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III. Aplicación de nuevas técnicas de biología molecular a

la virología. Detección de tamizaje en bancos de sangre
Del Rey-Pineda G.*

Historia por el método de ELISA enzimático, o por inmunoensayo

QUIMIOLUMINISCENCIA, por lo que el periodo de ventana
La Biología Molecular ha avanzado desde finales de 1860 serológico es aproximadamente de 16 días después de la
en que Miescher aisló una nucleoproteina que finalmente infección para el caso de VIH-1, de 70 días para VHC, y
fue un ácido nucleico, el cual en la década de 1940 Avery para VHB es de 45 días.1
y sus colaboradores demostraron que contenía la
información genética en la bacteria Pneumococcus. En la
década de 1950 Watson y Crick en base a los estudios de Técnicas de biología molecular en el escrutinio de la
cristalografía de rayos X de Franklin, identificaron la serología viral en bancos de sangre
estructura de doble hélice del ácido desoxirribonucleico
(ADN). El posterior entendimiento de la replicación del La implementación de metodologías de Biología Molecular
DNA junto con el descubrimiento de Kornberg en la como la tecnología de ácidos nucleicos (NAT), en el
década de 1950, de la DNA polimerasa capaz de sintetizar escrutinio de donadores, fue posible sólo por la
fragmentos de DNA. Fueron la base de los desarrollos automatización y la adaptación de la metodología a grandes
tecnológicos que derribaron el dogma genético DNA RNA cargas de trabajo, como lo es el caso de la tecnología de
Proteína, al descubrirse en 1970 por Temin la transcriptasa Amplificación mediada por Transcripción (TMA), que utiliza
reversa, encontrada en algunos virus RNA (llamados un aparato TECAN que puede hacer hasta 16 mezclas o
retrovirus) que permite al RNA ser copiado a DNA. Las pooles de muestras individuales, lo cual se valorará en el
enzimas denominadas endonucleasas de restricción, Banco Central de Sangre del Centro Médico Nacional "La
junto con todo el arsenal de la década de 1980, permitió Raza".
a Mullis amplificar segmentos con la reacción de polimerasa En principio, utilizar dicha metodología NAT reduce el
en cadena (PCR), método que pronto se convirtió en "un riesgo residual de infecciones virales transmitidas por
procedimiento de rutina" en los laboratorios de Biología transfusión. Aún más, se están usando minipooles de
Molecular. En un corto período esta tecnología ha donadores unido a la tecnología NAT detectando VHC ó
modificado radicalmente el diagnóstico clínico. HIV y VHC,2,3 ó VIH, VHC y VHB.4
La metodología NAT ha demostrado en algunos casos
ser eficiente para mejorar la transfusión segura comparado
Necesidad de técnicas más sensibles en la detección con el tamizaje basado sólo en la detección de
de virus en productos sanguíneos anticuerpos,5-7 sin embargo la metodología NAT no puede
detectar todas las infecciones en período de ventana,
Para que un Banco de Sangre sirva a su propósito real, porque se han reportado casos en los cuales componentes
que es proporcionar productos sanguíneos útiles con el sanguíneos que fueron NAT negativo causaron hepatitis
mínimo riesgo de infectar a los receptores sanguíneos, postransfusión.8-10 No obstante, la introducción de la
los exámenes practicados a cada uno de los donadores metodología NAT para tamizaje de la sangre, reduce la
deben ser correctos y las determinaciones de cada uno de incidencia de la hepatitis postransfusión.11,12
los donadores deben ser relevantes para el diagnóstico y Lo anterior se debe a que las metodologías basadas
vigilancia de los mismos, cuando hay evidencias de en detección de anticuerpos son capaces de detectar la
infección, fundamentalmente para no transmitir los agentes infección vírica durante la fase crónica solamente,13 por
causales de enfermedades infecciosas como son el Virus lo que es necesario conocer la inmunobiología de la
de la Hepatitis B (VHB), Virus de la Hepatitis C (VHC) y infección para interpretar adecuadamente los resultados
Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). brindados por las técnicas NAT, y darles su justo valor.
El principal problema que se tiene en el escrutinio de los De esta manera es imprescindible contar con ambas
donadores es que el tamizaje de agentes etiológicos se metodologías para disminuir la probabilidad de no detectar
realiza mediante la huella inmunológica detectando IgG, productos sanguíneos infectantes. Por ejemplo se ha

* Banco Central de Sangre CMN “La Raza" Banco Central de Sangre. Centro Médico Nacional Siglo XXI. IMSS. México, D.F.

Gac Méd Méx Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004 S 73

demostrado utilizando paneles de seroconversión de En el Banco de Sangre del CMN “La Raza” del IMSS,
donadores de plasma que después del contacto infectante se evalúa dicha metodología, estableciendo un
con el VHB, hay un período de 2 a 4 semanas antes de planteamiento en el cual la determinación de la serología
que se pueda detectar el antígeno de superficie de la de VIH y VHC se realiza por quimioluminiscencia usando
hepatitis B (HBsAg) durante el cual, el ADN VHB puede un aparato PRISMA, al igual que la determinación de
ser detectado por pruebas NAT. HBsAg. Lo cual determina períodos de ventana para
hepatitis B de 45 días, hepatitis C de 70 días y VIH de 16
días, los cuales se verán reducidos con el estudio
El sistema de minipooles y la automatización de NAT adicional de la prueba TMA, en minipooles de 16 plasmas.
en el banco de sangre El objetivo genérico del estudio es el determinar la
sensibilidad de TMA simultánea para la detección de
El advenimiento de la tecnología de microchips hizo hepatitis B, hepatitis C y VIH en minipooles de 16 muestras
posible inventar aparatos que pudieran automatizar las en donadores, contrastando con la quimioluminiscencia y
técnicas NAT, y particularmente que fueran de alto la determinación individual.
rendimiento al realizar mezclas o pooles de los plasmas o La técnica en su proceso genérico se muestra en el
sueros de los donadores, y aún más, determinar en un cuadro I.
mismo tubo de reacción los dos virus RNA que son VHC El principio de la metodología TMA Procleix es la
y HIV y el DNA que es el VHB. siguiente:
En el Banco de Sangre del CMN “La Raza” se evalúa • Captura Selectiva .
uno de esos aparatos, con su metodología, que utiliza • Captura los ácidos nucleicos virales en micropartícu-
como mezclador el TECAN y la metodología NAT la las magnéticas.
denominada PROCLEIX ULTRIO ASSAY que es una • Amplificación Mediada por Trascripción (TMA).
técnica basada en la amplificación mediada por • Amplifica porciones de RNA y/o DNA.
trascripción. • Detección.
El sistema Procleix Ultrio creado por Chiron y Gen-
Probe aparentemente disminuye la ventana serológica Ensayo de protección de la hibridación (HPA) inactiva
entre la infección y la detección amplificando y detectando selectivamente el marcaje AE (éster de acridinio) sobre las
secuencias virales.16 Se ha reportado que reduce la sondas no hibridadas para reducir al máximo el ruido de
detección de la ventana arriba de 50% para VIH, de 22 fondo.
días a aproximadamente 11 días,14,17 y cerca de 72 días La tecnología de ensayo cinético dual (DKA) simul-
para VHC, de 82 días a aproximadamente 23 días.15 Para táneamente detecta el control (IC), la carga viral de RNA
VHB es detectado un promedio de 20 días más temprano o la señal de DNA.
que las pruebas sexológicas.18 La evaluación contempla trabajar con 6 000 muestras
Sin embargo existe evidencia de que la metodología en 375 pooles de 16 muestras cada uno, y 2000 procesadas
puede no ser tan sensible como se piensa. Varía su individualmente para la determinación simultánea de
sensibilidad de acuerdo a la seroprevalencia, llegando a VIH, VHB y VHC.
detectar de 10 a 20 copias, pero debe ser probada en las Los resultados preliminares hasta el momento son de
poblaciones en las cuales se utilizará para dar su valor real 5264 donadores en 329 pooles,(Cuadro II).
a esa población. Se ha reportado que el grado de detección
depende del número de copias virales en el paciente, en el
caso de VIH < 400 copias/mL pueden no ser detectadas en Cuadro II.
minipooles de 8 muestras, o aun procesándola como
Pooles Discriminatorios Quimioluminiscencia
muestra única, por lo que se define que ambas metodologías,
positivos positivos positivos
la serológica y la NAT son imprescindibles y no mutuamente
excluyentes. 11 11 11

Cuadro I.

Hacer Procesamiento Reacción Detección en Leer resultados

minipooles muestras en TMA en baño de agua en el
de 16 pool o individual baños de luminómetro
muestras agua

S 74 Gac Méd Méx Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004

 4. Jos JAM, Weusten Harry AJ, van Drimmelen P, Nico L.
Cuadro III. Mathematic modeling of the risk of HBV, HVC, and HIV
transmission by window-phase donations not detected by NAT.
Pruebas Procleix Quimioluminiscencia Transfusion 2002;42:537-48.
discriminatorias TMA 5. Roth Wk, Weber M, Buhr S, et al. Yield of HCV and HIV-1 NAT
after screening of 3.6 million blood donations in central Europe.
VHC 8 8 Transfusion 2002;42:862-8.
VIH 2 2 6. Dodd RY, Notari EP 4th, Stramer SL. Current prevalence and
VHB 1 1 incidence of infectious diseases markers and esstimated
window-period risk in the American Red Cross blood donor
population. Transfusion 2002;42:975-9.
7. Gallarda JL, Dragon E. Blood screenin by nucleic acid
amplification technology:Current issues, future challenges.
Molecular Diagnosis 2000;5:11-22.
Hasta el momento la positividad de los pooles y las 8. Schüttler CG, Caspari G, Jursch CA, et al. Hepatitis C virus
pruebas discriminatorias han coincidido, no hay resultados transmission by blood donation negative in nucleic acid
amplification tests for viral RNA(letter).Lancet 2000;355:41-2.
falsos positivos. Los ensayos discriminatorios diferencian 9. Matsumoto C, Tadokoro K, Fujimura K, et al. Analysis of
la positividad, porque en el pool positivo no se sabe que HBV infection after blood transfusion e Japan through
ácido nucleico fue detectado, y las pruebas discriminatorias investigation of comprehensive donor specimen repository.
emplean sondas específicas para VIH, VHC ó HB. Transfusion 2001;41:878-84.
Pruebas Discriminatorias de los 11 pooles positivos, 10. Weusten JJ, Drimmelen HA, Lelie PN. Mathematic modeling
of the risk of HBV, HVC, and HIV transmission by window-phase
cuadro III.
donations not detected by NAT. Transfusion 2002; 42:537-48.
Actualmente con estos resultados preliminares existe 11. Mitsunaga S, Fujimura K, Matsumoto C, et al. High-troughput
coincidencia entre la prueba serológica de quimioluminis- HBV DNA and HCV RNA detection system using a nucleic acid
cencia y TMA discriminatorio. purification robot and real-time detection PCR: its to analysys
Hasta el momento la metodología Procleix en las of posttransfusion hepatitis.Transfusion 2002;42:100-5.
aproximadamente 6 corridas, ha invalidado 1. Todo coincide 12. Seed CR, Cheng A, Ismay SL, et al. Assesing the accuracy
of three viral risk models in predicting the outcome of implementing
con los resultados de otros investigadores que han
HIV and HCV NAT donor screening en Australia and the
encontrado discordancias entre NAT y serología. Con implications for future HBV NAT. Transfusion 2002;42:1365-72.
estos resultados podemos concluir preliminarmente que 13. Ling AE, Robbins KE, Brown TM, et al. Failure of routine HIV-
aparentemente no hay problemas de resultados falsos 1 tests in a case involving transmission with preseroconversion
positivos, por lo que la especificidad será como se ha blood components during the infecctious window period. JAMA
referido por el fabricante del 100%. Las discrepancias que 2000;284:210-4.
14. Busch MP, Stramer SL, Kleinman SH. 1997. Evolving
pudieran existir y que se han encontrado en otros estudios applications of nucleic acid amplification assays for prevention
deben de interpretarse en función del ciclo de infección del of virus transmission by blood components and derivatives. In:
agente determinado, por lo que la sensibilidad analítica del Garrity G (ed): Applications of Molecular Biology to Blood
ensayo Procleix Ultrio es alta, pero se determinará con el Transfusion Medicine. AABB. Bethesda, MD. 123-176.
estudio del panel de seroconversión que podrá demostrar 15. Schreiber GB, et al. 1996. For the Retrovirus Epidemiology
que achica la ventana de detección, lo cual será crítico Study.
16. Kolk D, Martínez A, Ahern S, Binder A, Knight J, Tidd J, Sun
para el análisis de la sensibilidad en pooles de 16 muestras. G, Coffman B, Eaton B, McElroy A, Park M, Linnen J,
Dockter J, McDonough S, Mimms LT, Giachetti C,
Referencias Macioszek J. Simultaneous NAT screening of HIV-1, HCV and
HBV in blood donations on a fully automated, high throughput
1. Jackson BR, Busch MPñ, Stramer SL, AuBuchon JP. The system. Abstract Transfusion 2002;42,9S:82S-83S.
costeffectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV in whole-b lood 17. Aprili G, Gandini G, Piccoli P, et al. Detection of an early HIV-
donations. Transfusion 2003; 43:721-729. 1 infection by HIV RNA testing in an Italian blood donor during
2. Busch MP, Kleinman SH, Jackson B, et al. Committee report. the preseroconversion window period. Transfusion
Nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion- 2003;43:848-52.
transmitted infectious diseases: Report of the Interorganizational 18. Linnen JM, Broulik A, Umali A, Kolk D, Dockter J,
Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing of Blood McDonough S, Mimms L, Giachetti C. Analytical Sensitivity
Donors. Transfusion 2000;40:143-59. of the PROCLEIX™ ULTRIO™ ASSAY (A TMA-based triplex
3. Glynn SA, Kleinman SH, Wrigh DJ, Busch MP. International assay) for simultaneous screening of HIV-1, HCV and HBV in
application of the incidence rate/window period model. Tranfusion blood donations and effect of assay sensitivity on closing the
2002;42:966-72. HBV detection window. Abstract Transfusión 2002;42:9S:8S.

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