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SISTEMAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCION

SE DENOMINA BIOPROCESO A CUALQUIER OPERACIÓN QUE INVOLUCRE

LA TRANSFORMACIÓN EN PRODUCTOS DE UN SUSTRATO
DETERMINADO MEDIANTE EL USO DE MICROORGANISMOS, CÉLULAS
ANIMALES O VEGETALES O POR MATERIALES DERIVADOS DE ESTOS
COMO LAS ENZIMAS.
UN BIOPROCESO ESTÁ COMPUESTO DE TRES ETAPAS PRINCIPALES, LA
PRIMERA ETAPA SE DEFINE COMO LA PREPARACIÓN DE LA MATERIA
PRIMA DONDE SE REALIZAN DIFERENTES OPERACIONES NECESARIAS
PARA LLEVAR A CABO CON ÉXITO LAS BIOTRANSFORMACIONES, ENTRE
ESAS OPERACIONES SE ENCUENTRAN LA FORMULACIÓN DE LOS MEDIOS
DE CULTIVO Y LOS PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN DE LOS MISMOS POR
EL METODO CONVENIENTE. POSTERIORMENTE LA ETAPA DE LA
BIOREACCIÓN EN LA CUAL SE PRODUCEN LAS TRANSFORMACIONES DEL
SUSTRATO PARA CONVERTIRLO EN BIOMASA O EN BIOMASA MÁS
METABOLITOS PRIMARIOS O SECUNDARIOS. POR ÚLTIMO LA ETAPA DE
TRATAMIENTO DE LOS PRODUCTOS DE LA BIOREACCIÓN DONDE SE
REALIZAN LAS OPERACIONES DE SEPARACIÓN MECÁNICA, EXTRACCIÓN,
CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DEL MATERIAL DESEADO.

LOS SISTEMAS DE CULTIVO EN LABORATORIOS INDUSTRIALES PUEDEN

UTILIZARSE PARA VARIOS FINES, PARA LA PRODUCCION DE INOCULOS O
CULTIVOS SEMILLA, CULTIVOS PILOTO O DE EXPERIMENTACION Y/O
CULTIVOS DE PRODUCCION, TODOS ELLOS ENGLOBADOS DENTRO DE LO
QUE DENOMINAMOS BIOPROCESOS Y DENTRO DE UN RECIPIENTE
CONTENEDOR DENOMINADO BIOREACTOR.

ESTOS SISTEMAS DE CULTIVO PUEDEN SER:

1- ESTATICOS

2- EN MOVIMIENTO O AGITADOS

LOS CULTIVOS ESTATICOS PUEDEN REALIZARSE EN MEDIOS SÓLIDOS Y

LIQUIDOS, EN MEDIOS SÓLIDOS POR EJEMPLO EN BOTELLAS DE ROUX O
POWITSKY, DONDE EL MEDIO OCUPA UNA DE LAS CARAS DEL RECIPIENTE
Y EL RESTO ES CAMARA DE AIRE.
EL INTERCAMBIO DE OXIGENO Y GASES ES SIMPLE POR DIFUSION Y
ESTA ASEGURADO POR TRANSFERENCIA PASIVA A TRAVEZ DEL TAPON
DE ALGODÓN O GASA.
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EL METODO ES UTILIZADO MAYORMENTE PARA OBTENER ANTIGENOS

SOMATICOS EN PRODUCCION DE INMUNOGENOS VACUNALES O
REACTIVOS DE DIAGNOSTICO.

LOS MEDIOS LIQUIDOS SON UTILIZADOS MAYORMENTE EN PRODUCCION

DE Ag. SOLUBLES (TOXINAS) U OTROS M.O QUE DESARROLLAN MEJOR EN
ESTE TIPO DE MEDIOS (BCG, C. difteriae).
SE UTILIZAN TAMBIEN BOTELLAS TIPO ROUX O POWITSKY Y EL
INTERCAMBIO DE GASES ES TAMBIEN A TRAVEZ DEL TAPON EN FORMA
PASIVA.

PARA M.O AEROBIOS CULTIVADOS EN SISTEMAS ESTATICOS LA

RELACION MEDIO DE CULTIVO RECIPIENTE CONTENEDOR DEBE SER 1 –
10 ES DECIR EL VOLUMEN DE LIQUIDO REPRESENTA 1/10 DEL VOLUMEN
TOTAL DEL RECIPIENTE, ESTE NO DEBE MOJAR EL TAPON POR EL RIESGO
DE CONTAMINACION Y POR DIFICULTAR EL INTERCAMBIO DE OXIGENO Y
DE GASES DEL METABOLISMO BACTERIANO A TRAVEZ DE EL.
EN EL CASO DE ANAEROBIOS CULTIVADOS EN MEDIOS LIQUIDOS LA
RELACION MEDIO RECIPIENTE ES A LA INVERSA, EL MEDIO OCUPA 9/10
DEL VOLUMEN TOTAL DEL RECIPIENTE, PARA LOGRAR DISMINUIR LA
TRANSFERENCIA DE OXIGENO Y A SU VEZ FACILITAR LA EXPULSIÓN DE
GASES METABOLICOS.
LA ANAEROBIOSIS NECESARIA EN ESTOS CASOS, ES LOGRADA ADEMÁS
CON SUSTANCIAS REDUCTORAS PRESENTES EN LOS MEDIOS., EJ:
CISTEINA, CISTINA, TIOGLICOLATO DE SODIO, ETC.

CULTIVOS AGITADOS: LA AIREACIÓN PASIVA DE UN MEDIO DE CULTIVO A

VECES NO ES SUFICIENTE PARA MANTENER LAS CANTIDADES
NECESARIAS DE OXÍGENO A DISPOSICIÓN DEL M.O QUE LO REQUIERA, YA
SEA PARA SU NORMAL DESARROLLO COMO PARA LA PRODUCCIÓN DE
SUS METABOLITOS.
LA AGITACIÓN FACILITA LA OXIGENACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO, COMO
ASÍ TAMBIÉN LA NUTRICIÓN DEL M.O PONIÉNDOLO EN CONTACTO EN
FORMA HOMOGENEA CON LOS NUTRIENTES DEL MEDIO, ADEMÁS DE LA
SALIDA DE GASES TÓXICOS PRESENTES EN EL MEDIO HACIA EL
EXTERIOR COMO EN EL CASO DE CULTIVOS FERMENTADOS DE
ANAEROBIOS.

LOS MÉTODOS DE AGITACIÓN PUEDEN SER:

1- MECÁNICOS: LA AIREACIÓN ES PASIVA A TRAVVES DEL TAPON Y SE

FACILITA POR MOVIMIENTOS DEL LÍQUIDO DENTRO DE SU RECIPIENTE
CONTENEDOR.
PARA LOS ENSAYOS DE CULTIVO EN LABORATORIO LOS MÁS UTILIZADOS
SON LOS AGITADORES O SHAKERS DE 3 TIPOS:
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ROTATIVOS: QUE CONSISTEN EN UN BASTIDOR SOBRE UN MOTOR

ELÉCTRICO DONDE SE COLOCAN LOS RECIPIENTES A AGITAR
( GENERALMENTE ERLENMEYERS ) QUE REALIZA MOVIMIENTOS DE
ROTACIÓN SOBRE SU EJE; SON LOS MÁS UTILIZADOS POR OBTENER UNA
MEJOR AGITACIÓN Y UN MAYOR COEFICIENTE DE OXIGENACIÓN.

ALTERNATIVOS: QUE SE MUEVEN HACIA DELANTE Y HACIA ATRÁS

OSCILANTES

SE PUEDE AUMENTAR MUCHO LA OXIGENACIÓN DEL MEDIO HACIENDO

SALIENCIAS EN EL FONDO O EN LOS LATERALES DE LOS FRASCOS QUE
SON SOMETIDOS A AGITACIÓN QUE ACTÚAN COMO ROMPEOLAS
DENOMINADOS CONTRAPALAS O BAFLES QUE HACEN QUE SE ROMPA EL
MOVIMIENTO CIRCULAR DEL LÍQUIDO, GENERANDO TURBULENCIA QUE
FACILITA LA AIREACIÓN DEL CULTIVO.
ESTE TIPO DE RECIPIENTES SE DENOMINAN FRASCOS TREBOL.

2- AIREACIÓN: EL AIRE INYECTADO DESDE EL EXTERIOR EN UN MEDIO A

TRAVEZ DE DIFUSORES POROSOS AUMENTA LA DISPONIBILIDAD DE
OXÍGENO PARA EL M.O Y ADEMAS GENERA TURBULENCIA QUE ASEGURA
TAMBIEN LA AGITACIÓN DEL MISMO.

3- FERMENTACIÓN: LA FERMENTACIÓN DE UN M.O EN UN MEDIO DE

CULTIVO CONSISTE EN UTILIZAR LOS DOS METODOS DE AGITACIÓN
VISTOS ANTERIORMENTE EN FORMA COMBINADA, ES DECIR, SE INYECTA
AIRE DESDE EL EXTERIOR A TRAVEZ DE DIFUSORES POROSOS Y ADEMAS
SE AGITA EL MEDIO EN FORMA MECANICA MEDIANTE MOVIMIENTOS DE
ROTACIÓN.
LOS RECIPIENTES SE DENOMINAN FERMENTADORES Y SON LOS MAS
UTILIZADOS A NIVEL INDUSTRIAL PARA GRANDES VOLUMENES DE
PRODUCCIÓN.
LOS FERMENTADORES DE LABORATORIO PERMITEN EL CULTIVO DE
VOLÚMENES DE MEDIO MAS IMPORTANTES CON LAS MEJORES
CONDICIONES DE ESTERILIDAD, RENDIMIENTO Y RAPIDEZ.
ESTOS APARATOS SON DENOMINADOS CUBAS O TANQUES DE
FERMENTACIÓN, EXISTEN DE POCOS LITROS HASTA DE MILES DE LITROS
DEPENDIENDO DE LAS DIFERENTES UTILIZACIONES ( PRODUCCIÓN DE
VACUNAS, ANTIBIÓTICOS, ALCOHOLES ETC. ) Y DE LA ESCALA DE LAS
MISMAS.
PUEDEN SER CONSTRUIDOS DE VIDRIO BOROSILICATO HASTA 30 O 40
LITROS DE CAPACIDAD, O DE ACERO INOXIDABLE DE MUCHO MAYOR
TAMAÑO.
LOS FERMENTADORES DE LABORATORIO DE HASTA 4 O 5 LITROS DE
CAPACIDAD POSEEN UN CUERPO DE VIDRIO CERRADO EN SU BASE Y
PARTE SUPERIOR POR MEDIO DE DOS PLATINAS DE ACERO ANOXIDABLE
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CIRCULARES QUE SE UNEN A EL POR MEDIO DE JUNTAS DE TEFLÓN O DE

CUALQUIER OTRO ELEMENTO PLASTICO QUE RESISTA LA
TEMEPERATURA DE ESTERILIZACIÓN, LA SUPERIOR TIENE UNA SERIE DE
PERFORACIONES O ENTRADAS QUE CUMPLEN DIFERENTES FUNCIONES,
LA CENTRAL ES POR DONDE ATRAVIESA EL VASTAGO DE ACERO QUE
AGITA EL LIQUIDO EN EL INTERIOR DEL APARATO, ESTA PERFORACIÓN
DEBE IR ACOMPAÑADA DE ALGUN SISTEMA DE PRENSA ESTOPA U O
RINGS ( JUNTAS DE GOMA CIRCULARES ) QUE ASEGUREN EL CIERRE
HERMÉTICO DEL SISTEMA PARA EVITAR CONTAMINACIONES DESDE EL
EXTERIOR.
OTRAS PERFORACIONES QUE SIRVEN PARA EL INGRESO Y EGRESO DE
AIRE, SIEMBRA DEL INOCULO SEMILLA, COSECHA DEL CULTIVO, TOMA DE
MUESTRAS PARA CONTROLES DE PROCESO Y AGREGADOS DE
DIFERENTES SUSTANCIAS DURANTE EL MISMO EJ. CONTROL DE pH,
ANTIESPUMANTE ETC..ETC..
EL PASAJE DE LA BARRA AGITADORA ES UN PROBLEMA DE DIFÍCIL
RESOLUCIÓN HABIDA CUENTA EL ALTO RIESGO DE CONTAMINACIONES
QUE PROVOCA EL HECHO DE ATRAVESAR LA PLATINA DESDE EL
EXTERIOR HACIA EL INTERIOR, EN LA ACTUALIDAD SE UTILIZA UN
SISTEMA DE IMANES QUE HACEN QUE EL VASTAGO SE MUEVA SIN
NECESIDAD DE ATRAVESAR LA MISMA.
EN EL INTERIOR DEL FERMENTADOR Y A FIN DE ASEGURAR UNA
EFICIENTE AIREACIÓN, EL VASTAGO DE AGITACION PRESENTA EN SU
EXTREMO UNA CORONA DE DISTRIBUCIÓN CONSTITUIDA POR 4 O 8
PALAS DE DISEÑO ESPECIAL, CUYO ROL ES EL DE DISPERSAR LAS
BURBUJAS QUE SALEN DEL ELEMENTO AIREADOR, PUEDEN COLOCARSE
A DIFERENTE ALTURA DE LA BARRA MAS DE UN JUEGO DE PALAS PARA
HACER AUN MAS EFICIENTE LA AIREACIÓN DEL SISTEMA.
ADEMÁS PUEDE RECURRIRSE A CONTRAPALAS DISTRIBUIDAS A LO
LARGO DE LA CUBA QUE EVITAN LA FORMACIÓN DE VORTEX
AUMENTANDO LA TURBULENCIA DEL LIQUIDO.

PARA UN FERMENTADOR CIRCULAR MUNIDO DE AIREADOR Y UN

AGITADOR DE PALAS CHATAS LAS RELACIONES ENTRE SUS
DIMENSIONES SON LAS SIGUIENTES:
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MOTOR

PLATINA
SUPERIOR FILTRO DE AIRE

CUERPO DE VIDRIO

AIREADOR

B
W PALAS NIVEL DE LIQUIDO
Z
D

PLATINA INFERIOR
T

CONTRAPALAS

Diámetro de la Cuba T D=3 Altura del Agitador B D = 1 – 1,2

Diámetro del agitador Diámetro del Agitador

Altura del liquido Z D=3 Ancho de contrapalas W T = 0,1

Diámetro del Agitador Diámetro de la Cuba

LOS FERMENTADORES SON ESTERILIZADOS EN AUTOCLAVE CON EL

VOLUMEN QUE CORRESPONDA DE MEDIO DE CULTIVO O BIEN VACIOS
PARA LUEGO AGREGARLE EL MEDIO ESTERILIZADO APARTE, A TRAVEZ
DEL SISTEMA DE CONECTORES ESTERILES CONECTADOS A
TUBULADURAS DE VIDRIO O ACERO QUE ATRAVIESAN LA PLATINA
SUPERIOR.
LOS FERMENTADORES INDUSTRIALES DE ACERO INOXIDABLE TIENEN SU
PROPIO SISTEMA DE ESTERILIZACIÓN CONSTITUIDO POR UNA DOBLE
PARED CON UN SITEMA DE CAÑERÍAS POR DONDE CIRCULA VAPOR DE
AGUA, ESTE SISTEMA NO SOLO SIRVE PARA ESTERILIZAR EL
BIOREACTOR VACIO SINO TAMBIEN CON EL MEDIO DE CULTIVO EN SU
INTERIOR APROVECHANDO EL SISTEMA DE AGITACIÓN PARA DISMINUIR
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EL TIEMPO DE PENETRACIÓN, DE ESA MANERA SE REDUCE EL TIEMPO

TOTAL DEL CICLO Y CONSECUENTEMENTE EL DAÑO TERMICO SOBRE LOS
COMPONENTES DEL MEDIO.
EN EL LABORATORIO DE PRODUCCIÓN EXISTE LA POSIBILIDAD DE
FABRICAR FERMENTADORES CASEROS UTILIZANDO FRASCOS DE VIDRIO
DE 20 O 40 LITROS DE CAPACIDAD, REEMPLAZANDO LA PLATINA
SUPERIOR DE LOS APARATOS COMERCIALES POR TAPONES DE GOMA
SILICONADA DE UN TAMAÑO TAL QUE PERMITA LA REALIZACIÓN DE
ORIFICIOS SUFICIENTES QUE SERAN ATRAVESADOS POR LAS
TUBULADURAS DE VIDRIO O ACERO NECESARIAS.
EN ESTOS CASOS LA AGITACIÓN SE LOGRA MEDIANTE AGITADORES
MAGNETICOS COLOCADOS DEBAJO DE LOS FRASCOS QUE CONTIENEN
UNA BARRA DE METAL TEFLONADA.

LOS METODOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN FERMENTADORES O EN

RECIPIENTES AIREADOS CON BURBUJEADORES POROSOS, PUEDEN SER:

DISCONTINUOS: SE SIEMBRA UN FERMENTADOR O RECIPIENTE AIREADO

CON UN CULTIVO SEMILLA QUE NO DEBE SUPERAR EL 5 – 10 % DEL
VOLUMEN TOTAL DE MEDIO CONTENIDO EN EL MISMO Y UNA VEZ
FINALIZADO EL TIEMPO DE DURACION DEL CULTIVO, QUE DEPENDERA
DEL M.O EN ESTUDIO, SE PROCEDERA A LA COSECHA TOTAL.
EL RECIPIENTE SE DECONTAMINA SE LAVA Y SI NECESITAMOS UN NUEVO
CICLO, EMPEZAMOS DE CERO.

CONTINUOS: EL RECIPIENTE CON EL MEDIO DE CULTIVO SE SIEMBRA Y

CUANDO LLEGA AL MOMENTO OPTIMO DE LA COSECHA, COMIENZA LA
MISMA A LA VEZ QUE SE LE VA AGREGANDO NUEVO MEDIO.
SI BIEN EL TRABAJO ES MENOR, LAS LIMITANTES DEL METODO SON LA
POSIBILIDAD DE CONTAMINACIÓN POR PROLONGAR EN EL TIEMPO EL
PROCESO, EL RIESGO DE PERDER UNIFORMIDAD EN EL MEDIO DE
CULTIVO Y LOS POSIBLES CAMBIOS FENOTIPICOS EN LAS CEPAS DE
PRODUCCION QUE UTILIZAMOS, QUE SE TRADUCIRIAN POR EJEMPLO ES
UNA DISMINUCION DE LA PRODUCCION DE UNA TOXINA ESPECIFICA O LA
EXPRESIÓN DE UN INMUNOGENO ESTRUCTURAL COMO POR EJEMPLO
PILIS.

SEMICONTINUOS O MIXTOS: SE PREPARA TODO COMO PARA UN SISTEMA

DISCONTINUO, SE SIEMBRA CON LA CORRESPONDIENTE SEMILLA Y
LUEGO DE TRANSCURRIDO EL TIEMPO DE CULTIVO ESTABLECIDO SE
COSECHA PERO DEJANDO EN EL RECIPIENTE UN 10 O 15% DEL VOLUMEN
DEL CULTIVO QUE SIRVE COMO SEMILLA DESPUES DEL AGREGADO DE
UN NUEVO MEDIO ESTERIL.
LA VENTAJA ES QUE NO TENGO QUE HACER UNA NUEVA SEMILLA COMO
TAMPOCO ESTERILIZAR UN NUEVO FERMENTADOR.
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SE REPITE 3 O 4 VECES Y LUEGO VUELVO A COMENZAR DE CERO POR

LOS MISMOS RIESGOS O DESVENTAJAS DEL METODO ANTERIOR.

DESARROLLO DEL INOCULO PARA SEMILLA

OBJETIVOS:
1- MINIMIZAR LAS PERDIDAS DE M.O VIABLES DURANTE LAS FASES DE
RECUPERACION DE LAS CEPAS CONSERVADAS Y DE ADAPTACIÓN
DEL CULTIVO A LOS DIFERENTES MEDIOS DE PRODUCCION.

2- OBTENER COPIAS GENOTIPICAMENTE IDENTICAS A LA POBLACION

CONSERVADA.

3- INCREMENTAR LA BIOMASA

4- DESARROLLAR CULTIVOS DE CRECIMIENTO LOGARÍTMICO QUE

ASEGUREN UN ESTADO FISIOLOGICO OPTIMO PARA LA OBTENCION
DE DETERMINADOS PRODUCTOS METABOLICOS BUSCADOS.

UN INOCULO EXITOSO REQUIERE:

UN METODO DE TRANSFERENCIA DEL CULTIVO CONSERVADO AL MEDIO

DE REACTIVACION CON MAXIMA VIABILIDAD, DICHO METODO DEBE
MINIMIZAR LOS RIESGOS DE CONTAMINACION EN EL PROCESO, DEBE
SERVIR PARA CUANTIFICAR BIOMASA O PRODUCTOS DEL METABOLISMO
MICROBIANO, SELECCIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO Y UN SISTEMA DE
CULTIVO QUE OFREZCA LAS CONDICIONES OPTIMAS PARA LA DETECCION
DEL PRODUCTO DESEADO, EJ. BIOMASA, ESPOROS, TOXINAS, ETC.

LAS CONDICIONES QUE DEBE REUNIR LOS INOCULOS SON:

PUROS Y HOMOGENEOS: EN EL MOMENTO DE RESUSPENDER EL

MATERIAL CONSERVADO SE DEBEN AISLAR COLONIAS CON
CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS TIPICAS DE LA CEPA DE
PRODUCCION EJ. LUZ INCIDENTE ( METODO DE HENRY ) O COLORANTES
(CRISTAL VIOLETA), O PRUEBA DE ACRIFLAVINA PARA COLONIAS
RUGOSAS.
MICROSCOPICAMENTE DEBEN PRESENTAR MORFOLOGIA TIPICA ( Ej. B.
pertussis) DE LA CEPA DE PRODUCCION QUE NO SIEMPRE ES
COINCIDENTE CON LAS CEPAS TIPO, EJ. CEPA TH 89 DE Clostridium tetani
QUE NO ESPORULA EN LOS MEDIOS DE PRODUCCION.
DEBEN TENER IDENTIDAD SEROLOGICA Y BIOQUIMICA PROPIA.
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SUFICIENTES: LOS CULTIVOS SEMILLAS DEBEN PERMITIR LLEGAR EN

POCOS PASAJES A UN VOLUMEN DE INOCULO DE SIEMBRA DEL 5 – 10%
DEL VOLUMEN FINAL DEL LOTE DE PRODUCCION.

DESARROLLO DEL INOCULO: PASOS

1) CULTIVO O CEPA DE REFERENCIA, SEED LOT O SEMILLA MAESTRA

APERTURA DE AMPOLLA EXPANSION DEL CULTIVO Y LIOFILIZACION DE LA

MISMA

SEED LOT LIOFILIZACION

F 1 CULTIVO DE COLECCIÓN

LIOFILIZACION F 2 SEMILLA DE TRABAJO

LIOFILIZACION F 3 SEMILLA DE PRODUCCION

SE TRATA DE LIOFILIZAR O EMPLEAR EL METODO DE CONSERVACION DE

ELECCION PARA OBTENER EXPONENSIALMENTE LA MAYOR CANTIDAD DE
AMPOLLAS DE LA CEPA ORIGINAL PARA OBTENER FINALMENTE LOS
INOCULOS O SEMILLAS DE TRABAJO Y DE PRODUCCION PARA LAS
TAREAS DE LA RUTINA DE PRODUCCION SEMANALES O MENSUALES.