Decalcificacion

Tricrómico de Gomori
El tricrómico de Gomori en un paso es un método idóneo para teñir fibrina, tejido

muscular y citoplasmas, donde destaca esencialmente el condrioma (que son todos los
orgánulos que forman parte del citoplasma de la célula) como un fino granulado rojizo.
Sin embargo, por su pH ácido, que se encuentra entre 2.5 y 2.7 (ligeramente por encima
del óptimo para la tinción del colágeno), se presenta como una tinción incompleta y
difusa del componente fibrilar más fino (membrana basal y finas fibras reticulares).
Fundamento
Esta técnica combina un colorante plasmático (cromotropo 2R) y un colorante de fibras
conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solución de ácido fosfotúngstico y ácido
acético glacial. El tratamiento previo de las secciones con solución de Bouin caliente
intensifica la tinción. El ácido fosfotúngstico favorece la coloración roja de músculo y
citoplasmas. Las fibras de colágeno toman los iones de tungstato formando un complejo
al que se une el verde luz. El baño de ácido acético hace los colores más trasparentes
pero no altera el balance de color.
Tejido Control y Diana
Cualquier tejido con componente conectivo dará positivo con este método. El fijador
más utilizado para esta técnica es el Bouin, pero cualquier otro también es válido. El
grosor de corte ideal de las secciones es de 6 micras para tejidos que están incluidos en
parafina.
Reactivos
Para llevar a cabo esta técnica se precisan las siguientes soluciones:
1. Solución de Bouin: tras la fijación, se debe lavar la muestra en abundante alcohol de

70º hasta la decoloración de la misma para asegurar la total eliminación del ácido
pícrico. Una vez fijado se puede almacenar el tejido en etanol de 80º.
2. Solución tricrómica:
a. 0,6 g de cromotropo 2R.
b. 0,3 g Verde luz
c. 1 cc de ácido acético glacial.
d. 100 cc de agua destilada.
e. 0,8 g de ácido fosfotúngstico.
3. Solución verde luz (el verde luz puede ser sustituido por el azul de anilina):
a. 5 g de verde luz.
b. 250 cc de agua destilada.
c. 2 cc de ácido acético.
4. Solución acuosa de ácido acético al 0,5%.
5. Solución diaria de hematoxilina férrica de Weigert:
6. Solución matriz A: 1,0 g de hematoxilina de Weigert en 100 ml de etanol al 95%.
7. Solución matriz B:
a. 4,0 g de cloruro férrico al 29%.
b. 95 ml de agua destilada.
c. 1 ml de ácido clorhídrico concentrado.

Se deben utilizar a partes iguales cada una de las soluciones matrices. La solución diaria
de la hematoxilina de Weigert puede reutilizarse durante aproximadamente 2 semanas.
La hematoxilina de Weigert puede ser sustituida por la hematoxilina de cromo de
Gomori.
Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar.
2. Realizar mordentaje en líquido de Bouin durante 1 hora a 56 ºC o 24 horas a Tª

ambiente.
3. Lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.
4. Teñir con hematoxilina de Weigert (ver variantes) durante 10-13 minutos.
5. Realizar un lavado prolongado con agua corriente.
6. Teñir con la solución tricrómica durante 15 minutos.
7. Diferenciar en la solución de ácido acético al 0,5% durante 15 s (se puede

utilizar también ácido acético al 1%)
8. Si las secciones son muy rojas, se diferenciará con una solución de ácido acético
al 1%, a la cual se le agregarán 0,7 gr de ácido fosfotungstico.
9. Lavar en agua destilada.
10. Teñir con la solución de verde luz durante 20 o 30 s (ver variantes).
11. Deshidratar con alcoholes, aclarar con xileno y montar.

Resultados
1. Fibras musculares, fibrina y citoplasma: rojo.
2. Colágeno, cartílago, mucinas y membranas basales: verde.

3. Núcleos: azul negruzco.
Descalcificación
Cuando hay minerales en los tejidos, como por ejemplo en el hueso, dentina, o en
procesos patológicos calcificantes en tejidos blandos, es muy difícil obtener buenas
secciones finas, bien sea de material incluido en parafina o de material en congelación.
En estos casos el proceso histológico debe incluir un paso en el que se eliminan tales
minerales denominado generalmente como descalcificación, puesto que en la mayoría
de los casos se eliminan minerales de calcio. A la hora de elegir los tiempos y sustancias
descalcificantes hay que tener en cuenta si estamos interesados en el hueso compacto o
en el esponjoso. Por ejemplo, las sales minerales tardan más en disolverse en el hueso
compacto.
La descalcificación se realiza normalmente después de la fijación, aunque a veces se
hace tras la inclusión en parafina eliminando la sales de calcio sólo de las micras más
superficiales del plano de corte de la muestra. Es importante realizar una buena fijación
del tejido puesto que será incubado en soluciones ácidas relativamente agresivas.
Además, es bueno eliminar bien los restos de fijador con lavados abundantes para evitar
reacciones química con los agentes descalcificadores.
Los tiempos de fijación del hueso que se va a descalcificar suelen ser mucho mayores
que para otros tejidos. El mejor método de fijación es la perfusión, pero si no es posible
es conveniente hacer piezas pequeñas con sierras de dientes muy finos y eliminar los
tejidos que rodean al hueso antes de sumergirlo en fijador. Los mejores fijadores son
Bouin, mezclas de formalina con zinc, o FAA (formol, acético, alcohol).
Clasificación
Hay dos grupos principales de agentes descalcificantes: los ácidos y los quelantes de
calcio. A continuación veremos los descalficantes más comunes.
Basados en ácidos:
Los ácidos aportan hidrógenos y eliminan iones hidroxilos del medio por lo que la
reacción antes mencionada tiende hacia la solubilización del mineral.
Hay dos grupos de ácidos: los fuertes (inorgánicos) y los débiles (orgánicos). Los ácidos
fuertes suelen ser rápidos pero son muy agresivos por lo que el tiempo debe ser el
mínimo posible, ya que si es excesivo producen daños en los núcleos y maceran el
tejido. Los ácidos débiles son más lentos pero preservan mejor al tejido. Los ácidos
fuertes más usados son:
El ácido clorhídrico y el ácido nítrico: Descalcifican rápidamente y su acción no debería
prolongarse más de 24-48 horas. No se recomiendan para inmunocitoquímica ni ensayos
enzimáticos. Se emplean para muestras pequeñas y diagnósticos rápidos.
Mientras que en los débiles encontramos:
El ácido fórmico es el ácido débil más usado como descalcificante. Se puede usar en
solución acuosa (5-10 %), tamponado (con ácido cítrico) o combinado con formalina.
En este último caso la descalcificación va acompañada de fijación. El tiempo de
tratamiento con ácidos débiles es más prolongada (1 a 10 días), dependiendo del tamaño
y tipo de hueso, y de la concentración de ácido. La solución debería cambiarse cada 24
o 48 horas.
Agentes Quelantes:
Los agentes quelantes son aquellas sustancias orgánicas que pueden unirse
covalentemente a iones metálicos formándose un compuesto soluble llamado quelato de
metal. El EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) secuestra iones de calcio, presentes
en los cristales de hidroxiapatita del hueso, por lo que progresivamente irá
disminuyendo el tamaño del cristal. Se usa entre el 10 y el 14 % en soluciones acuosas o
tamponadas. Es un proceso lento, la descalcificación se puede extender durante
semanas, pero aporta una buena preservación de la estructura tisular.
Al final en cualquiera de los dos métodos, ácidos o quelantes, hay variables que pueden
disminuir el tiempo de descalcificación, como son el aumento de la temperatura o una
agitación suave del tejido. Hay otros más agresivos como sonicación o microondas, pero
hay que controlar los daños al tejido.
Comprobación
Averiguar el grado de descalcificación es importante para determinar el tiempo
necesario que tienen que incubarse las muestras en las soluciones descalcificadoras.
Cuando se emplean ácidos como descalcificantes se puede realizar una comprobación
química: se añade oxalato de amonio a la solución descalcificante, que ha sido
neutralizada con hidróxido amonio. Si hay calcio en la solución se forman precipitados
de oxalato de calcio, lo que indica que aún quedan minerales en el hueso.
Alternativas
A veces, sin embargo, es necesario mantener el contenido mineral del hueso y la
descalcificación no se lleva a cabo. En estos casos es posible obtener secciones
mediante procedimientos no convencionales. Por ejemplo, se puede serrar el hueso en
lonchas más a menos finas y luego limar las superficies hasta llegar a un grosor óptimo
para su observación con el microscopio. También se puede infiltrar el hueso con resinas
que al polimerizar alcanzan una dureza similar a la del hueso, y posteriormente cortar la
muestra incluida con microtomos especiales como el ultramicrotomo cuando se usan
cuchillas de diamante. Otra posibilidad es realizar cortes por congelación.

Decalcificacion

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Decalcificacion

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Decalcificacion

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Tricrómico de Gomori

El tricrómico de Gomori en un paso es un método idóneo para teñir fibrina, tejido

Para llevar a cabo esta técnica se precisan las siguientes soluciones:

1. Solución de Bouin: tras la fijación, se debe lavar la muestra en abundante alcohol de

a. 0,6 g de cromotropo 2R.

b. 0,3 g Verde luz

c. 1 cc de ácido acético glacial.

d. 100 cc de agua destilada.

e. 0,8 g de ácido fosfotúngstico.

4. Solución acuosa de ácido acético al 0,5%.

5. Solución diaria de hematoxilina férrica de Weigert:

6. Solución matriz A: 1,0 g de hematoxilina de Weigert en 100 ml de etanol al 95%.

a. 4,0 g de cloruro férrico al 29%.

c. 1 ml de ácido clorhídrico concentrado.

2. Realizar mordentaje en líquido de Bouin durante 1 hora a 56 ºC o 24 horas a Tª

3. Lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.

4. Teñir con hematoxilina de Weigert (ver variantes) durante 10-13 minutos.

5. Realizar un lavado prolongado con agua corriente.

6. Teñir con la solución tricrómica durante 15 minutos.

7. Diferenciar en la solución de ácido acético al 0,5% durante 15 s (se puede

9. Lavar en agua destilada.

10. Teñir con la solución de verde luz durante 20 o 30 s (ver variantes).

11. Deshidratar con alcoholes, aclarar con xileno y montar.

2. Colágeno, cartílago, mucinas y membranas basales: verde.

También podría gustarte