CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Fundamento Teórico

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas

complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; Es un conjunto de
técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos
componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como
resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación
efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser
usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este
caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.

Las distintas técnicas cromatografícas se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase
estacionaria:

 Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un
papel. Las principales técnicas son:
o Cromatografía en papel
o Cromatografía en capa fina
 Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.
Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:
o Cromatografía de líquidos
o Cromatografía de gases
o Cromatografía de fluidos supercríticos

Cromatografía en capa fina

Introducción

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante
la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen
las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y
una estufa para activarlas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria
será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase
estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán
los menos polares.

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehído

aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas

Ventajas de la cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos
cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es
más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la
separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel
destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente
reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos.

Adsorbentes

Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del
adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque
también se le puede añadir un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorbentes más
utilizados son:

 Celulosa
 Almidón
 Azucares
 Gel de sílice (silicagel)
 Óxido de aluminio (alúmina)
 Carbón activo (carbón en polvo)
 Kieselguhr

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y

animales.

Silicagel

El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente ácido, su pH
oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá utilizar con sustancias que se corrompan con los
ácidos. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este
factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del
grano suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de cálcico
semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. También han sido incorporados
dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos
tipos de gel de sílice.

Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar
los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides,
ácidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina
cromatografía de fase reversa (silanizado).

Alúmina

La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el

proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de
hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina, dándole a ésta un carácter básico. No
consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.

La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas, básicas y
neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un adsorbente de
carácter polar, de tal forma que retendrá con mayor avidez a los componentes polares.

Preparación de placas.

El adsorbente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla homogéneamente es

preferible agitar de modo mecánico. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo
de adsorbente. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general,
no obstante, habrán de consultarse la instrucciones del fabricante.

Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, láminas de vidrio, pero en la

actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles.
Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un
tamaño de placa u otro. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de
muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml.
de agua destilada.

Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos

tales como disoluciones taponadoras para mantener el pH deseado. En la preparación de las
placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.

Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina

argentación, y se utiliza para separar componentes insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele
ser de:

0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas.

0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.

La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al desarrollo del
proceso cromatográfico. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para
crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. Si no se disponer de
extensor, el proceso a seguir es el siguiente:

1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.

2. Agitar enérgicamente.
3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas;
luego se colocan en bandejas metálicas. En este momento puede activarse el agente
adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien
calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben
calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Es conveniente dejar secar
las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto
del cambio de temperatura.

Aplicación de las muestras

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico no

polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después
de la aplicación.. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo: metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de
manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Muchos reactivos
de revelado llegan a detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a
observar un 5% de impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de

siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de
siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la
placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro
aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la
placa solo quedará la muestra a analizar.
Elección del eluyente

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del
material en que la separación se lleva a cabo.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

.- Eter de petróleo.
.- Eter dietílico.
.- Ciclohexano.
.- Acetato de etilo.
.- Tetracloruro de carbono.*
.- Piridina.
.- Benceno.*
.- Etanol.
.- Cloroformo.*
.- Metanol.
.- Diclorometano.
.- Agua.
.- Ácido acético.

En la elección del eluyente influyen varios factores:

 Precio.
 Pureza.
 No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
 No utilizar compuestos muy volátiles.
 Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.

c) Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma
placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras
distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el
centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad,
de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más
eficaz.

Desarrollo de la cromatografía

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método

ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por
la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la
máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara, las parades se tapizan con papel
impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles
en las paredes, cosa que no debe olvidarse.

Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo, para
permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los
30 minutos. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos,
mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una
línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores
de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la más conveniente para
medir valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con
una corriente de aire caliente.

La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el

frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y
menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en una cámara que contenga
un gas inerte o aislada de la luz.

Localización de sustancias

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos

compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:

 Métodos químicos.
 Métodos físicos.
Métodos químicos

Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes
separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un
pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire
comprimido.

Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el reactivo revelador es

peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien
ventilada.

La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa fina no puede

realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí).

Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados
con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen
con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.

Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los
componentes orgánicos produciendo manchas negras.

El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.

Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:

 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

 Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
 Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
 Ninhidrina (para aminoácidos).

Métodos físicos.

El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que
al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la
longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay
componentes.

Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden
ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.

Constantes Rf Y Rx

La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un

compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un
componente. Se define como:
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la
mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean
reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase móvil,
fase estacionaria, cantidad de muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de
1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se
desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos,
puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el
contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.

Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con
el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En
este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino
indIcador ultravioleta.

También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que

tenga una posición de desarrollo conveniente; todos los demás compuestos sobre la placa se
relacionan con éste. De esta manera se tiene el , RX , ya que:

PARTE EXPERIMENTAL

SEPARACIÓN DE ASPIRINA, ACETOFENITIDINA Y CAFEÍNA POR

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Introducción
A menudo, la aspirina, acetofenitidinay cafeína se usan combinados en las preparaciones
analgésicas y antipiréticas. •La detección e identificación en tales preparaciones puede
hacerse por cromatografía de capa fina.

Material

Recipiente para desarrollo. •Portaobjetos. •Gelde sílice para cromatografía de capa fina.
Disolvente eluyente: mezcla de metanol absoluto, ácido acético glacial, éter dietílico y
benceno en la proporción volumétrica 1:18:60:120. •Disoluciones de aspirina,
acetofenitidina y cafeína en cloroformo con concentraciones de 5-10 mg/ml. •Reactivo
revelador: permanganato potásico 0,1N en ácido sulfúrico 0,05N. •Disolución mezcla de
composición desconocida.

Recipientes para el desarrollo

cubetas para cromatografía

Preparación de las placas

Limpiar dos portaobjetos (25x75 mm) con disolución de mezcla crómica, o con disolución
jabonosa, enjuagar minuciosamente con agua destilada y secar
Preparar una pasta formada por 15 g de gelde sílice G y 37 mlde agua, agitando bien con
una varilla.

Coger por sus extremos dos portaobjetos, juntos por sus caras más extensas, y sumergirlos
en la pasta separándolos a continuación. Debe quedar una capa fina y homogénea sobre
cada portaobjetos.
Dejar secar al aire

Una vez seco el gelal aire, colocar los portaobjetos en una estufa a 100ºCdurante una hora

Colocar los portaobjetos sobre la bandeja

Preparación Micropipeta

Abrir el gas para encender el mechero. Abrir la puerta

Girar las llaves de la derecha

Cerrado Abierto

Encender el mechero:
Girar el tornillo del mechero para dejar salir el gas y acercar la llama al mechero
Calentar el capilar de vidrio y estirar

Aplicación de la muestra

Aplicar en una de las placas la muestra de composición desconocida y una sustancia pura

En la otra las dos disoluciones restantes de las sustancias puras

Aplicar con una micropipetauna gotita de muestra a unos 12 mmdel extremo de la placa,
repitiendo pequeñas aplicaciones de la disolución en un punto y dejando que cada
incremento se seque antes de la nueva aplicación. La gota de muestra no debe tener más de
3 mmde diámetro.

Desarrollo cromatográfico
Se vierte el suficiente líquido eluyenteen el recipiente de desarrollo cromatográficopara que
entre en contacto con el extremo inferior del portaobjetos, pero sin llegar a tocar las
manchas de la muestra.

Tapar y dejar unos minutos para crear una atmósfera saturada de fase móvil
Colocar los portaobjetos en la cubeta y tapar

Cuando el frente del disolvente haya avanzado unos 50 mm, se saca de la cubeta y se rasga
cuidadosamente la superficie del portaobjetos para indicar la posición del frente del
disolvente. A continuación se deja secar al aire durante unos minutos para evaporar el
disolvente orgánico.

Revelado del cromatograma

Para ello colocar el portaobjetos seco en un papel de filtro

Pulverizar ese portaobjetos con la disolución de permanganato potásico mediante el frasco

pulverizador

Se calienta el portaobjetos en una estufa durante unos minutos.

Las muestras aparecen como manchas amarillo-verdosas en un fondo violeta.

La mancha de la cafeína es muy débil y algunas veces se distingue más fácilmente
observándola por la parte posterior, es decir, a través del vidrio.

Cálculos

Determinar el factor de retención (Rf) para las tres sustancias.

Dado que, en cromatografía de capa fina, los valores de Rf son reproducibles para unas
condiciones experimentales fijas, se utilizan los valores de Rf para localizar la posición de
cada componente en la placa donde se ha separado la mezcla desconocida.

Cálculos del factor de retención ( Rf) para cada una de las sustancias separadas