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Trabajo Práctico Nº7: Cromatografía
Objetivo General:
- Capacitar a los estudiantes en la técnica de la Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (high
performance liquid chromatography o HPLC), comprendiendo su uso como método de separación, identificación y cuantificación de sustancias.
Objetivo específico:
- Determinar la concentración de Furfural en una muestra mediante cromatografía líquida de alta
eficiencia.
Principio:
En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatográfica donde se encuentra la fase
estacionaria (pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto bajo determinadas condiciones cromatográficas. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Las fases móviles más utilizadas son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos. Particularmente, en el laboratorio se trabajará con HPLC de fase reversa (RP-HPLC), la cual consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la sílica tratada con RMe2SiCl (fase enlazada a la sílica), donde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. Técnica Operatoria: Se llevará a cabo la corrida cromatográfica de una muestra para determinar su concentración de furfural (se utilizará como referencia la curva de calibración previamente armada para este compuesto, bajo las mismas condiciones cromatográficas).
Cuestionario: Teniendo en cuenta lo realizado en el laboratorio
1) Explique la finalidad del uso del HPLC en el caso analizado.
2) Indique los valores que se utilizaron, en el caso estudiado, para las siguientes condiciones de análisis: - Composición de la fase móvil - Flujo de la fase móvil - Temperatura - Longitud de onda del detector 3) ¿Qué podría ocurrir al cambiar, por ejemplo, la composición de la fase móvil . 4) A partir del cromatograma obtenido indique: - Tiempo de retención del analito - Tiempo muerto - Tiempo de retención corregido - Factor de retención del analito 5) Esquematice las partes fundamentales que componen a un cromatógrafo HPLC indicando el recorrido de la fase móvil.
La cromatografía es una técnica utilizada en química y bioquímica para separar y analizar los componentes de una mezcla. En un ensayo de cromatografía, se utiliza una fase estacionaria y una fase móvil para separar