Este documento describe un experimento de desnaturalización y renaturalización de ADN mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. El experimento expone ADN a diferentes temperaturas (37°C, 60°C, 80°C, 100°C) para verificar su desnaturalización y luego lo renaturaliza. Los resultados muestran que a mayor temperatura hay mayor desnaturalización del ADN y cambios en la absorbancia. La electroforesis y espectrofotometría confirman la desnaturalización y posterior renaturalización del ADN.
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Este documento describe un experimento de desnaturalización y renaturalización de ADN mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. El experimento expone ADN a diferentes temperaturas (37°C, 60°C, 80°C, 100°C) para verificar su desnaturalización y luego lo renaturaliza. Los resultados muestran que a mayor temperatura hay mayor desnaturalización del ADN y cambios en la absorbancia. La electroforesis y espectrofotometría confirman la desnaturalización y posterior renaturalización del ADN.
Este documento describe un experimento de desnaturalización y renaturalización de ADN mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. El experimento expone ADN a diferentes temperaturas (37°C, 60°C, 80°C, 100°C) para verificar su desnaturalización y luego lo renaturaliza. Los resultados muestran que a mayor temperatura hay mayor desnaturalización del ADN y cambios en la absorbancia. La electroforesis y espectrofotometría confirman la desnaturalización y posterior renaturalización del ADN.
Este documento describe un experimento de desnaturalización y renaturalización de ADN mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. El experimento expone ADN a diferentes temperaturas (37°C, 60°C, 80°C, 100°C) para verificar su desnaturalización y luego lo renaturaliza. Los resultados muestran que a mayor temperatura hay mayor desnaturalización del ADN y cambios en la absorbancia. La electroforesis y espectrofotometría confirman la desnaturalización y posterior renaturalización del ADN.
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UNIVERDIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y
BIOQUÍMICAS CARRERA DE BIOQUÍMICA CÁTEDRA BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA N°8 DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION
CATEDRATICO:
Dra. XIMENA TABORGA
ESTUDIANTES:
Univ. APAZA GUTIERREZ LOURDES
Univ. NELSON POMA MAMANI
Univ. RENE CARLOS CHAMBI NICOLAS
Univ. ZAMORANO QUISPE FANNY LIZSHET
DÍA DE PRÁCTICA: JUEVES “B”
GRUPO: PAR
FECHA: 12 DE AGOSTO DEL 2019
LAPAZ-BOLIVIA DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION 1. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Verificar la desnaturalización y renaturalización del DNA por espectrofotometría
y electroforesis en gel de agarosa.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Comparar el efecto desnaturalizante por el cambio de temperatura sobre la
hebra de DNA. Observar el efecto hipercromico del DNA mediante las absorbancias. Ver e indicar la diferencia entre desnaturalización y renaturalización.
2. METODOLOGIA
Muestra de DNA Estas 3 temperaturas: 4ºC 37ºC 60ºC al baño maría Preparar 4 eppendorf para 4 diferentes temperaturas: 4ºC 37ºC 60ºC 80ºC poner a cada uno de estas temperaturas 600 ul de muestra de DNA .La última temperatura se lo realiza a ebullición y los otros a baño maria estufa, refrigerador. Calculando siempre la temperatura.
Temperatura 4°C:
El tubo a la temperatura de 4°C al
refrigerador por espacio de 10 minutos Temperatura 37 °C: El tubo a la temperatura de 37 °C se lo realizo en una estufa por espacio de 10 minutos
El tubo eppendorff a la temperatura de 60°C se lo realizo en baño maría por espacio de 10 minutos
Temperatura 60°C
Temperatura 80 °C:
El tubo eppendorf a la temperatura de
100°C se lo realizo en ebullición por espacio de 10 minutos Electroforesis
Pasados los 10 min llevamos al
baño de hielo todos los tubos
De cada temperatura sacar 200ul
de muestra a otro eppendorf y agregar una gotita de tampón de cargado a cada uno todo el proceso sobre hielo para luego cargar al gel y su posterior corrida para luego leer en el
Después de la corida electroforética Poner el resto de la muestra que es 400ul más 200ul de TNF 1x para luego Leemos a 260 nm cada llevar al espectrofotómetro y leer a 260 temperatura nm cada muestra en su temperatura
3. RESULTADOS
Corrida electroforética de las muestras de DNA en diferentes condiciones de
temperatura en gel de agarosa revelado con bromuro de etidio en el transiluminador
TABLA Nº2 ABSORBANCIA A 260nm DE LA MUESTRA DE DNA TRATADA CON
FORMALDEHIDO
Nota: se realizó 3 veces la lectura correspondiente en el espectrofotómetro por lo que
se hizo el cálculo correspondiente para obtener la absorbancia
4. DISCUSION
La estructura helicoidal del DNA se mantiene gracias a interacciones no covalentes.
Por un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece interacciones hidrofobicas entre éstas, y por otro lado, cada base está unida a su pareja mediante puentes de hidrógeno. La energía libre de las interacciones no covalentes que mantienen la estructura helicoidal del DNA no es muy superior a la energía de los movimientos térmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible desestabilizar la estructura tridimensional del DNA mediante un simple aumento de la temperatura.
La desnaturalización del DNA en la práctica se llevó a cabo por un factor físico que es la temperatura, ambiente, 60 ºC, 100 ºC Y 120 ºC. El cual se verifico midiendo el comportamiento electroforético y el cambio de absorbancia del mismo.
Según la corrida electroforética se observó cualitativamente la desnaturalización del
DNA a diferentes niveles por la varianza de las temperaturas donde a mayor temperatura, mayor energía calórica.
Para los resultados de la práctica se utilizó diferentes temperaturas las cuales fueron a 37 °C, 60 ºC, 100 ºC y 120 ºC en las cuales se realiza la desnaturalización del DNA al llevarlos a 10 minutos en dicha temperatura luego se llevó al hielo durante 5 minutos para su respectiva renaturalización del DNA. Se sembró 10 uL de la muestra de diferentes temperaturas en un gel de agarosa y se hizo la corrida correspondiente, a, 60 ºC,100 °C y 120 ºC. que corresponden a las bandas 8, 9 y 10 se observa bandas de DNA bien definidas y borrosas eso muestra que la renaturalización del DNA fue exitosa y a la temperatura, de 100 ºC que corresponde al carril 9, luego se llevó a espectrofotometría para comprar los resultados con el sembrado de DNA a las diferentes temperaturas ya que se hizo diluciones con 230 uL de TNE con 20 uL de la muestra, y los resultados muestran que a la temperatura de 37 °C la absorbancia es de 0,261, 60 ºC, es de 0,176 la cual disminuye y a 100 ºC 0,225, 120 ºC. 0.104 en el caso de 100 ºC desnaturalizado, lo que indica que el DNA absorbe más luz a 260 nm.
Con el procedimiento con formaldehido de acuerdo a los resultados obtenidos
observamos en el carril 1 (control) una corrida normal, con respecto al carril 2 observamos una corrida similar ya que tiene 0% de formaldehido, en los siguientes carriles 3 y 4 se ve claramente un rastro blanco en los pocitos (formaldehido) indicando que no hay corrida de la muestra debido a la carga eléctrica que posee el formaldehido desnaturalizando así al DNA también dando entender que el DNA esta con proteínas por la luminosidad que presenta el pocito ya que el DNA no es puro. El formaldehido es un mutágeno químico sobre el DNA, los mutágenos químicos ocasionan inestabilidad general que produce cambios químicos en el DNA; cambian químicamente las bases, con lo que causan errores de apareamiento.
5. CONCLUSIONES
En la práctica se logro verificar la desnaturalización y renaturalizacion del DNA
por los métodos de espectrofotometría y electroforesis en geles de agarosa. Se llevo la muestra de DNA a diferentes temperaturas y se comparo el efecto desnaturalizante sobre la hebra del DNA. Se diferencio lo que es desnaturalización y renaturalizacion y cuando estos procesos se pueden producir. 6. CUESTIONARIO
1.- Explique la desnaturalización del DNA con el factor de concentración de
sales.
Cuando se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras de DNA, por lo tanto el DNA es desnaturalizado es de una sola hebra.
La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por el calentamiento. Otro agente
desnaturalizante es el pH porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte de los puentes de hidrogeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida) se producen la separación de hebras. Este fenómeno se debe a que en agua muy pura, la fuerte repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfatos no es contrarrestada por los correspondientes contra iones.
2.- Como se puede detectar estructuras secundarias de DNA por electroforesis.
Actualmente se aplican en una cadena de análisis combinados entre ellas y con otras metodologías como extracciones, modificaciones enzimáticas y químicas, y purificación. Todo con el fin de probar hipótesis sobre el papel de las biomoleculas en el flujo de la información genética.
3.- A que se debe el efecto hipocrómico?
El efecto hipercrómico es el incremento de absorbancia en un material. El caso
opuesto es el efecto hipocrómico. El caso más conocido es la hipercromicidad del ADN, que ocurre cuando el dúplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que absorben más en el ultravioleta. Esta característica del ADN es una forma de seguir el proceso de desnaturalización de la molécula: a medida que el proceso avanza, se observa un incremento en la absorbancia.
4.- Que es estructura secundaria del DNA?
Es una estructura en doble hélice. Permite explicar el almacenamiento de la
información genética y el mecanismo de duplicación del ADN 5.- Proponga una cadena de 20 nucleótidos, saque el Tm con las formulas expuestas en la introducción de esta práctica y utilice el programa Oligocalculator. Discuta los resultados
El cálculo de Tm para moléculas menores de 50 pb: utilizando la siguiente formula
Tm= 2°C (A+T) + 4°C(G+C)
Tm= 2°C (4+2) + 4°C (9+5)
Tm= 18+ 56
Tm= 74°C
Calculo del Tm según el programa de Oligocalculator; Se introdujo los datos 20
nucleótidos el cual dio como resultado 66°C de la temperatura de fusión que varía en 4°C que se obtuvo con la formula.
7. BIBLIOGRAFIA Montoya Y, Baldeviano C, Caballero A, Cáceres O, Calderón R, De los Santos, M, et al. (1999). Guía de práctica del curso teórico-práctico: electroforesis de ácidos nucleicos y PCR. Lima: Instituto Nacional de Salud. Lima. (2003). Manual de Procedimientos de Electroforesis para Proteínas y ADN. Serie de Normas Técnicas N° 38. Bachmann, K. (1978). Biología para médicos. Obtenido de:https://books.google.com.bo/books? id=dwPg88Wq2xYC&printsec=frontcover&hl=es#v=onepage&q&f=true. Última revisión: 7/05/2019 Nick Oswald, N. (2014). ¡Los geles de agarosa no se polimerizan! Obtenido de: https://bitesizebio.com/10248/agarose-gels-do-not-polymerise/ . Última revisión: 7/05/2019 Kumar, V. (2012). Lecture 27: Agarose Gel Electrophoresis for DNA analysis. Obtenidode: https://www.google.com/url? sa=t&source=web&rct=j&url=https://nptel.ac.in/courses/102103017/pdf/lecture %252027.pdf&ved=2ahUKEwjtsIGO7IniAhURrVkKHR8OAnsQFjARegQICRAB &usg=AOvVaw3KyiQ3NaYKYHJztfsgy71a . Última revisión: 7/05/2019 Sánchez, R. (2019). Guía de Prácticas de Biología Molecular. La Paz. Bolivia Pérez Hilda. 2001. Laboratorio Betera. “Electroforesis en geles de agarosa: fundamentos, actualidad e importancia”. Ciudad de la Habana. Obtenido de: http://www.edvotek.com/site/pdf/101sp.pdf B. Lomonte. Inmunología General: Manual de Laboratorio.”Electroforesis en Gel de Agarosa. Obtenido de: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol- mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES %20AGAROSA.pdf Bandow J, Baker JD, Berth M, Painter C, et al. (2008). Improved image analysis workflow for 2-D gels enables large-scale 2-D gel-based proteomics studies - COPD biomarker discovery study. Proteomics Guadalupe Yunuén; M. C. Humberto; Juliette Morlon-fitgot ; ¨AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE GELES DE AGAROSA¨; INSTITUTO DE INVESTIGAC IONES BIOMEDICAS U. N. A. M. Obtenido de: https://www.google.com/search? rlz=1C1ASRM_enBO760BO762&sourceid=chrome&ie=UTF8&q=https%3A%2F %2Fwww.google.com%2Furl%3Fsa%3Dt%26source%3Dweb%26rct%3Dj %26url%3Dhttp%3A%2F%2F148.206.53.84%2Ftesiuami%2FUAM6900.pdf %26ved%3D2ahUKEwin5aM9IriAhVJX60KHRZwCTEQFjAGegQIARAB %26usg%3DAOvVaw16PzUcfnFaWOUpKxCkWLLZ&gws_rd=ssl http://biomodel.uah.es/tecnicas/inicio.htm#elf.
