en complementariedad (Thomassin-Lacroixet al.,
2002).
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3. METODOLOGIA

En este captulo se describe de manera detallada la tcnica de biorremediacin, obtenida de


fuentes bibliogrficas actuales y de experiencias comprobadas y realizadas en otros pases,
como Espaa, Mxico, Argentina, entre otros.

3.1 BIORREMEDIACION

Definicin

La biorremediacin consiste en usar microorganismos (hongos, bacterias) para acelerar la


tasa de degradacin natural de los contaminantes para descomponerlas o degradarlas en
sustancia menos toxicas o no toxicas obteniendo un suelo til para la agricultura por el uso
de nutrientes.

Algunos microorganismos se comen las sustancias orgnicas obteniendo de stas los


nutrientes y la energa que requieren para sobrevivir, los microorganismos descomponen
los contaminantes dando como resultado principalmente dixido de carbono y agua. Al
degradarse todos los contaminantes, es decir, al acabarse la fuente de alimentacin de los
microorganismos la poblacin de los mismos disminuye hasta desaparecer.

Su mbito de aplicabilidad es muy amplio, pudiendo considerarse como objeto cada uno de
los estados de la materia (Atlas y Unterman, 1999):

Slido. Con aplicaciones sobre medios contaminados como suelos o sedimentos, o


bien directamente en lodos, residuos, etc.

Lquido. Aguas superficiales y subterrneas, aguas residuales.

Gases. Emisiones industriales, as como productos derivados del tratamiento de


aguas o suelos.
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Tambin se puede realizar una clasificacin en funcin de los contaminantes con los que se
puede trabajar (Alexander, 1999; Eweiset al., 1999):

Hidrocarburos de todo tipo.

Hidrocarburos clorados.

Compuestos nitroaromticos.

Metales pesados. Estos no se metabolizan por los microorganismos de manera


apreciable, pero pueden ser inmovilizados o precipitados.

Otros contaminantes. Compuestos organofosforados, cianuros, fenoles, etc.

Los microorganismos transforman y metabolizan aerbicamente los hidrocarburos y otros


compuestos orgnicos hasta dixido de carbono, agua y fuentes de alimento para sustentar
su crecimiento y reproduccin, es decir, la biodegradacin ocurre naturalmente. Es
conocido que los microorganismos indgenas tienen la capacidad de adaptarse y
eventualmente degradar cualquier compuesto orgnico natural sin asistencia del hombre;
sin embargo, esta adaptacin requiere la presencia de condiciones ptimas apropiadas tales
como el pH, temperatura, el aceptor final de electrones (que en procesos aerbicos es el
oxgeno), concentraciones de contaminante no toxicas para los microorganismos y
adecuadas condiciones de humedad y conductividad del medio, entre las ms importantes.
La ausencia de alguna o varias de las anteriores condiciones puede limitar parcial o
totalmente la actividad biolgica y es cuando la mano del hombre juega un papel
fundamental en la optimizacin del proceso, ya sea mejorando estas condiciones para
aumentar la poblacin de microorganismos (bioaumentacin) y/o manipulando
genticamente los microorganismos para la degradacin especifica de algunos compuestos
qumicos (bioestimulacin).
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Tabla 2: Ventajas y desventajas de la biorremediacin.

Ventajas Desventajas
- Son efectivos en cuanto a
- Requieren mayores tiempos de
costos.
tratamiento.
- Son tecnologas ms benficas
Biorremediacin - Es necesario verificar la toxicidad
para el ambiente.
de intermediarios y/o productos.
- Los contaminantes
- No pueden emplearse si el tipo de
generalmente son destruidos.
suelo no favorece el crecimiento
- Se requiere un mnimo o ningn
microbiano.
tratamiento posterior.

Fuente: Elaboracin propia.

3.2 FUNDAMENTACION BIOQUIMICA DE LA BIODEGRADACION

El fundamento bioqumico de la biorremediacin se basa, principalmente, en la serie de


reacciones de xido-reduccin (cuyo fin es la obtencin de energa) que se producen en la
cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las clulas. La cadena la inicia un
sustrato orgnico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la clula y que acta
como dador de electrones, de modo que la actividad metablica de la clula acaba
degradando y consumiendo dicha sustancia. Los aceptores ms comnmente utilizados por
los microorganismos son el oxgeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dixido de
carbono. Cuando el oxgeno es utilizado como aceptor de electrones la respiracin
microbiana se produce en condiciones aerobias y los procesos de biodegradacin sern de
tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos o el dixido de carbono se produce en
condiciones reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradacin sern de tipo
anaerobio.
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Tabla 3 : Tipos de reacciones en los procesos de degradacin aerbicos y anaerbicos.

Degradacin aerobia: Sustrato + O2 Biomasa + CO2 + H2O


Sustrato + NO3- Biomasa + CO2 + N2
Sustrato + SO42- Biomasa + CO2 + S2+
Degradacin
Sustrato + Fe3+ Biomasa + CO2 + Fe2+
anaerobia:
Sustrato + Mn4+ Biomasa + CO2 + Mn2+
Sustrato + CO2 Biomasa + CO2 + CH4
Fuente: Elaboracin propia.

3.3 FACTORES QUE CONDICIONAN LA BIORREMEDIACIN DE UN SUELO

La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo contaminado


depende de diversos factores:

1. TEMPERATURA

2. pH

3. HUMEDAD

4. NUTRIENTES

5. ACEPTOR DE ELECTRONES

6. MICROORGANISMOS

7. ESTRUCTURA DEL SUELO

8. ESTRUCTURA DEL CONTAMINANTE


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3.3.1. Temperatura

Es uno de los factores ambientales ms importantes que afecta la actividad metablica de


los microorganismos y la tasa de biodegradacin. Generalmente, las especies bacterianas
crecen a intervalos de temperatura bastante reducidos, entre 20 y 30C (condiciones
mesfilas), decreciendo la biodegradacin por desnaturalizacin de las enzimas a
temperaturas superiores a 40C e inhibindose a inferiores a 0C. Sin embargo, tambin se
ha dado la biodegradacin de hidrocarburos a temperaturas extremas:

10C en suelos subrticos y subalpinos (Sparrow y Sparrow, 1988; Margesin y


Schinner, 1997a,b).

5C en suelos rticos (Whyteet al ., 1999)

60C por una cepa termfila de Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo


contaminado con crudo de petrleo del desierto kuwait (Sorkohet al ., 1993).

3.3.2. pH

Afecta significativamente la actividad microbiana. En consecuencia, cuanto mayor sea la


diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor ser el rango de
tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean ptimas en todos los
casos, pero en trminos generales el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos
es mximo dentro de un intervalo de pH situado entre 6 y 8. En general, el pH ptimo para
las bacterias hetertrofas es neutro (pH 6 - 8), mientras que es ms cido para los hongos
(pH 4 - 5). El pH ptimo establecido para procesos de biodegradacin es neutro (pH 7,4 -
7,8) (Dibble y Bartha, 1979). As mismo el pH tambin afecta directamente en la
solubilidad del fsforo y en el transporte de metales pesados en el suelo. La acidificacin o
la reduccin del pH en el suelo se puede realizar adicionando azufre o compuestos del
azufre.
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3.3.3. Humedad

Los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de humedad para su


crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio de
transporte a travs del cual los compuestos orgnicos y nutrientes son movilizados hasta el
interior de las clulas. Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir
la concentracin de oxgeno en el suelo (el rango vara en funcin de la tcnica). Por lo
anterior, la humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradacin,
fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el
contenido de agua. No obstante el nivel ptimo de humedad depende de las propiedades de
cada suelo, el tipo de contaminacin y si la biodegradacin es aerbica o anaerbica.

3.3.4. Necesidad de nutrientes inorgnicos

El metabolismo microbiano est orientado a la reproduccin de los organismos y stos


requieren que los constituyentes qumicos se encuentren disponibles para su asimilacin y
sintetizacin. Los nutrientes principalmente requeridos son el fsforo y el nitrgeno, por
tanto, las concentraciones asimilables de dichos elementos presentes en el suelo, suelen ser
limitantes para un incremento y activacin de la poblacin microbiana, mientras que otros
nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- ya estn presentes en cantidades
suficientes (Menn et al ., 2000). La adicin de fuentes de N y P inorgnicas, generalmente
tiene un efecto positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de
biodegradacin de hidrocarburos en suelos contaminados (Dott et al., 1995;Breedveld y
Sparrevik, 2001; Chaineau et al., 2003). Las proporciones molares de C:N:P, descritas en la
bibliografa, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas; el rango
normal de C:N:P depende del sistema de tratamiento a emplear, siendo de modo habitual
100:10:1. Aunque en general la adicin de fuentes inorgnicas de N y P al suelo es
beneficiosa para los procesos de biodegradacin, de igual manera, el uso excesivo de
nutrientes inorgnicos tambin puede inhibir los procesos de biodegradacin (Zhou y
Crawford, 1995; Margesin y Schinner, 1997; Genouw et al ., 1994). Para evitar el exceso de
nutrientes, as como la prdida de los mismos por lixiviacin, tambin se han utilizado
fertilizantes inorgnicos oleoflicos de liberacin lenta (Inipol EPA 22) para la
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biorremediacin de suelos contaminados (Lindstrom et al ., 1991; Pritchard y Costa, 1991)


Adems es importante destacar que la accin de los nutrientes inorgnicos puede estar
limitada debido a la interaccin qumica con los minerales del suelo. (el amonio se puede
unir a las arcillas por intercambio catinico y el fosfato puede unirse y precipitar con iones
calcio, hierro y aluminio) (Morgan y Watkinson ,1992)

3.3.5. Aceptores de electrones.

La cantidad de oxigeno disponible determinar si un sistema es aerobio o anaerobio. La


degradacin de HCs se da mejor en los sistemas aerobios y para ello los microorganismos
deben utilizar O2 como aceptor de electrones como el oxgeno (O2) ya que los procesos de
oxidacin de los HCs requieren de enzimas oxigenasas. Sin embargo la presencia de otros
aceptores de electrones como nitrato (NO3 -), sulfato (SO4 -2) o hierro (Fe+3) permiten la
biodegradacin de HCs en ambientes anaerobios (Atlas, 1981; Heitzer y Sayler, 1993;
Alexander, 1999; Roberts, 2000).

En los procesos de biorremediacin el oxgeno es proporcionado por el uso de aire, oxgeno


puro, perxido de hidrogeno u ozono a travs de bombas, propulsores, agitadores,
vaporizadores y chorros aunque tambin se puede suministrar el oxgeno de forma manual
mediante el arado directo del sistema (Levin y Gealt, 1997; EPA, 2000).

3.3.6. microorganismos.

La capacidad metablica de utilizar HCs est ampliamente distribuida entre diversas


poblaciones bacterianas (Atlas, 1981). Las transformaciones biolgicas de los
hidrocarburos se llevan a cabo por la accin de enzimas adecuadas para esa transformacin.
Las enzimas son especficas con relacin al compuesto que atacan y a las reacciones que
catalizan, generalmente ms de una enzima es requerida para degradar una sustancia
orgnica y los microorganismos que poseen las enzimas estn presentes ya en el suelo
(Atlas, 1981; Rittman y McCarty, 2001).

La densidad de microorganismos en el suelo es un factor primordial en el proceso de


biorremediacin. Se requiere una concentracin mayor de 1x103 UFC/gps para que se
alcance una aceptable actividad biodegradativa por los microorganismos (EPA, 1994;
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Leahy y Colwell, 1990; EPA, 2000). En ecosistemas no contaminados las comunidades


degradadoras de hidrocarburos constituyen menos del 0.1% y en ecosistemas contaminados
forman el 85% de microorganismos viables, estas diferencias se dan por el grado de
exposicin y por la adaptabilidad de los microorganismos a los hidrocarburos del ambiente
(Levin y Gealt, 1997; Sylvia et al., 1999; Roberts, 2000).

Antes de iniciar cualquier proceso de biorremediacin es importante realizar recuentos de


microorganismos hetertrofos y degradadores para conocer la densidad e identificar las
especies de microorganismos existentes para escoger una estrategia apropiada de
descontaminacin para un sitio en particular (Ordez, 1995; EPA. 2000).

3.3.7. Estructura del suelo.

La estructura del suelo (granulometra y textura) puede afectar directamente la entrada


efectiva de aire, agua, nutriente y la movilidad del contaminante durante la biodegradacin
(Atlas, 1981; Vidali, 2001).

Un suelo con baja permeabilidad impedir los movimientos de agua, nutrientes y oxgeno al
formarse complejos hmicos de arcilla disminuyendo la disponibilidad para los
microorganismos, de la misma forma esto contribuye a la formacin de residuos
persistentes en el ambiente (Eweis et al., 1999)

El contaminante puede ser absorbido en las partculas del suelo formando agregados los
cuales son difcilmente transportados hasta las clulas que los degradan con lo cual
aumenta la concentracin de la contaminacin (Bouwer y Zehnder, 1993)

3.3.8. Estructura del contaminante.

La estructura molecular del contaminante, afecta a sus propiedades qumicas y fsicas y su


capacidad para ser biodegradado. La capacidad para ser biodegradado est relacionada
con factores tales como la solubilidad, el grado de ramificacin, el grado de saturacin y la
naturaleza y el efecto de los sustituyentes.

La concentracin de los hidrocarburos en el ambiente tambin afecta considerablemente las


tasas de biodegradacin:
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Si las concentraciones presentes en el suelo son muy bajas los compuestos presentes
no suministran la energa suficiente para el mantenimiento de los microorganismos.

Si las concentraciones de HCs son altas pueden ser txicos para las clulas al
generar cambios en la estructura y funcin de la membrana celular.

3.4 MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIN

El suelo es un ambiente muy apropiado para el desarrollo de los microorganismos tanto


eucariotas (algas, hongos, protozoos) como procariotas (bacterias y arqueas), adems de
encontrar virus y bacterifagos. Todos estos organismos establecen relaciones entre ellos en
formas muy variadas y complejas y tambin contribuyen a las caractersticas propias del
suelo por su papel en la modificacin de las fases slida, lquida y gaseosa antes
mencionadas. Los microorganismos desempean funciones de gran importancia en relacin
con procesos de edafognesis; ciclos biogeoqumicos de elementos como el carbono, el
nitrgeno, oxgeno, el azufre, el fsforo, el hierro y otros metales; fertilidad de las plantas
y proteccin frente a patgenos; degradacin de compuestos xenobiticos, etc. En un suelo
agrcola estn presentes alrededor de 1010 organismos por gramo de suelo y constituyen
una biomasa de aproximadamente 1500 kg por Ha. Un gramo de suelo frtil puede contener
5 metros de micelio fngico, 108 clulas bacterianas, 106 esporos de actinomicetos.

Los microorganismos hacen parte fundamental de los procesos de biorremediacin. En


gran parte, las bacterias casi siempre son los degradadores primarios, aunque en algunas
ocasiones los hongos juegan un papel importante. Las bacterias desempean el papel de
mayor importancia en la biodegradacin de contaminantes orgnicos en suelos; los hongos
tambin metabolizan compuestos orgnicos pero no son tan eficientes como las bacterias.

3.4.1. Bacterias

Las bacterias son el grupo de organismos ms abundante en los suelos y la cantidad de


especies presentes en el mismo parece relativamente constante alrededor del mundo.
Dichos organismos son un grupo diverso con variaciones extensivas en las propiedades
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morfolgicas, ecolgicas y fisiolgicas y son los principales degradadores de compuestos


orgnicos naturales y xenobiticos encontrados en el suelo. Las ms comunes son:
Pseudomonas, Arthrobacter, Achromobacte, Micrococcus, Vibrio, Acinetobacter,
Brevibacterium, Corynebacterium y Flavabacterium.

Por su diversidad, las bacterias se encuentran regularmente en comunidades heterogneas;


algunas especies son degradadores primarios, es decir, ellas inician la degradacin de la
materia orgnica en el suelo; otras crecen en compuestos resultantes de la degradacin
parcial de complejos orgnicos o productos residuales de degradadores primarios.

Las bacterias tienen tres apariencias fsicas generales:

Esfricas (cocos)

Forma de bastones (bacilos)

Forma de espiras (espirilos)

Y se clasifican usando sus caractersticas fsicas, qumicas, genticas y metablicas.

Figura 2 : Apariencias fsicas generales de las bacterias (Fuente: Schlegel, 1993)

El uso y tolerancia al oxgeno que es uno de los mtodos ms generales de


clasificacin. Los aerobios estrictos son bacterias que requieren oxgeno como aceptor
final de electrones y crecen solamente en presencia del mismo. Las
aerobias facultativas son bacterias que pueden utilizar aceptores de electrones terminales
alternativos y crecer en presencia o ausencia de oxgeno. Algunas anaerobias son tolerantes
al oxgeno, pero ste es txico a muchas anaerobias estrictas. Las bacterias tambin se
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pueden clasificar como eutrofas, las cuales crecen en presencia de altas concentraciones de
sustratos, y oligotrofas, las cuales crecen con concentraciones trazas. Los actinomicetos son
un grupo intermedio entre las bacterias procariotas ms primitivas y los hongos eucariotas;
stos estn presentes en un gran nmero de suelos. Toleran un intervalo amplio de pH y
temperatura, crecen bajo condiciones limitadas de nutrientes y son resistentes a desecacin.
Aunque su tasa de crecimiento es ms baja que la de las bacterias, la habilidad de los
actinomicetos para crecer en condiciones adversas permiten a estos predominar
cuando las condiciones del medio son difciles

Algunas bacterias son capaces de formar esporas cuando las condiciones de crecimiento
son muy adversas, como cuando el suelo est seco o cuando los nutrientes estn limitados.
Las esporas son muy resistentes al calor y no son fciles de destruir por radiacin u otros
factores qumicos tales como cidos y desinfectantes. Las bacterias formadas de esporas
son muy comunes en suelos donde las condiciones pueden ser muy variables.

3.4.2. Hongos

Los hongos son altamente protistas, no tienen movimiento y emplean materia orgnica
como fuente de carbono y energa. Algunos de los hongos mejor conocidos son mohos,
levaduras y setas (ver Figura 4 y Figura 5).

En comparacin con las bacterias, los hongos son menos numerosos y crecen a velocidades
considerablemente bajas; adems, los procesos metablicos de stos son menos diversos.
Como grupo, los hongos tienden a ser ms tolerantes a los cidos que las bacterias (muchas
especies crecen a un pH ptimo de 5 o menos) y son ms sensibles a la variacin en la
humedad. Un hongo que tiene un considerable potencial en el tratamiento de compuestos
orgnicos peligrosos es Phanerochaete chrysoporium, hongo de la podredumbre blanca.
Este
organismo produce una encima extracelular peroxidasa que degrada la lignina en presencia
del perxido; se ha encontrado que degrada una alta variedad de compuestos altamente
clorados y recalcitrantes. El uso de dicho hongo est limitado para condiciones en las
cuales el nitrgeno est limitado porque la peroxidasa no se produce de otra manera.
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Microorganismos concretos

Los microorganismos aislados en suelos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas,


que permiten la oxidacin de algunas fracciones del petrleo. Esta oxidacin cambia las
propiedades de los compuestos hacindolos susceptibles a ataques secundarios y facilitando
su conversin a bixido de carbono y agua.

Tabla 4: Bacterias y hongos ms usados en biorremediacin.

BACTERIAS HONGOS
Achromobacter Aspergillus
Actinomyces Bitrytis
Alcaligenes Candida
Bacillus Cladosporium
Coryneforms Fusarium
Erwinia Hansenula
Flavobacterium Oidiodendrum
Lactobacillus Penicilium
Nocardia Paecylomyces
Pectococcus Saccharomyces
Pseudomonas Rhodotorula
Sarcina Torulopsis
Spirillum Trichoderma
Streptomyces Saccharomycopsis
Vibrio
Rhodosporidium
Xanthomyces

Fuente: Elaboracin propia.

3.5 TIPOS DE BIORREMEDIACIN

La Biorremediacin dependiendo las necesidades y caractersticas del problema se


subdivide en varias metodologas (Velasco y Volke, 2002):
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Figura 3: Tipos de biorremediacin. (Fuente: Elaboracin propia)

Lugar de realizacin del proceso de biorremediacin

Se distinguen dos tipos de tecnologa:

o In situ: Son las aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los
contaminantes son removidos del suelo contaminado, sin necesidad de excavar el
sitio. Es decir, se realizan en el mismo sito en donde se encuentra la contaminacin.

o Ex situ: La realizacin de este tipo de tecnologas, requiere de excavacin, dragado


o cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento
que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de l (off site).
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Tabla 1. Ventajas y desventajas de los tratamientos in situ y ex situ

In situ Ex situ
- Permiten tratar el suelo sin -Menor tiempo de tratamiento.
Ventajas necesidad de excavar ni - Ms seguros en cuanto a uniformidad:
transportar. es posible homogeneizar y muestrear
- Potencial disminucin en costos. peridicamente.
-Mayores tiempos de tratamiento. - Necesidad de excavar el suelo.
-Pueden ser inseguros en cuanto a - Aumento en costos e ingeniera para
uniformidad: heterogeneidad en equipos.
Desventajas
las caractersticas del suelo. - Debe considerarse la manipulacin del
-Dificultad para verificar la material y la posible exposicin al
eficacia del proceso. contaminante.
Fuente: Elaboracin propia.

Biorremediacin In Situ

3.5.1. Bioaireacin o Bioventeo

Consiste en estimular la biodegradacin natural de los contaminantes de forma pasiva


estimulando la actividad microbiana a travs de gases, como el metano y oxgeno. Se utiliza
principalmente para tratar suelos orgnicos semi voltiles o no voltiles.

Ventajas.

o Es una tcnica altamente efectiva para tratar contaminaciones con compuestos con
baja presin de vapor (menos de 1 mmHg), ya que su tasa de degradacin es mucho
mayor que la de volatilizacin (Matthews, 1993).

o Como todos los tratamientos In Situ, cuando los costos de excavacin son altos el
bioventeo puede ser una alternativa econmicamente interesante. No requiere rea
adicional para llevar a cabo el tratamiento, ni el uso de maquinaria pesada.
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Desventajas.

o Tipo y concentracin del contaminante.

o Prdida de nutrientes en el subsuelo.

o Bajo contenido de humedad del suelo y la dificultad de lograr el caudal de aire a


travs de la zona contaminada; por ello requiere caractersticas especiales del suelo
en cuanto a humedad, porosidad, conductividad hidrulica, etc.

o Requiere largos perodos de tiempo para obtener la concentracin final de


hidrocarburos deseada. Los tiempos de limpieza pueden durar de meses a aos.

o La descontaminacin puede llevarse a cabo por efecto de la volatilizacin de


compuestos ms que por su biodegradacin.

3.5.2. Bioestimulacin

Esta estrategia radica en adicionar soluciones acuosas que contengan nutrientes como el
nitrgeno y fsforo para mejorar la biodegradacin de contaminantes orgnicos o para la
inmovilizacin de los inorgnicos. Se aplica en suelos contaminados con pesticidas y se ha
comprobado buenos resultados con desechos de municiones. Los nutrientes son necesarios
para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos, los macronutrientes (C, N, P, K) y
en menor cantidad los micronutrientes26. Esta se puede dar en condiciones aerobias o
anaerobias:

Biodegradacin aerobia: en presencia de oxgeno suficiente y otros nutrientes


elementales, los microorganismos degradan los contaminantes orgnicos hasta
convertirlos finalmente en dixido de carbono, agua y nueva biomasa celular. Segn
las condiciones del lugar afectado como la topografa, altitud, clima se puede
utilizar materiales de la zona para mejorar las condiciones de degradacin.

Biodegradacin anaerobia: en ausencia de oxgeno, los contaminantes orgnicos


son metabolizados hasta metano, adems se obtiene cantidades limitadas de dixido
de carbono, hidrgeno molecular, cido sulfhdrico, amonaco entre los ms
importantes.
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Las caractersticas determinantes en la seleccin, el xito o el fracaso de esta tcnica de


remediacin son:

Tipo de suelo. Los suelos deben ser lo ms homogneos posible, con un valor de
porosidad y permeabilidad al aire adecuado (> 10-10 cm2).

Deben existir unas condiciones ptimas de pH (6 y 8), de humedad (12-30% en


peso), temperatura entre 0 y 40 C y los nutrientes del suelo en relacin N:P de 10:1

Ventajas.

o Esta tcnica es muy til en el tratamiento de extensas zonas contaminadas de


centros industriales donde no es posible o conveniente parar el proceso operativo
para realizar el tratamiento requerido

Desventajas

o Esta tecnologa no es recomendable para suelos arcillosos, altamente estratificados


o demasiado heterogneos, ya que pueden provocar limitaciones en la transferencia
de O2.

3.5.3. Bioaumentacin.

Esta tcnica se aplica cuando los microorganismos de la microflora son insuficientes para
degradar los contaminantes y cuando se requiere el tratamiento inmediato del sitio
contaminado, consiste en la adicin de una alta concentracin de microorganismos vivos
capaces de degradar los contaminantes. Se ha usado para tratar suelos contaminados con
insecticidas, herbicidas y con desechos con altas concentraciones de metales.

Esta tcnica funciona en condiciones de laboratorio o bioreactor, pero en ambientes


externos (suelo o agua) su implantacin depende de una serie de factores (Alexander,1999):

Presencia de toxinas, nutrientes y condiciones ambientales, movilidad y/o


distribucin de los microorganismos y la presencia de abundante materia orgnica.

Los microorganismos aadidos deben sobrevivir a los depredadores y competir con


xito con la poblacin autctona antes de ocupar los nichos potenciales.
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En general, los ambientes ms selectivos y la utilizacin de consorcios microbianos


favorecen la bioaumentacin.

Ventajas.

o No requiere rea adicional para llevar a cabo el tratamiento, ni el uso de


maquinaria pesada.

Desventajas.

o El tamao de la poblacin de microorganismos degradadores crece rpidamente


como respuesta a la contaminacin del medio y es muy difcil, si no imposible,
incrementar la poblacin microbiana ms all de esos valores.

3.5.4. Atenuacin natural.

Aunque no est considerada como una tcnica de remediacin est incluida en las tcnicas
in situ de bajo costo, consiste en la biotransformacin natural es decir utiliza los procesos
fsico-qumicos que se dan entre el suelo y el contaminante de forma natural. Estos
procesos reducen la concentracin de los contaminantes por medio de la dispersin,
volatizacin, dilucin, biodegradacin y todas las reacciones que ayuden a la degradacin
del contaminante.

Entre los factores que influyen en la eficacia y viabilidad de la atenuacin natural destacan:

La existencia de unas condiciones geolgicas y geoqumicas favorables.

Las necesidades de reduccin de la masa contaminante en un intervalo razonable de


tiempo (meses a aos), tanto en la superficie del suelo como en la zona ms sub
superficial del mismo.

Confirmacin de la existencia de los tipos y nmero de poblaciones de


microorganismos que puedan biodegradar los contaminantes.

La concentracin de los compuestos utilizados como aceptores de electrones en


condiciones anaerobias debe ser superior a 0,21 mg/l para nitratos, la de Fe3+ para
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33

que pueda ser reducido a Fe2+ debe ser superior a 21,8 mg/l y la de sulfatos mayor
de 0,21 mg/l.

El potencial redox debe estar situado entre un rango de -400 y 800 mV.

Deben existir unas condiciones ptimas de pH (6 a 8), de humedad (12 a 30% en


peso), temperatura entre 0 y 40 C y los nutrientes del suelo en relacin N:P de 10:1.

Existencia de un coeficiente de retardo favorable para que se produzcan los


fenmenos de sorcin con suficiente eficacia.

Si se aportan al medio algunos de los elementos de los que carece o bien se potencian los
existentes, se favorece la eliminacin del posible contaminante. En muchos casos este tipo
de intervencin ser necesario para reforzar el proceso natural o bien para implantar unas
condiciones que reduzcan el riesgo. En esto se basan la
bioestimulacin y la bioaumentacin, que son aproximaciones biotecnolgicas de la
atenuacin natural.

Ventajas.

o Es una tcnica de biorremediacin In Situ de muy bajo costo.

o Puede darse en presencia o ausencia de oxgeno, por tanto no se hace necesario


adicionar oxgeno al medio contaminado.

Desventajas.

o La exigencia de proteccin y el riesgo de los potenciales receptores durante el


tiempo que dura la atenuacin.

o Produccin y conservacin en el medio de subproductos de carcter persistente o


ms txico que los iniciales, durante y despus de la atenuacin natural
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34

Biorremediacin Ex Situ

3.5.5. Tratamiento del terreno o Landfarming.

Utilizada para el tratamiento de residuos oleosos y fangos aceitosos provenientes de


refineras. La tcnica consiste en dispersar el contaminante a biodegradar sobre la capa
arable (15-20 cm superficiales) de un terreno destinado a tal fin. Las recomendaciones y
limitaciones son las mismas que las explicadas anteriormente en el mtodo de
biorremediacin in situ. Se trabaja con sta tcnica para todos los hidrocarburos del
petrleo, siendo menos efectiva para petrleos pesados (grandes tanques): <50.000 ppm de
hidrocarburos y <2.500 ppm de metales pesados.

Los factores a tener en cuenta en la aplicacin del Landfarming son:

La existencia de unas condiciones geolgicas y geoqumicas favorables.

El manejo de un consorcio microbiano sobre la utilizacin de un solo morfotipo,


debido a que los morfotipos al estar en grupo pueden tolerar mejor los cambios
fsico-qumicos en el campo y sus actividades metablicas pueden interactuar entre
s para la parcial o final biorremediacin.

Conocer las condiciones ambientales en las cuales se desea que los morfotipos
trabajen, para as poder optimizar la biorremediacin, cambiando los posibles
parmetros fsicos o qumicos que puedan ir en contra de la actividad microbiana en
el material a biorremediar o en el ambiente.

Resaltar la importancia que tiene la seleccin de microorganismos autctonos


(aislados del lugar para la biorremediacin), debido a que estos morfotipos se
encuentran mejor adaptados al contaminante; a diferencia de morfotipos forneos,
que aunque con una gran actividad biorremediadora, pueden no funcionar bajo las
condiciones ambientales del lugar.

Ventajas.

o Es econmico con respecto a otras tcnicas de biorremediacin.


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35

o Es un proceso considerado de bajo nivel tecnolgico que no requiere exigentes


consideraciones de ingeniera, y a la vez permite una fcil manipulacin y control
de las variables de diseo y operacin.

Desventajas.

o Requiere grandes extensiones de terreno para disposicin de suelos y no es viable si


no se cuenta con suficiente rea.

o Cuando los contaminantes son hidrocarburos livianos la remediacin puede ser


acelerada por su volatilizacin, lo cual generara problemas con las autoridades
ambientales donde las regulaciones de emisiones atmosfricas son exigentes.

o Cuando la contaminacin es profunda los costos de excavacin y movimiento de


tierras pueden ser altos.

3.5.6. Biopilas.

La tcnica conocida como biopilas es un tratamiento de biorrecuperacin en condiciones no


saturadas, que consiste en la reduccin de la concentracin de contaminantes derivados del
petrleo en suelos excavados mediante el uso de la biodegradacin a partir de la
construccin de un sistema cerrado que permita controlar lixiviados, hidrocarburos voltiles
y algunas variables de diseo mediante el suministro de nutrientes y oxgeno a travs de la
pila del suelo. La tcnica consiste en la formacin de pilas de material biodegradable de
dimensiones variables, formadas por suelo contaminado y materia orgnica (compost) en
condiciones favorables para el desarrollo de los procesos de biodegradacin de los
contaminantes. En el fondo de la pila el sistema cuenta con un aislante que generalmente
son geomembranas o canales plsticos para el control de lixiviados. Estas pilas de compost
pueden ser aireadas de forma activa, volteando la pila, o bien de forma pasiva, mediante
tubos perforados de aireacin, con distribucin permanente de nutrientes, microorganismos
y aire. En principio, las biopilas se pueden aplicar a la mayora de los compuestos
orgnicos, siendo ms eficaz en los compuestos de carcter ms ligero. Entre los factores
que influyen en la aplicacin de las biopilas se destacan:
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36

Los hidrocarburos deben ser no halogenados y deben encontrarse en el suelo en


concentraciones menores a 50.000 ppm.

Dada la necesidad de excavacin y posterior depsito del suelo contaminado, se


requiere una superficie de trabajo relativamente grande cuyas dimensiones
dependen del volumen de suelo a tratar.

Necesidad de una densidad de poblaciones microbianas (>1.000 CFU/gramo de


suelo), condiciones de humedad (40 a 85% de capacidad de campo), temperatura
(10 a 45C), textura (baja proporcin de arcillas), pH del suelo adecuadas (6 a 8) y
baja presencia de metales pesados (< 2.500ppm).

La concentracin de nutrientes en el suelo cuyo rango normal de C:N:P sea de


100:10:1.

Ventajas.

o Esta tcnica es muy eficiente en el tratamiento de residuos con bajas


concentraciones de hidrocarburos.

o Por ser un sistema cerrado permite un mayor control de las variables del proceso,
como el control de condiciones climatolgicas adversas (baja temperatura o
alto rgimen pluviomtrico).

o Cuando no se dispone de espacio suficiente para extender el suelo, este sistema


permite construir pilas de suelo cuatro o cinco veces ms altas que en una
disposicin sobre el suelo (ocupa diez veces menos rea) (Zitrides, 1995).

Desventajas.

o Si en el proceso se generan gases o vapores de hidrocarburos voltiles regulados por


la autoridad ambiental, o las condiciones climatolgicas de la zona pueden afectar
negativamente la eficiencia del proceso, la pila del suelo se debe cubrir con
membranas o poner techo de forma similar a los invernaderos. Los vapores
generados en el proceso se deben colectar y tratar antes de ser emitidos a la
atmsfera. Lo que incurre a costos adicionales.
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37

o Como todos los tratamientos Ex Situ, cuando la contaminacin es muy profunda,


el movimiento de tierra puede requerir costos ms altos.

3.5.7. Tratamiento de biosuspensin.

Tambin conocido como sistema biorreactor. El procedimiento consiste en excavar el suelo


contaminado y luego introducirlo en un reactor aadiendo nutrientes, agua, y los cultivos
microbianos adecuados para que se lleve a cabo la degradacin. Se mezcla bien y se airea la
suspensin hasta que las transformaciones de los compuestos seleccionados para su
eliminacin alcanzan el nivel deseado. A continuacin se detienen el mezclado y la
aireacin, y se deja a los slidos separarse de los fluidos por sedimentacin. El sedimento
es retirado y, si la transformacin ha tenido xito, el suelo se devuelve a su lugar de origen,
mientras que los lquidos se tratan como aguas residuales. El suministro de oxgeno puede
realizarse mediante aireacin difusa, turbina difusora y aireacin superficial (Metcalf y
Eddy, 1991). La tasa de transferencia de oxgeno necesaria es funcin de la tasa de
degradacin de los compuestos orgnicos y de la tasa de crecimiento microbiano. Su
determinacin no es fcil de hacer, sin embargo, las tasas de transferencia disminuyen al
aumentar la concentracin de slidos suspendidos. El mezclado y el suministro de
nutrientes tambin son fundamentales, ya que por el primero se incrementa el contacto
entre los microorganismos y los componentes contaminantes, dando como resultado un
incremento de las velocidades de transferencia de masa y de reaccin. Los nutrientes
normalmente optimizan la biorrecuperacin por favorecer el crecimiento de los
microorganismos. Por otro lado, el mezclado y la aireacin ayudan a romper los flculos de
tierra y a disolver los contaminantes.

Ventajas.

o En comparacin con otros procesos de tratamiento, los reactores va suspensin


proporcionan mayor contacto entre los contaminantes, los microorganismos, el
oxgeno, el agua y los nutrientes.

o La capacidad de controlar los sistemas del tratamiento va suspensin es mucho


mayor y por tanto puede ser la tecnologa ms efectiva.
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o El tratamiento va suspensin puede aplicarse en particular a los suelos


contaminados con residuos oleosos y de consistencia alquitranada (siendo estos
compuestos difciles de biodegradar).

o Es ms rpido y requiere menos superficie que otros sistemas.

Desventajas.

o Debido al energtico mezclado y a la aireacin forzada se favorece el escape de


emisiones de aire, por ello la suspensin no es una buena eleccin para suelos donde
los compuestos voltiles sean mayora.

o Esta tcnica demanda mayores costos monetarios en comparacin con otras


tcnicas de biodegradacin.

3.7 ETAPAS DEL TRABAJO PARA UNA BIORREMEDIACIN MS EFICAZ

3.7.1. Investigacin y caracterizacin de la contaminacin y del emplazamiento

La caracterizacin del emplazamiento se lleva a cabo mediante el estudio del mismo


detallando la volumetra del suelo a tratar, las condiciones geolgicas e
hidrogeolgicas, analizando las caractersticas del suelo y sus propiedades (pH,
granulometra, humedad, porosidad, etc.)

La caracterizacin del contaminante se centra en la investigacin del tipo y


concentracin del mismo, as como la biodisponibilidad de los compuestos en el
suelo (aceptores de electrones, metales pesados, nutrientes, etc.).

3.7.2. Anlisis y eleccin de las medidas biocorrectivas.

Para ello se hace necesario:

a) Identificar y cuantificar los contaminantes. Definiendo sus propiedades


fisicoqumicas ms importantes:
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Identificacin y clasificacin de compuestos.

Concentracin en suelos y aguas subterrneas.

Caracterizacin de la presin de vapor, constante de Henry, densidad y grado de


solubilidad.

b) Conocer los factores que influyen en la transformacin biolgica de los


contaminantes:

Factores ambientales tales como humedad, oxgeno disuelto, temperatura, pH,


disponibilidad de nutrientes.

Factores microbiolgicos tales como presencia de microorganismos y aclimatacin


de las poblaciones microbianas.

c) Designar las medidas biocorrectivas. En funcin de los factores anteriormente


expuestos, se debe elegir el sistema de biotratamiento ms adecuado

3.7.3. Diseo y evaluacin del sistema.

Para el diseo de un sistema de biorrecuperacin es necesario establecer unas etapas de


trabajo, en las cuales se determinan y evalan los parmetros fundamentales necesarios
para su eficacia. Las etapas a seguir en el diseo de un sistema de biotratamiento son:

a) Evaluacin de la viabilidad de la tcnica. Se deben estudiar los parmetros de


evaluacin que definen el sistema elegido, as como se deben evaluar las
condiciones de biotratabilidad, los objetivos de limpieza exigidos y los costes de
tratamiento necesarios.

b) Evaluacin del diseo. Se deben estudiar los factores que afectan la eficacia de la
tcnica y las posibles mejoras o acondicionamientos a aplicar.

c) Evaluacin del control y seguimiento. Para asegurar la correcta ejecucin y un


progreso adecuado del tratamiento se debe llevar a cabo un plan de control y
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40

seguimiento del sistema. Para una correcta optimizacin se debern controlar los
siguientes puntos:

Control de las condiciones de degradacin y biodegradacin. Se debe


registrar la variacin de concentracin de TPH, BTEX, CO2 desprendido y
Oxgeno disuelto, variacin de nutrientes (N, P, etc.)

Control de los parmetros que afectan directamente en el funcionamiento del


sistema.

3.7.4. Anlisis e interpretacin de resultados.

En esta ltima etapa se deben analizar los resultados obtenidos, haciendo un balance de los
objetivos alcanzados y los marcados inicialmente. En este punto, si fuese necesario, se
deben proponer y estudiar aquellas mejoras o modificaciones necesarias para la
optimizacin del sistema
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41

4. RESULTADOS

4.1 ENSAYOS DE TRATABILIDAD EN LA BIORREMEDIACIN DE SUELOS


CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS.

Para evaluar si un tratamiento biolgico es apropiado para la descontaminacin de un suelo,


es necesario caracterizar tanto las poblaciones microbianas como la biodegradabilidad de
los contaminantes del suelo. Adems, debido a que existen una gran variedad de parmetros
fisicoqumicos y biolgicos que condicionan el proceso de biorremediacin, tambin es
necesario evaluar la influencia de los factores que afectan al proceso de la biodegradacin.

Para ello se disean los ensayos de tratabilidad, que se definen como conjunto de
experimentos realizados a escala de laboratorio, previos a la implementacin de cualquier
tecnologa de biorremediacin a un suelo contaminado (Cattaneo et al., 1997; Dibble y
Bartha, 1979; Zhouet al., 1995). Los ensayos de tratabilidad representan una parte muy
pequea de los costes totales de recuperacin de cualquier emplazamiento y, sin embargo,
la informacin que pueden proporcionar es fundamental ya que pueden disminuir el coste
final, y lo que es ms importante, aumentar las posibilidades de xito en la
descontaminacin del suelo.

Primero se debe llevar a cabo una caracterizacin microbiolgica, y determinar la cantidad


de poblacin microbiana degradadora de los contaminantes y su proporcin respecto a la
poblacin total hetertrofa de la microbiota indgena del suelo contaminado. Adems es
necesario evaluar si la poblacin microbiana autctona est metablicamente activa o es
activable en condiciones de bioestimulacin. Una vez caracterizado el suelo, los
contaminantes y la poblacin microbiana, es necesario determinar la biodegradabilidad de
los contaminantes mediante ensayos rpidos de biodegradabilidad (fase I) y en caso
afirmativo evaluar los factores fisicoqumicos y biolgicos que afectan a la biodegradacin
(fase II), en ensayos de microcosmos.
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42

4.2 PROTOCOLO DEL ENSAYO DE TRATABILIDAD

Los ensayos de biotratabilidad incluyen 2 fases de estudio

SUELO CONTAMINADO

Fase I: 15 dias duracin


Caracterizacin fsico-quimica
Textura
Capacidad de campo
Conductividad y PH
NT y COT
Nitrato, nitrito,amonio, fosfato
EOT, HTP
Caracterizacin Microbiolgica
Heterotrofos totales
Degradadores de hidrocarburos
Caracterizacin de la actividad metablica
Respirometra: produccin de CO2
Ensayos de biodegradabilidad en slurries

Fase II: 6 meses duracin


Mesocosmos (30 Kg suelo cada mesocosmo):
Bioestimulacin: aireacin, humedad,
fertilizantes inorgnicos N, P, K.

Bioaumento: Utilizacin de consorcios


microbianos

Figura 4: Fases de estudio presentes en el estudio de tratabilidad de un suelo contaminado


por hidrocarburos.
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43

Donde:

NT: Nitrgeno total.

COT: Carbono orgnico total.

EOT: Extracto orgnico total.

HTP: Hidrocarburos totales del petrleo.

HAPs: Hidrocarburos aromticos policclicos.

La fase I: Estudio a corto plazo, basado en una caracterizacin fsico-qumica,


microbiolgica y ecotoxicolgica del suelo. Se lleva a cabo un estudio respiromtrico del
suelo (produccin de CO2) en diferentes condiciones de bioestimulacin, para determinar si
la microbiota presente en el suelo es activa metablicamente o potencialmente activa.
Tambin se lleva a cabo un ensayo de Microtox como indicador de la presencia de posibles
inhibidores y ensayos rpidos de biodegradabilidad en slurries (resuspensiones del suelo en
agua y nutrientes inorgnicos). Los resultados obtenidos en la primera fase del protocolo
tienen como objetivo determinar si el suelo contaminado es apto para aplicar la tecnologa
de la biorremediacin.

La fase II: Estudio a medio-largo plazo en mesocosmos con 30 kg de suelo, donde se


evalan distintos tratamientos de bioestimulacin y bioaumento.

Objetivo general

Disear un protocolo de ensayos de tratabilidad a escala de laboratorio, para la


biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos.

Objetivos especficos

Comprobar la biodegradabilidad de los contaminantes.

Optimizar su actividad metablica.


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44

4.3 MATERIALES Y METODOS

4.3.1. Materiales.

Materiales de vidrio.

Medios de cultivo.

Equipos y aparatos.

Suelo contaminado.

4.3.2. Ensayos con mesocosmos.

Los materiales son:

Suelo contaminado de la zona a tratar.

Suelo con microorganismos adaptados a la presencia de hidrocarburos.

Nutrientes (Nitrgeno, Fosforo, Potasio).

5 canastas de polietileno de alta densidad. Este material fue escogido por su baja
permeabilidad y mnima absorcin de hidrocarburos.

Palas de jardinera para mezclar el sedimento.

Para la comparacin del efecto de bioaumentacin y bioestimulacin se trabajan con 5


mesocosmos y se distribuyen de la siguiente manera:

Mesocosmos N1: (B+F: bioaumentado con fertilizante inorgnico).

30 Kg de suelo contaminado.

3 litros de cepas bioaumentadas (TX4, TX5, T2X-1).

2 litros de agua destilada.


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Fertilizantes inorgnicos (NPK: 20:20:1), correspondiendo por cada kilogramo de


tierra: 1,62 g de NO3NH4, 0,067 g de (NH4)2HPO4 y 0,087 g de K2HPO4.

Mesocosmos N2: (B-F: bioaumentado sin fertilizante inorgnico).

30 Kg de suelo contaminado.

3 litros de cepas bioaumentadas (TX4, TX5, T2X-1).

2 litros de agua destilada.

Mesocosmos N3: (N+F: nativo con fertilizante inorgnico).

30 Kg de suelo contaminado.

5 litros de agua destilada

Fertilizantes inorgnicos (NPK: 20:20:1), correspondiendo por cada kilogramo de


tierra: 1,62 g de NO3NH4, 0,067 g de (NH4)2HPO4 y 0,087 g de K2HPO4.

Mesocosmos N4: (N-F: Nativo sin fertilizante inorgnico).

30 Kg de suelo contaminado.

5 litros de agua destilada

Mesocosmos N5: (C: Control).

30 Kg de suelo no contaminado.

Para el proceso de biodegradacin bacteriana, se seleccionan consorcios bacterianos de


acuerdo a su capacidad degradativa y emulsificante (Pseudomonas aeruginosa TX-5,
Acinetobacter calcoaceticus T2X-1, Bacillus sp. TX-4) y por otro lado, para el proceso de
bioestimulacin se selecciona una mezcla de componentes inorgnicos y se formul la
concentracin de estos fertilizantes inorgnicos, de la siguiente manera (C/N: 100:1 y NPK:
20:20:1).
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Se utiliza:

NO3NH4, como fuente de nitrgeno.

(NH4)2HPO4, como fuente de fsforo.

K2HPO4, como fuente de potasio.

Se consideraron los rangos ptimos de los factores que influyen en la degradacin de


hidrocarburos totales (Tabla 2).

Tabla 5: Rangos ptimos para procesos de biorremediacin.

PROPIEDAD RANGO REFERENCIA


Temperatura (C) 18 - 30 Gmez, S., et al, 2008
pH (unidades) 68 Ros, R., 2005
Humedad (% capacidad de campo) 20% - 75% Gmez, S., et al, 2008
Nutrientes N:P:K 20:20:1 Gmez, S., et al, 2008
Microorganismos degradadores
10^6 10^8 Ros, R., 2005
(UFC)
Fuente: ustez Cuartas, Diana. (11)

Tabla 6: Anlisis de caractersticas fsicas.

ANALISIS MTODO FRECUENCIA


Temperatura Termmetro
Estas caractersticas
pHmetro (1 suelo:2,5
pH se miden una vez a la
agua)
semana
Humedad Mtodo gravimetrico
Fuente: ustez Cuartas, Diana. (11)

A estos mesocosmos tambin se les realiz un volteo manual tres veces por semana para
incrementar el contenido de oxgeno.
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Tabla 7: Cantidad de agua aplicada y volteos manuales por semana.

DIAS DE LA SEMANA ACTIVIDAD CANTIDAD DE AGUA


Lunes A todos los mesocosmos 600 ml
Mircoles se les adiciona agua y 600 ml
Viernes volteo manual 1000 ml
Fuente: ustez Cuartas, Diana. (11)

En cada evento de muestreo, se utilizan guantes de ltex desechables, palas de jardinera,


las cuales de un mesocosmos a otro se enjuagan previamente con agua y una esponja, para
evitar contaminacin cruzada, se realiza el volteo manual y se toma sedimento de puntos
aleatorios dentro de cada mesocosmo con la pala aproximadamente 20g hasta alcanzar unos
100 a 160g, muestra compuesta, para los diferentes anlisis de laboratorio.

Para este fin se realizan los siguientes anlisis desde el inicio de los montajes
experimentales, a travs del tiempo de la investigacin (6 meses):

4.3.3. Anlisis fisicoqumico del suelo.

Determinacin de la textura del suelo: Es la cantidad relativa de arenas, limos y


arcillas expresadas en porcentaje (%) de la fraccin mineral del suelo una vez
tamizado por un tamiz de 2 mm de dimetro de malla. Para determinar la textura de
un suelo se utiliza la tcnica de la sedimentacin segn Gee y Bauder (1986).
(ANEXO A.1)

Determinacin de la humedad y la capacidad de campo: La humedad de un suelo


se define como la cantidad de agua que existe en un suelo, referida en porcentaje (%
p/p). Se calcula por la diferencia de peso entre una misma muestra hmeda, y
despus de haberse secado en la estufa hasta obtener un peso constante. (Ver
ANEXO A.2).
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La capacidad de campo, es a la cantidad mxima de agua (expresada en valores de


humedad) que es capaz de retener el suelo justo en el momento que llega al estado
de saturacin. Para su determinacin es necesario saturar el suelo con agua, y
eliminar el exceso de agua por gravedad. Finalmente, se determina el contenido de
agua (humedad) del suelo cuando ya no se libera agua por escorrenta. Para ello se
emplean viales de plstico de 100 ml de capacidad nominal, que se perforan en su
base (1 cm de separacin entre poros) y se aade fibra de vidrio para evitar que se
escape el particulado del suelo cuando se encuentre colmatado de agua. Luego se
aaden 30 gramos de suelo secado 16h a 105C, y se tara el conjunto.
Posteriormente se colmata el suelo con agua y se deja que el exceso de agua se
elimine por gravedad.

Finalmente se determina la humedad del suelo saturado (cuando ya no pierde agua


por gravedad), obtenindose as la capacidad de campo del suelo.

Determinacin del carbono orgnico total (COT) y del nitrgeno total (NT):

Carbono orgnico total (COT): Se determina en un analizador de carbono


con una cmara de combustin y un detector de infrarrojo. (Ver ANEXO
A.3)

Nitrgeno total (NT): Se determina con el mtodo Micro- Kjeldahl


(Modificado por Bremner, 1965). (Ver ANEXO A.4)

Determinacin de la concentracin de nutrientes inorgnicos

Fosfatos: Para determinar los fosfatos se utiliza el mtodo de Bray


(desarrollado por Bray y Kurtz, 1945), el cual fue modificado en la parte de
extraccin del P. La cuantificacin se lleva a cabo por colorimetra. Este
mtodo se emplea como ndice del P aprovechable en suelos con pH neutro
y cido (NOM-021-RECNAT-2000). (Ver ANEXO A.5)
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Nitratos, nitritos: Determinacin de nitritos y nitratos intercambiables en


suelo por extraccin con cloruro de potasio (KCl 1M) y determinacin por
electroforesis in capilar (EIC). (Ver ANEXO A.6)

Amonio: Determinacin de amonio intercambiable en suelo por extraccin


con cloruro de potasio (KCl 1M) y determinacin por electrodo de in
selectivo. (Ver ANEXO A.7)

Determinacin del pH: El pH determina el grado de adsorcin de iones por las


partculas del suelo, afectando as su solubilidad, movilidad, disponibilidad y
formas inicas de un contaminante y otros constituyentes del suelo (Alexander
1994). La solubilidad de muchos contaminantes inorgnicos cambia en funcin del
pH y normalmente su movilidad disminuye con altos valores de pH. La
determinacin del pH en suelo se realiza segn el mtodo de la pasta saturada en
una suspensin de suelo:agua en proporcin 1:2,5 (p/v). Para ello se resuspenden 10
g de suelo en 25 ml de agua, se agita la mezcla durante 40 minutos y se mide el pH
en un Crison micro pH 2000. La medicin se realiz semanalmente en cada uno de
los mesocosmos. (Ver tabla de pH ANEXO A.8)

Determinacin de la conductividad elctrica: El mtodo de la conductividad


elctrica se realiza por medio de un conductmetro sobre una muestra de agua o
extracto de suelo. (Ver ANEXO A.9)

Extracto orgnico total (EOT): Para obtener el EOT de las muestras de suelo de los
mesocosmos se lleva a cabo una extraccin por Soxhlet de 10 gramos de suelo
tamizado por 2 mm, mientras que en la fase de los slurries, se filtran en papel de
filtro (previamente limpiado con diclorometano) y se deja secar el contenido entre 1
y 3 das para poder llevar a cabo la extraccin del EOT por Soxhlet. Para ello (en
ambos casos), antes de la extraccin se aade ortoterfenil y antraceno-d10 como
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50

estndares internos de tipo surrogate a una concentracin final en el suelo de 80 g


g-1 y 40 g g-1 respectivamente, a partir de stocks de 1mg ml-1 en acetona. Se deja
evaporar la acetona y, a continuacin, se aaden 10 g de Na2SO4 anhidro y se
mezcla el conjunto. A partir de esta mezcla, se lleva a cabo la extraccin en Soxhlet
durante 24 horas, utilizndose como solvente la mezcla diclorometano:acetona, en
proporcin volumtrica 1:1. El extracto orgnico resultante (100 ml) se deshidrata
en una columna de Na2SO4 anhidro (10cm longitud x 2,5 cm ancho) y
posteriormente se evapora en un rotavapor (Bchi) hasta 1 ml final.

Hidrocarburos totales del petrleo (HTP): Se realiza mediante extraccin por


reflujo soxhlet, empleando hexano como disolvente, este mtodo de extraccin
asegura el contacto de la matriz de la muestra con el disolvente, para la ptima
extraccin de los compuestos el suelo se seca, se pulveriza en partculas pequeas,
para asegurar un mejor contacto, se evapora el solvente al final de la prueba y el
extracto se cuantifico gravimtricamente (EPA 3540C., 1996). (ANEXO A.9).

Temperatura: Se lleva a cabo semanalmente en cada uno de los mesocosmos. Se


utiliza un termmetro de mercurio.

4.3.4. Caractersticas microbiolgicas.

Determinacin de la poblacin microbiana hetertrofa y degradadora de


hidrocarburos: Para el conteo de hetertrofos totales y degradadores de
hidrocarburos del suelo se utiliza la tcnica de cuenta por dilucin en placa
(ANEXO B).

4.3.5. Caractersticas de la actividad metablica

Ensayos de respirometra:

La respirometra es una tcnica basada en la medicin del consumo de oxgeno por parte de
los microorganismos que degradan y oxidan un sustrato orgnico convirtindolo en CO2 y
agua. El anlisis respiromtrico arroja datos sobre el consumo de O2 por el metabolismo
microbiano en presencia de un sustrato orgnico.
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51

La respiracin inducida con sustrato (SIR), se da al adicionarse un sustrato al suelo, en este


caso el contaminante a degradar. La respiracin est influenciada por la humedad del suelo,
la temperatura, la disponibilidad de nutrientes y la estructura del suelo (Alef y Nannipieri,
1995), la temperatura de incubacin puede oscilar entre 20C y 30C y la capacidad de
retencin de agua en el suelo puede variar entre 50-70 %.

La respiracin del suelo se determina mediante la tcnica de incubacin del suelo en jarras
cerradas, en sta el CO2 es absorbido en una solucin de NaOH y cuantificado por
titulacin con HCl.

Procedimiento: Se pesan 50 gr de suelo de cada uno de los tratamientos y


del control en un beaker y se colocan en el fondo de una jarra de 1L. Se
pipetean 25 ml de solucin de NaOH (0.05M) e inmediatamente se sella la
jarra para atrapar el aire presente en la parte superior de la misma. El control
del procedimiento se realiza llenando de 3-5 jarras con NaOH (0.05 M) pero
sin muestra de suelo. Se incuban todas las jarras durante 3 das a 25C el
investigador de acuerdo a la produccin de CO2 determinara el tiempo
mnimo de incubacin, el tiempo mximo no deber superar los 3 das,
periodos superiores de incubacin podran generar condiciones anaerbicas,
adems sera imposible cuantificar la produccin de CO2-. El procedimiento
se lleva a cabo por 61 das.

Estimacin de la cantidad de CO2 producido por los microorganismos:


se abren las jarras y se sacan los beakers. Se lava la superficie externa con
agua libre de CO2, para garantizar que toda la solucin de NaOH quede al
interior de la jarra. Se adicionan 5 ml de solucin de BaCL2 (0.5 M) y
algunas gotas de indicador-felnolftaleina-, para la titulacin, se adiciona gota
a gota una solucin de HCl bajo continua agitacin hasta que se presente el
cambio de color.

Para obtener la solucin de cloruro de bario se disolven 122.14 gr de BaCL2. En agua


descarbonatada hasta completar 1 L. El agua descarbonatada se obtiene hirviendo el agua
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52

destilada por espacio de 2 minutos, se deja enfriar y se mantiene en un frasco con trampa de
CO2.

La velocidad de respiracin se calcul con la siguiente relacin:

Donde:

Vo: volumen en mililitros de HCL gastado para titulacin de los blancos.

V: volumen en mililitros de HCL gastado para titulacin de las muestras (promedio).

dwt: es el peso seco de un (1) gramo de suelo hmedo y 1.1 es un factor de conversin (1
ml de NAOH 0.05M es igual a 1.1 mg de CO2). Para el caso del HCL y el NAOH 1 M es
equivalente a 1N.

Ensayos de toxicidad.

La determinacin de la toxicidad se lleva a cabo mediante el test de Microtox. Este ensayo


se basa en el principio de que cuanto mayor es la toxicidad de una muestra (para Vibrio
fisheri), menor es la emisin de luz. En el ensayo de Microtox se determina la EC50, la cual
se define como la concentracin de la muestra en la que se observa una disminucin del
50% de la emisin de luz original de Vibrio fisheri. Para ello se estudia el efecto de
diferentes concentraciones problema en la emisin de luz mediante un fotomultiplicador.
Posteriormente se obtiene, matemticamente, la EC50 a partir de la funcin dosis respuesta.

Para ello, se reconstituyen liofilizados comerciales de Vibrio fisheri segn las instrucciones
del fabricante y se incuban a 15C durante 30 minutos, frente a un banco de diluciones de
lixiviados de suelo o de EOT de suelo. Los lixiviados de suelo se obtienen de acuerdo al
protocolo de Microtox en fase slida, segn instrucciones del fabricante. Para obtener los
lixiviados de suelo se resuspenden 7 g de suelo en 35 ml de NaCl 3,5% (p/v) y se agita
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53

durante 10 minutos con muesca magntica. Luego se filtran 5 ml (2 cm por debajo de la


superficie) en filtros de 0,45 m de dimetro de poro y se hace un banco de diluciones del
lixiviado filtrado con NaCl 3,5% como solvente. El EOT del suelo se diluye en un banco de
diluciones con DMSO como solvente.
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54

5. CONCLUSIONES

Se presentaron los diferentes tratamientos existentes de biorremediacin para suelos


contaminados con hidrocarburos, de lo que se puede desprender que, tanto los
tratamientos ex-situ como in-situ son una buena alternativa para conseguir degradar
el contaminante, siendo los tratamiento ex-situ los que mejores resultados presentan,
ya que las variables pueden ser mejor controladas, es un tratamiento costoso a causa
del transporte del terreno contaminado a la zona de tratamiento. El tratamiento in
situ es el ms recomendado para suelos permeables cuando la contaminacin afecta
a los horizontes subsuperficiales.

Se identificaron factores principales, como componentes del conjunto de accin


directa en los tratamientos de biorremediacin resaltando que para cualquier
tratamiento de biorremediacin la velocidad de descomposicin por los organismos
va a depender de su concentracin, de determinadas caractersticas del suelo
(disponibilidades de oxgeno y de nutrientes, pH, humedad y temperatura) y de la
estabilidad del contaminante.

Se dise un protocolo de ensayos de tratabilidad, a escala de laboratorio, previo a


la biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos que consta de 2 fases
de estudio.

A. En la fase I se evala la presencia de poblaciones microbianas, la actividad


metablica real y potencial y la biodegradabilidad de los contaminantes
presentes en el suelo.

B. En la fase II se estudia la optimizacin de las condiciones fisicoqumicas


(humedad, aireacin, nutrientes inorgnicos) y biolgicas (posibilidad de
inocular poblaciones microbianas alctonas) que pueden condicionar el
proceso de biodegradacin durante la biorremediacin de suelos
contaminados por hidrocarburos.

La informacin obtenida en la fase I de los ensayos de tratabilidad, permite decidir,


en un corto intervalo de tiempo, si es factible la aplicacin de la biorremediacin en
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55

un suelo contaminado, mientras que la fase II permite establecer las condiciones


ptimas de biorremediacin en procesos aerbicos.

Los microorganismos son los principales responsables de la degradacin de


hidrocarburos en los ecosistemas acuticos y terrestres.

En el caso de los hidrocarburos, la degradacin aerbica es la ruta ms favorable de


degradacin. Aunque se han descrito degradaciones anaerobias, el principal proceso
para eliminarlos es la respiracin aerbica de los microorganismos implicados. La
tasa de degradacin es directamente proporcional a la disponibilidad de oxgeno, ya
que es utilizado como aceptor final de electrones y tambin como sustrato en las
reacciones catalizadas por las oxigenasas, enzimas implicadas en la ruta aerbica
bacteriana de degradacin de los hidrocarburos.

6. COMENTARIOS

La mayora de las tcnicas innovadoras que existen en la actualidad para el


tratamiento de los suelos contaminados requieren equipos especiales y consumos
elevados de recursos energticos y de otro tipo para su aplicacin.

La biorremediacin es el tratamiento ms apropiado a seguir en suelos


contaminados con hidrocarburos por sus ventajas conocidas.

Al dejar el suelo sin tratar, es decir, permitir la atenuacin natural, requerira


demasiado tiempo y dependiendo de las concentraciones y tipo de contaminante no
se puede asegurar la recuperacin del suelo puesto que algunos componentes no son
degradables total o parcialmente.

El proceso ex situ permite un mayor control de los procesos de remediacin,


mediante el movimiento de tierra los agregados se disgregan, teniendo los
microorganismos ms probabilidad de entrar en contacto con el contaminante para
la degradacin del mismo.
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56

La Presencia del agua es necesaria para la transformacin de los hidrocarburos,


debido a que los microorganismos requieren condiciones mnimas de humedad para
su crecimiento. Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir
la concentracin del oxgeno en el suelo.

Debido a que los sitios contaminados por lo general no presentan la actividad


biolgica necesaria para que se produzca la degradacin de los contaminantes, es
conveniente introducir al medio, microorganismos, cuya efectividad haya sido
probada previamente.

En trminos generales, las tecnologas de remediacin fisicoqumicas pueden usarse


para tratar sitios con caractersticas geolgicas difciles, sus costos no son
demasiado elevados y los tiempos de limpieza son de corto a mediano plazo. Con
las tecnologas trmicas es posible disminuir significativamente los tiempos de
limpieza, aunque generalmente es necesario excavar el sitio contaminado y es el
grupo de tratamientos ms costoso.

Como regla general, cuando un sitio se encuentra contaminado con ms de un tipo


de contaminantes, puede ser necesario emplear una combinacin de varias
tecnologas de remediacin, en lo que se conoce como tren de tratamiento.

En general, la contaminacin de suelos por productos, compuestos o desechos


orgnicos de la industria petrolera pueden ser tratados y recuperados
ecolgicamente con la biorremediacin, basada en la estimulacin de los
microorganismos para adecuacin de los factores abiticos.

As mismo podra indicarse que en suelos de textura contrastantes como los


arcillosos y arenosos, deben emplearse acondicionadores orgnicos que permitan
mejorar la estructura de la mezcla para favorecer as la biorremediacin.

Para definir el tratamiento ms apropiado es necesario un estudio previo de las


caractersticas edficas del suelo y el nivel de contaminacin que presenta, con el
fin recuperar sus caractersticas biolgicas y morfolgicas.
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7. RECOMENDACIONES

Es deseable mejorar la actividad microbiana de organismos indgenas, ms que usar


microorganismos exgenos porque los microorganismos indgenas estn
aclimatados al material de desecho.

Con respecto al pH:

A. La acidez del suelo se puede reducir a travs de aplicaciones de piedra


caliza.

B. La alcalinidad del suelo se puede reducir a travs de la aplicacin de


fertilizantes cidos u otros materiales tales como amonio, sulfato, flor de
azufre o sulfato frrico.
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58

8. REFERENCIAS

1. Orosco Verdezoto, Vernica Paulina y Soria Guano, Mercedes Margarita. TESIS DE


GRADO, BIORREMEDIACIN DE VEGETACIN CONTAMINADA CON PETRLEO POR
DERRAMES EN EL CAMPAMENTO GUARUMO - PETROPRODUCCIN. Riobamba : Escuela
Superior Politcnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias, Escuela de Ciencias Qumicas,
2008.
2. Cando Rodrguez, Miguel ngel. DETERMINACIN Y ANLISIS DE UN PROCESO DE
BIORREMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS. Cuenca :
Universidad Politcnica Salesiana, 2011.
3. Torres Delgado, Katerine y Zuluaga, Montoya Tatianan. BIORREMEDIACIN DE SUELOS
CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS. Medelln : Universidad Nacional de Colombia,
Facultad de Minas, Ingeniera Qumica, 2009.
4. Samanez Gibaja, Elizabet. Biodegradacin bacteriana por bioestimulacin en suelos
contaminados con petrleo crudo. [En lnea] FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
UNIDAD DE POST GRADO; UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS , 2008.
http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2008/samanez_ge/pdf/samanez_ge.pdf.
5. Riojas Gonzlez, Hctor, y otros, y otros. Efectos de los surfactantes en la
biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos. [En lnea] Departamento de
Recursos Naturales. Instituto Tecnolgico de Sonora, 5 de Febrero 818 Sur,Colonia Centro,
Cd. Obregn, Sonora, Mxico. C.P. 85000; UPIBI-Instituto Politcnico Nacional, Av
Acueducto s/n Colonia Barrio La Laguna Ticoman. Mxico, D.F. C.P. 0, 12 de Diciembre de
2010. [Citado el: ] http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v9n3/riojas.pdf.
6. Ortiz Bernad, Irene, y otros, y otros. Informe de Vigilancia Tecnologica. [En lnea]
http://www.madrimasd.org/informacionidi/biblioteca/publicacion/doc/vt/vt6_tecnicas_r
ecuperacion_suelos_contaminados.pdf.
7. Montenegro Gallardo, Fabian. AISLAMIENTO Y SELECCIN DE CEPAS BACTERIANAS
NATIVAS DE SUELOS DE LA XII REGIN DE CHILE, PARA LA DEGRADACIN DE CRUDOS DE
PETRLEO. [En lnea] 2007.
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2007/fam777a/doc/fam777a.pdf.
8. Mallea Alvarez, Mara Isabel. REMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS Y ANLISIS
DE UN PROYECTO PILOTO EN CHILE, EN EL MARCO DEL SISTEMA DE EVALUACIN DE
IMPACTO AMBIENTAL . [En lnea]
http://www.achidam.cl/documentos/Remediaciondesueloscontaminados.pdf.
9. Schmidt, Wini. SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS. [En lnea]
http://www.ingenieroambiental.com/3021/Bioremed_Mex2.pdf.
10. Remediation trials for hydrocarbon-contaminated sludge from a soil washing. Garca
Frutosa, F. J., y otros, y otros. 2011, Journal of Hazardous Materials, pg. 10.
11. Bioventing remediation and ecotoxicity evaluation of phenanthere - contaminated soil.
Garca Frutos, Francisco Javier, y otros, y otros. 2010, Journal of Hazardous Materials,
pg. 8.
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59

12. Vias Canals, Marc. Biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos:


caracterizacin microbiolgica, qumica y ecotoxicolgica. Universitat de Barcelona :
Facultat de Biologia - Departament de Microbiologia, Abril de 2005.
13. Instituto Mexicano del Petrleo, Secretara de Medio Ambiente y Recursos
Naturales, Instituto Nacional de Ecologa. Manual de tcnicas de anlisis de suelos
aplicadas a la remediacin de sitios contaminados. 2006. ISBN 968-489-039-7.
14. ustez Cuartas, Diana Cristina. Biorremediacin para la Degradacin de Hidrocarburos
Totales Presentes en los Sedimentos de una Estacin de Servicio de Combustible. [ed.]
Universidad Tecnolgica de Pereira. s.l. : Facultad de Ciencias Ambientales, 2012. Proyecto
de Grado presentado como requisito para optar al ttulo de Magister en Ecotecnologa.
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60

9. ANEXOS

ANEXO A : ............................................ANALISIS FISICOQUIMICO DE UN SUELO.


.............................................................................................................................................. 62

A.1 Tabla de textura de suelo. ......................................................................................... 62


A.2 Humedad ................................................................................................................... 62
A.3 Carbono orgnico total (COT) .................................................................................. 63
A.4 Nitrgeno total (NT) ................................................................................................. 66
A.5 Fosfatos ..................................................................................................................... 70
A.6 Nitratos y nitritos ...................................................................................................... 75
A.7 Amonio intercambiable. ............................................................................................ 78
A.8 pH .............................................................................................................................. 81
A.9 Conductividad elctrica ............................................................................................ 81
A.10 Extraccin y cuantificacin de Hidrocarburos totales de petrleo. ........................ 84

ANEXO B : ............................................. CARACTERISTICAS MICROBIOLGICAS.


.............................................................................................................................................. 88

ANEXO C : .......... CUANTIFICACION DE LA PRODUCCION DE CO2 EN SUELO.


.............................................................................................................................................. 91

ANEXO D : .................. TIPOS DE BACTERIAS MS COMUNES USADAS EN LOS


PROCESOS DE REMEDIACIN. .................................................................................. 93

ANEXO E : ................. Lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos.


.............................................................................................................................................. 94

ANEXO F : .................. CLASIFICACIN DE TECNOLOGAS DE REMEDIACIN.


.............................................................................................................................................. 95

ANEXO G : ....................................... TCNICAS DE REMEDIACIN MS USADAS.


.............................................................................................................................................. 97
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61

ANEXO H : .........................................................................DE MEDIOS Y REACTIVOS.


............................................................................................................................................ 102
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62

ANEXO A : ANALISIS FISICOQUIMICO DE UN SUELO.

A.1 Tabla de textura de suelo.

TIPO DE SUELO TAMAO DE PARTICULAS


Grava > 2 mm
Arena 0.2 a 2 mm
Arena fina 0.02 a 0.2 mm
Limo 0.002 a 0.02 mm
Arcilla < 0.002 mm

Primero se elimina la materia orgnica, mezclando 20 gramos de suelo tamizado por 2 mm,
con 50 ml de H2O2 en una botella de vidrio de 1000 ml, y se deja reposar hasta que la
efervescencia desaparezca. Luego se aaden 40 ml de dispersante (NaPO3)6 1N, y se lleva
el conjunto a un bao de ultrasonidos durante 10 minutos para desagregar el cemento
interparticular. Posteriormente, se lleva todo el contenido a una probeta de vidrio de 1000
ml de capacidad y se enrasa a un volumen final de 1000 ml con agua desionizada y se
mezcla por inversin durante 2 minutos tapando la probeta con Parafilm y se deja
sedimentar el particulado, recogiendo volmenes de 5 ml de la suspensin a 5 cm de la
superficie en diferentes momentos segn la ley de Stockes. Se obtiene una alcuota inicial
justo despus de la agitacin inicial, para determinar el peso seco del conjunto de arenas,
limos y arcillas. Los limos y arcillas se recogen a los 40 segundos y los limos a las 2 horas.

A.2 Humedad

La humedad del suelo se calcula por la diferencia de peso entre una misma muestra
hmeda, y despus de haberse secado en la estufa hasta obtener un peso constante.

Material y equipo

Muestras de suelo.

Balanza analtica.

Esptula.
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Charolas o papel aluminio a peso constante.

Estufa.

Procedimiento

1) Pesar 1 g de muestra sobre un papel o charola de aluminio a peso constante.

2) Colocar la muestra dentro de la estufa a 80C de 12 a 24 horas.

3) Sacar la muestra de la estufa y colocarla dentro de un desecador para que se enfre.

4) Pesar la muestra con todo y papel.

5) Calcular los porcentajes de humedad en el suelo por la diferencia de pesos.

% Humedad del suelo = (Peso inicial Peso final)/ Peso inicial * 100

A.3 Carbono orgnico total (COT)

Material y equipo

Muestra de suelo seco y molido en mortero.

Cpsulas de porcelana especiales para el equipo de carbono total.

Esptulas.

Analizador de carbono con detector de infrarrojo y accesorio para muestras slidas.

Balanza analtica.

Pinzas.

Reactivos

Biftalato de potasio (C6H4(COOK)).


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Procedimiento

Esta tcnica puede realizarse con muestras de suelo hmedo, pero se recomienda utilizar
suelo seco y molido para homogeneizar la muestra, ya que se utilizan cantidades muy
pequeas (menores que 0.3 g).

1) Pesar suelo seco (0.1 a 0.3g) dentro de una cpsula de porcelana.

2) Encender el analizador de carbono y esperar a que la temperatura del horno llegue a


900oC. Una vez que el equipo est estabilizado a esta temperatura, se procede a
analizar las muestras.

3) El mtodo utilizado para hacer los anlisis en este equipo debe indicar que se est
utilizando el accesorio para muestras slidas; y en caso de contar con un software
para la integracin de los datos se debe incluir la curva patrn, para que el resultado
de la medicin se proporcione con base en sta.

4) Colocar la muestra dentro de la cmara de slidos y proceder a la medicin.

5) El tiempo de corrida de cada muestra es aproximadamente de cinco minutos. Al


final el software presenta la cantidad de carbono (mg kg-1 suelo o en porcentaje)
contenido en el suelo.

6) El resultado debe ser ajustado por la humedad de la muestra, para indicarlo en mg


de C/kg suelo completamente seco.

Curva patrn. Se realiza con biftalato de potasio (C6H4(COOK)) en un rango de


concentraciones de 0 a 25 mg (0 a 0.025 g) de carbono contenido en este compuesto. El
biftalato debe secarse en la estufa durante 12 horas a 60C antes de ser analizado. Pesar la
cantidad necesaria del reactivo para obtener la concentracin deseada (de 0 a 25 mg de
carbono en la muestra), como se indica en la tabla C1 del anexo C y hacer la medicin de
carbono orgnico total en el analizador, como se indic para las muestras.
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Tabla A3.1 : Concentracin de biftalato para la curva patrn de carbn orgnico.

mg C contenidos en
Biftalato de potasio (mg)
biftalato
0 0
12.15 5
24.31 10
36.46 15
48.62 20
60.77 25

Clculos

Calcular la cantidad de carbono orgnico total (COT) contenido en el suelo con la ecuacin
lineal de la curva estndar.

CO (mg) = (A b) / m).

Donde:

CO = carbono orgnico (mg) contenido en el suelo.

A = rea del pico obtenido.

b = ordenada al origen.

m = pendiente.

Calcular la concentracin final de COT de la muestra de suelo mediante la siguiente


ecuacin:

COT (mg / kg de suelo seco) = CO (mg) * 1 000 / P * FH

COT = carbono orgnico total (mg / kg de suelo seco).

CO = carbono orgnico (mg).

P = cantidad de suelo (0.1 g a 0.5 g).


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1 000 = factor de correccin de concentracin (1 000 g = 1 kg).

FH = factor de correccin de humedad = (1-(%humedad/100)).

A partir del contenido total de carbono orgnico se puede estimar el contenido de materia
orgnica (tabla C2); suponiendo de forma convencional que la materia orgnica contiene
58% de carbono. As, el contenido de carbono orgnico se multiplica por el factor 1.724
para obtener el contenido de materia orgnica (Len y Aguilar, 1987).

Tabla A3.2 : Interpretacin del contenido de materia orgnica en suelo.

MATERIA ORGANICA (%)


CLASE SUELOS VOLCANICOS SUELOS NO VOLCANICOS
Muy bajo < 4.0 < 0.5
Bajo 4.1 - 6.0 0.6 - 1.5
Medio 6.1 - 10.9 1.6 - 3.5
Alto 11.0 - 16.0 3.6 - 6.0
Muy alto > 16.1 > 6.0

A.4 Nitrgeno total (NT)

Material y equipo

Muestra de suelo seco y molido con un mortero.

Balanza analtica.

Matraces Kjeldahl.

Vasos de precipitados.

Probetas.

Digestor.

Matraz aforado de 1 L.

Matraces Erlenmeyer de 1 L.
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Perlas de ebullicin.

Pipeta.

Destilador.

Bureta.

Soporte universal con pinza.

Soluciones y reactivos

1) Solucin de cido brico con indicador. Pesar 20 g de cido brico (H3BO3) y


disolver en 750 ml de agua destilada. Calentar para la completa disolucin del
cido. Dejar enfriar y agregar 20 ml de la siguiente mezcla de indicadores: 0.099 g
de verde de bromocresol y 0.066 g de rojo de metilo disueltos en 100 ml de alcohol
etlico al 96%. El pH de la mezcla debe de ser de 5.0, si es ms cido agregar
algunas gotas de solucin de hidrxido de sodio 0.1 N, hasta que la solucin
adquiera una coloracin prpura o alcance el pH indicado. Completar el volumen a
1 L con agua destilada y mezclar.

2) Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N: Pesar 4 g de hidrxido de sodio (NaOH),


disolver en agua destilada y aforar a 1 L.

3) Mezcla de catalizadores: pesar 62.5 g de sulfato de potasio (KSO4) y 6.25 g de


sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O). Homogeneizar la mezcla.

4) Solucin de hidrxido de sodio 10 N: Pesar 200 g de hidrxido de sodio (NaOH),


disolver en agua destilada y aforar a 500 ml. El agua para preparar la solucin debe
ser hervida previamente para eliminar el CO2, dejndola enfriar antes de agregarla.

5) Solucin de cido sulfrico 0.01 N: Diluir 0.28 ml de cido sulfrico concentrado


(H2SO4) hasta completar un volumen de 1 L con agua destilada. La concentracin
del cido debe ser estandarizada con la solucin valorada de carbonato de sodio.
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6) Solucin valorada de carbonato de sodio: Pesar 0.25 g de carbonato de sodio


(NaCO3), previamente secado en la estufa durante 2 horas a 105oC, disolver en
agua destilada y aforar a 50 ml.

7) Solucin de anaranjado de metilo: Pesar 0.1 g de anaranjado de metilo, disolver en


agua destilada y aforar a 100 ml.

Valoracin de la normalidad del cido sulfrico 0.01 N:

Tomar 3 alcuotas de 10 ml de la solucin de NaCO3.

Agregar 5 o 6 gotas de anaranjado de metilo como indicador.

Titular con la solucin de cido sulfrico 0.01 N.

Calcular la normalidad real sustituyendo en la siguiente frmula:

Normalidad del H2SO4 = (0.050 g/ 53) X (1/ Promedio de ml gastados en las tres
alcuotas).

8) cido sulfrico concentrado (H2SO4).

9) Granallas de zinc.

Procedimiento

A. Digestin.

1) Pesar una muestra de suelo de 0.25 a 1 g, que depender de la materia orgnica


contenida en el suelo, entre ms materia orgnica tenga un suelo menos sern los
gramos de muestra.

2) Colocar la muestra de suelo en un matraz Kjeldahl seco.

3) Adicionar 2 g de mezcla de catalizadores.

4) Agregar 5 ml de cido sulfrico concentrado.


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69

5) Poner a calentar en el digestor a una temperatura media, hasta que la muestra se


torne clara. La temperatura debe ser regulada de modo que los vapores de cido
sulfrico se condensen en el tercio inferior del cuello del matraz Kjeldahl.

6) Hervir la muestra por una hora a partir de ese momento.

7) Una vez terminada la digestin, apagar el digestor y tapar con un frasco los
matraces para dejar enfriar.

B. Destilacin.

1) Aadir al matraz Kjeldahl fro 25 ml de agua destilada y mezclar vigorosamente


hasta una disolucin completa.

2) Transferir el lquido a un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Colocar de 5 a 6 perlas de


ebullicin.

3) Adicionar 3 granallas de zinc. Aadir 15 ml de la solucin de hidrxido de sodio 10


N, sosteniendo el matraz inclinado de modo que se deposite en el fondo.

4) Colocar en la salida del aparato de destilacin un vaso de precipitados de 50 ml, que


contenga 10 ml de la solucin de cido brico ms indicador.

5) Conectar el flujo de agua e iniciar la destilacin. Destilar hasta que el volumen


alcance la marca de 20 ml en el vaso de precipitados de 50 ml. Una vez alcanzado
dicho volumen, retirar el matraz y apagar el aparato.

6) Titular el nitrgeno amoniacal con la solucin de cido sulfrico 0.01 N hasta que
vire de verde a rosado fuerte.

7) Realizar un blanco siguiendo los pasos del 3 al 15.


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70

Clculos

Calcular la concentracin de nitrgeno, sustituyendo en la siguiente frmula:

Donde:

T = ml de cido sulfrico valorado gastados en la muestra.

B = ml de cido sulfrico valorado gastados en el blanco.

N = normalidad exacta del cido sulfrico.

S = peso de la muestra de suelo.

Tabla A4.1 : Criterios para evaluar un suelo con base en su contenido de nitrgeno total
(Moreno, 1978).

Valor (%) de nitrgeno en


Categora
suelo
Extremadamente pobre < 0.032
Pobre 0.032 - 0.063
Medianamente pobre 0.064 - 0.095
Medio 0.096 - 0.126
Medianamente rico 0.127 - 0.158
Rico 0.159 - 0.221
Extremadamente rico > 0.221

A.5 Fosfatos

Material y equipo

Muestra de suelo (1 g) seco y molido en un mortero.

Vasos de precipitado.

Pipetas de 1, 5 y 10 ml.
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Matraces aforados de 0.5 y 1 L.

Espectrofotmetro visible.

Probeta de 250 ml.

Botellas de polipropileno 1 L.

Tubos de ensayo de 10 ml.

Tubos de plstico para centrfuga de 15 ml.

Gradillas.

Vrtex.

Centrifuga.

Matraz Erlenmeyer de 1 y 2 L.

Frascos de vidrio mbar con tapa esmerilada.

Nota: Para llevar a cabo esta determinacin deber utilizarse material de vidrio Pirex, y
guardar el agua y los reactivos en frascos neutros o de Nalgene. El agua empleada deber
ser libre de fsforo, ya sea bidestilada o desmineralizada. Es recomendable vaciar el agua
del garrafn a envases de Nalgene neutros. Previamente a la realizacin de esta tcnica,
todo el material que se utilice para preparar los reactivos y realizar los anlisis deber
dejarse por lo menos cinco minutos en mezcla crmica y despus enjuagar con agua
bidestilada. No usar ningn tipo de detergente para el lavado del material de cristalera o
bien utilizar jabn libre de fosfatos. En caso de usar este ltimo ya no es necesario lavar el
material con mezcla crmica.

Soluciones y reactivos

1) Mezcla crmica: Pesar 100 g de dicromato de potasio (2Cr2O7) y disolver en 1 L de


agua destilada. Calentar hasta la completa disolucin del reactivo. Dejar enfriar la
solucin y agregar gota a gota 100 ml de cido sulfrico concentrado (H2SO4).
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2) Solucin madre de fluoruro de amonio (NH4F) 1 N: Pesar 37 g de fluoruro de


amonio, disolver en agua destilada y aforar a 1 L. Guardar en un recipiente de
polipropileno.

3) cido clorhdrico (HCl) 0.5 N: Diluir 20.2 ml HCl concentrado hasta completar un
volumen de 500 ml con agua destilada.

4) Solucin extractora: Agregar 460 ml de agua destilada a 15 ml de solucin madre de


fluoruro de amonio y 25 ml de solucin de cido clorhdrico 0.5 N. Esto nos da una
solucin 0.03 N de fluoruro de amonio y 0.025 N de cido clorhdrico. La solucin
final debe ser almacenada en un recipiente de polipropileno perfectamente tapado,
de esta forma se conserva hasta un ao.

5) Solucin de cido clorhdrico (HCl) 10 N: En un matraz aforado de 500 ml colocar


80 ml de agua destilada y adicionar lentamente y por las paredes del matraz 404 ml
de cido clorhdrico concentrado (HCl), al final completar un volumen de 500 ml
con agua destilada.

Nota: tener mucho cuidado al preparar esta solucin, se debe hacer en una campana de
extraccin y sobre un bao de hielo.

6) Solucin de molibdato de amonio-cido clorhdrico: Pesar 15 g de molibdato de


amonio tetrahidratado ((NH4)6Mo7O24.4H2O) y disolver en 350 ml de agua
destilada. Aadir lentamente y con agitacin constante 300 ml de cido clorhdrico
10 N. Enfriar a temperatura de laboratorio y aforar a 1 L con agua destilada.
Mezclar bien y guardar en frasco mbar con tapn esmerilado. Esta solucin debe
ser preparada cada dos meses.

7) Solucin madre de cloruro estaoso: Pesar 5 g de cloruro estaosodihidratado


(SnCl2. 2H2O) y disolver en 12.5 ml de cido clorhdrico concentrado (HCl).
Calentar a bao Mara hasta que se disuelva bien. Guardar en el refrigerador en
frasco mbar con tapn esmerilado, pues de esta forma se conserva seis semanas
mximo.
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8) Solucin de cloruro estaoso diluida: Agregar 33 ml de agua destilada a 0.1 ml de


solucin madre de cloruro estaoso o 0.3 por 99 ml de agua. Esta solucin debe ser
preparada cuatro horas antes de su uso.

9) Solucin tipo de fosfato (100 mg/ml): Pesar 0.4389 g de fosfato de potasio


monobsico (KH2PO4), disolver en agua destilada y aforar a 1 L. Un mililitro de
esta solucin contiene 100 ppm de fsforo.

10) Agua bidestilada o desmineralizada.

Procedimiento

1) Pesar 1 g de suelo previamente seco y molido, y colocarlo en un tubo para


centrfuga de 15 ml.

2) Agregar 7 ml de solucin extractora, agitar con vrtex de tal manera que se mezcle
bien el suelo y la solucin extractora.

3) Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 6 000 rpm.

4) Del sobrenadante tomar 1 ml y colocarlo en un tubo de vidrio, agregar 6 ml de agua


destilada y 2 ml de la solucin de molibdato y mezclar bien.

5) Agregar 1 ml de solucin de cloruro estaoso diluido (que debe prepararse al


momento) y nuevamente mezclar.

6) Pasados 10 minutos leer la absorbancia en el espectrofotmetro a una longitud de


onda de 640 nm. Todas las lecturas debern terminarse antes de 20 minutos.

Nota: En caso de que las muestras tengan un alto contenido de fsforo deben hacerse las
diluciones apropiadas con el extracto (sobrenadante), de tal manera que los valores de
absorbancia estn dentro de la curva de calibracin. O bien se puede iniciar la extraccin
con 0.5 g de suelo.

7) Cada vez que se lea un lote de muestras realizar un blanco de la siguiente manera:
Poner 1 ml de H2O destilada y 1 ml de solucin extractora, agregar 5 ml de agua
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destilada y 2 ml de solucin de molibdato de amonio, mezclar bien y agregar 1 ml


de la solucin de cloruro estaoso, finalmente mezclar otra vez.

8) Para construir la curva patrn hacer las diluciones correspondientes de la solucin


tipo de fosfato, llevando el volumen a 100 ml, y considerar las proporciones de la
tabla 4.7.

Curva patrn. Colocar 1 ml de cada una de las diluciones (ppm) de la solucin tipo de
fosfato en los tubos. Agregar 1 ml de la solucin extractora, 5 ml de agua destilada y 2 ml
de solucin de molibdato de amonio. Posteriormente 1 ml de solucin de cloruro estaoso
diluido y mezclar bien.

Finalmente hacer las lecturas y terminarlas antes de 20 minutos.

Tabla A5.1 : Concentracin de fosfato para realizar la curva patrn de fsforo.

ml de solucin tipo de
Concentracin (ppm)
fosfatos
10 10
9 9
8 8
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1

Tabla A5.2 : Criterios para determinar la calidad de un suelo en cuanto a su contenido


de fsforo. (NOM-021-RECNAT-2000).

Categora Valor (mg kg-1)


Bajo < 5.5
Medio 5.5 -11
Alto > 11
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A.6 Nitratos y nitritos

Material y equipo

Estufa.

Mortero.

Balanza.

Centrfuga.

Analizador in capilar.

Tubos Falcon para centrfuga o equivalente.

Vrtex.

Pipetas.

Matraces volumtricos.

Filtro con membrana de 0.45 m.

Reactivos y soluciones

Solucin extractora. Cloruro de potasio (KCl) 1M. Pesar 74.56 g de KCl disolver en
agua destilada y aforar a volumen de 1 L.

Medio de dilucin de estndares. Cloruro de potasio (KCl) 0.0037M. Medir 0.915


ml de la solucin KCl 1M y aforar a 0.25 L.

Solucin para lavado de columna. Hidrxido de sodio (NaOH) 0.1N. Pesar 0.4 g de
NaOH disolver en agua desionizada y diluir a 100 ml.

Solucin patrn de nitrato (NO3) 1 000 mg L-1. Pesar 1.37 g de NaNO3, disolver
en agua desionizada en un volumen de 1 L.
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Solucin patrn de nitrito (NO2) 1 000 mg L-1. Pesar 1.5 g de NaNO2, disolver en
agua desionizada en un volumen de 1 L.

Electrolito. Base de cromato de sodio 0.1 M. 4.6 ml de solucin OFM anin-BT


(Water CIA-pak), 9.2 ml de cromato de sodio 0.1 M en 200 ml de agua desionizada
grado MiliQ.

Procedimiento

A. Extraccin.

1) Secar el suelo a temperatura ambiente (25-30oC) y moler en un mortero.

2) Pesar 10 g del suelo molido, colocarlos en un tubo (Falcn para centrfuga o


equivalente), posteriormente agregar gradualmente 30 ml de KCl 1M, mezclando
intensamente en vrtex durante un minuto. Centrifugar a 8 000 rpm por 10 minutos
y recuperar el sobrenadante. Aproximadamente 1 ml ser utilizado para el anlisis
de nitrato y nitrito.

Nota: Este procedimiento de extraccin permite la obtencin de sobrenadante para la


determinacin de amonio intercambiable, con la diferencia de requerirse 25 ml para la
determinacin del amonio con otro protocolo de cuantificacin (ver seccin 4.7).

B. Cuantificacin.

1) Realizar una dilucin inicial 0.5/5 (0.5 ml de sobrenadante en 4.5 ml de agua


desionizada); a partir de sta hacer una segunda dilucin 0.2/5 (0.2 ml de la primera
en 4.8 ml de agua desionizada). Esta ltima se debe filtrar a travs de una
membrana de 0.45 m y, posteriormente, colocar 0.5 ml del filtrado en viales para
el anlisis por electroforesis capilar.

2) Condiciones del equipo (CIA):

Temperatura: 25C.

Voltaje: 15kV con fuente de poder negativa.


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Deteccin: UV indirecta a 254 nm.

Columna: Capilar de 75 m (di) x 375 m (de) x 60 cm (largo).

Curva patrn. Elaboracin de la curva estndar para nitrato (NO3). Deber preparar
estndares entre 5 a 80 mg NO3/L a partir de la solucinpatrn 1 000 mg NO3/L y como
medio de disolucin KCl 0.0037M.El tiempo de corrida durante el anlisis debe ajustarse a
4.5 minutos.

Elaboracin de la curva estndar para nitrito (NO2). Deber preparar estndares entre 5 y
80 mg NO2/L, a partir de la solucin patrn 1 000 mg NO2/L y como medio de disolucin
KCl 0.0037M. El tiempo de corrida durante el anlisis debe ajustarse a 4.5 minutos.

Clculos

Para calcular la concentracin final en mg L-1 deber tomarse en cuenta la relacin de


diluciones. Finalmente, para convertir el resultado mg L-1 a concentracin en peso (mg kg-
1), se utiliza la siguiente relacin. Adems es necesario corregir con la humedad.

mg anin/kg suelo = mg anin /L * 3


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Tabla A6.1 : Clasificacin de fertilidad de suelos por el contenido de nitrgeno inorgnico.

N inorgnico en el
Clase
suelo (mg kg-1)
Muy bajo 0 - 10
Bajo 10 - 20
Medio 20 - 40
Alto 40 - 60
Muy alto > 60

Nota: Los valores de la tabla F1 corresponden a fertilidad de suelos del nitrgeno


biodisponible para plantas; por lo que junto al amonio se debe interpretar el contenido de
nitrgeno inorgnico en funcin a la capacidad extractiva de la solucin empleada, y
evaluar si es un parmetro que permita definir los requerimientos nutricionales de los
microorganismos en los procesos de biodegradacin de hidrocarburos.

A.7 Amonio intercambiable.

Material y equipo

Estufa.

Mortero.

Balanza.

Centrfuga.

Potencimetro con electrodo in selectivo.

Tubos Falcon para centrfuga o equivalente.

Vrtex.

Pipetas.

Matraces volumtricos.
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Reactivos y soluciones

Cloruro de potasio (KCl) 1M. Solucin extractora. Pesar 74.56 g de KCl disolver en
agua destilada y aforar a volumen de 1 L.

Hidrxido de sodio (NaOH) 10N. Disolver 400 g de NaOH en agua. Enfriar y diluir
a 1 L.

Solucin patrn. 1 000 mg NH4/L. Secar NH4Cl por una hora a 100oC. Pesar 3.027
g, disolver en agua y diluir a 1 L.

Procedimiento

A. Extraccin.

1) Secar el suelo a temperatura ambiente (25-30oC) y moler en un mortero.

2) Pesar 10 g del suelo molido, colocarlos en un tubo (Falcn para centrfuga o


equivalente); posteriormente, agregar gradualmente 30 ml de KCl 1M, mezclando
intensamente en vrtex durante un minuto.

Centrifugar a 8 000 rpm por 10 minutos y recuperar el sobrenadante. Aproximadamente 25


ml sern utilizados para el anlisis del amonio.

Nota: La determinacin de amonio intercambiable en el presente mtodo permite tambin


extraer con la solucin extractora (KCl 1M) a los iones nitrito y nitrato. Con la diferencia
que el amonio se cuantifica por electrodo de in selectivo y los iones nitrito y nitrato por
electroforesis capilar (EIC).

B. Cuantificacin.

1) Tomar 25 ml del sobrenadante de la extraccin, adicionar 0.45 ml de NaOH 10N;


bajo agitacin llevar a cabo la medicin de mV mediante electrodo de in selectivo
para amonio. Calcular de la curva estndar (de elaboracin reciente) la
concentracin mg NH4/L.
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80

Curva patrn. Preparar por lo menos tres estndares segn rango de concentracin
esperada en muestras. Es importante preparar siempre estndares nuevos. Debern
prepararse estndares entre 0.1 a 100 mg NH4/L en un volumen de por lo menos 25 ml,
usando la solucin patrn 1 000 mg NH4/L y como medio de disolucin KCl 1M. Para
estndares de 1, 10 y 100 mg NH4/L medir 0.05, 0.5 y 5 ml de solucin patrn y aforar a
50 ml con KCl 1M. Al igual que las muestras, medir la diferencia de potencial en milivolts
(mV). Construir grfica semilogartmica. Poner en el eje (x) logartmico la concentracin
NH4/L y en el eje lineal (y) el potencial del electrodo.

Clculos

Para convertir el resultado a concentracin en peso (mg NH4/kg suelo), en este caso se
utiliza la siguiente relacin. Adems es necesario corregir con la humedad.

mg NH4/ kg suelo = mg NH4/L * 3

Tabla A7.1 : Clasificacin de fertilidad de suelos en funcin del nitrgeno inorgnico


(NOM-021-RECNAT-2000).

N inorgnico en el
Clase
suelo (mg kg-1)
Muy bajo 0 - 10
Bajo 10 - 20
Medio 20 - 40
Alto 40 - 60
Muy alto > 60
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A.8 pH

Tabla A8.1 : Parmetros de evaluacin de un suelo con respecto a su pH (NOM-


021-RECNAT-2000).

CATEGORIA VALOR DE pH
Fuertemente acido < 5.0
Moderadamente acido 5.1 - 6.5
Neutro 6.6 - 7.3
Medianamente
7.4 - 8.5
alcalino
Fuertemente alcalino 8.5

A.9 Conductividad elctrica

Material y equipo

Muestra de suelo seco y molida en un mortero.

Balanza analtica.

Frascos de plstico de boca ancha de 250 ml.

Vaso de precipitado de 100 ml.

Bureta.

Esptula.

Papel filtro.

Embudo Buchner.

Pipeta de 10 ml.

Matraz Kitazato.

Piceta con agua destilada.


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Bomba de vaco.

Probeta.

Conductmetro.

Frascos.

Agua destilada.

Matraz aforado de 100 ml.

Soluciones

Solucin estndar de cloruro de potasio (KCl) 0.1 N. Disolver 0.7455 g de KCl en


agua destilada y aforar a 100 ml.

Solucin estndar de cloruro de potasio (KCl) 0.01 N. Tomar una alcuota de 10 ml


de la solucin estndar de KCl 0.1 N y aforar a 100 ml.

Procedimiento

A. Preparacin de la pasta de saturacin.

1) Pesar 40 g de suelo seco y colocarlo en un recipiente de plstico, si el suelo es


arenoso o areno-migajoso pesar 600 g.

2) Agregar agua destilada con la bureta y mezclar con la esptula hasta saturacin.

3) Golpear el recipiente con cuidado sobre la mesa de trabajo para asentar el suelo.

4) La pasta estar lista cuando se observe un brillo en su superficie (formacin de un


espejo), esto no sucede en el caso de suelos con alto contenido de arcilla.

5) Anotar el volumen de agua gastado (ml).

6) Dejar reposar la pasta durante una hora y comprobar a criterio su saturacin.

7) Tapar el recipiente y dejarlo reposar por tres horas, excepto suelos arcillosos que
deben dejarse reposar 24 horas.
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B. Obtencin del extracto del suelo.

1) Colocar papel filtro sobre el embudo, humedecerlo con agua destilada, dejando
drenar el exceso. Conectar el sistema de filtracin al vaco.

2) Mezclar nuevamente la pasta y colocarla en el embudo y aplicar vaco.

3) Obtener un extracto de aproximadamente 50 ml.

C. Determinacin de la conductividad elctrica.

1) Calibrar el conductmetro. Antes de usar el medidor de conductividad debe


calibrarse con una solucin estndar. Para esto se requiere de dos soluciones de
KCl, 0.1 N y 0.01 N, con cada una se ajusta el equipo a la conductividad indicada
en le tabla B1 del anexo B.

2) Leer la conductividad elctrica y la temperatura del extracto. Si la lectura se toma


en mhos, transformar los resultados a mmhos o dS dividiendo entre 1 000.

3) Si es necesario, hacer correccin consultando la tabla de factores de correccin para


diferentes temperaturas (tabla B2 del anexo B), se multiplica el resultado de
conductividad elctrica por el valor correspondiente.

Tabla A9.1 : Ajuste de conductividad en funcin de la solucin de KCI.

Conduct. elctrica a
Sol. estndar de KCl
25C
0.1 N 12.9 dS/m
0.01 N 1.412/m

Cuando no se sabe la conductividad de la muestra se recomienda calibrar primero con una


de las dos soluciones y tomar la lectura de la muestra, despus volver a calibrar con la
segunda solucin y tomar nuevamente la lectura. Para calibrar finalmente el equipo, se debe
elegir la solucin con la que se aproxime ms la conductividad de la muestra.
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Tabla A9.2 : Factores de correccin de la conductividad elctrica en funcin de la


temperatura del extracto de saturacin.

Temperatura Factor de Temperatura Factor de


(C) correccin (C) correccin
8 1.499 22 1.067
10 1.421 23 1.044
12 1.350 24 1.021
14 1.284 25 1.000
16 1.224 26 0.979
18 1.168 28 0.941
19 1.142 30 0.906
20 1.128 32 0.873
21 1.092 34 0.843

Clculos

La unidad estndar de conductividad elctrica es el siemens/metro (S/m = Ohm/m), pero


para evitar la expresin de resultados en pequeas fracciones decimales se usa
generalmente una unidad ms pequea: el miliSiemens/metro (mS/m). Aunque la
conductividad generalmente es reportada en mhos/cm.

mS/m = 10 mhos/cm.

A.10 Extraccin y cuantificacin de Hidrocarburos totales de petrleo.

Extraccin por reflujo (Soxhlet)

Este mtodo consiste en extraer los hidrocarburos contenidos en el suelo, mediante la


accin de un solvente orgnico voltil apropiado, que es reflujado a travs de la muestra
varias veces durante un tiempo determinado. El solvente es evaporado y posteriormente
condensado en un refrigerante, se le hace pasar por la muestra y se le regresa al origen para
ser nuevamente evaporado. La muestra slida es mezclada con sulfato de sodio anhidro
para eliminar el agua residual, se le coloca en un dedal o cartucho de papel o fibra de vidrio
y se usa un solvente orgnico apropiado para su extraccin en un equipo Soxhlet. Mediante
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los reflujos del solvente y la temperatura se permite el contacto ntimo de la muestra con el
solvente de extraccin, de esta manera se logra la liberacin de los hidrocarburos presentes
en la muestra. El extracto orgnico se concentra (si es necesario) o bien se evapora para
realizar el intercambio de solvente, acorde con el mtodo de cuantificacin.

Material y equipo

Equipo de reflujo Soxhlet de 250 ml.

Perlas de ebullicin.

Cartuchos de celulosa o fibra de vidrio.

Balanza analtica.

Vaso de precipitados 250 ml.

Viales.

Esptula.

Reactivos

Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).

Diclorometano (cloruro de metileno, CH2Cl2) grado HPLC.

Procedimiento

1) Colocar de 5 a 10 g de suelo seco y finamente molido en un cartucho de celulosa o


fibra de vidrio.

2) Adicionar sulfato de sodio anhidro en una relacin suelo:sulfato 1:1 y mezclar.

3) Colocar cada cartucho conteniendo las muestras dentro de la camisa o columna


extractora del equipo Soxhlet.

4) Adicionar 125 5 ml de diclorometano en el matraz de bola y colocar suficientes


perlas de ebullicin para evitar la proyeccin del solvente al calentarse.
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5) Ensamblar el equipo Soxhlet e iniciar calentamiento hasta alcanzar una temperatura


de 45oC.

6) Mantener el reflujo en estas condiciones durante 8 horas, de tal manera que se


efecten entre 6 y 8 reflujos por hora, lo que permitir la liberacin de los analitos.

7) Despus de 8 horas, el extracto orgnico contendr todos los hidrocarburos solubles


en diclorometano. Pasar el matraz bola a un rotoevaporador y concentrar el extracto
orgnico a sequedad.

8) Recuperar el concentrado en un vial de 40 ml con tapn de tefln para su


cuantificacin.

Mtodo gravimtrico para la cuantificacin de hidrocarburos totales del petrleo

El mtodo se basa en la cuantificacin de los hidrocarburos que son extrados dentro de un


solvente adecuado. El solvente es evaporado y el extracto orgnico obtenido es pesado.
Esta cuantificacin es llamada HTPs y es reportada como porcentaje de la muestra total en
peso seco. Este mtodo es ms adecuado para petrleos pesados que no se pierden en la
etapa de evaporacin. El mtodo se basa en la cuantificacin de los hidrocarburos que son
extrados dentro de un solvente adecuado. El solvente es evaporado y el extracto orgnico
obtenido es pesado. Esta cuantificacin es llamada HTPs y es reportada como porcentaje de
la muestra total en peso seco. Este mtodo es ms adecuado para petrleos pesados que no
se pierden en la etapa de evaporacin.

Material y equipo

Matraces de bola de 250 ml.

Rotoevaporador.

Viales o tubos de vidrio de 25 ml.

Balanza analtica.

Pinzas.
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Procedimiento

1) Poner a peso constante el recipiente donde se colocar el extracto orgnico obtenido


(matraz de bola para la extraccin, vial o tubo de vidrio) (ver seccin 5.2 ). Colocar
el recipiente en la estufa a 120C durante 4 horas. Sacar este material y colocarlo en
un desecador para que se enfre. Pesar el recipiente, despus colocarlo otra vez
dentro de la estufa y volver a realizar el procedimiento hasta que el peso no cambie.
Anotar el peso del recipiente (RA).

2) Una vez que el extracto orgnico obtenido (ver seccin 5.2 ) est en un matraz de
bola, tubo o vial de vidrio a peso constante, se procede a la evaporacin total del
solvente (diclorometano) en un rotoevaporador 740 50 mbar y 45C hasta
sequedad.

3) Pesar nuevamente el matraz, vial o tubo con el extracto libre de solvente. Anotar el
peso (RB).

Clculos

La diferencia en peso corresponde al contenido total de HTPs. Para hacer el clculo de


concentracin de hidrocarburos totales del petrleo provenientes de la muestra, se debe
considerar la cantidad de suelo que se pes para la extraccin, as como la humedad de la
muestra. El resultado debe expresarse en mg de HTP/kg de suelo seco, y se calcula de la
siguiente manera:

HTPs (mg kg-1 de s.s.) = (RB RA) * (FC) / (P * FH).

Donde:

HTPs (mg kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petrleo en mg/ kg de suelo seco.

RA= peso (mg) del recipiente vaco a peso constante.

RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgnico concentrado.

P = cantidad de suelo extrado (g).


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88

FH = factor de correccin de humedad (1-(%humedad/100)).

FC = factor de correccin para transformar a kg de s.s. = 1 000.

ANEXO B : CARACTERISTICAS MICROBIOLGICAS.

B.1 Determinacin de la poblacin microbiana hetertrofa y degradadora de


hidrocarburos.

Material y equipo

Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solucin salina 0.85% estril.

Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 ml de solucin salina 0.85% estril.

Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estriles.

Vrtex.

Balanza.

Esptulas.

Campana de flujo laminar o rea estril.

Cajas de Petri con medio de cultivo-agar.

Varilla de vidrio.

Muestra de suelo o agua.

Incubadora.

Papel aluminio estril.


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89

Soluciones y reactivos

1. Solucin salina 0.85% estril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de


agua destilada.

2. Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento.

3. Etanol (CH3-CH2-OH).

Procedimiento

1. En condiciones estriles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1 g del


suelo a una botella de dilucin o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solucin
salina isotnica estril (dilucin 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con
agitacin vigorosa en vrtex.

2. Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solucin salina estril (dilucin 10-


3). De ah se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta
10-10 o las adecuadas, asegurndose de utilizar una punta o pipeta estril diferente
en cada paso. Agitar de forma constante con vrtex en cada paso.

3. Tomar 0.1 ml de la dilucin seleccionada y colocarla en el centro de la superficie


del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y
con tres diluciones prximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para asegurar la cuenta.

4. Extender la alcuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio


previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasndola por la flama del mechero
permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribucin homognea por toda la
superficie del medio.

5. Incubar las placas de forma invertida a 30C en ausencia de luz.

6. Despus de un periodo de incubacin (de 3 a 7 das, dependiendo del tipo de


microorganismo), contar el nmero de colonias y reportar como unidades
formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.
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90

Clculos

1. Contar slo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.

2. Con la siguiente ecuacin calcular las UFC/g s.s.

UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).

Donde:

UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.

NC= nmero de colonias en una caja.

FD = factor de dilucin que corresponde a la dilucin de donde se tom la muestra con la


que se inocula la caja (10-2 a 10-10).

V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.

P = peso de la muestra hmeda = 1 g.

FH = factor de correccin de humedad (1-(%humedad/100)).


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ANEXO C : CUANTIFICACION DE LA PRODUCCION DE CO2 EN SUELO.

Mtodo

En esta tcnica la medicin de CO2 producido por microorganismos durante la incubacin


de suelo en un sistema cerrado y a determinadas condiciones, se cuantifica por
cromatografa de gases con un detector de conductividad trmica.

Material y equipo

Botellas serolgicas de 125 ml.

Tapones de hule para botellas serolgicas.

Sellos de aluminio para los tapones de hule.

Jeringa para gases de 5 ml.

Cromatgrafo de gases con detector de conductividad trmica.

Reactivos

1) Helio grado cromatogrfico de alta pureza.

Procedimiento

1) Sistema de degradacin: colocar una muestra de suelo en un recipiente (botella


serolgica) sellado con un tapn de hule y arillo de aluminio (la cantidad depender
del tamao del sistema por establecer); posteriormente, se incubar a condiciones de
temperatura, humedad, pH, establecidas. Las condiciones dependern del sistema de
monitoreo del suelo que se desee evaluar.

Nota: La medicin de CO2 producido tambin se puede realizar en sistemas abiertos con
flujo de aire constante, monitoreando en lnea (conectando directamente al cromatgrafo).

2) A travs del tapn de hule introducir la jeringa para obtener la muestra de gas.

3) Tomar con la jeringa de 0.5 a 2.0 ml de muestra de la atmsfera de los sistemas por
monitorear.
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Nota: El volumen de muestra depender del tipo de sistema que se tenga, mientras ms
actividad microbiana presente el sistema (suelo) menor ser el volumen de muestra
gaseosa que se requiera; por el contrario, mientras menor actividad microbiana se
observe, mayor ser el volumen necesario de muestra gaseosa para la cuantificacin de
CO2 producido.

4) Antes de inyectar la muestra gaseosa, el cromatgrafo de gases debe estar a las


condiciones sealadas en la tabla 6.5.

5) Inyectar el volumen total de la muestra de gas tomada en la jeringa en el


cromatgrafo de gases.

6) El resultado de la medicin en este equipo permite cuantificar dixido de carbono


(CO2), oxgeno (O2), nitrgeno (N2) y metano (CH4). El primer pico que sale es de
inyeccin, el segundo corresponde a CO2, el tercero a O2, el cuarto a N2 y el quinto
a CH4 (Fig. 6.3). Cuando se hace la integracin de los datos, eliminar el primer pico
de dicha integracin, porque el resultado del rea de cada pico se toma en
porcentaje. Tomar la lectura del rea del pico de CO2 en porcentaje.

7) Una vez tomadas las reas de los picos en porcentaje, se procede a calcular la
concentracin de CO2 presente en los sistemas, utilizando la ecuacin de los gases:
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ANEXO D : Tipos de bacterias ms comunes usadas en los procesos de remediacin.

Tabla D1 : Tipos de bacterias ms utilizadas.

Grupo de bacterias Genero Importancia ambiental

Pseudomonas Degrada compuestos orgnicos

Flavobacterium Degrada protena

Organismo formador de floculos


Zooglea en plantas de lodos activados
Producen cidos grasos a partir
Clostridium
Bacterias de descomposicin de orgnica en un digestor
Micrococcus anaerobio materia

Methanobacterium
Producen metano gaseoso a partir
de cidos grasos en un digestor
Methanococcus
anaerobio
Methanosarcina

Nitrobacter Oxidan compuestos nitrogenados


Bacterias nitrificantes
inorgnicos
Nitrosomonas

Bacillus Reducen nitratos y nitritos a


Bacterias desnitrificantes
nitrgeno gaseoso u oxido ntrico
Pseudomonas
Degradan compuestos txicos
Bacterias degradadoras de Pseudumonas que contienen cloro (como el
cloro transgenicas vinilcloruro) en compuestos
menos nocivos

Azobacter Capaces de fijar el nitrgeno


Bacterias fijadoras de nitrgeno
Beijerinckia atmosfrico en NH3

Interviene en la corrosin de
Bacterias reductoras de sulfatos Desulfovibrio
tuberas de hierro
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Chlorobium Reducen sulfuros a azufre


Bacterias fotosintticas
elemental
Chromatium
Dan volumen a los lodos en las
Sphaerotilus
Bacterias Filamentosas plantas de lodos activados
frricas Oxidantes
Leptothrix Oxidan el hierro ferroso
del hierro
Pseudomonas
Arthrobacter
Actinomyces
Bacterias degradadoras de Aerobacter
Degradan hidrocarburos
hidrocarburos Flaviobacterium
Corynebacterium
Sphingomonas
Micrococcus

ANEXO E : Lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos.

Tabla E1 : Lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos en suelo (NOM-


SEMARNAT/SS-2003).

Uso del suelo predominante 1 (mg kg-1


FRACCION DE base seca)
HIDROCARBUROS
Agrcola 2 Residencial 3 Industrial
Ligera 200 200 500
Media 1200 1200 5000
Pesada 3000 3000 6000
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ANEXO F : CLASIFICACIN DE TECNOLOGAS DE REMEDIACIN.

Tecnologa de tratamiento implica cualquier operacin unitaria o serie de operaciones


unitarias que altera la composicin de una sustancia peligrosa o contaminante a travs de
acciones qumicas, fsicas o biolgicas de manera que reduzcan la toxicidad, movilidad o
volumen del material contaminado (EPA 2001). Las tecnologas de remediacin
representan una alternativa a la disposicin en tierra de desechos peligrosos que no han sido
tratados, y sus capacidades o posibilidades de xito, bajo las condiciones especficas de un
sitio, pueden variar ampliamente.
El uso de una tecnologa de remediacin en particular depende, adems de los factores
especficos del sitio y de las propiedades fisicoqumicas del contaminante, de su
disponibilidad, de la fiabilidad demostrada, de su estado de desarrollo (laboratorio, escala
piloto o gran escala) y de su costo (Sellers 1999).
Las tecnologas de remediacin pueden clasificarse de diferentes maneras, con base en los
siguientes principios:

a. Estrategia de remediacin.
b. Lugar en que se realiza el proceso de remediacin.
c. Tipo de tratamiento.

Cada una de estas clasificaciones proporciona diferente informacin acerca de las


tecnologas de remediacin.

Estrategia de remediacin

Son tres estrategias bsicas que pueden usarse separadas o en conjunto, para remediar la
mayora de los sitios contaminados:

- Destruccin o modificacin de los contaminantes: Este tipo de tecnologas busca alterar


la estructura qumica del contaminante.

- Extraccin o separacin: Los contaminantes se extraen y/o separan del medio


contaminado, aprovechando sus propiedades fsicas o qumicas (volatilizacin, solubilidad,
carga elctrica).
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- Aislamiento o inmovilizacin del contaminante: Los contaminantes son estabilizados,


solidificados o contenidos con el uso de mtodos fsicos o qumicos.

Lugar de realizacin del proceso de remediacin

- In situ: Aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los


contaminantes son removidos del suelo contaminado, sin necesidad de excavar el sitio. Es
decir, se realizan en el mismo sito en donde se encuentra la contaminacin.

- Ex situ: La realizacin de este tipo de tecnologas, requiere de excavacin, dragado o


cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento que
puede realizarse en el mismo sitio (onsite) o fuera de l (off site).

Tipo de tratamiento

- Tratamientos biolgicos: Utilizan las actividades metablicas de ciertos organismos


(plantas, hongos, bacterias) para degradar (destruccin), transformar o remover los
contaminantes a productos metablicos inocuos.

- Tratamientos fisicoqumicos: Utiliza las propiedades fsicas y/o qumicas de los


contaminantes o del medio contaminado para destruir, separar o contener la contaminacin.

- Tratamientos trmicos: Utilizan calor para incrementar la volatilizacin (separacin),


quemar, descomponer o fundir (inmovilizacin) los contaminantes en un suelo.
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Tabla F1: Ventajas y desventajas de las distintas aplicaciones de tratamiento.

Ventajas Desventajas
- Son efectivos en cuanto a
- Requieren mayores tiempos de
costos.
tratamiento.
- Son tecnologas ms benficas
Tratamientos - Es necesario verificar la toxicidad
para el ambiente.
Biolgicos de intermediarios y/o productos.
- Los contaminantes
- No pueden emplearse si el tipo de
generalmente son destruidos.
suelo no favorece el crecimiento
- Se requiere un mnimo o
microbiano.
ningn tratamiento posterior.

- Los residuos generados por


- Son efectivos en cuanto a
tcnicas de separacin, deben
costo.
tratarse o disponerse: aumento en
- Pueden realizarse en periodos
Tratamientos costos y necesidad de permisos.
cortos.
Fisicoqumicos - Los fluidos de extraccin pueden
- El equipo es accesible y no se
aumentar la movilidad de los
necesita de mucha energa ni
contaminantes: necesidad de
ingeniera.
sistemas de recuperacin.
Tratamientos - Es el grupo de tratamientos ms
Trmicos costoso.
Fuente: Elaboracin propia.

ANEXO G : TCNICAS DE REMEDIACIN MS USADAS.

Extraccin por fluidos

La extraccin por fluidos consiste en separar los contaminantes mediante un fluido


arrastrando el contaminante cuando se usa aire o lavndolo en el caso de utilizar agua, una
vez arrastrado el contaminante a un lugar ms accesible donde podr ser depurado con las
tcnicas apropiadas.
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Tratamiento electroqumico

Este tratamiento se basa en el desplazamiento del contaminante mediante la creacin de


campos elctricos introduciendo unos electrodos en el suelo haciendo que los
contaminantes se muevan de un electrodo a otro siguiendo las lneas del campo elctrico.
Este procedimiento tiene como ventaja que la textura y la permeabilidad del suelo tienen
una influencia nfima en la aplicacin de este tratamiento debido a que se trata del
transporte masivo del contaminante a travs de los poros grandes y pequeos. Esta tcnica
de remediacin proporciona buenos resultados en el caso de metales pesados y compuestos
orgnicos.

Inyeccin de aire

La inyeccin de aire consiste en inyectarle aire u/y oxgeno a presin al suelo a travs de
pozos de inyeccin lo cual provoca la degradacin de los hidrocarburos por volatilizacin y
por biodegradacin, debido a que se estimula la actividad bacteriana al aumentar la
oxigenacin del suelo.
Hay que tener en cuenta que las molculas ms pequeas se degradaran ms fcilmente, es
un proceso lento y los contaminantes son devueltos a la atmsfera sin sufrir depuracin sin
embargo estos compuestos tienden a degradarse rpidamente.

Enjuague del suelo

Esta tcnica consiste en inundar el suelo con una solucin que transporta los contaminantes
hasta un sitio donde puedan extraerse, el tipo de solucin va a depender del contaminante a
tratar y por lo general consiste en agua sola o con aditivos como cidos, hidrxidos.
Cuando los contaminantes son fciles de disolver se usa solamente agua, en el caso que
sean metales y contaminantes orgnicos los cuales se encuentran, por lo general, en el
reciclaje de bateras o en los procesos de cromado industrial se deben usar las soluciones
cidas. Las soluciones bsicas se usan para tratar los fenoles (alcohol) y ciertos metales.
En lugares donde hay arcilla o limo los resultados no son ptimos debido a que la solucin
de enjuague no puede desplazarse libremente y no entra en contacto fcilmente con el
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contaminante, otro inconveniente es que en ocasiones el enjuague contiene aditivos que si


no se retiran completamente pueden contaminar el agua subterrnea.
Cuando hay varias sustancias peligrosas como metales y aceites este tratamiento no es
eficaz debido a que es difcil hacer un enjuague que sirva para retirar varios contaminantes
a la vez.
Se utiliza para tratar principalmente contaminantes como metales, gasolina, plaguicidas y
fuel oil, este tratamiento tiene varias ventajas a ms de ser un tratamiento que se puede
realizar en el sitio, crea un sistema que no es afectado por las condiciones externas y siendo
el costo bajo puede usarse como tratamiento preliminar.

Extraccin con solventes

Este tratamiento consiste en utilizar solvente para separar o retirar los contaminantes
inorgnicos peligrosos, no destruyndolos sino concentrndolos para poder reciclarlos o
eliminarlos con mayor facilidad.

Los solventes utilizados principalmente para la extraccin con solventes son:


Dixido de carbono liquido
Butano
Propano
Acetona
Metanol
ter dimetlico

Al poner en contacto la tierra contaminada con el solvente dentro de un tanque, sta se


dividir en tres elementos: agua, slido y solventes con contaminantes disueltos, cada uno
de estos componentes pueden ser tratados de manera individual; este mtodo es eficaz para
tratar fangos residuales, suelo con contaminantes orgnicos y desechos de petrleo, no es
recomendable para contaminantes inorgnicos puesto que en la mayora de los solventes
estos materiales no se disuelven fcilmente.
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Incineracin

La incineracin es utilizada para destruir sustancias orgnicas y en algunos casos hasta para
transformar ciertas sustancias inorgnicas en condiciones controladas en slidos inertes y
gases. Este proceso transforma los metales pesados en sus xidos los cuales son menos
txicos, tambin ha sido utilizada en la eliminacin de compuestos procedentes de
plaguicidas con ptimos resultados.

Tratamiento trmico

Esta tcnica consiste en suministrar calor al sitio afectado, sometiendo el suelo a altas
temperaturas (entre los 1000 C) se produce la desintegracin de los contaminantes, se
realiza en dos fases, en la primera se oxida la mayor parte de los contaminantes y en la
segunda fase se elimina el contaminante por completo los contaminantes y los gases
manteniendo el suelo a altas temperaturas.
Este tratamiento es comnmente usado para eliminar la contaminacin producida por
hidrocarburos poliaromticos. En algunos casos se somete el suelo a temperaturas ms
bajas (entre 250 y 550 C) consiguiendo con esto la desorcin de los contaminantes en
lugar de la destruccin de los mismos, es muy usada para remediar suelos contaminados
con lubricantes, aceites minerales, gasolinas y en ciertos casos metales pesados como el
mercurio.

Solidificacin o estabilizacin

Esta tcnica se encarga de inmovilizar el contaminante reduciendo la generacin de los


lixiviados, es especialmente til para residuos altamente peligrosos que no son posibles de
destruir como es el caso de los compuestos inorgnicos.
Este tratamiento tiene un origen muy antiguo, al observar la eficiencia de la mezclas de
suelo-cemento en la construccin de los terraplenes se adopt esta tcnica a la remediacin
de suelos.
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101

Tabla G1: Ventajas y desventajas de algunos mtodos de remediacin (Heinke, 1999).

Mtodos de Remediacin Ventajas Desventajas

Solo funciona en suelos


permeables.
El procedimiento es
Extraccin por fluidos
sencillo. No es efectivo en suelos
con alta absorcin.

Proporciona buenos
resultados en el caso de Costos elevados en cuanto
metales pesados y a equipos.
compuestos orgnicos.

La textura y la
permeabilidad del suelo
Tratamiento electroqumico El suelo tratado pierde
tienen una influencia
ligeramente su fertilidad.
nfima en la aplicacin
de este tratamiento.

El contaminante puede
Es necesario hidratar el
separarse con facilidad
suelo 24 horas antes de la
del suelo, incluso en
aplicacin del tratamiento.
forma pura.

Bajo presupuesto
Inyeccin de aire Procedimiento lento.
econmico.
En arcilla o limo los
resultados no son ptimos
debido a que la solucin
Su proceso y efectividad
de enjuague no puede
no son afectados por las
desplazarse libremente y
condiciones externas.
no entra en contacto
fcilmente con el
contaminante.
En ocasiones el enjuague
Siendo el costo bajo contiene aditivos que si no
puede usarse como se retiran completamente
Enjuague del suelo tratamiento preliminar. pueden contaminar el agua
subterrnea.

Cuando hay varias


sustancias peligrosas como
metales y aceites este
Efectivo para tratar
tratamiento no es eficaz
suelos arenosos o muy
debido a que es difcil
permeables.
hacer un enjuague que
sirva para retirar varios
contaminantes a la vez.
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102

No es aplicable para
extraer contaminantes
Es eficaz para tratar
inorgnicos debido a que
Extraccin con solventes contaminantes
estos materiales no se
orgnicos,
disuelven fcilmente en la
mayora de los solventes.
Emisiones gaseosas.
Se pueden tratar grandes
Incineracin volmenes en tiempo
cortos Alto costo de los
incineradores.

La principal desventaja de
utilizar este mtodo es que
Permite tiempos rpidos el suelo queda desprovisto
Tratamiento trmico
de limpieza de toda la materia orgnica
imposibilitndolo as para
su posterior utilizacin.

Solidificacin o Solo se retiene el


Bajo costos en equipos.
estabilizacin contaminante.
Fuente: Elaboracin propia.

ANEXO H : DE MEDIOS Y REACTIVOS.

AGAR NUTRICIO

Peptona de carne.3 g

Extracto de carne0.9 g

NaCl..1,5 g

Agar4,5 g

Agua destilada..300 ml

pH..7,0

Esterilizacin: 21C por 15 minutos.

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