INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E

INVESTIGACIÓN

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL VIRUS DE LA

RABIA EN EL ESTADO DE MEXICO

QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD

PRESENTA
Q.F.B. FERNANDO GUADALUPE BASTIDA GONZÁLEZ

Directores de Tesis:

Dr. José Leopoldo Aguilar-Faisal

Dra. Paola Berenice Zárate-Segura
Noviembre, 2011
II
III
 Declaración de originalidad

“Yo declaro que esta tesis, así como los resultados en ella reportados, son
producto de mi trabajo y que hasta donde yo sé, no contiene material previamente
publicado o escrito por otra persona, ni tampoco contiene material que haya sido
utilizado para obtener algún grado o diploma en alguna otra institución educativa
excepto donde se reconoce como tal. Declaro igualmente que hago justo
reconocimiento en la tesis a las personas que contribuyeron con su trabajo y,
finalmente, declaro que esta tesis es producto de mi propio trabajo con el apoyo
permitido de terceros en cuanto a la concepción del proyecto, al estilo de la
presentación o a la expresión escrita.”

Fernando G. Bastida-González

Vo. Bo. del director o directores de tesis.

Dr. Leopoldo Aguilar-Faisal

Dra. Paola Berenice Zárate-Segura

IV
 Comité Tutorial

Dr. Leopoldo Aguilar-Faisal (1) (CO-DIRECTOR)

Dra. Paola B. Zárate Segura (1, 2) (CO-DIRECTOR)
Dra. Evangelina Muñoz
Dr. Eleazar Lara Padilla
Dr. Angel Miliar

(1) Laboratorio Medicina de Conservación, Escuela Superior de Medicina,

Instituto Politécnico Nacional, Colonia de Santo Tomás, México.
(2) Departamento de Bioprocesos, Unidad Profesional Interdisciplinario de
Biotecnolgía, Instituto Politecnico Nacional, Av Acueducto S/N La Laguna
Ticomán.

El trabajo de esta tesis se realizó en los laboratorios del departamento de

Medicina de Conservación (LMC) en la Escuela Superior de Medicina, en las
instalaciones del Laboratorio Estatal de Salud Publica del Estado de México, en
colaboración con la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del
Instituto Politécnico Nacional, bajo la Co-dirección del Dr. Leopoldo Aguilar-
Faisal y Dra. Paola Berenice Zárate-Segura.

Para el desarrollo de esta tesis de Maestría se tuvo el apoyo de beca PIFI y del
proyecto SIP No 20110501, así como recursos propios de la Dra. Paola B. Zárate
Segura.

V
 Índice

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1 Generalidades del Virus de la rabia 1

1.1.1 Estructura y clasificación 1

1.1.2 Patogenia 5

1.1.3 Replicación del virus de la Rabia 5

1.1.4 Vías de Infección 9

1.1.5 Tipos de Rabia 9

1.1.5.1 Rabia furiosa 10
1.1.5.2 Rabia paralítica 11
1.1.6 Rabia en Animales 12

1.1.7 Tratamiento 17
2. ANTECEDENTES 18

2.1 Antecedentes de la Rabia en México 19

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 27

4. JUSTIFICACIÓN 28

5. OBJETIVOS 29

5.1 Objetivo General 29

5.2 Objetivos Específicos 29

6. MATERIAL Y MÉTODOS 30

7. RESULTADOS 38

8. DISCUSIÓN 45

9. CONCLUCIONES 53

REFERENCIAS 54

VI
 Índice de Figuras

Figura 1. Representación esquemática del virus de la rabia 2

Figura 2. Genoma del virus de la Rabia 3
Figura 3. Ciclo de replicación del virus de la rabia 8
Figura 4. Fase clínica, duración promedio y toma de muestra 16
Figura 5. a) Muestra positiva a rabia por inmunofluorescencia 38
Figura 5. b) muestra negativa a rabia por inmunofluorescencia 38
Figura 6. A Alineamiento de secuencias del gen N del virus de la rabia 39
e iniciador RABN1 con Mega 5.0
Figura 6. B. Diseño de Iniciadores con el programa Vector NTI a partir 39
de las secuencias del gen N
Figura 7. Electroferograma de una clona 41
Figura 8. Análisis electroforético de los amplicones perro y murcielago 42
externos e internos.
Figura 9. Análisis electroforético de los amplicones vampiro y zorrillo 42
externos e internos.
Figura 10. Curvas melting de las variantes de acuerdo al hospedero. 43
Figura 11. Árbol taxonomico generado con el algoritmo neighbor- 44
joining.
Figura 12. Variantes antigénicas reportadas del estado de Mexico y su 45
distribución.
Figura 13. Árbol taxonomico generado con el algoritmo neighbor- 58
joining.

VII
 Índice de Tablas

Tabla 1: Genotipos del género Lyssavirus 5

Tabla 2: Tratamiento posexposición. 18
Tabla 3. Casos reportados de rabia en especies silvestres de 1996 al 23

2002.

Tabla 4(1). Variantes antigénicas identificadas en el país. 23

Tabla 5. Iniciadores para la detección de virus de la rabia en PCR 25
punto final.
Tabla 6. Iniciadores para la detección de genotipos de RABV en PCR 26
punto final.
Tabla 7. Iniciadores externos usados para la detección de las 41
variantes del virus de la rabia.
Tabla 8. Iniciadores internos usados para la detección de las 42
variantes del virus de la rabia
Tabla 9: Ensayos convencionales de PCR basados en análisis 49
electroforético para la detección de lissavirus.

VIII
RESUMEN

El Virus de la rabia es el miembro más diseminado y epidemiológicamente

importante del género lyssavirus y es el único taxón que sea documentado en el
Continente Americano. Varias variantes específicas del virus de la rabia se han
caracterizado de diferentes huéspedes mamíferos, como perros, zorros, coyotes,
mapaches, mofetas, así como numerosas especies de murciélagos frugívoros,
insectívoros y hematófagos. Hoy día, muchos de los estudios moleculares se han
enfocado al gen N, estos estudios han permitido tener una idea mas clara sobre la
relación virus- reservorio, los patrones de transmisión y difusión, así como la
evolución viral. El objetivo de este estudio fue determinar las variantes geneticas
de los virus de la rabia (RV) presentes en muestras del el Estado de México por
reservorio. Se utilizaron muestras de cerebro positivas a rabia por
inmunofluorescencia directa (IFD) y con una tipificación con anticuerpos
monoclonales (MABS) previa (INDRE). La detección por hnRT-PCR y RT-PCR
con Syber green se hicieron con el diseño de iniciadores propios del grupo de
trabajo Para confirmar la detección de productos de PCR fueron secuenciados e
identificados en BLAST de la base de datos NCBI. En la determinación de
variantes antigénicas con anticuerpos monoclonales para muestras de perro se
obtuvieron seis V1 Perro-mangosta, éste resultado concordó con el RT-PCR Y
SYBR GREEN con los iniciadores de perro en un 100%, así como la muestra
detectada en zorrillo con iniciadores de zorrillo. Por otra parte en las muestras de
bovino en donde la detección por MABS fue V8 zorrillo, el host determinado por
hnRT-PCR y sybr green fue positivo con los iniciadores de vampiro la muestra
determinada como atípica y en la muestra no determinada por MABS se logró la
detección por HnRT-PCR y sybr green dando positiva con los iniciadores
murcielago. Demostrando así la especificidad de la detección de variantes del RV
dependiendo del reservorio con la técnica propuesta en este estudio. Los
resultados obtenidos de nRT-PCR y SYBR Green coincidió con un 100% contra
IFD y el 80% con MABs.
IX
ABSTRACT
Rabies virus is the most widespread and epidemiologically important member of
the genus and the only taxon documented in America. Several specific Rabies
virus variants have been characterized from different mammalian hosts, such as
dogs, foxes, coyotes, raccoons, skunks, and multiple species of frugivorous,
insectivorous, and hematophagous bats. Nowadays, many molecular studies have
been performed targeting of the N gene, this data have permitted insights to virus-
reservoir relationships, patterns of transmission and dissemination, as well as viral
evolution. Brain samples were using in this study tested positive by FAT and
Monoclonal variants (INDRE) collected in Mexican State. hnRT-PCR and RT-PCR
Syber green detection were done with own primer design in complete sequence of
N gene rabies virus (genomic databases NCBI) concededly dog, skunk, non
hemetophage bat and vampire bat as host. To confirm detection PCR products
were sequenced and identificated in BLAST of the NCBI database. All of the brain
samples from rabid animals, diagnosed as positive in the FAT test, signaled
positive in the nRT-PCR and RT-PCR SYBR Green. To confirm the specificity of
the both methods, they were carried out with the additional genotype 1 prototype
laboratory strain CVS, used as a positive control. Real-time RT-PCR used primers
of internal semi-nested end-point RT-PCR.In the characterization of the antigenic
variants (AgV) with MABs in the dog sample, the dog primers identified the Variant
dog (AgV1). This result matched with both the nRT-PCR and SYBR Green primers
a 100%. Similarly, the skunk samples matched the same percentage with the
skunk primers. On the other hand, in the bovine samples where the MABs
detection identified the skunk Variant (AgV8), the determined host by nRT-PCR
and SYBR Green diagnosed as positive with the vampire primers. The last two
samples, the one determined as atypical and the one not determined with the
MABs, the nRT-PCR and SYBR Green diagnosed as positive with the bat primers;
proving thus the specificity of the RV variant detection depending on the host with
he present study proposal. nRT-PCR and SYBR Green detection matched a 100%
with the FAT and 80% with the MABs results.
1. INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades del Virus de la rabia

1.1.1 Estructura y clasificación

El virus de la rabia, es un microorganismo perteneciente a la familia

Rhabdoviridae, al genero Lyssavirus del orden de los Mononegaviroles, su

tamaño es aproximadamente de 180 nm de longitud, 75 – 80 nm de diámetro y de

6 a 7 nm de longitud, asemejando la forma de una bala de fusil (2).

EL genoma del virus de la rabia consta de 11,932 nucleótidos en la cepa modelo

del virus Pasteur (VP), tiene una región líder al inicio y una región terminal que se

considerna como parte final del genoma, la posición de los genes en el RNA de

cadena negativa es N, P, M, G y L en sentido 3´a 5´ y un pseudogene entre los

genes G - L denominado ψ (3), todos los genes codificantes tienen señal de inicio

de transcripción (TIS) y de terminación de transcripción (TTP) con poliadenilación

(Figura 1).

Figura 1. Genoma del virus de la Rabia. (Modificado de Aurelie et al. 2011).

Este virus está constituido por 5 tipos de proteínas representado en la Figura 2:

 RNA polimerasa o proteína L de 190 KDa

 Glicoproteína o proteína G de 65 a 80 KDa

 Nucleoproteína o proteína N de 58 a 62 KDa

1
  Fosfoproteína o proteína P de 35 a 40 KDa

 Matrixproteína o proteína M de 22 a 25 KDa

y un RNA no segmentado de cadena sencilla (4).

Glicoproteína Matriz 

Nucleoproteína Polimerasa Fosfoproteína

Figura 2. Representación esquemática del virus de la rabia.( Modificado de Matthias, 2010)

En la figura 2 se muestra la ribonucleoproteína interna (RNP), el núcleo esta formado por el
genoma RNA de cadena sencilla en sentido negativo encapsulado con la proteína de la
nucleocápside (N), la polimerasa asociada al RNA del virión (L) y la fosfoproteína (P)., El núcleo de
RNP en asociación con la proteína matriz (M) se condensa en la típica forma de partículas bala
que es característico de rabdovirus, sobre la bicapa lipídica (o membrana) la glicoproteína de
superficie trimérica en forma de picos (G) se encuentra anclada de manera circundante a la
estructura de RNP-M.

Los Lyssavirus, al igual que otros rabdovirus están constituidos principalmente de

RNA (2-3%), proteínas (67-74%), lípidos (20-26%) y carbohidratos (3%) como

componentes integrales de su estructura (5). El genoma de RNA viral es de

cadena sencilla, no segmentado y de polaridad negativa (6), éste constituye la

columna vertebral de la fuerza en espiral helicoidal del complejo RNP (RNA

2
además de proteína) central, que se extiende a lo largo del eje longitudinal de la

partícula del virus en forma de bala. El RNA viral tiene un arreglo en espiral dentro

del núcleo del complejo RNP (proteinas N, P y L), éstos se encuentran rodeados

por las proteínas de la membrana viral, M y G, y una mezcla de los componentes

de las lipoproteínas derivados de la membrana celular que forman la envoltura

exterior o de la membrana " matriz "de la partícula del virus (7).

En la actualidad para el estudio de los lyssavirus la Organización Mundial de la

Salud (OMS) reconoce nueve genomas completos de cepas del genotipo 1: Virus

Pasteur (VP), Street Alabama Dufferin (SAD)-B 19, RC-HL, Nishigahara, SRV9,

Ni-CE, HEP-Flury, Virus de la Rabia de los Murciélagos de pelo plateado-18

(SHBRV-18) y RABV(8).

El virus de la rabia y los genotipos conocidos como "rabias relacionadas" con

lyssavirus en general son virus altamente neurotrópicos en la infección de

mamíferos (animales y humanos) y causan encefalomielitis fatal, han sido aislados

de tejidos cerebrales de animales postmortem aún en estado de descomposición

(9), es resistente a la desecación y puede soportar ciclos repetidos de congelación

y descongelación (2).

El virus de la rabia es el prototipo del género Lyssavirus del genotipo 1 (antes

denominado serotipo 1), otros virus relacionados son: Los virus Lagos bat (LBV, el

genotipo 2/serotipo 2), Mokola (MOKV, el genotipo 3/ serotipo 3), Duvenhage

(DUVV, el genotipo 4/ serotipo 4), Europan bat lyssavirus tipo 1 (EBL-1, el

genotipo 5), Europan bat lyssavirus tipo 2 (EBL-2, genotipo 6) y Australian bat
3
lyssavirus (ABLV, genotipo 7), Los lyssavirus recién aislados de murciélagos,

como el Irkut (IRKV), West Caucasian Bat (WCBV) (10, 11) , Aravan (ARAV),

Kjuhand bat (KHUV) y Shimoni bat (SHIBV), Esta variedad de virus refleja la

diversidad genotípica que tiene el género Lyssavirus (Tabla 1), además

presentan altos niveles de homologia en la secuencia de nucleótidos y

aminoácidos en los genes G y N (12), (13, 14).

Tabla 1: Genotipos del género Lyssavirus.

Distribución
Lyssavirus Abreviatura Filogrupo Reservorio
Geográfica
Cosmopolita
excepto en
Australia,
Rabia virus Perros, zorrillos y Inglaterra, Irlanda,
RABV 1
(prototipo) murcielagos Nueva Zelanda,
Japón, Antartida,
Escandinava y
Hawai
Murciélagos
Aravan virus ARAV 1 Eurasia
insectívoros
Murciélagos
Australian bat
ABLV 1 insectívoros y Australia
lyssavirus
frugívoros
Duvenhage Murciélagos
DUVV 1 Africa
virus insectívoros
European bat Murciélagos
EBLV-1 1 Europa
lyssavirus 1 insectívoros
European bat Murciélagos
EBLV-2 1 Europa
lyssavirus 2 insectívoros
Murciélagos
Irkut virus IRKV 1 Eurasia
insectívoros
Murciélagos
Khujand virus KHUV 1 Eurasia
insectívoros
Murciélagos
Lagos bat virus LBV 2 Africa
insectívoros
Murciélagos
Mokola virus MOKV 2 Africa
insectívoros
West Caucasian Murciélagos
WCBV 2 Eurasia
Bat virus insectívoros
Shimoni bat Murciélagos
SHIBV 2 Kenya
virus insectívoros
4
 Modificado de fooks et al. 2010

1.1.2 Patogenia

Este virus utiliza a la proteína G para unirse a las células huésped e inicia las

relaciones entre ambos al unirse a los receptores celulares. Se cree que esta

proteína determina el tropismo y la patogenicidad del virus, ademas junto con la

proteína M está implicada en la formación de la envoltura vírica y en la producción

de viriones. La proteína G es también un blanco de los linfocitos T y de los

anticuerpos neutralizantes del virus (15, 16). La proteína N funciona como

superantígeno indica que contiene lugares de unión tanto para el receptor de los

linfocitos T como para los antígenos de clase II del complejo mayor de

histocompatibilidad (17). La proteína P interactúa con la proteína N evitando su

autoagregación, y con el complejo proteína RNA-N, para facilitar el inicio de la

transcripción y la elongación de la cadena por la RNA-polimerasa (proteína L)(18,

19). Además, estabiliza la proteína L y participa en la encapsulación del RNA.

Entre las funciones de la proteína M se encuentran el ensamblaje del virus,

participación en el mecanismo de exositosis y en la regulación de los niveles de la

transcripción. Por último, la proteína L dirige la transcripción y replicación del RNA

viral (Figura 2) (3, 7, 20).

1.1.3 Replicación del virus de la Rabia

El virus de la rabia se replica en el citoplasma de la célula (Figura 3), en presencia

de la proteína L ó RNA polimerasa dependiente de RNA (función de transcriptasa

5
y replicasa) requiere de la maquinaria de traducción de proteínas y síntesis de

nucleótidos, aminoácidos y lípidos de la celula (4, 19).

1.1.3.1 Ciclo de replicación

El virus entra en la celula a través de pozos revestidos (viropexis) o por receptores

de superficie celular 1, mediado por la glicoproteína viral (G) la fusión con la

membrana celular (endocitosis) 2. Después de la internalización, una proteína

celular de la mebrana del endosoma bombea inoes H+ desde el citosol hacia el

interior del endosoma, la disminución consecuente del pH endosomico induce un

cambio de conformación en la glicoproteína viral, conduciendo a la fusión de la

envoltura viral con la bicapa lipídica endosomica y a la liberación de la

nucleocapside helicoidal (NC) de la RNP en el citosol 3 y 4. La RNA polimerasa

viral utiliza ribonucleósido trifosfato en le citosol para replical el RNA viral y

sintetizar los mRNA virales. Los cinco genes estructurales (N, P, M, G y L) del

RNA del genoma en la NC se transcriben en cinco cadenas de RNA mensajeros

positivos monocistronicos y una cadena completa replicativa (antigenoma). El RNA

sirve como plantilla para la replicación del genoma de la progenie (- cadena) de

RNA 5 y 6. Las proteínas (N, P, M y L) se sintetizan a partir de sus respectivos

mRNA en los ribosomas a la membrana en el citoplasma y la G se sintetiza a partir

del G-mRNA en los ribosomas unidos a la membrana (retículo endoplasmático

rugoso) 7. El carbohidrato se adiciona al dominio mayor plegado dentro de la luz

del retículo endoplasmico es modificado a medida qu el amebrana la glicoproteína

asociada pasan atravez del aparato de Golgi (4, 21)8. Las vesículas con la
6
glicoproteína madura se fusionan con la membrana plasmática de la célula y

depositan la glicoproteína viral sobre la superficie de la célula con el dominio

mayor de unión al receptor por fuera de ella 9. Mientrastanto otros mRNA virales

son traducidos sobre ribosomasde la célula huésped a proteínas de la

nucleocápside, proteínas de la matriz y RNA polimerasa 10 (4, 22). Algunos de los

complejos moleculares NP producen cuerpos de inclusión citoplasmáticos

(cuerpos de Negri), en vivo y algunos complejos de NP encapsidan la cadena de

RNA viral. Después de la progenie del genoma de RNA es encapsulado por el

complejo de proteínas NP y la proteína L se incorpora a la forma RNP progenie,

las estructuras de la proteína M se une a la RNP y se condensa el RNP en la

estructura de 'esqueleto' 11. Las estructuras de esqueleto interactuar con las

estructuras de proteínas G trimérica anclada en la membrana plasmática y se

ensamblan para formar las partículas de virus que brotan de la membrana

plasmática de la célula infectada hacia el espacio extracelular o intersticial

adyacente 12 y 13 (3, 23).

7
Figura 3. Ciclo de replicación del virus de la rabia

1.1.4 Vías de Infección

Las vías de infección que presenta el virus para especies suceptibles son por
transmisión transcutánea, epidérmica, aérea y digestiva (24). Las vías
transcutánea y aérea están altamente relacionadas con el mecanismo de
transmisión que mantiene el ciclo enzoótico de la enfermedad. Se consideran
vías accidentales la aérea y digestiva . La velocidad con la que se manifiestan los
signos y síntomas de la rabia depende de las características biológicas de la cepa
del virus que infecta como son: la concentración de receptores para el virus en las
células nerviosas del músculo esquelético, la magnitud del inóculo, la inervación
nerviosa en el sitio de entrada y la proximidad de la lesión al Sistema Nevioso
Central (SNC)(25).
8
Cuando la vía de entrada del virus es transcutanea o epidérmica, éste se localiza
en el sitio de inoculación durante un tiempo variable, durante ese tiempo puede
suceder una primera replicación en las células nerviosas de la placa
neuromuscular más cercanas a la herida, en general al inicio las células donde se
multiplica el virus son parte de los nervios sensores y motores que inervan el sitio
de la infección (26), una vez que el virus alcanza el SNC la infección es
irreversible y por último la muerte del individuo (27).

1.1.5 Tipos de Rabia

La rabia por su sintomatología se clasifica en furiosa y en paralítica. Aunque el

agente etiológico es el mismo un animal rabioso puede desarrollar cualquiera de

estas formas, L. Pasteur demostró que si la infección radica en el cerebro, el

animal desarrolla rabia furiosa, y cuando radica en la medula ósea presenta la

forma paralítica (28).

1.1.5.1 Rabia furiosa

La rabia furiosa pasa por tres fases clínicas: la prodrómica, la excitativa y la

paralítica, algunas veces son muy precisas y otras muy vagas. Se le llama rabia

furiosa cuando prevalece la fase excitativa(29).

Fase prodrómica o melancólica

Esta fase puede durar en promedio de 12 horas a 3 días. Los pródromos son un

cambio de carácter y de conducta. Los perros en esta fase se tornan raros,

caprichosos, nerviosos, irritables, miedosos, inquietos y cariñosos. Cuando el

dueño nota algunos de estos comportamientos anormales en su perro es

9
recomendable aislar al perro para su observación de 15 días ya que la mascota

puede estar desarrollando un cuadro de rabia(15, 29).

También se pueden observar alteraciones en sus hábitos de obediencia, afecto y

apetito. En algunos casos caminan agitados de un lado a otro, se lamen

constantemente y muerden o rascan violentamente el lugar donde fueron

mordidos y pueden llegar hasta automutilaciones del rabo y las extremidades. La

sed puede aumentar considerablemente pero no puede beber agua, por la

parálisis de faringe. Se puede observar dificultad de defecación, de orinar y un

aumento en el deseo sexual. Lame constantemente sus genitales, hay un ligero

aumento de temperatura, dilatación pupilar y reflejo corneal lento (30).

Fase excitativa o furiosa

Esta fase dura de uno a siete días y disminuye la dificultad de diagnosticar. El

perro tiende a morder personas, animales y objetos. Se vuelve mas irritable,

inquieto y nervioso, deglute sustancias extrañas a su alimentación. Cambia su

respiración, lo que causa que la saliva tenga un aspecto espumoso, también hay

un cambio en el ladrido, tiende a huir, anda errante sin rumbo fijo y puede recorrer

grandes distancias.La expresión de la cara refleja recelo ó miedo, la mirada es fija

con dilatación pupilar. Al final de esta fase se presentan convulsiones e

incoordinación muscular. El perro puede morir a causa de los ataques

convulsivos, en caso de sobrevivir pasa a la fase paralítica (29, 31).

Fase paralítica

En esta fase dura de 5 a 10 dias y se observa la parálisis de la mandíbula causada

por la parálisis de los músculos de la masticación, evitando que el animal coma y

10
beba. Hay escurrimiento de la saliva. La parálisis también afecta al intestino, vejiga

y cola. El abatimiento y la debilidad aumentan sin cesar muriendo el animal por

parálisis cerebral y por agotamiento general. Los animales enflaquecen hasta

quedarse en los huesos, se les eriza el pelo, emiten un ruido como si se

estuvieran ahogando, lo cual puede confundir al dueño como si tuviera un hueso

atorado en la garganta (25, 32, 33).

1.1.5.2 Rabia paralítica

La rabia paralítica también se le conoce como rabia muda. Esta se caracteriza por

presentar una evolución mas rápida que la forma furiosa, el animal muere dentro

de los 4 días de iniciar los síntomas, el periodo prodrómico es más rápido y

predomina la forma paralítica. El animal presenta una parálisis de la mandíbula,

esta se encuentra caída, con la boca abierta y la lengua colgando, aunque la

mandíbula este paralizada y por tanto el animal esta imposibilitado a morder, pero

con los dientes puede causar lesiones ya que en muchos casos mantienen la

agresividad (33, 34).

1.1.8 Rabia en Animales

El virus de la rabia produce una encefalitis aguda en los animales y su final es

letal. Todos los vertebrados de sangre caliente pueden contraer rabia y sus

reservorios del virus son los carnívoros y los quirópteros. En los animales de

sangre caliente el periodo de incubación depende de la cantidad de virus

inoculado a través de mordeduras ó lameduras de superficies excoriadas, el sitio

11
de la mordedura o excoriación y el tratamiento dado a las heridas entre otros

factores (28, 35).

La distribución geográfica de una población viral asociado a su hospedero esta

determinada por la gama de la especie animal, así como los aspectos de la

biología del hospedero que determina el grado de interacción entre los diferentes

subpoblaciones del hospedero. La relación virus-hospedero por un largo tiempo

aísla al virus de las demás poblaciones y esto lleva a tener un virus con

marcadores distintivos que pueden ser utilizados para diferenciar de otras

poblaciones del virus de la rabia(36).

Un evento de efecto colateral ocurre cuando el virus de la rabia se mantiene en un

reservorio satisfactoriamente e infecta a otra especie animal la cual por sus

características biológicas no favorece la propagación del virus interrumpiendo el

ciclo de transmisión. Sin embargo puede ocurrir un evento donde inicie una

nueva relación virus-hospedero en donde la propagación y la transmisión sean

satisfactorias dentro de la nueva especie hospedera de manera que la nueva

especie se convierte en un reservorio de la rabia. "salto de especie” por lo general

se asocia con algún nivel de adaptación viral a su nuevo huésped lo que daría

lugar a la aparición de una población viral distinta y por lo tanto un nuevo

linaje(37).

Un linaje viral dado se asocia siempre a una especie animal en particular,

conocido como el reservorio esto se debe a la eficiencia con que el virus se

propaga por los individuos de esta especie animal y de la transmisión entre sus

congéneres(37).
12
 Rabia en perros

El perro es considerado como la especie prototípica para la rabia y fue descrita

desde la antigüedad. El perro puede manifestar cualquiera de las formas de rabia,

aunque es más frecuente la rabia furiosa (38). El periodo de incubación

generalmente es menor de 60 días puede variar de 7 días hasta 6 meses. En

perros infectados experimentalmente los periodos de incubación han sido de 9 a

42 días(29).

Rabia en bovinos (Derriengue)

La rabia bovina paralítica es conocida por los ganaderos en las áreas afectadas

como: derriengue, mal de caderas o rabia paresiente.

La mayoría de los casos de rabia bovina se deben a que son mordidos por

vampiros en el cuello, detrás de las orejas, la punta de la espaldilla, vulva y en la

región cercana a la pezuña. El periodo de incubación va de 4 a 6 semanas. El

bovino rabioso golpea el suelo con las pezuñas, la mirada es generalmente feroz,

los ojos dan la sensación que van a salirse de las orbitas.

Las conjuntivas se encuentran muy enrojecidas, mugen sin cesar con alteración

en la voz, bostezos constantes durante horas, arqueamiento del dorso y parálisis,

por lo general enflaquecen y mueren a los 4 o 6 días(39).

Rabia en murciélagos

Se considera que de las especies de murciélagos hematófagos, el de mayor

importancia como transmisor es el Desmodus rotondus, sin embargo, se ha

logrado aislar virus rábico de murciélago no hematófago.

13
El periodo de incubación es muy variable observando valores entre 9 y 171 días,

se pueden presentar indistintamente la forma furiosa y paralítica(40).

En el periodo prodrómico que va de 12 a 24 horas el animal esta inquieto, se irrita

fácilmente, presenta temblores musculosos, algunas veces apático y sin apetito,

después pasa una fase de excitación y furia que dura aproximadamente 5 días, en

el cual retorna a los hábitos normales. Se observan cambios de hábitos como es

volar en horas diurnas, atacan a los humanos, presentan parálisis en las alas y/o

patas, sobreviniendo la muerte(41).

El virus rábico se elimina durante un tiempo variable. Un murciélago puede ser

portador del virus, en estado latente durante uno a dos años, por lo cual, la rabia

en murciélagos es un problema independiente de los ciclos infecciosos de otros

mamíferos (42).

Rabia humana

La rabia humana es considerada como un accidente ya que el humano no es

reservorio del virus rábico (43).

El humano es poco susceptible a la rabia, el riesgo de que se desarrolle rabia en

una persona expuesta en un animal rabioso varia de acuerdo a muchos factores

como son: lugar de la mordedura, entre mas cerca del SNC mayor es el riesgo de

contraer la enfermedad, del inoculo y si el paciente recibe algún tratamiento

después de la exposición, entre otros.

En el hombre se distinguen 5 periodos en la rabia clínica: incubación, pródromos,

fase neurológica aguda, coma y muerte (44)

Periodo de Incubación
14
Los periodos de incubación del virus rábico en el hombre varían según la distancia

que exista entre el sito de lesión y el SNC. La duración promedio es de 20 a 60

días y es más corto cuando el sitio de mordedura está en la cabeza o cuello.

Durante este periodo la persona está bien por lo general, fuera de las molestias

que ocasiona la lesión, aunque se han observado algunos síntomas inespecíficos

tales como: malestar general y fiebre (45).

Pródromos

Los síntomas característicos en este periodo son: fiebre, fatiga, cefalalgia,

ansiedad, insomnio y depresión, en algunos casos se llegan a presentar

escalofríos, nauseas, vómitos, diarrea y síntomas locales en el sitio de la lesión

(44).

Fase Neurológica aguda

En esta fase el paciente desarrolla signos de afección al SNC como son:

hiperactividad, alucinaciones, desorientación, rigidez de la nuca y comportamiento

desordenado. Esta fase dura de 2 a 10 días (46).

Coma y Muerte

Esta fase puede durar horas y hasta meses. El paciente presenta paro

respiratorio, seguido de coma y después expira. Durante la fase del coma llegan a

desarrollarse varias complicaciones que causan la muerte al paciente. El

diagnóstico de rabia antes de la muerte del paciente puede establecerse por la

detección de material fluorescente (virus específico) en biopsia de piel, aislamiento

viral en saliva o la presencia de anticuerpos en suero o LCR en los pacientes que

no habían sido vacunados. Desafortunadamente, el uso de la vacuna antirrábica o

15
de inmunoglobulina específica no mejora el pronóstico una vez aparecidos los

síntomas (Figura.4) (27, 47, 48).

LCR: liquido cefalorraquídeo. BCC: biopsia de cuero cabelludo. IC: impronta de córnea.

Figura 4. Fase clínica, duración promedio y toma de muestra. InDRE, 2005.

1.1.9 TRATAMIENTO

Vacunación preexposición

La vacunación preexposición está indicada en personas que están expuestas al

virus rábico en el laboratorio o que tienen contacto con mamíferos, incluyendo

murciélagos (OPS-OMS, 2001).

Vacunación Postexposición

16
La profilaxis postexposición correcta implica: limpieza cuidadosa de la herida,

administración de gammaglobulina cuando esté indicada y vacunación.

La limpieza de la herida debe realizarse con agua abundante al menos durante 5

minutos como medida importante del tratamiento local. Además debe

Desinfectarse la herida con alcohol al 70%. De acuerdo a los criterios de la OPS-

OMS 2001 (Tabla 2) se administrará la vacuna y se aplicará inmunoglobulina

antirrabica según el tipo de exposición (49).

Tabla 2: Tratamiento postexposición.

Categor Tipo de contacto con animal Tratamiento

ía sospechoso de rabia, Recomendado
con rabia confirmada o no
posible observación

I Tocar o alimentar animales Ninguno (si se tienen datos fiables

No Lameduras sobre piel intacta sobre la circunstancias de la
exposición exposición)

II Mordisco de piel descubierta 1. Tratamiento inmediato y correcto

Exposición Arañazos o erosiones leves sin de la herida
Menor sangrado 2. Vacunación inmediata
Lameduras sobre piel no intacta - Suspender si el animal sigue sano
después de 10 días de observación
veterinaria
- Suspender si las muestras
analizadas del animal son negativas,
en diagnóstico directo en Laboratorio
de Referencia

III Contaminación de membrana 1. Tratamiento inmediato y correcto

Exposición mucosa con saliva (lamedura) de la herida
Grave mordeduras o arañazos 2. Vacunación inmediata (suspender
transdérmicos sencillos o igual que en la categoría II)
múltiples 3. Inmunoglobulina antirrábica

Fuente: OPS-OMS, 2001.

17
2 ANTECEDENTES

La rabia es una de las enfermedades más antiguas de Europa y Asía en la

actualidad hay rabia en más de 150 países y territorios aledaños. Cada año más

de 55.000 personas mueren de rabia en todo el mundo de estos el 40% son

menores de 15 años mordidos por animales presuntamente rabiosos (50, 51).

Los pocos casos de rabia humana originasios en Europa, ocurren sobre todo en

los países del este donde la rabia canina es importante (menos de 10 casos por

año), de manera excepcional, las personas infectadas en regiones donde la rabia

es endémica (África, Asia) desarrollan la enfermedad en un país europeo(52, 53).

En Asia se tiene la mayor cantidad de casos de rabia en humanos y el principal

reservorio de la rabia es el perro, el número estimado de muertos es del orden de

40.000 al año (cifra superior al número oficialmente declarado), lo que representa

más del 95% de todos los casos mundiales. En países como China, Indonesia,

Malasia y Tailandia han establecido programas nacionales de lucha contra la rabia

lo que ha reducido el número de víctimas fatales de manera significativa (54).

En África, el perro continúa siendo el principal reservorio de rabia (alrededor del

90%). Más de 4.000 casos de rabia animal han sido diagnosticados, pero solo

reflejan una parte de la situación de la rabia en África(OMS,2010).

En África el perro es el principal reservorio de rabia (alrededor del 90%), la

detección de rabia en animales son más de 4.000 casos por año que reflejan

18
una parte de la situación de la rabia en África (OMS,2010), de 100 a 200

personas mueren de rabia cada año, en la mayoría de los casos, el diagnóstico es

únicamente clínico. Sin embargo al igual que en Asia, hay una subestimación del

número de casos de rabia(54).

En los Estados Unidos de América y Canadá, los casos de rabia humana son tras

la exposición a murciélagos, zorros, mapaches, mofetas, chacales, mangostas y

otros huéspedes carnívoros salvajes, en america latina los casos de rabia humana

se han reducido en un 91% debido a los programas de vacunación y esterilización

canina (54).

2.1 ANTECEDENTES DE LA RABIA EN MÉXICO.

La rabia en México no fue introducida por los conquistadores, ya existía en su

reservorio murciélago. Los mayas ya tenían deidificación del murciélago el cual

llamaban Tzotz, (dios murciélago) a quien le atribuían la muerte de los hombres

que por su conducta el dios murciélago castigaba con la hidrofobia y estaban

destinados a morir de sed (55).

Las primeras descripciones de rabia datan del siglo XV, en el año 1514 Fernando

de Ovieron en la Conquista del Darien, describe que muchos soldados murieron al

ser mordidos por murciélagos y que los indios conocían la cura, la cual consistía

en lavar la herida con agua caliente y colocar una brasa encendida para cauterizar

la herida. En 1527 Molina Solís, relata que cuando las tropas de Francisco de

Montejo conquistan la península de Yucatán, mientras dormían fueron atacados

por una gran cantidad de murciélagos, no sólo a hombres sino también a las
19
bestias (56). Las primeras medidas de contención fueron en 1553 con la

construcción de un Hospital General de los Indios en San Juan de Letran, el cual

contaba con una sala especial para enfermos de hidrofobia, no obstante cerró sus

puertas en 1882 y fue demolido en 1933 para ampliar el eje vial Lázaro

Cárdenas.(55)

La primera epizootia de rabia en la Ciudad de México data de 1709 que inicia en

los perros callejeros de la ciudad afectando al ganado y a humanos. El día 20 de

enero de 1888 el Dr. Eduardo Liceaga recibe del propio L. Pasteur la vacuna

antirrábica y México fue el primer país de Latinoamérica en contar con la vacuna,

la cual estuvo a cargo del Dr. Cervera del Consejo de Salubridad (55).

La vacuna de cerebro de ratón lactante para uso humano se aplicó a partir de

1967, y se introdujo al sector salud el uso de la inmunoglobulina antirrábica

humana en 1973; en otros estudios relevantes en mujeres embarazadas y con

rabia se demostró que el virus de la rabia no se transmite por cordon humbilical

por la ausencia de teratogenicidad durante la gestión (54).

Los primeros diagnósticos realizados fueron por inmunofluorescencia en 1960 en

encéfalos (55) e impresión corneal para diagnostico de rabia en humanos.

En la actualidad, se han abierto centros antirrábicos y de diagnostico del virus de

la rabia asi como la creación de una norma Mexicana para el control y prevecion

de la rabia y en algunos centros de diagnóstico se están tipificando las variantes

antigénicas del virus de la rabia con el fin de tener un mejor control epidemiológico

(57).

20
En México la rabia humana se transmite principalmente por agresión de perro. Se

presentaron 1713 casos de rabia humana en el país de 1970 a 1997, de los cuales

1395 fueron ocasionados por mordedura de perro (80.5%), 126 por agresión de

quiróptero (7.27%) y 310 por otras especies (11.23%) (58). De acuerdo a la NOM -

011 - SSA -1993, se establece que la vacunación antirrábica es obligatoria para

perros y gatos(59).

La rabia silvestre es un problema que requiere métodos de control especializados,

el sistema nacional de vigilancia epidemiológica (SINAVE) reporta entre 1996-

2002, 112 casos positivos de rabia, en la Tabla 3 se muestran especies

afectadas(60).

Tabla 3. Casos reportados de rabia en especies silvestres de 1996 al 2002.

Especie casos reportados de rabia %

Agutí 2 1.8
Ardilla 1 0.9
Ciervo 4 3.6
Coatí 1 0.9
Coyote 2 1.8
Felinos salvajes 3 2.7
Mapache 7 6.2
Marsupial 4 3.6
Tejón 3 2.7
Quiróptero 52 46.4
Zorrillo 26 23.2
Zorro 7 6.2
Total 112 100%
Fuente: (Boletín de vigilancia epidemiológica de la rabia en las Américas., 2002)

21
Las variantes antigénicas identificadas en el país mediante anticuerpos

monoclonales dirigidos a la proteína N de los virus de la rabia identificados en el

país, son las que se muestran en la Tabla 4(57).

Tabla 4. Variantes antigénicas identificadas en el país.

Especie Variante Antgénica (Vag)

animales domésticos Vag – 1

felinos salvajes Vag – 7

Quiróptero Vag – 3, Vag - 4, Vag - 9, Vag – 11

Zorrillos Vag – 8, Vag - 10

Zorros Vag – 7

(Velasco-Villa, et al., 2002)

La técnica de los anticuerpos monoclonales es una excelente herramienta para

conocer las variantes que circulan en el país, además permite conocer el origen y

diseminación de los focos y/o brotes rábicos (57).Se ha encontrado que se

obtienen resultados similares al método de RT-PCR (61).

La rabia silvestre se encuentra fluctuante, por lo cual es importante contar con un

buen sistema de vigilancia epidemiológica y para ello se cuentan con diversas

técnicas estandarizadas y reconocidas por la WHO para el diagnostico de la rabia

por ejemplo:

Las de diagnostico como la inmunofluorescencia directa (IFD), inoculación en

ratón y el cultivo celular, el tiempo de resultados es de 2 horas , 4 y 28 días

respectivamente (1) (62).

22
Existen algunos ensayos serológicos como la neutralización de focos fluorecentes

y la inhibición de focos fluorescentes, los ensayos serológicos no son

aptos como herramientas de diagnóstico de la rabia para los exámenes rutinarios

ya que solo detectan la presencia de anticuerpos más no de la infección además

de que la respuesta inmunológica es diferente en cada individuo(63).

Sin embargo existen otros métodos que caracterizan atributos antigénicos del

virus que permiten identificar las variantes responsables de epizootias y casos de

rabia tanto en humanos como animales de los cuales no se cuenta o se

desconoce información(64).

Los anticuerpos monoclonales permiten realzar análisis antigénicos comparativos

de las variantes del virus de la rabia, además ayudan para realizar estudios de

prevalencia relativa, distribución y la transmisión de la rabia entre diferentes

especies tanto salvajes como urbanas(57).

La caracterización de las variantes antigénicas del virus de la rabia ha sido útil

para comprender la epidemiología de la rabia humana especialmente en casos

donde no hay antecedentes de exposición, como puede ocurrir en lugares donde

la rabia canina esta controlada(65).

Actualmente hay una serie de pruebas moleculares que se pueden utilizar para

complementar pruebas convencionales de diagnóstico de la rabia con un alto

rendimiento y en poco tiempo (63).

Para fines de diagnóstico, lo ideal sería que la PCR que pueda amplificar con

éxito todos los miembros del género Lyssavirus; en consecuencia, las secuencias

altamente conservadas a nivel de género que deben dirigirse los iniciadores son el
23
gen N Puesto que es una de las regiones más conservadas del genoma de los

lyssavirus(66).

En la tabla 5 y 6 se presentan los iniciadores que se han utilizado para el

diagnostico de rabia por lo que podemos observar que solo hay diseños para

detectar rabia y sus genotipos mas no rabia y sus variantes genéticas de acuerdo

a su reservorio(63).

Tabla 5. Iniciadores para la detección de virus de la rabia en PCR punto final.

24
PCR Nombre Direccion Secuencia Detalles Posicion Amplicon Año
semianidado 20R R AGCTTGGCTGCATTCATGCC 2004
21F F ATGTAACACCCCTACAATG 55–73 210
23F F CAATATGAGTACAAGTACCCGGC 122
anidado RabN1 F GCTCTAGAACACCTCTACAATGGATGCCGACAA 1ra vuelta 59–84 1477 1998
RabN5 R GGATTGAC(AG)AAGATCTTGCTCAT 1514–1536
RabNF F TTGT(AG)GA(TC)CAATATGAGTACAA 2da vuelta 135–156 762
RabNR R CCGGCTCAAACATTCTTCTTA 876–896
semianidado P510 F ATAGAGCAGATTTTCGAGACAGC 510-531 2002
P942 R CCCATATAACATCCAACAAAGTG 1ra vuelta 965-942 455
P784 R CCTCAAAGTTCTTGTGGAAGA 2da vuelta 805-784 295
estandar N1161 F AAGAACTTCAAGAATACGAGGC 1161-1182 418 2001
N1579 R TTCAGCCATCTCAAGATCGG 1579–1560
estandar 113 F GTAGGATGATATATGGG solo RT 2002
509 F GAGAAAGAACTTCAAGA 377
304 R GAGTCACTCGAATATGTC
estandar F ACTGATGTAGAAGGGAATTG gen N 533 2001
R GAACGGAAGTGGATGAAATA
F TAATCCCAGAGATGCAAT gen G 406
R CCTCACAGTCTGGTCTCACC
anidado Primer1 F GAAGCCTGAGATTATCGTGG 1ra vuelta 63–82 304 1999
Primer2 R CCCTTCTACATCAGTACG 349–367
da
Primer3 F TGAGTACAAGTACCCTGC 2 vuelta 90–107 139
Primer4 R GGAACATACATCGTCAGG 229-211
anidado N1 F TAGGGAGAAGGATCGTGGAGCACCATACTCTCA 611-632 179 2008
N2 R GATGCAAGGTCGCATATGAGTACCAGCCCTGAACAGTCTTCA 790-769
estandar N12 F GTAACACCTCTACAATGG 57-74 1998
N40 R GCTTGATGATTGGAACTG 1368-1349
anidado N1 F TTTGAGACTGCTCCTTTT 1997
N4 R GCTTGATGATTGGAACT
JW4 F AGAATGTTTGAGCCACGGCA
JW5 R TCAGGTGAAACCAGAAGTCC
Modificado de: Fooks et al 2009l

Tabla 6. Iniciadores para la detección de genotipos de RABV en PCR punto final.

25
Genotipo PCR Nombre Direccion Secuencia Detalles Posicion Amplicon Año
EBLV-1 semianidado N1001fw CAGAGTTGTGCACCCCATGAA 1061-1081 475 2008
1066fw GAGAGAAGATTCTTCAGGGA 1136–1155 400
304rv TTGACAAAGATCTTGCTCAT 1517-1536
anidado N1161 F AAGAGCTACAGGATTACGAGG 1ra vuelta 1161-1181 373 2004
N1534 R GACAAAGATCTTGCTCATGA 1534-1514
EBLV-1nF F TTGGCAGATGATGGGACAGT 2da vuelta 1211-1230 216
EBLV-1nR R TCCCTTATCTAATCAGGGGA 1427-1408
EBLV-2 anidado EBLV-2F F TCATGGTCAATGGGGGAAAG 1ra vuelta 1226–1245 229 2004
EBLV-2R R TTGGGATGGAGCAGGAAGAG 1455–1436
EBLV-2nF F CAAAAATCCCACATCAAAAG 2da vuelta 1249–1269 180
EBLV-2nR R TCTTAGTTTTTTTCTTTCCCC 1429–1409
LBV anidado LagNF F GGGCAGATATGACGCGAGA 2006
LagNR R TTGACCGGGTTCAAACATC
LBV,WCBV, MOKV anidado N1F F ATGGAKTCWGAMAASATTGT 1ra vuelta 71-90 595 2008
N550B R GTRCTCCARTTAGCRCACAT 647-666
N70F F GAYCAATATGARTATAARTA 2da vuelta 140-159 439
N490B R TCCATYCTRTCTGCWACATT 560-579
WCBV anidado F AATATCCTGCCATTACAGATTA 1ra vuelta 165-177 606 2008
R TCATATGCAGTGACAACTGTGC 1ra vuelta 750-771
F ATGATGTGTGCTCCTATCTAGCA 2da vuelta 273-295 394
R GGTACTCCAATTGGCACACATC 646-667
ABLV semianidado NP1087 F GAGAAAGAG[A/C]T[G/T]CAAGA[A/C/T]TA N-gene 1996
NP1279 R CAGAGACATATCT[G/C]C[G/T][G/T]ATGTG
NP1227 R CTTCA[C/T]C[G/T]ACC[A/T][C/T][C/T]GTTCATCAT)
ARV anidado F F AGTATCCTGCCATTGGGAATCA 1ra vuelta 86–107 616 2006
R R GACTGTTGTAACTGCATATGAG 681–702
NF F ATGACGTCTGTTCTTATCTTGCT 2da vuelta 203–225 376
NR R ATGTGTGCAAATTGGAGCACG 577–597
KHUV anidado F F AATACCCGGCTATTGTGGATAG 1ra vuelta 86–107 615 2006
R R GAACTGTTGTGACCGCATATGA 680–701
NF F ATGATGTCTGTTCTTATTTGGCC 2da vuelta 203–225 375
NR R AATGTGTGCTAACTGGAGCACA 576–597
IRKV anidado F F AATACCCTGCGATTGATGATAA 1ra vuelta 86–107 615 2006
R R GAACAGTTGTGACTGCATATGA 680–701
NF F ATGATGTGTGCTCTTACTTGGCT 2da vuelta 203–225 375
NR R AATGTGTGCAAATTGGAGCACA 576–597
todos estandar N1 F TTTGAGACTGCTCCTTTT 587-605 443 1991
N2 R CCCATATAGCATCCTAC 1029-1013
universal lyssavirus semianidado JW12 F ATGTAACACCYCTACAATG 55–73 1997
DUVV,RABV,LBV JW6(DPL) R CAATTCGCACACATTTTGTG 1ra vuelta 660–641 605
EBLV-1 y 2 JW6(E) R CAGTTGGCACACATCTTGTG 1ra vuelta
MOKV JW6(M) R CAGTTAGCGCACATCTTATG 1ra vuelta
DUVV,LBV,EBLV-2 JW10(DLE2 R GTCATCAAAGTGTGRTGCTC 2da vuelta 636–617 581
MOKV,EBLV1 JW10(ME1) R GTCATCAATGTGTGRTGTTC 2da vuelta
RABV JW10(P) R GTCATTAGAGTATGGTGTTC 2da vuelta
anidado D017 F AGATCAATATGAGTAYAARTAYCC 2da vuelta 139–163 497 2006
anidado LISEBL1F F AAGATGTGTGCCAACTGGAG 1ra vuelta 2001
LISEBL1R R ATGTTTGAGCCAGGGCAAGA
LISEBL2F F TACTGCTTATGAGGATTGTTC 2da vuelta
LISEBL2R R AAGAACTTCGAGGAAGAGATC
anidado GRAB1F F AARATNGTRGARCAYCACAC 1ra vuelta 538-557 373 2006
GRAB1R R GCRTTSGANGARTAAGGAGA 911-892
GRAB2F F AARATGTGYGCIAAYTGGAG 2da vuelta 574-593 259
GRAB2R R TCYTGHCCIGGCTCRAACAT 833-814
Modificado de: Fooks et al 2009

26
 3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En el Estado de México, 2006, se registró el ultimo caso de rabia humana

transmitido por perro y la tasa de agresión se ha mantenido desde hace 9 años

en un promedió de 170 agredidos por cada 100,000 habitantes. Los casos de

rabia en perro se han mantenido en un promedio de 20 casos por año. Gracias al

esfuerzo de los sistemas de vigilancia epidemiológica la rabia urbana ha

disminuido en un 98.3% de 1990 al 2003. Se ha encontrado que la rabia silvestre

se encuentra fluctuante. El Estado de México cuenta con centros antirrábicos,

epidemiólogos y un laboratorio para diagnostico del virus de la rabia, pero esto no

es suficiente ya que la técnica empleada (inmunofluorescencia directa) sólo

proporciona datos de positivo o negativo a rabia lo cual ayuda identificar un foco

rábico pero no se sabe que reservorio esta implicado, ya que en varias regiones

se mezcla la fauna silvestre con la fauna urbana y no se sabe si se tiene rabia

silvestre y/o rabia urbana o si tal vez la vacuna antirrábica administrada a perros

y gatos no este funcionando adecuadamente, entre otros problemas. Lo que hace

necesario conocer las variantes genéticas circulantes en el Estado de México para

saber que medidas tomar y fortalecer los sistemas de vigilancia epidemiológica.

Por lo anterior decidimos abordar el siguiente problema:

¿Cuales son las variantes genéticas de los virus de la rabia presentes en muestras

de diferentes especies estudiadas en el Estado de México ?

27
 4 JUSTIFICACIÓN

Justificación Epidemiológica

La rabia es una enfermedad con una letalidad del 100% por lo que es un problema

de salud pública, en México se cuenta con una norma oficial para el control y

prevención de la rabia (NOM-011-SSA2-1993) donde se indica la definición

operacional de caso y como actuar ante ello, al presentarse un caso positivo a

rabia es de reporte inmediato a las autoridades sanitarias correspondientes(59).

Aún cuando la rabia es considerada una de las enfermedades más antiguas y

devastadoras del mundo, la rabia sigue siendo un problema de salud pública grave

que implica grandes perdidas económicas (ganadería por derriengue, vacunación)

y ha cobrado varias vidas humanas. En la República Mexicana de 1970 a 1999 se

presentaron 1738 casos de rabia humana, el 88% de los casos fueron transmitidos

por perros, el 8.6% por murciélago y el 10.5% por otras especies. Por lo anterior

la detección adecuada reduce costos de cercos sanitarios y la propuesta de

investigación para la detección del reservorio implicado daría mejores alternativas

para el manejo y control de posibles brotes.

28
 5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo General

Determinar las variantes geneticas de los virus de la rabia (RABV1) presentes en

muestras del el Estado de México por reservorio.

5.2 Objetivos Específicos

 Determinar por Inmunofluorescencia directa el diagnóstico a muestras

posibles a rabia.

 Establecer la detección diferencial al virus de rabia por RT-PCR.

 Identificar el reservorio de acuerdo a la variantes genéticas del virus de la

rabia en del Estado de México en muestras positivas del Laboratorio Estatal

de Salud Pública.

29
 6 MATERIAL Y MÉTODOS

Tipo de Estudio

El presente estudio es: observacional, descriptivo.

Universo de trabajo

Catorce muestras positivas a rabia por inmunofluorescencia directa (IFD)

provenientes del Estado de México, las muestras son encéfalos de animales

infectados (perro,bovino,quirópteros.) , de rabia.

Criterios de inclusión

Todas las muestras positivas a rabia por IFD remitidas al LESP del Estado de

México en 1996-2010.

Con una tipificación antigénica.

Que el instrumento de recolección tenga los datos correctos.

Criterios de exclusión

Muestras no conservadas adecuadamente

Instrumento de investigación

Se utiliza el formato del LESP código RAB-FOR-01 que se encuentra declarado

en el manual de calidad del laboratorio de rabia según, los lineamientos de la

norma ISO9001-2000, el cual está compuesto de 9 partes.

Parte 1: datos del solicitante.

En esta parte se recolectan los datos del solicitante: nombre, domicilio, municipio,

localidad y jurisdicción sanitaria.

30
Parte 2: tipo y características del animal.

Se obtienen los datos del animal: especie, raza, sexo y edad.

Parte 3: identificación y estado vacunal del animal.

Datos de identificación del animal: color, estado vacunal, tipo de vacuna empleada

y fecha de la última vacunación.

Parte 4: lesionados.

Datos de la persona agredida, si fue o no provocado el animal agresor, si existen

lesionados, fecha de la lesión, sitio de lesión, edad y sexo del o los lesionados.

Parte 5: existió contacto con.

Se obtiene la cantidad de personas y animales con quien tuvo contacto el animal

agresor.

Parte 6: enfermedad y muerte del animal.

Tiempo que duró la enfermedad, la causa de muerte del animal (sacrificado,

enfermedad) y fecha de la muerte.

Parte 7: descripción clara y breve de los datos clínicos.

Se redacta una historia clínica clara y breve incluyendo quién la elabora.

Parte 8: resultado de laboratorio.

Se da el resultado de IFD y/o Prueba biológica, nombre de la persona que

comunica el resultado, por que vía se emite, nombre de la persona que recibe el

resultado, fecha y hora de entrega del resultado.

Parte 9: Observaciones.

De las cual se utilizaran los siguientes datos:

31
Fecha de envió de muestra

Lugar de procedencia (jurisdicción sanitaria)

Especie

Resultado de laboratorio por IFD

Límite de tiempo

El presente estudio se realizara de enero del año 2010 a diciembre del 2011.

Métodología

Se identificaron los encéfalos diagnosticados como positivos por IFD y se

confirmo nuevamente por IFD su positividad (67). Se inocularon en ratón lactante

para replicar y amplificar el virus para posteriormente realizar la RT-PCR con el

panel de iniciadores para identificar las variantes genéticas y posteriormente se

realizo la secuenciación nucleotídica.

6.1 Prueba biológica

La prueba biológica (PB) de inoculación en raton lactante (68) se realizo con 0.2

mL del sobrenadante del homogenizado de encéfalo (0.5 g) homogenizado en 2.5

mL de diluyente para suspensión viral, los especímenes se observaron hasta el

28º día posterior a la inoculación para presentar signos clínicos positivos sigiendo

el protocolo establecido por el InDRE (www.salud.gob.mx), así como la NOM-011-

SSA2-1993 Para la Prevencion y Control de la Rabia, (1993).

32
6.2 Extracción de ácidos nucleídos

Se realizó la extracción de Ácidos Nucleícos totales a partir de 0.2 g de encéfalo

homogenizado con 200 µL de amortiguador de lisis usando el MagNA Pure LC

Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, USA) en el equipo automatizado MagNA

Pure LC instrument (Roche, USA) siguiendo el protocolo de lisis externa de

acuerdo a las instrucciones de la compañía para obtener un volumen final de 50µL

de ácidos nucleícos totales.

6.3 Diseño de iniciadores para variantes de Rabia

Para el diseño de iniciadores se utilizo el programa vector NTI versión 10.5, en el

que se tomaron en cuenta parámetros como la formación de orquillas, contenido

de GC, formación de homoduplex y heteroduplex, etc. Se diseñaron 16

iniciadores, 2 pares para cada hospedero (perro, murcielago, vampiro y zorrillo).

6.4 Detección de variantes por RT-PCR

La detección de las variantes de rabia deacuerdo al reservorio se realizó con los

iniciadores diseñados en este trabajo.

Cada reacción fue de un solo paso empleando el SuperScript™III Platinum® One-

Step Quantitative Kit (Invitrogen,USA) de acuerdo con las instrucciones de

fabricante, usando 5 µL de RNA total (aprox. 50 ng) en un volumen total de 25 µL

de reacción (cada 25 µL de reacción contuvo 12.5 µL SSIII buffer, 1U de SSIII

33
RT/Taq enzima, 4.8 mM MgSO4, 0.1 mM de cada iniciador y 50 ng de RNA total).

Las condiciones para detectar las variantes fueron las siguientes: 20 min a 50°C, 2

min a 94°C; 35 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a Tm 55°C específica para cada par de

iniciadores, 30s a 68°C; 5 min a 72°C en termociclador C1000 (BIO-RAD, USA).

6.5 PCR anidado

La mezcla de reaccion de la PCR se realizo de la siguiente manera : 1 µL

templado DNA, 5 µL 10X buffer, 1µL 25mM MgCl2, 1µL dNTPs (conteniendo 5 mM

dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 µL 10 mM iniciador sentido, 1 µL 10mM iniciador

antisentido, 45 µL agua grado PCR, and 1U Taq polimerasa, para tener un

volumen final of 50 µL. La PCR se llevo acabo a 94°C predesnaturalización 5 min

y 35 ciclos con 95°C desnaturalizacion 30 s, alineamiento Tm 55°C específica

para cada par de iniciadores 30 s y 72°C extensión 30 s, finalmente 72°C

extensión 10 min.

6.6 RT-PCR con SYBR GREEN

La detección con Syber green se realizó usando LCFastStart RNA Master SYBR-

Green I (Roche, Germany). La mezcla de rectivos fue de acuerdo a las

instrucciones del fabricante , 20 µL volumen total por reacción incluyendo 50 ng

de RNA total y 0.01µM de iniciadores. La amplificación se realizó en el

termociclador LightCycler 2.0 (Roche, Germany) en tiempo real con las siguientes

condiciones : un ciclo de 55°C por 30 min, seguido de una desnaturalización a

95°C for 30 s, 45 ciclos con una desnaturalización de 95°C por 10 s, alineamiento

34
a 58°C for 10 s, y la elongación a 72°C por 20s, La medición de la señal de

fluorescencia se efectuó durante la fase de extensión en modo single a 530 nm. Al

finalizar la amplificación se efectuó un análisis de las curvas de disociación del

producto de amplificación aumentando la temperatura a razón de 0.1 °C/s desde

65 hasta 95 °C mientras se registra la señal de fluorescencia a 530 nm en modo

continuo y una etapa de enfiamiento de 40°C por 30s.

6.7 Análisis Electroforético

Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1.5 % en regulador

Tris-Acido Acetico-EDTA (TAE).

6.8 Clonación de los fragmentos amplificados por PCR en un vector TOPO

Los productos de PCR se purificaron con QIAquick PCR purification Kit (Qiagen,

UK). Se clonaron los productos de PCR en pCR®2.1-TOPO (Invitrogen cat.

K4560-1), con 2 μL de producto de PCR, 1 μL solución salina, 2 μL de agua

destilada estéril y 1 μL del vector TOPO, y se dejaron las reacciones por 30 min a

37 °C.

6.9 Células competentes de E. coli TOP 10

Las células de E. coli se sembraron en una placa de agar LB durante toda la

noche, se tomó una colonia y se sembró en 50 mL de medio líquido LB y se dejó

crecer hasta una densidad óptica de 0.4 a 600 nm, el medio de cultivo se pasó a

35
un tubo falcon de 50 mL, se dejó enfriar a 4°C por 10 min, se centrifugó a 4000

rpm durante 10 min a 4°C y se decantó el sobrenadante, se agregaron 5 mL de

CaCl2 0.1 M previamente enfriado y se mezcló, se centrifugó de nuevo a 4000 rpm

por 10 min. El sobrenadante se retiró y se adiciono 1 mL de CaCl2 0.1 M frío y se

homogenizo, se hicieron alícuotas de 200 μL en 5 diferentes tubos tipo eppendorf

de 1.5 mL (Sambrook and Russel, 2001).

6.10 Transformación de E. coli Top 10

Una vez terminada la clonación se transformo E. coli con las células competentes.

A cada alícuota de células competentes se le agregaron los 6 μL de la reacción de

clonación y se agita ligeramente, se dejo enfriar por 30 min en hielo y se realizo un

choque térmico a 42°C por 90 s, se coloco en hielo 3 min y se adicionaron 800 μL

de medio líquido LB, se dejo incubando durante 45 min a 37°C para

posteriormente espatular 150 μL en placas LB ampicilina dejándolas incubando a

37°C durante 16 h (Sambrook and Russel, 2001).

6.11 Extracción de plásmido de E. coli transformada

Se selecciono una clona y se inoculo en 5 mL de medio LB ampicilina por 5 h, se

sigue el método para la extracción de plásmido de acuerdo al protocolo del kit

PureLink™ Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen cat. K2100-10).

6.12 Análisis de secuencias

36
Los insertos contenidos en el plásmido TOPO-TA se secuenciaron en ABI Prism

377 DNA sequencer (Perkin–Elmer applied biosystems). Posteriormente las

secuencias obtenidas de cada inserto se alinerán con el uso de Clustal X (Higgins

et al., 1996). La identiifcación de las muestras se realizo con el uso de BLAST

searches of the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).

7 RESULTADOS

7.1 DIAGNÓSTICO POR INMUNOFLUORESCENCIA

Para este trabajo 14 muestras diagnosticadas como positivas por el método por

inmunofluorescencia en el LESP del Estado de México fueron seleccionadas y

diagnósticadas por el mismo método, para confirmar el diagnóstico previo y que

fuera consistente al momento de ser procesadas por el método alternativo

propuesto en este trabajo. En la Figura 5 se muestra el patrón característico

obtenido de muestra positiva y negativa al virus de la rabia por IFD directa.

a) b)

Figura 5. a) Muestra positiva a rabia por inmunofluorescencia b) muestra negativa a rabia

por inmunofluorescencia

37
7.2 DISEÑO DE INICIADORES

Se realizaron alineamientos de secuencias completas del gen N del virus de la

rabia obtenidas de base de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para diseñar los

cuatro pares de iniciadores para cuatro variantes del virus de la rabia en regiones

conservadas del gen N (Figura 6).

Figura 6. A Alineamiento de secuencias del gen N del virus de la rabia e iniciador RABN1
con Mega 5.0, B. Diseño de Iniciadores con el programa Vector NTI a partir de las
secuencias del gen N.

38
Los iniciadores diseñados para este trabajo en secuencia de aminoácidos fueron 8

pares, cuatro para RT-PCR externo y cuatro para interno. El diseño de los

iniciadores se hizó con la finalidad de tenter un RT-PCR anidado para cada

variante (Tabla 7 y 8).

TABLA 7. Iniciadores externos usados para la deteccion de las variants del virus de la rabia.
Iniciador Tm SECUENCIA Variante
Sentido VAMPIROF 55°C FKVNNQV Vampiro
Antisentido VAMPIRORC RLLVLIPI
Sentido PERROF 55°C FKVNNQV Perro
Antisentido PERRORC NHQARPN
Sentido MURCIELAGOF 55°C FKVNNQV Murcielago
Antisentido MURCIELAGORC VPVYYFIS
Sentido ZORRILOF 55°C FKVNNQV Zorrillo
Antisentido ZORRILLORC ILSFFQVS

TABLA 8. Iniciadores internos usados para la deteccion de las variants del virus de la rabia.
Iniciador Tm SECUENCIA Variante
Sentido FBVFQ 55°C HFANLK Vampiro
Antisentido FBVRCQ VSLVHS
Sentido FBPFQ 55°C CFHPYW Perro
Antisentido PERRORC IGYHAN
Sentido FBMFQ 55°C LSPVTI Murcielago
Antisentido FBMRCQ SKAFSN
Sentido ZORRILOF 55°C ASIWSD Zorrillo
Antisentido FBZRCQ HFANLK

7.3 VALIDACIÓN DE INICIADORES

Para la validación de iniciadores se clonaron fragmentos amplificados por PCR en

un vector TOPO-TA 2.1, se transformó E. coli y fueron extraidos por lisis alcalina

(Sambrook, 2009). Posteriormente las secuencias obtenidas de electroferogramas

(Figura 7) de cada inserto se alineron con el uso de Clustal X (Higgins et al.,

39
1996). La identiifcación de las muestras se realizó con el uso de BLAST searches

of the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).

Figura 7. Electroferograma de una clona

7.4 ESTANDARIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE RT-PCR PARA

VARIANTES

Se utilizó gradiente de temperatura de +/- 5°C de acuerdo a cada Tm de cada

iniciador, se obtuvo la Tm ideal para cada juego de iniciadores tanto externos

como internos, una vez obtenida la Tm ideal de cada iniciador se determinó la

concentración de +Mg2 ideal para cada iniciador.

7.5 RT-PCR Y PCR ANIDADO

Se realizó RT-PCR y PCR anidado para cada variante del virus de la rabia

obteniendo diferentes amplicones de acuerdo a cada diseño y variante (tabla 7 y

8). Para el análisis de perro y murcielago los amplicones largos fueron del orden

de 1000 pb aproximadamente, en tanto que los amplicones de la hn-PCR fueron

40
de 200 pb (Figura 8). Para el análisis de zorrillo y vampiro los amplicones largos

fueron del orden de 1000 pb aproximadamente, en tanto que los amplicones de la

hn-PCR fueron de 300 pb (Figura9).

 1      2     3      4      5     6      7     8

Figura 8. Análisis electroforético de los amplicones perro y murcielago externos e internos.

Carril 1. Marcador de peso molecular, pozo 2 y 5. Control negativo, pozo 3 y 6. Amplicones
externos para perro y murcierlago, pozo 4 y 7 amplicones internos para perro y murcielago.
Carril 8. Control positivo.

    1      2     3      4      5     6      7    8

41
Figura 9. Análisis electroforético de los amplicones vampiro y zorrillo externos e internos.
Carril 1. Marcador de peso molecular, pozo 2 y 5. Control negativo, pozo 3 y 6. Amplicones
externos para zorrillo y vampiro, pozo 4 y 7 amplicones internos para zorrillo y vampiro.
Carril 8. Control positivo.

7.6 Sybr Green RT-PCR

Se realizó RT-PCR utilizando el colorante Sybr Green para cada variante del virus

de la rabia obteniendo diferentes temperaturas de disociación de acuerdo a cada

diseño y variante (figura 10). Las temperaturas de disociación fueron: 83°C, 80°C,

85°C, 86°C para perro, muercielago, zorrillo y vampiro respectivamente.

A) B)

C) D)

Figura 10. Curvas melting de las variantes de acuerdo al hospedero. Las temperaturas de
disociación fueron: 83°C, 80°C, 85°C, 86°C respectivamente.

42
7.7 Analisis taxonómico

Se obtuvo un árbol taxonómico con el análisis bioinformático de las secuencias de

los amplicones obtenidos apartir de las muestras en estudio. El árbol taxonómico

obtenido con las 14 muestras con una secuencia de 1053pb con el algoritmo

neighbor-joining con 1000 bootstraps (figura 11).

0068ECAPER05
268

5
R0
8T

PE
EJ

LA
BO

9T
V0

065
8

06 05
58
PER
VB 0.05
RB CA
13

OV 93E
80

05 22
10
0

1545
R05
4 8 E CAPE
07
0110
T EJVA
M06

100
AM05
TEJV
3919 26
0885
E
44

80 CAPE
R05
99

06
UR
99

NM
7XO 06
5
08

07 47
UR

EC
AP
LM

ER
9JI

05
107

136
9T
1594CUAMUR07

EJ
SK
U0
6

FIGURA 11. Árbol taxonomico generado con el algoritmo neighbor-joining. iniciador perro,
iniciador zorrillo, iniciador murcielago, iniciador vampiro.

43
8 DISCUSIÓN

Para el diagnóstico del virus de la rabia, la prueba de inmunofluorescencia

directa (IFD) es la gold standard (69), en esta prueba se usa un anticuerpo

monoclonal conjugado con fluoresceína dirijido a la nucleoproteína N del virus de

la rabia, ésta prueba se utilizó para redianosticar las 14 muestras seleccionadas y

comprobar su viabilidad, la IFD detecta al genotipo 1 rabia pero no tiene la

sensibilidad para detectar variantes antigénicas de acuerdo a su reservorio. Se

han realizado estudios para determinar la existencia de distintas variantes

asociadas con hospederos terrestres específicos (perros,zorrillos) y especies de

quirópteros (murcielagos no hematofagos y murcielagos vampiros), las variantes

antigénicas reportadas en el Estado de México son: Vag1, Vag3, Vag8 y Vag9 en

sus respectivos reservorios(figura 12).

44
 1.- J. S. Atlacomulco.
2.- J. S. Ixtlahuaca.
3.- J. S. Jilotepec.
4.- J. S. Tenango.
5.- J. S. Toluca.
6.- J. S. Xonacatlan.
7.- J. S. Tejupilco.
8.- J. S. Tenancingo.
9.- J. S. Valle de Bravo.
10.- J. S. Atizapan de z.
11.- J. S. cuautitlan.
12.- J. S. Naucalpan.
13.- J. S. Teotihuacan.
14.- J. S. Tlalnepantla.
15.- J. S. Zumpango.
16.- J. S. Amecameca.
17.- J. S. Ecatepec.
18.- J. S. Nezahualcoyotl.
19.- J. S. Texcoco.

Figura 12. Variantes antigénicas reportadas del estado de Mexico y su distribución.

Los iniciadores se diseñaron para detectar las 4 variantes reportadas en le Estado

de México de acuerdo a su reservorio. Se ha utilizado el RT-PCR para el

dianóstico de rabia en general y para detectar los genotipos del virus mas no para

detectar variantes para ello se a utilizado un panel de 8 anticuerpos monoclonales

que diferencían 11 variantes antigénicas del virus de la rabia(64).

La técnica de anticuerpos monoclonales conciste en una inmunofluorescencia

indirecta en algunos casos se han reportado patrones atipos es decir el panel de

los 8 anticuerpos monoclonales no es capas de disernir la variante antigénica del

virus de la rabia(70).

Se ha utilizado el RT-PCR para el dianóstico de rabia en general por su alta

sensibilidad más que la inoculación en ratón (MIT) y cultivo celular en

Neuroblastoma de Ratón (RTCIT), éste diagnóstico se basa en la detección de

45
fragmento del virus altamente conservado, la mayoría de los estudios amplifican

una región de la nucleoporteína N (15), debido a que codifica para una proteína

implicada en mecanismos de regulación trancipcional y replicación del virus,

además de desempeñar un factor importante en la adaptación en el hospedero,

comparte un 80% de similitud del gen N y un 92% en aminoácidos de

Nucleoproteína con los diferentes genotipos relacionados con Rabia (63).

La detección se ha realizado en RT-PCR por ser una herramienta sensible y de

uso rutinario en el diangóstico en particular en muestras descompuestas (71-73) o

en muestras preservadas(74, 75). La RT-PCR semianidada y andidada aumentan

la sensibilidad y se ha usado en muestras antemortem (saliva, LCF, ICC) y

postmortem (tejido de cerebro) (Tabla 9).

Tabla 9: Ensayos convencionales de PCR basados en análisis electroforético para la

detección de lissavirus.
Genotipo PCR Nombre Sentido Secuencia Detalles
del oligo
Todos standard N1 F TTT GAG ACT GCT CCT TTT
N2 R CC CAT ATA GCA TCC TAC
heminested JW12 F ATGTAACACCYCTACAATG universal lyssavirus
primer
JW6 (DPL) R CAATTCGCACACATTTTGTG 1st round (DUVV, RABV,
LBV)
JW6 (E) R CAGTTGGCACACATCTTGTG 1st round (EBLV-1 and 2)
JW6 (M) R CAGTTAGCGCACATCTTATG 1st round (MOKV)
JW10 R GTCATCAATGTGTGRTGTTC 2nd round (MOKV,
(ME1) EBLV1)
jw12 R GTCATCAAAGTGTGRTGCTC 2nd round (DUVV, LBV,
(DLE2) EBLV-2)
JW10 (P) R GTCATTAGAGTATGGTGTTC 2nd round (RABV)
nested D017 F AGATCAATATGAGTAYAARTAYCC 2nd round forward primer
instead of JW12,
otherwise identical to
Heaton et al.
nested LISEBL1F F AAGATGTGTGCCAACTGGAG 1st round
LISEBL1R R ATGTTTGAGCCAGGGCAAGA
LISEBL2F F TACTGCTTATGAGGATTGTTC 2nd round
LISEBL2R R AAGAACTTCGAGGAAGAGATC
nested GRAB1F F AARATNGTRGARCAYCACAC 1st round
GRAB1R R GCRTTSGANGARTAAGGAGA
GRAB2F F AARATGTGYGCIAAYTGGAG 2nd round
GRAB2R R TCYTGHCCIGGCTCRAACAT
Modificado de: Fooks et al 2009
46
Otros estudios en los que se ha usado RT-PCR anidada o semianidada son : (a)

Un estudio realizado con hnRT-PCR para la detección del virus de la rabia, en el

que usaron 60 muestras y seis aislamientos de los siete genotipos de la rabia y

virus relacionados, éstos fueron evaluados con éxito por hnRT-PCR e hibridación

Southern blot, se obtuvo de los 60 aislamientos, 93% (56 de 60) fueron positivas

por PCR externa, mientras que todos los aislados fueron detectados por PCR

heminested y la hibridación de Southern blot. La detección por IFD fue deficiente

para detectar el antígeno viral en el tejido cerebral que se incubó a 37 ° C por más

de 72 h, mientras que se logró detectar el virus por hnRT-PCR en el tejido

cerebral que se incubó a 37 ° C durante 360 h(76). (b) En otro estudio realizado

por RT-PCR anidado, diseñado para la detección del virus de la rabia en el

murcielago europeo en muestras bucofaríngeas y en encéfalos, la técnica fue

utilizada con éxito para la vigilancia del murciélago serotine (Eptesicus serotinus)

involucrado en un caso de exposición humana, en las que 15 de las 71 muestras

bucofaríngeas fueron positivos. La infección por Lyssavirus se detectó en 13 de

las muestras bucofaríngeas, pero sólo en cinco cerebros de los 34 animales, esta

técnica ofreció en esta investigación la posible proyección de la población de

murciélagos silvestres para la infección por lyssavirus activa, la investigación con

fines epidemiológicos, de acuerdo no sólo con las políticas de conservación, sino

también de una manera más eficiente que las técnicas de detección clásicas que

utilizan tejido cerebral (77). Todos los trabajos antes mencionados sustentan que

47
la hnRT-PCR y RT-PCR anidado sonespecificos y sencibles para la detección del

virus de la rabia.

En este trabajo los iniciadores propuestos fueron para la detección por RT-PCR

anidada de variantes a diferencia de los estudios realizados que son para detectar

los genotipos del virus mas no para detectar variantes (Tabla 9). Se realizó una

estandarización de los iniciadores dando una Tm homogénea de 55°C y se

determinó que la reacción no es altamente dependiente de una concentración de

cofactor con una concentración óptima de Mg2+ 1.25mM.

Trabajos recientes se han enfocado en mejorar la tecnología de PCR al hacerla

más sensible y rápida a la que llamaron PCR en tiempo Real, estas metodologías

eliminan la necesidad de analizar los amplicones por análisis electroforético en

geles de agarosa, además de la reducción de los resultados falsos positivos y

evita la contaminación de amplicones en los laboratorios. Los amplicones

producidos por PCR en tiempo real se detectan conforme se van generando

debido a que se a intercalando un fluorocromo (Sybr Green, Rox, Eva green) en la

doble cadena de DNA; una de las químicas más empleadas es la del formato

TaqMan que usan sondas marcadas, esta metodología fue descrita por Lee et al

en 1993(78), cabe mencionar que ésta última es más costosa que el uso de un

fluorocromo intercalado, por esa razón el uso de RT-PCR con Syber Green resulta

atractivo para detección rutinaria a bajo costo en tiempo real. En estudios

realizados para detección del virus de la rabia por SYBR green se ha detectado de

manera exitosa en muestras de saliva en humanos antemortem (79), en muestras

48
de saliva y líquido cefaloraquídeo (LCR) de la sospecha de perros rabiosos en el

momento de la cuarentena, 13 de los 15 perros (87%) fueron positivos para rabia.

Dos perros con rabia furiosa dieron negativos a rabia por saliva. Se encontraron 4

positivos de 15 perros (27%) en LCR previamente positivos con saliva, en este

estudió se evidenció que el virus puede estar ausente o presente en niveles muy

bajos en ambos fluidos, además a pesar de la detección del virus de la rabia

antemortem, en la toma de muestras para el diagnóstico ante-mortem

definitivamente no se puede descartar la rabia(80). El uso de RT-PCR en tiempo

real así como heminested RT-PCR en un estudio permitió la detección de virus de

la rabia, 23 muestras positivas y nueve muestras negativas con el 100% de

concordancia en ambos métodos en muestras de animales terrestres y los

murciélagos amplificados en ratón (81).

Para las variantes vag1, vag3 y vag9 por RT-PCR en tiempo real se tuvo un 100%

de concordancia con los iniciadores perro, vampiro y murcielago respectivamente

por ambos métodos así como para la Vag8 aislada en su reservorio natural

(Zorrillo). Para las Vag8 aisladas en bovinos se obtuvieron resultados positivos

para los iniciadores vampiro tanto por punto final como por tiempo real, por lo cual

se decidio secuenciar los amplicones para confirmar la detección del lyssavirus y

obtener datos para el análisis bioinformatico utilizando la herramienta blast y

confirmar la variante vampiro para las dos muestras. En dos muestras atípicas por

monoclonales y realizando la detección por los iniciadores se obtuvó un resultado

positivo para el par de iniciadores murcielago tanto por punto final y tiempo real

que se confirmó por secuenciación.

49
Analisis taxonómico

El análisis de las secuencias de nucleótidos permite entender la transmisión del

virus de la rabia de un hospedero a otro incluyendo humanos y animales

domésticos(82-84).

El análisis taxinómico basado en 1053 pb del gen N demostró que todos los virus

investigados en las 14 muestras fueron del genotio 1 y de cuatro diferentes

variantes de acuerdo al hospedero (zorrillo, murcielago, vampiro y perro) ( Figura

11).

Se usaron las secuencias obtenidas en este trabajo en un análisis taxonómico que

incluye secuencias de la base de datos (NCBI) cuyo numero de acceso es:

DQ416036, DQ416037, DQ416038, DQ416039, DQ416040, DQ416041,

DQ416042, DQ416043, DQ416044, DQ416045, DQ416046, DQ416047,

DQ416048, DQ416049, DQ416050, DQ416051, DQ416052, DQ416053,

DQ416054, DQ416055, DQ416056, DQ416057, DQ416058, DQ416059,

DQ416060, DQ416061, DQ416062, DQ416063, DQ416064, DQ416065,

DQ416066, DQ416067, DQ416068, DQ416069, DQ416070, DQ416071,

DQ416072, DQ416073, DQ416074, DQ416075, DQ416076, DQ416077,

DQ416078, DQ416079, DQ416080, DQ416081, DQ416082, DQ416083,

DQ416084, DQ416085, DQ416086, DQ416087, DQ416088, DQ416089,

DQ416090, DQ416091, DQ416092, DQ416093, DQ416094, DQ416095,

DQ416096, DQ416097, DQ416098, DQ416099, DQ416100, DQ416101,

DQ416102, DQ416103, DQ416104, DQ416105, DQ416106, DQ416107,

50
DQ416108, DQ416109, DQ416110, DQ416111, DQ416112, DQ416113,

DQ416114, DQ416115, DQ416116, DQ416117, DQ416118, DQ416119,

DQ416120, DQ416121, DQ416122, DQ416123, DQ416124, AY854587,

AY854595, AY8774335, AY561764, AY561762, AY561763, AY561770,

AY561766, AY561765, AY561774, AY561772, AY561775, AY561778,

AY561779, AY561776, AY561788, AY561773, AY561780, AY561789,

AY561771, AY561781, AY561782, AY561786, AY561769, AY561768,

AY561783, AY561784, AY561785, AY561787, AY561767, AY561790,

AY561791, AY561792, AY561794, AY561795, AY561796, AY561797,

AY561793, AY561804, AY561805, AY561806, AY561798, AY561799,

AY561802, AY561803, AY561800, AY561801, AY561777, AY561818,

AY561819, AY561820, AY561821, AY561822, AY561807, AY561808,

AY561809, AY561810, AY561813, AY561811, AY561812, AY561814,

AY561815, AY561816, AY561817.

El análisis taxonómico dio como resultado el agrupamiento de las secuenias

consistentes en el genotipo 1 y agrupadas en 4 grupos de acuerdo con el diseño

de iniciadores para detectar las variantes Perro, Zorrillo, Murcielago y Vampiro

respectivamente (figura13).

51
FIGURA 14. Árbol taxonomico generado con el algoritmo neighbor-joining, iniciador perro,
iniciador zorrillo, iniciador murcielago, iniciador vampiro.

52
9 CONCLUCIONES

 La detección del virus de Rabia en las muestras seleccionadas fue

adecuado por Inmunofluorescencia directa.

 El diseño de de iniciadores para detección de variantes del virus de la Rabia

(RABV1) concordó de acuerdo al reservorio.

 Con la detección propuesta por hnRT-PCR y RT-PCR Syber Green se logró

Identificar el reservorio de acuerdo a la variantes genéticas del virus de la

rabia en muestras positivas del Laboratorio Estatal de Salud Pública del

Estado de México.

 La detección diferencial al virus de rabia concordó al 100% por hnRT-PCR

RT-PCR Sybr Green.

 Las variantes genéticas de los virus de la rabia (RABV1) fueron Variante

perro, Variante vampiro, Variante zorrilo y Variante murcielago en muestras

del Estado de México.

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