DESARROLLO DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE Β-

CAROTENO Y GLICEROL A PARTIR DE LA MICROALGA DUNALIELLA SP. EN LA

SALINA LAS CUMARAGUAS

LAURA MARCELA PATIÑO ACEVEDO-1650824

LUIS ARANDIA AVILA-1650874

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE

INGENIERIA AMBIENTAL

LIMNOLOGIA I

CUCUTA 2019
 DESARROLLO DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE Β-

CAROTENO Y GLICEROL A PARTIR DE LA MICROALGA DUNALIELLA SP. EN LA

SALINA LAS CUMARAGUAS

LAURA MARCELA PATIÑO ACEVEDO-1650824

LUIS ARANDIA AVILA-1650874

PRESENTADO A:

SANCHEZ DE AVENDAÑO MARJORIE JOSEFINA

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE

INGENIERIA AMBIENTAL

LIMNOLOGIA I

CUCUTA 2019
DESARROLLO DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE Β-

CAROTENO Y GLICEROL A PARTIR DE LA MICROALGA DUNALIELLA SP.

EN LA SALINA LAS CUMARAGUAS

Las microalgas contienen una amplia variedad de componentes químicos entre los que

se encuentran los carotenoides, ficobilinas, ácidos grasos, polisacáridos, vitaminas, minerales,

esteroles y otros compuestos biológicamente activos, por lo que han sido utilizadas durante

mucho tiempo para la alimentación animal y humana. Las micro algas, como organismos

fotosintéticos, son imprescindibles en el mantenimiento de la vida en La Tierra ya que

proporcionan compuestos orgánicos reducidos y oxígeno para soportar al resto de la vida del

planeta. Las microalgas son la principal fuente de producción fotosintética del planeta. Como

organismos unicelulares que son, tienen una capacidad de crecimiento y de generación de

biomasa mucho mayor que las plantas superiores, ya que no necesitan arraigar o generar

estructuras reproductoras, lo que les permite duplicarse en cuestión de horas. Las microalgas

tienen una composición bioquímica compleja debida a la presencia del aparato fotosintético,

que le da una gran riqueza en pigmentos y componentes como citocromos y ácidos

poliinsaturados de cadena larga (PUFAs). Esto resulta en un elevado contenido en productos

de alto valor, como los carotenoides luteína y astaxantina o los PUFAs DHA y EPA. Como

captadoras de CO2 y asimiladoras del nitrógeno, son además una fuente sostenible

de biocombustibles y biofertilizantes.

Uno de los géneros de microalgas más utilizados por su importancia comercial en la

obtención de compuestos bioactivos es Dunaliella; los organismos de éste género contienen

entre 50 y 60% de proteína en células verdes en base al peso seco y alrededor de 30% para

células rojas con un alto contenido de carotenoides. Las especies de Dunaliella presentan

además en su composición, un porcentaje considerable de pigmentos como clorofila así como

un amplio rango de carotenoides y xantofilas incluyendo β-caroteno y luteína, los cuales por
su actividad provitamínica tienen aplicación tanto en la industria alimentaria como en la

farmacéutica. Para obtener una mayor producción de biomasa en estos organismos, se

recomiendan los cultivos semicontinuos, en los cuales se mejora la eficiencia en la

productividad y la composición bioquímica debido a la tasa de renovación de agua y de los

nutrientes. Diversos estudios han demostrado que la producción de carotenoides en

Dunaliella puede optimizarse mediante variaciones de salinidad, intensidad luminosa,

temperatura y limitación de nutrientes. Uno de los nutrientes más importantes en el

crecimiento de las microalgas, es el nitrógeno, por lo que es importante Dunaliella sp.

Dunaliella salina es un tipo de micro-alga halófila que se conoce por su

actividad antioxidante, y es usada en cosméticos y en suplementos nutricionales. Es la

responsable de que las salinas se vean rojizas, ya que es una gran productora de carotenoides,

especialmente el beta-caroteno. Son las condiciones de estrés salino y luminoso, lo que hace

que tengan esta reacción. Es un alga clorofila predominante en ambientes hipersalinos,

caracterizada por acumular grandes cantidades de carotenoides, llegando hasta 14 % de su

masa seca, lo que la convierte en una fuente potencial de β-caroteno natural de importancia

para el uso en las industrias alimenticias y farmacéuticas, así como una herramienta útil para

estudios bioquímicos relacionados con biosíntesis de pigmentos y mecanismos de regulación

ante ambientes extremos. Diversos estudios han demostrado que la producción de

carotenoides en Dunaliella salina puede optimizarse mediante variaciones de las condiciones

de cultivo, las cuales incluyen aumento de la salinidad, intensidad luminosa y temperatura.

Dunaliella se multiplica por división asexual, sin embargo, la reproducción sexual se

produce en raras ocasiones, mediante isogametos (proceso de conjugación).Esta alga no

contiene una pared celular rígida, sino una delgada membrana elástica. Se sabe que se

acumulan carotenoides bajo diversas condiciones de estrés. Posee un notable grado de

adaptación al medio, mediante la producción de un exceso de β-caroteno y glicerol, de esta

manera mantiene un balance osmótico. Los β-carotenos se acumulan en forma de glóbulos de

lípidos entre los espacios de los tilacoides de los cloroplastos. Los β-carotenos que producen

presentan su forma natural, sin embargo también producen sus isómeros, trans-, cis-9, 13 cis,

y las formas 15-cis, los cuales funcionan como pigmentos accesorios para la recolección de

luz, protegiendo de este modo el aparato fotosintético contra los daños que puede provocar la

incidencia de luz.

En el campo de la cosmética, el uso de las microalgas es reciente y las primeras

fueron tres especies de microalgas de cuyos extractos ya existe alguna patente y ya se van

consolidando en el mercado: Spirulina (Arthrospira), Dunaliella salina y Chlorella. La

Arthrospira y la Chlorella contienen sustancias emolientes, anti-inflamatorias y reparadores

de la piel, y sus extractos se incluyen en diferentes productos del mercado cosmético.

Recientemente se ha introducido un extracto de otra microalga, la Nannochloropsis oculata,

para mejorar la tersura de la piel. De modo general se usan, pues, para estimular la síntesis de

colágeno en la piel, para prevenir el envejecimiento, con fines emolientes e hidratantes y para

mejorar la renovación celular. Todas ellas están incluidas en patentes de importantes

compañías fabricantes de ingredientes activos cosméticos. Existen otras aplicaciones, como

los polisacáridos, que han encontrado un nicho de mercado en la cosmética como emolientes

y espesantes, a pesar de competir con los derivados de las macroalgas.

Una de las aplicaciones más interesantes de las microalgas es la relacionada con las

sustancias de interés químico-farmacéutico, debida a la utilidad práctica que estas encuentran

en biomedicina, farmacología, fitocosmética y en la industria alimentaria. A partir de

diferentes especies de microalgas se extraen sustancias como vitaminas, pigmentos,

alcoholes, aminoácidos, polisacáridos sulfatados, glicerol, ácidos grasos polisaturados,

enzimas, extractos acuosos reguladores del crecimiento, ceras, biosurfactantes, fosfolípidos,

lecitinas, betaínas y precursores de prostaglandinas, dependiendo de las que sean capaces de

sintetizar, así como sustancias con efectos terapéuticos como: cicatrizantes,

inmunorreguladores, anticancerígenos, tensorreguladores, antiinflamatorios,

hipocolesterolémicos, entre otros.

Dunaliella salina y Dunaliella bardauril son muy valiosas por su alto contenido en β-

caroteno, además de ser fuentes de glicerol y proteína; aunque estos son los tres productos de

mayor interés comercial en estas microalgas, pueden incluirse, además, vitaminas, enzimas,

como la glicerol deshidrogenasa, ácidos grasos y reguladores del crecimiento.

El Beta-caroteno es un precursor de la vitamina A, que es esencial para muchas

funciones en el cuerpo humano, tales como visión, el crecimiento y desarrollo de los huesos y

actúa como una coenzima, de igual forma, tiene funciones en el equilibrio de las hormonas.

La capacidad antioxidante de las microalgas despierta interés en la terapia de enfermedades

relacionadas con la oxidación, como la degeneración macular o diverso tipo de

inflamaciones, así como en la prevención de ciertos desarrollos tumorales (de piel, de mama

y de colon, entre otros), lo que confiere a estas moléculas valor como aditivos alimentarios.

Los pigmentos son moléculas orgánicas de mucha utilidad en la industria alimentaria,

química y farmacéutica, así como en biomedicina, cosmetología y acuicultura. Las algas

contienen los tres grupos de pigmentos fotosintéticos mayoritarios: clorofilas, que absorben

luz azul y roja; carotenoides, que absorben en la región del verde y el azul; y ficobilinas, que

absorben luz verde, amarilla y anaranjada. Por medio de estos pigmentos, que aparecen

asociados a proteínas en el cloroplasto, se lleva a cabo la absorción de la luz en toda la zona

del espectro visible y gracias a ellos se realiza la fotosíntesis. Además de la importancia

fisiológica y el papel que juegan los pigmentos en la vida de los organismos fotosintéticos,

estos constituyen valiosos productos al servicio de las necesidades del hombre. Se pueden

citar autores que explican la utilización de las ficoeritrinas como colorante fluorescente en
inmuno ensayos, de las ficocianinas en fitocosmética, además de su amplio uso como

moduladores de la respuesta inmune, otros destacan el uso de diferentes carotenoides como

colorantes alimentarios, implicados en la calidad de productos de origen animal, así como la

utilización de derivados de la clorofila en la conservación de alimentos y como aditivos en

diferentes preparaciones farmacéuticas y cosmética.

En el cultivo de microalgas, el rendimiento depende de factores como la viabilidad y

concentración celular, el suministro de nutrientes, el control de parámetros físico-químicos

como el pH, la salinidad y la temperatura; las condiciones de iluminación y la disponibilidad

de la luz; esta constituye un factor fundamental tanto por sus efectos como por sus

interacciones con otros parámetros. En lo que se refiere a la extracción de β-caroteno de

Dunaliella sp.,Mojaat y colaboradores presentan una nueva estrategia de selección de

disolvente proporcionando información experimental nueva para la selección de disolventes

orgánicos adecuados para la extracción de β-caroteno de Dunaliella salina, donde el β-

caroteno se extrae en disolventes orgánicos o aceites comestibles, directamente y después las

células se rompen por osmosis o shock mecánico lo que lleva a una disminución significativa

de la cantidad de trabajo experimental requerida. El investigador presenta varios métodos de

extracción de β-caroteno a partir de algas con los métodos adecuados a cada solvente, un

biodisolvente orgánico compatible está en contacto con la fase acuosa donde las células están

llevando a cabo la bioconversión; el producto se extrae de forma continua en la fase orgánica

debido a un efecto de la permeabilidad del disolvente en la celda membrana. Sólo los

disolventes que tienen un valor de coeficiente de partición, indicador de su hidrofobicidad,

mayor que 5 o una masa molar superior a 150 g/mol, son aplicables para la extracción

biocompatible de βcaroteno a partir de Dunaliella salina. Sin embargo, para la selección más

racional de los solventes, compuestos de éter, cetona y alcohol se calculó aplicando el modelo

de Osborne, donde la predicción de la toxicidad de cualquier disolvente dado en dos fases

líquidas del sistema utilizando Dunaliella salina fue posible hasta cierto punto la inducción y

la extracción de β-caroteno. La prueba de la eficacia de la extracción de mezclas de

disolventes puso de manifiesto que la mezcla de un disolvente altamente apolar (por ejemplo,

decano) con un uno más polar (CH2 Cl2 , MEK) combina la propiedades deseables de cada

uno: unos pocos volúmenes de disolvente polar tiene permitido una mejor extracción de β-

caroteno, mientras el solvente orgánico polar es biocompatible cuando se añade el solvente

biocompatible (decano). Sin embargo, la selección de disolvente polar es complicada. Esta

investigación puede dar una idea de los diferentes solventes que permiten realizar una mejor

cuantificación de β-caroteno a partir de la microalga y que, dependiendo de los solventes

disponibles, podrían utilizarse compuestos similares en las muestras de Dunaliella de la salina

Las Cumaraguas.

Esta investigación resalta la tecnología del cultivo de Dunaliella, la cual puede

hacerse mediante cultivos a gran escala: cultivo extensivo, desarrollado sin agitación, con un

control mínimo de las condiciones ambientales; cultivo intensivo, usando una alta tecnología

para controlar los factores que afectan el crecimiento y bioquímica del alga; y cultivo muy

intensivo, el cual se realiza en fotobiorreactores cerrados (PRRs), los cuales permiten

establecer los medios más apropiados para la obtención de cantidades de β-caroteno. El autor

destaca que dentro de los factores que estimulan la acumulación de carotenoides están las

variables ambientales: calidad e intensidad de luz y temperatura y los factores nutricionales:

compuestos químicos, sales y limitación de nutrientes.

En el estudio de la inducción y extracción de βcaroteno en muestras de Dunaliella

salina en dos localidades: la primera, un área de aguas estancadas en Bubiyan Island, una

localidad aislada de Kuwait, la segunda, una muestra traída desde Perth en Australia, se

mantuvieron y produjeron cultivos puros /11/. Un conjunto de experimentos se llevó a cabo

para estudiar y evaluar los factores de estrés ambientales requeridos para la inducción de β-
caroteno en el laboratorio simulando las condiciones en el mar, en tanques de 200 · 65 · 25

cm3 y con cantidades de sal establecidas por recomendaciones de expertos. Las extracciones

de carotenoides se realizaron a escala de laboratorio por análisis espectrofotométrico y la

determinación cualitativa de β-caroteno por cromatografía en columna.Los resultados

mostraron que las dos muestras de D. salina tendían a cambiar de color, de verde a amarillo o

marrón bajo las siguientes condiciones de cultivo: salinidad alta (200 a 250 unidades

prácticas de salinidad) y temperatura elevada (38,5 ºC), alta intensidad de luz (55 · 103 lux) y

bajas concentraciones de medios de cultivo, es decir, en el 25 % de cualquiera de los dos

medios de cultivos comerciales de algas. Otro conjunto de ensayos se llevó a cabo para

extraer β-caroteno utilizando el método de extracción de fluidos a presión. Los resultados

obtenidos mostraron que las muestras de D. salina contenían cantidades relativamente buenas

de β-caroteno 33,8- 96,5 pg. célula-1. Debido al éxito y alentadores resultados obtenidos en

este estudio, se recomienda que se lleve a cabo una producción a escala piloto de Dunaliella

salina cultivada utilizando canalizaciones exteriores de poca profundidad.

Esta investigación resalta la tecnología del cultivo de Dunaliella, la cual puede

hacerse mediante cultivos a gran escala: cultivo extensivo, desarrollado sin agitación, con un

control mínimo de las condiciones ambientales; cultivo intensivo, usando una alta tecnología

para controlar los factores que afectan el crecimiento y bioquímica del alga; y cultivo muy

intensivo, el cual se realiza en fotobiorreactores cerrados (PRRs), los cuales permiten

establecer los medios más apropiados para la obtención de cantidades de β-caroteno.Tras

obtener una caracterización descriptiva de los niveles de radiación UV y PAR, se han

estudiado tres cepas de Dunaliella en cultivos bajo condiciones controladas de laboratorio

para decidir cuál de ellas podría ser más apropiada para el cultivo exterior. En esta parte de

los trabajos se analiza el efecto de radiaciones UV-A y UV-B sobre la productividad y valor

biotecnológico de cultivos de microalgas, constatando el valor potencial de la radiación

ultravioleta (UV), fundamentalmente la menos energética, UV-A, en la estimulación de la

acumulación de carotenoides sin pérdida de viabilidad. Asimismo, se ha confirmado el papel

esencial de la radiación UV-B en la acumulación de β-caroteno y en detrimento de la

viabilidad celular de los cultivos, después de cortos períodos de iluminación con una alta

relación UVB/PAR. La cepa de Dunaliella que resultó más adecuada para continuar con la

investigación en cultivos exteriores fue el mutante obtenido por el grupo (Dunaliella EMS).

La mencionada microalga mostró un crecimiento rápido, una buena capacidad de adaptación

a las condiciones exteriores y niveles cuantitativamente comparables al de otras cepas del

género (Dunaliella bardawil) el cual es de un 15 % mayor en cuanto a la acumulación de

carotenoides.

Esta investigación es de mucha importancia, ya que refleja la importancia de la

utilización de cultivos de microalgas con diversos fines y las condiciones ambientales a las

que se deben cultivar dichas especies para obtener rendimientos de β-caroteno. Por otra parte

el trabajo destaca que el cultivo de esta microalga se puede realizar bajo diversas formas

dependiendo de los recursos que se tengan al alcance, lo cual es de provecho para esta

investigación ya que es un factor clave a la hora de realizar esquemas tecnológicos y evaluar

factibilidades económicas al realizar la proyección a escala industrial.

En Venezuela, las investigaciones relacionadascon el cultivo y extracción de

carotenoides a partir de Dunaliella sp. se refieren en el trabajo "Cuantificación de

carotenoides totales y β-caroteno en dos cepas de Dunaliella salina (Chlorophyta, Volvocales)

aisladas de lagunas hipersalinas de Venezuela" (Romero, et al., 2008) /13/. El objetivo

principal fue identificar caratenoides y en especial β-caroteno, esto mediante pruebas de

cromatografía en liquidos de alta eficiencia. Se probaron diferentes mezclas de solventes:

acetona/agua, acetona/metanol y tetrahidrofurano/etanol, en tres proporciones cada una,

50/50, 70/30 y 90/10 V/V.

 Por otro lado en el trabajo "Análisis físico-químico y estudio de micro algas y hongos

de las aguas de la salina «Las Cumaraguas» en Paraguaná, Estado Falcón". Fue realizado

bajo las directrices del método descrita en la American Public Health Asociation, la cual trata

de hacer de hacer toma cinco días por cinco semanas. Se hizo observación directa con el

microscopio donde se observaron Dunaliella sp; además se realizaron diferentes pruebas de

tolerancia a diferentes concentraciones y consigo poder identificar parámetros como pH,

conductividad, temperatura y oxígeno disuelto.

En ese mismo sentido, Araujo J., Chirinos J., & Vegas (2012) realizaron una

investigación titulada "Obtención de B-carotenos con fines industriales a partir de

biofactorías fotosintéticas de Dunaliella sp. del sector Las Cumaraguas, municipio Falcón,

estado Falcón", las cuales se hicieron pruebas con el fin de observar aplicaciones industriales.

El trabajo se realizó tomando muestras por duplicado en 10 estaciones. Lo que dio como

resultados unos rangos de temperatura, pH, Oxigeno requerido y fosforo total. Se realizaron

diferentes pruebas para determinar que método era mas eficiente, arrojando que el manual fue

el más alto con una eficiencia de 68%. Reflejando que la vibración ocasionada por la

centrifugación (61,8 %) y la sonicación (47,29 %) originan cambios en las moléculas y

probablemente esto se deba a efectos en la disrupción molecular y aumento de la temperatura.

Se utilizaron solventes con alta solubilidad sobre los carotenos, la acetona para la extracción

de los pigmentos totales y hexano en la obtención de β-caroteno.

MATERIALES Y METODOS

Se deben verificar las condiciones ambientales de las micro algas para recrear esas

condiciones a nivel laboratorio, tales como pH, conductividad, temperatura, nitrógeno total y

salinidad. Todo esto siguiendo las medidas dispuestas en la American Public Health

Asociation y resumidad en la siguiente tabla 1.

Determinación de pH por el método electrométrico (N° 4500-H+B, APHA, AWWA,

WPCF)

Este método consiste en la determinación de la actividad de iones hidrogeno mediante

la toma de muestra con un electrodo patrón y otro de referencia.

Determinación de oxígeno disuelto. "Método Winkler Modificado" (Norma APHA,

WPCF, AWWA)

El método mas confiable para medir volumétricamente el OD es, la adición de

magnesio, seguido de la adición de un álcali fuerte, a la muestra que está contenida en un

frasco con tapón de vidrio. OD disuelto oxida al Hidróxido manganoso divalente a

Hidróxidos con mayor número de oxidación. Con la adición de yodo el magnesio regresa a su

forma oxidada, en este caso el yoduro obtiene el OD. Entonces Se valora en yodo como

solución patrón del tiosulfato de sodio. El punto final de la titulación se puede detectar

visualmente con un indicador de almidón, o electrométricamente, con técnicas potencio

métricas.
Determinación de nitrógeno total. "Método Kjeldahl" (Norma APHA, WPCF,

AWWA)

Este método determina el nitrógeno de oxigeno -3, esto mediante la adición de ácido

sulfúrico causando que el nitrógeno amínico, pase hacer sulfato de amonio que en exceso de

hidróxido de sodio produce amoniaco, el cual es destilado en base alcalino absorbido por el

ácido bórico o sulfúrico.

Determinación de fósforo total (PT): "Método del cloruro estañoso" (Norma

APHA, WPCF, AWWA)

Descripción del método: Se basa en la formación de ácido molibdofosfórico que se

reduce con cloruro estañoso a azul de molibdeno de color intenso.

Determinación de conductividad eléctrica por el método electrométrico: (N°2510A,

APHA, AWWA, WPCF)

Es una expresión numérica para una solución en cuanto a su capacidad de transportar

corriente eléctrica. Esta capacidad depende de la presencia de iones y de su concentración

total, de su movilidad, valencia y concentraciones relativas, así como de la temperatura de la

medición.

Determinación de la salinidad por el método electrométrico: (N°2520A, APHA, AWWA,

WPCF)

Se hace generalmente calculando una propiedad física como lo es la conductividad,

esto de acuerdo a una relación con la salinidad. Esto se realiza gracias a medidas que se

toman con respecto a una solución estándar que permite tomar una medida. Por las

condiciones controladas se pueden observar en la tabla. Esto para garantizar el crecimiento

exponencial de la micro alga. A partir de estas variables se puede simular el proceso gracias

al software Statgraphics, con un diseño multifactorial de 3 niveles.

Atributos de Diseño Factorial Multinivel

Clase de diseño: Factorial Multi nivel Diseño Base Número de factores

experimentales: 3. De esta forma podemos evaluar en qué momento se da un mayor

crecimiento y por ende es la más óptima de los compuestos de interés por parte de la

Dunaliella sp.

Metodología para la extracción de carotenoides totales y la determinación cuantitativa

de b-caroteno y glicerol a partir de la micro alga Dunaliella sp.

Determinación de la concentración de carotenos totales

 Se agrega a un embudo de separación 50 ml de muestra y 50 ml de acetona, se

decanta y se va agregando acetona poco a poco hasta conseguir el objetivo de extraer

todos los pigmentos.

  Agregar 15 ml de hexano

 Agregar una pequeña cantidad de Na2SO4 anhidro. Dejar la solución con el agente

desecante unos 15 min. Agitar ocasionalmente.

 Transferir la solución que contiene hexano a un matraz de 100 ml y terminar aforando

con hexano.

 Tomar aproximadamente 2mL de esta solución con una pipeta y transferir a un tubo

de ensayo.

 Agregar 8 ml de hexano y medir la absorbancia a 490 nm.

 Llevar al rota evaporar la solución que contiene el hexano.

 Pesar la muestra para saber la cantidad de carotenos que hay.

 Se calcula la concentración con la siguiente formula.

Determinación de la concentración de las fracciones de -

caroteno por cromatografía de columna

 Empacar la columna y sujetarla en el soporte de las pinzas.

 Engrasar la llave y mantenerla en posición de cerrado.

  Tomar una pequeña porción de algodón y dejarla caer en la columna con ayuda de

una varilla de vidrio.

 Agregar 8 mL de hexano y presionar el algodón para que quede bien colocado.

 Preparar una suspensión de 10 gramos de sílica gel en 40 mL de hexano y agitar

durante 5 min en un vaso precipitado de 100 mL.

 Añadir a través de un embudo sobre el eluyente (hexano) que se encuentra en la

columna.

 Abrir la llave para eliminar el exceso de eluyente (hexano) teniendo cuidado de no

dejar secar la sílica gel.

 Añadir pequeñas porciones de eluyente (hexano) a medida que desciende el mismo.

 - Colocar una pequeña porción de algodón de aproximadamente 1 cm de altura sobre

el absorbente (sílica gel).

 - Añadir 15 mL de la muestra problema en la parte superior del adsorbente (sílica gel)

con ayuda de una pipeta y el aspirador teniendo cuidado de no salpicar las paredes.

 Abrir la llave, dejando que la muestra penetre en la sílica gel.

 Cerrar cuando la mezcla de colorantes alcance la interfase entre el algodón y la parte

superior del adsorbente (sílica gel).

 Añadir una porción del eluyente (hexano) igual al volumen de la muestra.

 Abrir la llave dejando que el nivel descienda nuevamente hasta la interfase algodón-

adsorbente (sílica gel).

 Repetir la operación añadiendo pequeñas porciones tres o cuatro veces hasta

asegurarse que la muestra quede adsorbida en el interior de la columna.

Colectar las fracciones en frascos viales de 5 ml y controlar la separación haciendo

cromatografía en papel a cada una de fracciones ante una muestra testigo (patrón de b-
caroteno). Se evaluará el porcentaje de rendimiento de la cantidad de β-caroteno obtenido de

las fracciones en cromatografía en columna, respecto a la cantidad de pigmentos totales y los

carotenos totales con la finalidad de estimar las cantidades de b-caroteno en gramos que se

puede recuperar a partir de la Dunaliella sp.

Metodología para estimar la cantidad de glicerol

De acuerdo con lo reportado por (Hernández, et al., 2000), la biomasa resultante del

cultivo de Dunaliella salina se trata con hidróxido de calcio (0,3 g de Ca(OH)2/g de biomasa)

en atmósfera de nitrógeno y una temperatura de 100 °C durante 2 horas, en condiciones de

agitación.

Se deja enfriar a 50°C , la mezcla resultante es filtrada luego de adicionarle una

pequeña cantidad de agua y como resultado se obtiene un producto verde claro- amarillento.

Se procedió a la extracción del β-caroteno con un disolvente insoluble en agua y acto seguido

se neutralizó el filtrado hasta un pH de 6-7, con ácido sulfúrico al 50 %.

La disolución obtenida después de filtrado el CaSO4 precipitado se evaporó al vacío

hasta lograr una sustancia viscosa amarillenta, que fue agitada durante varias horas con 3 ml

de isopropanol. Se filtró la sal no disuelta, se evaporó el filtrado y se repitió este

procedimiento con 2 ml de isopropanol.

Resultados y Discusiones

Debido a que aun esta en ejecución el proyecto, los resultados están relacionados es

con el rendimiento de extracción de β-caroteno de la Dunaliella sp. Lo que indica que por el

momento no se han manejado condiciones, ni temperatura, pH o radiación, esto debido a que

solo se han evaluado las condiciones en las que se encontraban las algas en todo caso, la

manipulación de las condiciones fue precisamente en la extracción y cuantificación del b-

caroteno de las cepas de Dunaliella sp, provenientes de las salinas de Las Cumaraguas Estado
Falcón. Los análisis de laboratorio permitieron recuperar un 45,18 % de b-caroteno de los

pigmentos extraídos con acetona y el 54,82 % restante es de los otros pigmentos presentes en

la Dunaliella sp. Cabe destacar que este tipo de estudio se realizó anteriormente en la

búsqueda de caroteno total, sin embargo en este caso se busca evaluar los b-caroteno que se

encuentra en algas ya tratadas con el fin de recuperar materias prima, y mirar si se puede

utilizar en el sector industrial.

Se buscó encontrar la estimación de recuperación del -caroteno, sobre el de otros

carotenos, dando como resultado una estima del 76,14% de rendimiento, que supero en un

50% estudios anteriores los cuales utilizaron solventes como acetona/metanol, sin embargo

para este estudio se utilizó el hexano, mostrando mejores respuestas en cuanto a la extracción

de Carotenos en especial el -caroteno.

BIBLIOGRAFIA

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partir de la microalga Dunaliella sp. en la salina Las Cumaraguas. Revista Cubana de

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