Facultad de Ciencias Veterinarias

-UNCPBA-

Comparación de la calidad microbiológica de

fiambres feteados envasados al vacío en origen
con feteados en comercios minoristas.

Piñero, María del Rocío; Recavarren, Mariana; Williams Karen

Agosto, 2017

Tandil
Comparación de la calidad microbiológica de fiambres feteados
envasados al vacío en origen con feteados en comercios
minoristas.

Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada como

parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del estudiante: Piñero,
María del Rocío

Directora: Médica Veterinaria, Williams Karen

Co-directora: Médica Veterinaria, Recavarren Mariana

Evaluador: Médica Veterinaria, Elida Elichiribehety

Agradecimientos:

Quisiera agradecer a Karen Williams y Mariana Recavarren, que me dedicaron

su tiempo tan libremente.

Al Instituto de Análisis Fares Taie que me brindo el lugar y la oportunidad, y a

Paula Casado que me acompaño durante las practicas realizadas.

Un agradecimiento especial a mi familia, a Emmanuel y Elsa, que estuvieron a

mi lado en cada paso tomado.
Resumen:

Objetivo. Comparar la calidad microbiológica de fiambres de la misma marca

envasados al vacío en origen respecto del mismo tipo fraccionados en locales
de venta directa al público. Materiales y Métodos. Se analizaron 30 muestras
totales de fiambre de las cuales 5 muestras fueron de Jamón cocido, Bondiola y
Salame tipo Milán envasadas en vacío y obtenidos de supermercados y otras de
origen y feteados en locales fraccionadores de igual marca, ambos en la
localidad de Mar del Plata, durante el periodo de 3 meses (julio a septiembre de
2015). Se realizaron los análisis teniendo en cuenta los criterios planteados por
el Código Alimentario Argentino (CAA) para observar si los mismos eran aptos
para el consumo general. Resultados. No se registró crecimiento de
microorganismos patógenos en ninguno de los 2 tipos de muestras de la misma
marca, aunque si un gran crecimiento de organismos deteriorantes. Se observó
crecimiento de Hongos y Levaduras en todas las muestras de los fiambres,
siendo mayor en las obtenidas de locales fraccionadores que las envasadas en
vacío; solo en una muestra de Bondiola sucedió a la inversa. En algunas de las
muestras no se pudo realizar el conteo de UFC dado que no se encontraban
dentro del rango de diluciones utilizadas en la metodología aplicada Conclusión.
Todas las muestras se consideran aptas para el consumo, pero habría que
evaluar si la presencia de microorganismos deteriorantes puede afectar el tiempo
de caducidad estimado y generar pérdidas económicas.

Palabras Claves: Fiambres – Comparación Microbiológica – Envasado al vacío

en origen– Local Fraccionador.
Índice:

1. Introducción…………………..………..……………………………....………..…1
2. Objetivo …………………………………………………………………………...11
3. Hipótesis …………..……………………………………………………………...11
4. Marco Legal ………………………………………………………….………..….12
5. Materiales y Métodos …………….……..…….….…..…………….…………...16
5.1. Muestras ………………………………………………………………….16
5.2. Método horizontal para la enumeración de Staphylococcus coagulasa
positivo…...………………………..…….…………….………..….…….18
5.3. Método horizontal para la enumeración de
Coliformes…………………………………………...………….………..20
5.4. Método horizontal para la enumeración de mohos y levaduras en
alimentos con aW ≥ 0,95 ……………………………..………………...22
5.5. Método horizontal para la determinación de Salmonella
spp………………….……………….......................………………...….23
5.6. Método horizontal para la enumeración de Clostridium sulfito
reductores bajo condiciones
anaeróbicas……………..............................................……………….26
5.7. Método horizontal para la detección de Listeria Monocytogenes
……………..………………………………………………………..….....27
5.8. E.Coli……………………………..............………………...……………28
5.8.1. Protocolo para extracción de ADN de la muestra con Kit
ROCHE……….……………………………..…………………..28
5.8.2. PCR…………………………...………………………...…….30
6. Resultados …………………………………………..……………………………32
7. Discusión…………………………….……………….………….….…………….35
8. Conclusiones………………………..…….……………….……………………..37
9. Bibliografía ...……………………………………….…………………………….39
10. Anexo I : Resultados Completos …….……….………..………….……………44
11. Anexo II :Fotos …………………………..……………………………………….47
12. Anexo II: Planilla de trabajo de la corrida del PCR…………….………………55
1. Introducción:

En la actualidad uno de los riesgos que se observan cotidianamente en la salud

pública son las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA). Dichas
enfermedades son provocadas por el consumo de agua o alimentos
contaminados con microorganismos o parásitos, o bien por las sustancias tóxicas
que aquellos producen. Pueden ocasionar intoxicaciones o infecciones de
diversa gravedad cuyos síntomas incluyen vómitos, dolores abdominales,
diarrea y fiebre. Para las personas sanas, la mayoría son enfermedades
pasajeras, que no generan mayores complicaciones. Por el contrario, es preciso
tomar precauciones en el caso de niños, ancianos, mujeres embarazadas o
aquellos que ya se encuentren enfermos, ya que en esos grupos las ETA’s
pueden ser más severas, dejar secuelas e incluso provocar la muerte. Con
frecuencia, los casos/ brotes de ETA´s no son reconocidos como tales, no son
reportados o no son investigados, esto es debido a la dificultad que conlleva la
identificación del origen del mismo. Un alto porcentaje de los casos de ETA no
puede asociarse con algún alimento en particular o no es factible identificar al
patógeno responsable, debido, fundamentalmente, a que los resultados de los
análisis bacteriológicos demoran. Asimismo, el vehículo alimentario implicado ya
no se encuentra disponible para su análisis (Gonzales Flores; 2005).

Los microorganismos pueden pasar de un alimento a otro por contacto directo o

bien a través de quienes los manipulan, de las superficies de contacto o del aire.
En cada etapa de la cadena alimentaria desde la producción primaria hasta el
consumo son necesarias prácticas higiénicas eficaces. (Ministerio de
Agroindustria; 2016) La capacitación de los recursos humanos forma un eslabón
muy importante a la hora de evitar que el consumidor sufra una ETA por lo que
el conocimiento y la aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y
de los Procedimientos Operativos Estandarizados de Saneamiento. (POES) en
toda la cadena alimentaria incluido los locales expendedores de alimentos, es
irreemplazable. Los POES son prácticas y procedimientos de saneamiento
escritos que un establecimiento elaborador de alimentos debe desarrollar e
implementar para prevenir la contaminación directa o la adulteración de los

1
alimentos que allí se producen, elaboran, fraccionan y/o comercializan.
(Ministerio de Agroindustria; 2016) Las estadísticas elaboradas por el Sistema
de Vigilancia Epidemiológica de Enfermedades Transmitidas por Alimentos
indican que en Argentina el 40% de los brotes de ETA ocurren por una incorrecta
manipulación de los alimentos. (OPS/OMS, 2014).

Según el CAA se entiende por Fiambre, los chacinados, las salazones, las
conservas de carne y los productos que se expendan y consuman fríos. Los
fiambres ocupan un rol importante en la dieta humana y actualmente están
asociados a una comida rápida por practicidad y facilidad de consumo.
(Odriozola; 2008). En Argentina el consumo de carne de cerdo es bajo en
relación al promedio mundial y está dado principalmente por el consumo de
fiambres siendo las salazones las de mayor demanda del consumidor (Alfonso;
2010). Durante el año 2014 el consumo de carne porcina se estima que fue de
10,65 kg/hab/año, dentro de los cuales 0,62 kg/hab/año se trataba de salazones.
Esto se entiende considerando el aumento en la producción de los mismos.

Tabla 1: Consumo de chacinados (kg/hab/año) en Argentina

(Fuente: GITEP · Anuario 2014 - Grupo de Intercambio Tecnológico de Explotaciones Porcinas)

2
Grafica 1: Evolución en la producción de chacinados (Ton) a lo largo de los años en Argentina

(Fuente: GITEP · Anuario 2014 - Grupo de Intercambio Tecnológico de Explotaciones Porcinas)

Entre los microorganismos que el CAA considera posibles de encontrar en los

fiambres se encuentran patógenos como: Salmonella spp, Staphylococcus
aureus, Listeria Monocytogenes y Escherichia Coli O157:H7; y microorganismos
indicadores como: Anaerobios sulfitos reductores y Mohos y Levaduras.

El género Salmonella spp. pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son

bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, no formadores de esporas.
Sobreviven a la refrigeración y congelación y mueren por calentamiento (mayor
a los 70 °C). Hasta el presente se han identificado más de 2.500 cepas diferentes
de Salmonella spp. La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de
los animales de sangre caliente pertenecen a la subespecie I (entérica) y llevan
un nombre relacionado con el lugar geográfico donde fueron aisladas. (ANMAT;
2011) La salmonelosis es una de las enfermedades de transmisión alimentaria
más comunes y ampliamente extendidas. Anualmente afecta a decenas de
millones de personas de todo el mundo y provoca más de cien mil defunciones.
La Salmonella es una bacteria omnipresente y resistente que puede sobrevivir
varias semanas en un entorno seco, y varios meses en agua. Algunas cepas
causan gastroenteritis, que puede ser grave en los niños, los ancianos y los
pacientes inmunodeprimidos. A ese grupo pertenecen Salmonella Enteritidis y
Salmonella Typhimurium, los dos serotipos más importantes de salmonelosis

3
transmitida desde animales a seres humanos en la mayor parte del mundo. Las
personas contraen la salmonelosis a través del consumo de alimentos
contaminados de origen animal (principalmente huevos, carne, aves y leche),
aunque también otros alimentos se han vinculado a la transmisión. Las
principales causas de infección son los alimentos crudos o que hayan sufrido
cocción insuficiente, además de la contaminación cruzada que ocurre cuando los
productos cocidos entran en contacto con alimentos crudos o con superficies o
materiales contaminados como las tablas para cortar (ANMAT, 2011).También
puede transmitirse entre las personas por vía fecal-oral (OMS, 2013) ya que el
hombre también es reservorio de esta bacteria lo que revela la importancia de
considerar a los manipuladores de alimentos portadores como fuente de
infección (ANMAT, 2011)

Staphylococcus aureus es una bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva,

productora de coagulasa, catalasa positiva, inmóvil y no esporulada, que se
encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de
cada tres personas se hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella. Puede
producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones
cutáneas hasta enfermedades de riesgo vital, abscesos profundos, osteomielitis,
meningitis, sepsias, endocarditis o neumonía. Además, puede afectar al aparato
gastrointestinal por la ingestión de alimentos contaminados con la enterotoxina
estafilocócica (ES) secretada por la bacteria. Los estafilococos pueden
multiplicarse exponencialmente a temperaturas entre 6.7°C y 45.5°C. La
enterotoxina es producida las células durante o inmediatamente después de la
multiplicación. El hombre es el principal reservorio, se encuentra en la piel y en
las vías respiratorias superiores (nasofaringe). La contaminación de los
alimentos puede ocurrir desde los operadores y por contaminación cruzada por
el uso de utensilios contaminados o materias primas contaminadas. Muy
diversos alimentos han sido la causa de la intoxicación alimentaria estafilocócica.
En lugar destacado en términos de frecuencia han de citarse la carne de
mamíferos y aves cocinadas, leche y sus derivados, alimentos cortados en
rebanadas, sándwiches y otros tipos de alimentos que llevan manipulación por
parte del operador. Las enterotoxinas de S. aureus poseen una elevada

4
estabilidad, ya que resisten la irradiación y la actividad de enzimas proteolíticas
como la pepsina y la tripsina. Las SE son termoestables, se inactivan a
temperatura de esterilización a 115°C. Los alimentos procesados o tratados en
los que se ha destruido una elevada población de estafilococos por
calentamiento pueden, no obstante, producir intoxicación alimentaria debido a la
termoresistencia de las SE. La intoxicación estafilocócica se puede evitar
respetando las Buenas Prácticas de Higiene a lo largo de la cadena alimentaria,
especialmente en el momento de preparación de las comidas. Respetar la
cadena de frío, es el punto clave para la prevención del crecimiento de S. aureus.
(ANMAT; 2013)

Listeria monocytogenes es una bacteria Gram positiva y catalasa positiva,

anaerobia facultativa, no esporógena, con forma de bacilos cortos, a veces
cocoides. Es un microorganismo psicótrofo y su rango de crecimiento oscila entre
0ºC a 45ºC siendo las condiciones óptimas entre 30ºC y 37ºC. Puede crecer a
niveles de pH entre 4,4 y 9,4 y con una actividad de agua (aW) ≥ 0,90. Tolera
concentraciones de NaCl de hasta 20%. Es una bacteria oportunista. Puede
multiplicarse fuera del huésped aún con bajas exigencias en cuanto a nutrientes.
Presenta la particularidad de resistir distintas condiciones de estrés como
congelación a -18°C durante varias semanas, en distintas matrices alimentarias,
secado, acidez y frío, pudiéndose adaptar a éstas mediante la producción de
biofilms. La enfermedad puede manifestarse de manera no invasiva, también
conocida como gastroenteritis febril leve y también puede ocurrir como
enfermedad invasiva en adultos y embarazadas produciendo meningitis,
septicemia y abortos, como algunas de las características más importantes. Esta
bacteria se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente y los
alimentos relacionados con la listeriosis han sido, en su gran mayoría, productos
listos para el consumo que generalmente se conservan durante largos períodos
a temperaturas de refrigeración. (ANMAT; 2011) El riesgo de Salmonella en
embutidos fermentados se considera generalmente bajo ya que son productos
con baja actividad de agua (aW) y bajo el pH. Sin embargo, puede sobrevivir,
habiéndose descrito diversos brotes causados por Salmonella en embutidos.
(Begoña; 2007).

5
Escherichia Coli productor de toxina Shiga (STEC), incluido el serotipo
O157:H7, es un patógeno emergente asociado a casos de diarrea, colitis
hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) en seres humanos. El período
de incubación promedio de la infección por STEC es de 3 días (con un rango de
1 - 8 días) y el cuadro clínico incluye un período de 1 a 2 días de vómitos, fiebre
baja o ausente, dolores abdominales severos y diarrea sin sangre, como
síntomas iniciales, seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis hemorrágica
durante 4 a 6 días. Aunque en la mayoría de los casos la diarrea por STEC es
autolimitada, aproximadamente el 5 a 10% de los niños infectados evolucionan
a SUH. Los rumiantes en general y el ganado vacuno en particular, han sido
señalados como los principales reservorios de STEC. La principal vía de
transmisión son los alimentos contaminados como carne molida, productos
cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, embutidos fermentados, leche, etc.
Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada durante la
preparación de alimentos, el contacto directo del hombre con los animales y de
persona a persona por la ruta fecal-oral. (ANMAT; 2011) El SUH es una
enfermedad endémica en Argentina con aproximadamente 400 a 500 casos
nuevos cada año, es el país con mayor incidencia de SUH a nivel mundial
(13,9/100000 niños menores de 5 años). La enfermedad está distribuida en todo
el país, pero la frecuencia es mayor en las provincias del centro y sur. La
infección por Escherichia Coli productor de toxina .Shiga (STEC) es la principal
causa de SUH (40% de los casos) siendo Escherichia Coli 0157:H7 el serotipo
predominante. (ANMAT; 2014).

Los anaerobios sulfito-reductores constituyen un grupo bacteriano asociado

al género Clostridium, donde se divide en 203 especies y 5 subespecies, las que
se relaciona a ETA´s son Clostridium botulinum cuya toxina afecta al sistema
nervioso y Clostridium perfringens cuya enterotoxina afecta al sistema digestivo.
Son organismos Gram positivos, anaeróbicos, formadores de esporas. Crecen a
temperatura de 37ºC, la actividad de agua (aW) mínima para su desarrollo es
0.95 y a un pH entre 7 y 7.4. Las exotoxinas extracelulares y enzimas son los
principales factores de virulencia. Las bacterias se encuentran extendidas por el
medio ambiente, y las esporas se encuentran habitualmente en el suelo, polvo y

6
en el tracto digestivo de los animales entre otros lugares. Debido a esto pueden
transmitirse a una amplia gama de alimentos, tanto crudos, como parcialmente
tratados tales como: las carnes curadas (principalmente embutidos), conservas,
fermentados, ahumados y productos envasados al vacío. Recuentos elevados
de los anaerobios sulfito reductores evidencian una posible deficiencia en las
buenas prácticas de fabricación a lo largo del proceso de transformación, o
materia prima de baja calidad. (ANMAT, 2014)

Los hongos presentan múltiples formas, incluidos setas, mohos y levaduras.

Son microorganismos aerobios estrictos, se desarrollan en un rango de pH de 2
a 9, a temperaturas entre 10 a 35ºC y pueden crecer en condiciones de actividad
de agua (aW) relativamente bajas (<0.85), aunque las levaduras generalmente
requieren una mayor actividad de agua. Comúnmente se da el nombre de moho
a ciertos hongos multicelulares filamentosos, cuyo crecimiento en los alimentos
se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Asimismo las
levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos
de células independientes. La importancia de la presencia de mohos y levaduras
en los alimentos está determinada por la capacidad de producir diferentes grados
de deterioro y descomposición de los mismos. Además los hongos producen
metabolitos tóxicos conocidos como micotoxinas, compuestos estables que no
se destruyen durante el procesamiento de alimentos, por lo que son
responsables de intoxicación con consecuencias graves (cáncer, mutagénesis)
en los órganos afectados. También están asociados a reacciones alérgicas e
infecciones sobretodo en la población inmunocomprometida, en ancianos y
niños. (ANMAT; 2014)

Las técnicas de identificación bacteriana basadas en el cultivo de bacterias y su

posterior identificación de características fenotípicas de las mismas son
laboriosas y dependiendo del microorganismo puede requerir semanas para
obtener resultados. Para el análisis del tratamiento de Escherichia Coli O157
productora de toxina Shiga se utilizó la técnica de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR por su nombre en inglés) que es una técnica de biología
molecular altamente específica, rápida, sensible y versátil que permite la

7
amplificación selectiva de secuencias específicas de ADN para luego detectarlo.
En los equipos actuales, los procesos de amplificación y detección se producen
de manera simultánea; ya que son capaces de detectar secuencias marcadas
con flourocromos durante la amplificación en cada momento, dado que la
emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad
de ADN o ARN formado, es decir, el producto de amplificación es monitoreado
conforme transcurre la reacción. Es por esto que se conoce como PCR en tiempo
real (PCRtr). Estos equipos están diseñados para establecer un sistema
homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se
modifiquen en cada uno de los ciclos y están conectados a una PC con un
software que generan una serie de gráficos con todos los datos. Para que se
lleve a cabo la reacción es necesario que haya presente en los equipos
termocicladores: ADN molde o templado, la polimerasa termoestable, los
oligonucleótidos o primers que delimitan la secuencia blanco que se desea
amplificar, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) para construir las
nuevas cadenas, ion magnesio (Mg+) que funciona de cofactor enzimático que
influye en la especificidad de la reacción, una solución buffer y agua como
disolvente para completar el volumen final de la reacción. La presencia de otras
moléculas inhibidoras en la muestra (como hemoglobina, grasas o proteínas
entre otras que se encuentran en las matrices alimentarias) pueden reducir la
eficiencia de la amplificación por lo que previamente a analizar la muestra se
realiza una extracción de ADN.

Esta reacción consta en ciclos repetidos n veces de 3 partes:

I. Desnaturalización: Se produce la ruptura de puentes de hidrogeno del

ADN para desnaturalizarlo, para la cual se incuba a 95° C consiguiendo
que se expongan las bases nitrogenadas del ADN blanco.
II. Hibridación: La hibridación de las cadenas desnaturalizadas del ADN
blanco con los primers que se alinean al extremo 3´ del ADN templado a
una temperatura que depende de la temperatura de fusión de los mismos,
en general entre los 50 y 60°C. En la detección y diagnóstico de E. Coli
se utilizan secuencias blanco a los genes que codifican para las variantes

8
 de las toxinas Shiga que en la actualidad se consiguen de manera
comercial, aunque esto no implica que el factor de virulencia se exprese.
III. Extensión: La polimerasa termoestable extiende la longitud de los
cebadores añadiendo los dNTPs libres y complementarios en el orden que
le dicta la cadena que actúa de molde. La extensión se realiza en el
sentido 5´ a 3´ de la cadena a una temperatura de 72°C. La fluorescencia
es directamente proporcional a la abundancia de moléculas sinterizadas,
que a su vez es la medida directa del número de moléculas que se
encontraban en la muestra al inicio de la reacción.

Sin embargo, las ETA’s no son el único riesgo que existe, los productos cárnicos
se pueden alterar a causa de una serie de microorganismos deteriorantes, como
Pseudomonas spp., Shewanella, Enterobacteriaceae, Brochothix
thermosphacta, mohos, bacterias lácticas y levaduras (Blazquez; 2014),
provocando pérdida económica para el productor y la caducidad del alimento
antes de la fecha de vencimiento establecida y de esta manera, llegando al
consumidor en un estado no apto para el consumo o deteriorado en sus
características organolépticas y/o en su valor nutricional. La producción industrial
de alimentos es un proceso que se desarrolla a gran escala, razón por la cual las
consecuencias de pérdidas por contaminación microbiana son elevadas y
altamente costosas. (Orberá Ratón; 2004).

La alteración se define como "Cualquier modificación beneficiosa o perjudicial de

las características físicas y/o químicas del alimento, pero que no supone riesgo
para la salud". La alteración de los alimentos la podemos clasificar en: físicas,
químicas, biológicas y fisiológicas. Las alteraciones biológicas son ocasionadas
por:

lugar a dos alteraciones fundamentales, la fermentación y la putrefacción.

(Blazquez, 2014).

9
Algunos microorganismos necesitan O2 para su desarrollo por lo tanto una forma
de conservar los alimentos preservándolos del desarrollo de este tipo de
microorganismos será ponerlos fuera del contacto del aire, por ejemplo
envasándolos en atmósferas pobres de O2 lo cual se consigue por medios físicos
y da lugar a otros métodos industriales de conservación: vacío, gases inertes y
atmósferas controladas o atmósferas modificadas. (Ospina Meneses, 2008) El
envasado al vacío es una forma efectiva de prolongar la vida útil de un producto
y protegerlo contra los elementos externos. Al sacar el oxígeno no hay que
preocuparse de que los microorganismos aeróbicos que se encuentran en los
productos alimentarios estropeen el alimento y a su vez inhibe la oxidación de
alimentos ricos en grasa como son algunos fiambres (ej. Salame tipo Milán).

La seguridad del consumidor de comprar un alimento inocuo depende en gran

medida, no solo de las BPM durante la elaboración y las POES, sino también de
la manipulación que se le haga al producto una vez llegado al local expendedor.
Los análisis indicados por el Código Alimentario Argentino (CAA) están
destinados a sacar de circulación los alimentos contaminados mediante la
detección de los mismos, por lo que, una manera de conocer si existe
contaminación podría ser comparando al mismo alimento, de la misma marca,
feteado y envasado al vacío directamente en fábrica respecto de otro fraccionado
en cada local expendedor.

10
2. Objetivo:

Comparar la calidad microbiológica de fiambres de la misma marca envasados

al vacío directamente en fábrica respecto del mismo tipo fraccionados en locales
de venta directa al público.

3. Hipótesis:

La hipótesis que se trata de demostrar en este trabajo es que los fiambres de la

misma marca envasados al vacío en origen van a tener menor cantidad de
microorganismos que aquellos que se compren feteado en locales
fraccionadores debido a la mayor manipulación que sufren estos últimos a lo
largo de la cadena alimentaria hasta que llega al público.

11
 4. Marco Legal:

Para cumplir los objetivos dentro del marco legal me baso en el Código
Alimentario Argentino (CAA), capítulo VI, Alimentos Cárneos y Afines que define:

I. Artículo 309: Se entiende por Fiambre, los chacinados, las salazones, las
conservas de carne y los productos que se expendan y consuman fríos.
II. Artículo 286: Considérase como salazones a los siguientes productos:
bondiola; cabeza de cerdo salada; carnes curadas; cecina; costillas de cerdo
saladas; chalona; cuero de cerdo salado; jamón cocido; jamón crudo; hocico o
trompa de cerdo salados; huesos de cerdo salados; lenguas saladas; orejas de
cerdo saladas; paletas de cerdo saladas; paleta de cerdo cocida, panceta salada;
patitas de cerdo saladas; tasajo; tocino salado; unto salado; lomos de cerdo
salados; lomo de cerdo cocido.
III. Artículo 294: Se entiende por Jamón cocido, una salazón preparada con
pernil de cerdo, con o sin hueso y sometido a la cocción en agua salada con o
sin condimentos autorizados. A los efectos de esta definición se entiende por
Pernil de cerdo a la pieza única de carne correspondiente al despiece total o
parcial de los miembros posteriores del ganado porcino, separado como máximo
del resto del costado de la semicanal en un punto no anterior al extremo del
hueso de la cadera, excluyéndose expresamente las carnes trituradas o picadas,
y recortes de carne. El jamón cocido deberá responder a las siguientes
exigencias:

No tener proteínas agregadas ni otros extensores.

Hidratos de carbonos totales máximo: 1,5 % expresado como glucosa.

Relación Humedad/proteínas: 4,65.

Reacción de almidón negativa.

Sólo podrán utilizarse los aditivos que están permitidos por este Código para
salazones cocidas. Estos productos tendrán como máximo 1196 mg de
sodio/100 g de producto.
12
IV. Artículo 286 bis: Las salazones cocidas deberán responder a los
siguientes Criterios microbiológicos:

Tabla 2: Criterios microbiologicos a analizar en Salazones Cocidas

V. Artículo 287: Se entiende por Bondiola, una salazón preparada con

músculos del cuello del cerdo, debiendo someterse a un proceso de maduración.
Una vez terminada la maduración, se envuelve o introduce en tela orgánica o
plástica y se ata fuertemente. Queda admitida la elaboración de bondiola sin
envoltura alguna.

IV. Artículo 286 tris: Las salazones crudas deberán responder a los siguientes
Criterios Microbiológicos:

13
 Tabla 3: Criterios microbiológicos a analizar en Salazones Crudas

VI. Artículo 302: Se entiende por Chacinados, los productos preparados

sobre la base de carne y/o sangre, vísceras u otros subproductos animales que
hayan sido autorizados para el consumo humano, adicionados o no con
substancias aprobadas a tal fin. Los chacinados clasificados en embutidos
(frescos, secos y cocidos) y no embutidos (frescos y cocidos) deberán cumplir
con las siguientes especificaciones microbiológicas de acuerdo a su clasificación
según las siguientes tablas:

14
Tabla 4: Criterios microbiológicos a analizar en Chacinados Embutidos Secos

VII. Artículo 331 Son embutidos secos de acuerdo con la definición los
siguientes chacinados: Cervelat, Chorizo a la española, Longaniza, Longaniza a
la española, Longaniza napolitana, Lomo embuchado a la española, Salame,
Salamines, Sopresatta a la italiana.
15
5. Materiales y Métodos:
5.1. Muestras
La toma de muestra se realizó durante el periodo de tiempo de julio de 2015 a
septiembre de 2015 en la ciudad de Mar del Plata, Buenos Aires. Se adquirieron
los fiambre envasados al vacío en origen de la marca X en supermercados,
mientras que los fiambres de igual marca fueron obtenidos en diferentes locales
fraccionadores, conocidos como fiambrerías. El mantenimiento y transporte de
las muestras al laboratorio de análisis se realizó refrigerado para mantener las
condiciones propias del momento de la compra.

Existen dos tipos de planes de muestreo reconocidos internacionalmente,

definidos por la ICMSF: el plan de dos clases (por ejemplo: n=5, c=0 / n=5, c=2,
m=) y el de tres clases (por ejemplo: n=5, c=2, m=10 3, M=104) donde:

n = número de muestras examinadas de un lote;

m = límite microbiológico que, en un plan de dos clases, separa la calidad

aceptable de la rechazable y en un plan de tres clases separa la calidad
aceptable de la marginalmente aceptable.

M = límite microbiológico que en un plan de tres clases separa la calidad

marginalmente aceptable de la rechazable

c = número máximo permitido de unidades de muestra defectuosas (plan de dos

clases) o marginalmente aceptables (plan de 3 clases).

El plan de dos clases es utilizado para patógenos, mientras que el plan de tres
clases es utilizado para el análisis de indicadores de higiene donde es posible la
cuantificación (en unidades de masa o de volumen) de los microorganismos.
(ANMAT; 2006).

Se tomó n= 5 en todos los casos dado que el CAA así lo requería.

16
Una vez que las muestras llegaron al laboratorio se procedió a su preparación y
análisis siguiendo los métodos correspondientes a cada microrganismo que se
pretendía analizar.

El análisis de las muestras fue realizado en Fares Taie Instituto de Análisis, de

la ciudad de Mar del Plata, en el área de Alimentos y Medio Ambiente conjunto
con el área de Biología Molecular.

En algunos casos se utilizaron técnicas diferentes a las indicadas en el CAA

únicamente debido a que en el lugar de la práctica se realizaban siguiendo
protocolos diferentes pero igualmente validados. Los métodos de detección de
bacterias patógenas realizados fueron basados en el Manual de Calidad del
Laboratorio de Microbiología de SENASA y en normas del International Standard
ISO, las cuales rigen en el mencionado establecimiento. La elección del método
a utilizar privilegió a aquellos métodos estandarizados y de alta sensibilidad que
fueron validados por organismos internacionales/ nacionales de referencia.
(CAA, Art. 1413 y 1414). A continuación se detallan los mismos:

Material y equipo generales:

1. Pipetas automáticas graduadas estériles de 1 ml y 0,1 ml junto con los tips

descartables estériles (se debe utilizar un tip para cada dilución).
2. Pipetas Pasteur estériles.
3. Pipetas automáticas graduadas estériles de 200 µl, 40 µl, 100 µl, 500 µl
junto con los tips descartables estériles (se debe utilizar un tip para cada
dilución).
4. Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas,
pinzas, tijeras, espátulas, frascos.
5. Bolsa para Stomacher.
6. Stomacher.
7. Vortex mixer.
8. Ansa bacteriológica.
9. Balanza granataria.
10. Autoclave para esterilizar material de vidrio.

17
 11. Estufa a 25 ± 2°C.
12. Estufa a 30°C.
13. Estufa a 35 ± 2°C.
14. Estufa a 37 ± 2°C.
15. Estufa a 41,5±1°C.
16. Placas de Petri descartables.
17. Tubos de ensayo estériles.
18. Espátula de Drigalski estéril.
19. Mechero
20. Matraz de 250 ml
21. Jarras anaerobias.

5.2. Método horizontal para la enumeración de Staphylococcus coagulasa

positivo:

Reactivos y Medios de cultivo:

1. Agar Baird Parker.

2. Caldo infusión cerebro corazón (BHI).
3. Agua peptonada al 0.1% (Diluyente).
4. Plasma de Conejo liofilizado.
5. Tubos de hemolisis.

Procedimiento:

1) Se pesaron 10 gr de la muestra en condiciones de asepsia en una bolsa de

Stomacher y se lo diluyó en 90 ml de Diluyente (agua peptonada estéril al
0,1%).
2) Se precedió a homogenizar en el Stomacher durante 30 seg.
3) Se realizaron diluciones decimales hasta 10-3. (Se tomaron 1 ml de la dilución
inicial y se diluyeron en 9 ml de diluyente en un tubo de ensayo
sucesivamente).
4) Se tomaron 0,1 ml de la dilución inicial y de cada dilución y se colocaron en
una placa de Petri con un medio anteriormente preparado de Agar Baird

18
 Parker. Con una espátula de Drigalski estéril se disemino el volumen sin tocar
los bordes.
5) Se mantuvo de 10 a 15 minutos en posición horizontal para que la muestra
sea absorbida.
6) Se colocaron en estufa en posición invertida (agar en la parte de arriba) a 35-
37 °C durante 45-48 Hs con el cuidado de no apilar más de 3 placas de Petri.
7) Pasado el tiempo se contaron las colonias Típicas1 y Atípicas2 en las placas
que tengan crecimiento entre 15 y 300 colonias.

Para realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, se hizo la

prueba de presencia de la enzima coagulasa:

1. Se re inoculo la colonias sospechosas utilizando ansa bacteriológica recta

estéril, en tubos de ensayo con caldo cerebro – corazón.
2. Se colocaron en estufas a 35-37 °C durante 24 ± 2 Hs.
3. Transferimos 0,1 ml del cultivo a un tubo de hemolisis ya preparado con 0,3
ml de plasma de conejo.
4. Se colocaron en estufa a 35 – 37 °C y se controlaba cada 6 hs.
5. Se considera como positivo si se forma un coagulo que ocupa más de la mitad
del volumen original del líquido.

1
Colonias Típicas: Se considera aquellas circulares, no rugosas, con apariencia húmeda y gomosa al
contacto, convexa, de 2 a 3 mm de diámetro, de coloración gris a negro tinta, circundada por zona circular
opaca y halo claro.

2
Colonia Atípica: Se considera aquellas circulares, negra o gris, que tenga o no halo de clarificación.

19
Cálculos y Expresión:

Se informó en UFC/g o ml. Si las placas de dilución tienen menos de 15 colonias

se utiliza la media aritmética, dividiendo en cada caso por la dilución que
corresponda. Si al contrario las placas tienen más de 300 colonias se considera
que el conteo estimado esta fuera del rango del ensayo. Se redondea el
resultado a 2 cifras significativas.

5.3. Método horizontal para la enumeración de Coliformes:

Reactivos y Medios de Cultivo:

1. Agar violeta cristal rojo neutro bilis lactosa (VRBL).

2. Agua peptonada al 0.1% (Diluyente).
3. Caldo lactosa verde brillante bilis (BLGB).

Procedimiento:

1. Se pesaron 10 gr de la muestra en condiciones de asepsia en una bolsa de

Stomacher y se lo diluyo en 90 ml de Diluyente (agua peptonada estéril al
0,1%).
2. Se precedió a homogenizar en el Stomacher durante 30 seg.
3. Realizamos diluciones decimales hasta 10-4. (Se tomaron 1 ml de la dilución
inicial y se diluyo en 9 ml de diluyente en un tubo de ensayo sucesivamente).
4. Se tomó 1 ml de la muestra y de cada dilución (por duplicado) y se colocó en
una placa de Petri descartable.
5. Se agregó 15 ml de agar VRBL fundido y enfriado a 45±1 °C. Se debe tener
especial cuidado en que no supere los 15 minutos entre la primera dilución y
el vertido del agar en la última placa.
6. Se mezcló el medio e inoculo con movimientos circulares, de lado a lado y de
arriba abajo. Se dejó solidificar.
7. Se colocó en la superficie una capa virgen de 4 ml de agar VRBL.

20
8. Solidificado el agar se invirtieron las placas y se colocó en estufa de 37°C
durante 24±2 Hs.
9. Pasado el tiempo se contaron las colonias típicas3 y se registró en planilla.
10. Las colonias a confirmar se colocaron inoculando con ansa bacteriológica
recta estéril en al menos 5 tubos de agar BLGB en estufa de 35°c durante 24-
48 Hs.
11. Se considera como Coliforme si hay presencia de gas en los tubos.

Expresión de Resultados:

Los conteos se registran en planillas para volcarlos en una hoja de cálculo de

Distribución de Poisson y Criterios de Precisión que nos indica:

1. Número de Coliformes en la muestra

2. La estimación de la incertidumbre

Se informó en UFC/g o ml ± incertidumbre estimada en las placas de Petri que

tienen entre 1 y 150 colonias. Si la cantidad de colonias es menor a 10 se utiliza
la media aritmética, dividiendo en cada caso por la dilución que corresponda. Si
al contrario las placas tienen más de 150 colonias se considera que el conteo
estimado esta fuera del rango del ensayo. Se redondea el resultado a 2 cifras
significativas.

3
Se considera Colonia Típica de Coliforme a las que son circulares, de color rojo-purpura, con un diámetro
mayor a 0,5 mm y con un halo de precipitación debido al consumo de las sales biliares.

21
 5.4. Método horizontal para la enumeración de mohos y levaduras en
alimentos con aW ≥ 0,95:

Reactivos y Medios de Cultivo:

1. Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC).

2. Agua peptonada al 0.1% (Diluyente).

Procedimiento:

1. Se pesaron 10 gr de la muestra en condiciones de asepsia en una

bolsa de Stomacher y se lo diluyo en 90 ml de Diluyente (agua peptonada estéril
al 0,1%).
2. Se precedió a homogenizar en el Stomacher durante 30 seg.
3. Se realizaron diluciones decimales hasta 10-4. (Se tomaron 1 ml de
la dilución inicial y se diluyo en 9 ml de diluyente en un tubo de ensayo
sucesivamente).
4. Se tomó 0,1 ml de la muestra y de cada dilución (por duplicado) y
se colocó en una placa de Petri descartable ya preparada con el medio DRBC.
5. Se tomó 0,1 ml de la dilución inicial y de cada dilución y se colocó
en una placa de Petri con un medio anteriormente preparado de DRBC. Con una
espátula de Drigalski estéril se disemino el volumen sin tocar los bordes.
6. Se mantuvo de 10 a 15 minutos en posición horizontal para que la
muestra sea absorbida. Se colocó en estufa en posición invertida (agar en la
parte de arriba) a 25±1 °C durante 5 días con el cuidado de no apilar más de 3
placas de Petri.
7. Transcurrido el tiempo se contaron las colonias. No se debe tener
en cuenta a las placas en donde los micelos se cruzan o estén en contacto.

Cálculo y expresión de Resultados:

Los conteos se registraron en planillas para volcarlos en una hoja de cálculo de

Distribución de Poisson y Criterios de Precisión que nos indica:

1. Número de Coliformes en la muestra

22
2. La estimación de la incertidumbre

Se informó en UFC/g o ml ± incertidumbre estimada en las placas de Petri que

tienen entre 1 y 150 colonias. Si la cantidad de colonias es menor a 10 se utiliza
la media aritmética, dividiendo en cada caso por la dilución que corresponda. Si
al contrario las placas tienen más de 150 colonias se considera que el conteo
estimado esta fuera del rango del ensayo. Se redondea el resultado a 2 cifras
significativas.

2.2. Método horizontal para la determinación de Salmonella spp. :

Reactivos y Medios de Cultivo:

1. Agua peptonada al 0.1% (Diluyente).

2. Caldo de enriquecimiento de salmonellas según Rappaport-Vassiliadis
(CRV).
3. Caldo Tetrationato con agregado de novobicina (CT).
4. Agar XLD (por sus siglas en ingles Xylose-Lysine-Desoxycholate).
5. Agar Salmonella Shigella (SS).
6. Agar Tripteina Soya (ATS).
7. Agar TSI (por sus siglas en ingles Triple Sugar Iron).
8. Agar Urea.
9. Agar Lisina Hierro (LIA).
10. Caldo Triptófano.
11. Reactivo INDOL.
12. Solución Fisiológica estéril.
13. Tolueno.
14. Disco de prueba de la β-galactosidasa.
15. MR-VP Medio.
16. Reactivos de Barrit A y B.
17. Hidróxido de potasio (K (oh)).

23
Procedimiento:

 Pre-enriquecimiento no selectivo:

1. Se pesaron 25 gr de la muestra en condiciones de asepsia en una

bolsa de Stomacher y se lo diluyo en 225 ml de Diluyente (agua peptonada estéril
al 0,1%). Pudo variar la cantidad de diluyente necesaria, pero siempre se obtuvo
una dilución 1/10.
2. Se precedió a homogenizar en el Stomacher durante 30 seg.
3. Se incubo en estufa a 37°C durante 18±2 Hs.

 Enriquecimiento selectivo:

1. Se tomó 0,1 ml de la mezcla anterior y se colocó en un tubo de

ensayo con 10 ml de CRV. A su vez, otro 1 ml a un tubo de ensayo con CT.
2. El tubo con CRV se incubo en estufa a 41,5±1°C durante 24 Hs.
3. El tubo con CT se incubo en estufa a 37±1°C durante 24 Hs.

 Aislamiento diferencial en placa:

1. Luego del tiempo de incubación se pasaron ambos tubos por el

Vortex mixer y se inocularon en placas de Petri preparadas con anterioridad con
los medios agar XLD y agar SS de crecimiento selectivo, con ansa de metal recta
estéril en superficie.
2. Se incubaron en estufa de 37°C durante 24±3 Hs.
3. Se marcó la posición de las colonias que cumplan las
características típicas, tanto en el agar XLD4 como en el agar SS5.

4
Se trata de las colonias de color rosado con o sin centro negro. En su mayoría se observan muchas con
un gran centro negro brillante.

5
Son las colonias translucidas, ocasionalmente opacas. Algunas pueden presentar un centro negro.

24
  Aislamiento y Purificación:

1. Se tomaron 5 colonias características y se inoculan en agar

nutritivo ATS
2. Se incubaron en estufa a 37±1 °C durante 24±3 Hs.

 Confirmación mediante pruebas bioquímicas:

1. Se inoculo en pico de flauta por medio de punción y estriado en

superficie en 3 medios: ATS, Urea y LIA.
2. Se incubaron durante 24±3 Hs en estufa a 37±1°C.
3. Observamos los resultados.

En el agar TSI se considerara positivo si se ve un pico rojo, debido a la

fermentación alcalina en la superficie, un fondo de tubo amarillo, por la
fermentación acida y la producción de ácido sulfhídrico (H 2S) en el 90% de los
casos.

En el agar Urea el positivo es cuando el medio vira al rosa por el

desprendimiento de amonio.

En el LIA, los tubos positivos tendrán en el fondo una coloración

purpura por la descarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de
ácido sulfhídrico.

 Confirmación mediante la Reacción del Indol:

1. Se inocularon las colonias en 5 ml de caldo Triptófano.

2. Se incubaron en estufa de 37±1 °C durante 24±3 Hs.
3. Pasado el tiempo se aplicaron 2 gotas del reactivo INDOL y se
observó el resultado. Se considera positivo si en la superficie del tubo se produce
un anillo de color rojo.

Cálculo y expresión de Resultados:

Se informó como PRESENCIA o AUSENCIA en 25g/cm2.

25
 5.5. Método horizontal para la enumeración de Clostridium sulfito
reductores bajo condiciones anaeróbicas:

Reactivos y Medios de cultivo:

1. Agua peptonada estéril al 0,1% (Diluyente).

2. Agar TSC (Triptosa-Cicloserina-Sulfito).
3. Caldo Diferencial y Reforzado para Clostridios (DRCM).
4. Parafina.

Procedimiento:

1. Se pesaron 10 gr de la muestra en condiciones de asepsia en una

bolsa de Stomacher y se lo diluyo en 90 ml de diluyente (agua peptonada estéril
al 0,1%).
2. Se precedió a homogenizar en el Stomacher durante 30 seg.
3. Se tomó 1 ml de la muestra (por duplicado) y se colocó en una placa
de Petri descartable.
4. Se agregó 15 ml de agar TSC fundido y enfriado a 45±1 °C. Se tuvo
especial cuidado en que no supere los 15 minutos entre la primera dilución y el
vertido del agar en la última placa.
5. Se mezcló el medio e inoculo con movimientos circulares, de lado
a lado y de arriba abajo. Se dejó solidificar.
6. Se colocó en la superficie una capa virgen de 4 ml de agar TSC.
7. Solidificado el agar se invirtieron las placas y se colocó en estufa
de 37°C durante 24-48 Hs dentro de jarras anaerobias.
8. Pasado el tiempo se contaron las colonias típicas6 y se registró en
planilla.
9. Para la confirmación se pasaron a un tubo de ensayo que contenía
caldo DRCM y se cubrió la boca del mismo con una capa de 3 a 5 mm de
parafina.

6
Se consideran a aquellas circulares, de color negro, rodeada de coloración negro.

26
 10. Se colocó en estufa a 30 °C durante por lo menos 7 días, hasta 4
semanas.
11. Si pasado el tiempo se observa producción de gas y de nitratos
(evidenciada en coloración negra) se considera positivo.

Expresión de Resultados:

Los conteos se registraron en planillas para volcarlos en una hoja de cálculo de

Distribución de Poisson y Criterios de Precisión que nos indica:

1. Número de Clostridium en la muestra

2. La estimación de la incertidumbre

Se informa en UFC/g o ml ± incertidumbre estimada en las placas de Petri que

tienen entre 1 y 150 colonias. Si la cantidad de colonias es menor a 10 se utiliza
la media aritmética, dividiendo en cada caso por la dilución que corresponda. Si
al contrario las placas tienen más de 150 colonias se considera que el conteo
estimado esta fuera del rango del ensayo. Se redondea el resultado a 2 cifras
significativas.

2.3. Método horizontal para la detección de Listeria Monocytogenes: En el

presente caso, no se pudo realizar el método debido a un problema con los
suministros de insumos que tenía el laboratorio en ese momento. Es por ese
motivo, y entendiendo que en una residencia uno debe adaptarse al ambiente en
el que le toca trabajar, que mis muestras no fueron analizadas para Listeria
Monocytogenes aún cuando el CAA lo requiere.

27
 5.6. E.Coli O157:H7

5.6.1. Protocolo para extracción de ADN de la muestra con Kit ROCHE:

Material y equipo específico:

1. Termoblock a 70°C.
2. Centrifuga.
3. Columnas de filtración
4. Membranas de filtración

Reactivos y Medios de cultivo:

1. Binding Buffer.
2. Proteinasa.
3. Isopropanol.
4. Buffer Inhibitor Removal.
5. Wash Buffer.
6. Elution Buffer TE

Obtención de las muestras:

1. Se pesaron 25 gr de la muestra en condiciones de asepsia en

frasco estéril y se lo diluyo en 225 ml de Diluyente (Caldo M-CASO). Puedo variar
la cantidad de diluyente necesaria, pero siempre se obtuvo una dilución 1/10.
2. Se hizo un pool con las muestras.
3. Se colocó en estufa de 37 °C durante 24 Hs.
4. Transcurrido el tiempo, se procedió a esterilizar las muestras y el
pool sometiéndolos a hervor, dado que el método de PCR no necesita la bacteria
viva, sino el material genético.
5. Conservación de la muestra: se mantuvo a -20°C.

28
Procedimiento:

 Se tomó con pipeta automática de 200 µl del pool de las muestras y se

colocó en un tubo estéril de 1,5 ml.
 Se colocó 200 µl de Binding Buffer y 40 µl de Proteinasa K. Se mezcló.
 Se incubo durante 10 minutos a 70°C en el Termoblock.
 Se agregó 100 µl de Isopropanol. Se mezcló y se pasó a la 1er columna
de filtración.
 Se colocó en centrifugadora a 8000 G durante 1 minuto y a temperatura
ambiente.
 Se descartó el filtrado y se colocó la columna en un tubo de 2 ml.
 Se colocó 500 µl de Buffer Inhibitor Removal.
 Nuevamente se centrifugo a 8000 G durante 1 minuto y a temperatura
ambiente.
 Se descartó el filtrado y se colocó la columna nuevamente en un tubo de
2 ml.
 Se colocó 500 µl de Wash Buffer.
 Se colocó en centrifugadora a 8000 G durante 1 minuto y a temperatura
ambiente.
 Se descartó el filtrado y se colocó la columna en un tubo de 2 ml.
 Se colocó 500 µl de Wash Buffer por segunda vez.
 Se colocó en centrifugadora a 8000 G durante 1 minuto y a temperatura
ambiente.
 Se descartó el filtrado y se colocó la columna en un tubo de 2 ml.
 Se centrifugo 10 segundos a 13000 G.
 Se colocó la columna en un tubo de 1,5 ml estéril y se descartó el tubo de
2 ml con el filtrado resultante.
 Se precalentó el Evolution Buffer TE a 70°C para mejorar la eficiencia de
la dilución.
 Se agregó 200 µl ya precalentado de Evolution Buffer TE en el centro de
la membrana de filtración.
 Se incubo 1 minuto a Temperatura ambiente.

29
  Se centrifugo 1 minuto a 8000 G. El ADN obtenido es estable
indefinidamente si se conserva a -20°C.

2.7.2 PCR

Material y equipo específico:

1. PCRtr

Reactivos y Medios de cultivo:

1. Mescla EVAGREEN 2X
2. Primer E. Coli O157 fw 20 µM
3. Prime E. Coli O157 rv 20 µM
4. Cloruro de magnesio
5. ADN templado
6. Agua destilada

Procedimiento:

1. Se realizaron los cálculos necesarios para llegar al volumen final de 20 µ

en cada uno de los 8 tubos, basándose en la relación que deben mantener
los componentes mediante una regla de 3 simple.

Tabla 5: Relación entre componentes del mix de la PCR (µl)

MIX 1X
Mescla EVAGREEN 2X 10 µl
Primer E. Coli O157 fw 20 µM 0,8 µl
Prime E. Coli O157 rv 20 µM 0,8 µl
Cloruro de magnesio 2 µl
ADN templado 1 µl
Agua destilada 5,4 µl
Ver en Anexo III la hoja de trabajo completa.

30
 2. Se tomó el volumen total de Mescla EVAGREEN 2X con pipetas
graduadas, en este caso 80 µl, y se colocó 10 µl en cada tubo de la grilla del
PCR.
3. Se tomó el volumen total de 6,4 µl del Primer E. Coli O157 fw 20
µM con pipetas graduadas, y se distribuyó 0,8 µl en cada tubo de la grilla del
PCR.
4. Se tomó el volumen total de 6,4 µl del Primer E. Coli O157 rv 20 µM
con pipetas graduadas, y se distribuyó 0,8 µl en cada tubo de la grilla del PCR.
5. Se tomó el volumen total de 16 µl de Cloruro de magnesio con
pipetas graduadas, y se distribuyó 2 µl en cada tubo de la grilla del PCR.
6. Se tomó el volumen total de 8 µl de ADN templado extraído
previamente con pipetas graduadas, y se distribuyó 2 µl en cada tubo de la grilla
del PCR, menos en los controles positivo y negativo. Las muestras se procesaron
por duplicado.
7. Se tomó el volumen total de 43,2 µl de agua destilada con pipetas
graduadas, y se distribuyó 2 µl en cada tubo de la grilla del PCR.
8. Se colocó la grilla del PCR dentro del equipo de PCRtr y atreves
del software se da inicio a la corrida.
9. Luego de 45 ciclos se obtiene el resultado de forma gráfica y en
tabla.

Cálculo y expresión de Resultados:

Se informó como PRESENCIA o AUSENCIA en la muestra.

31
6. Resultados:

Es importante remarcar algunas condiciones que fueron observadas en el

momento de la toma de muestras de fiambrerías para entender los resultados.
En ninguno de los casos, el empleado encargado del feteado utilizaba guantes
al manipular los fiambres y sólo en un caso (Bondiola muestra 4) no era el
responsable de cobrar. En la muestra 3 del Jamón cocido y la muestra 1 de la
Bondiola, el fiambre fue abierto in situ y la maquina feteadora fue higienizada en
el momento anterior de la compra. En el resto de los casos, los fiambres se
encontraban en una heladera exhibidora con otros fiambres, ya abierto su
envase original y cubierto con film la parte expuesta al ambiente.

En todas las muestras analizadas se pudo observar un crecimiento microbiano

en diferentes medidas.

Teniendo en cuenta los criterios que plantea el CAA se puede asegurar que
todas las muestras estaban en perfectas condiciones de ser consumidas sin
riesgo de patógenos, dado que el único criterio que excedió lo previsto en todas
las muestras fue el de Hongos y Levaduras que se considera complementario,
es decir, es el criterio relativo a la evaluación del proceso tecnológico utilizado
para la obtención de un producto (ANMAT; 2006). Cabe aclarar, que en algunas
de las diluciones realizadas para llevar a cabo los análisis, los resultados del
conteo estimado se encontraban por fuera del rango del ensayo realizado. Para
analizar los resultados se tomaron en cuenta aquellas diluciones dentro del rango
del método. A continuación se colocan las tablas con los resultados promedio de
las muestras teniendo en cuenta al CAA. (ANEXO I: Resultados completos).

32
Tabla 6: Resultados promedio de muestras de Salame Milán de fiambrería vs
Salame Milán envasado al vacío

Microorganismo ̌ Salame tipo milan de

𝒙 ̌ Salame tipo milan
𝒙
analizado fiambrería envasado al vacio
Staphylococcus
0 UFC/g 0 UFC/g
coagulasa +
Coliformes totales 0 UFC/g 0 UFC/g
Anaerobios sulfito
0 UFC/g 0 UFC/g
reductores
Salmonella ausencia/25 g ausencia/25g
E. Coli O157:H7 ausencia Ausencia
Hongos y
34,187 103UFC/g 3,27 102 UFC/g
Levaduras

Tabla 7: Resultados promedio de muestras de Jamón cocido de fiambrería vs

Jamón cocido envasado al vacío

Microorganismo ̌ Jamon cocido de

𝒙 ̌ Jamón cocido
𝒙
analizado fiambreria envasado al vacío
Staphylococcus
0 UFC/g 0 UFC/g
coagulasa +
Coliformes totales 0 UFC/g 0 UFC/g
Anaerobios sulfito
0 UFC/g 0 UFC/g
reductores
Salmonella ausencia ausencia
E. Coli O157:H7 ausencia ausencia
Hongos y Levaduras 14,5 103 UFC/g 1,35 103 UFC/g

33
Tabla 8: Resultados promedios de muestras de Bondiola de fiambrería vs
Bondiola envasado al vacío

Microorganismo ̌ Bondiola de
𝒙 ̌ Bondiola envasado al
𝒙
analizado fiambreria vacio
Staphylococcus
0 UFC/g 0 UFC/g
coagulasa +
Coliformes totales 0 UFC/g 0 UFC/g
Anaerobios sulfito
0 UFC/g 0 UFC/g
reductores
Salmonella ausencia ausencia
Hongos y Levaduras 7,94 103UFC/g 8,6 103 UFC/g

34
7. Discusión:

El objetivo de este trabajo fue relacionar por medio del recuento de patógenos,
el riesgo de ETA con la manipulación en los locales expendedores comparando
la misma marca de un fiambre en 2 formatos, envasado al vacío en el lugar de
origen y feteado en el momento por locales minoristas. En ambas formas de
envasado de la misma marca de fiambres se observó un crecimiento importante
de microorganismos no patógenos, pero los basados en los criterios del CAA
estaban dentro de los límites aceptados o ausentes en las muestras. Los únicos
microorganismos obtenidos fueron Hongos y Levaduras. En los 3 tipos de
fiambres los limites microbiológicos para Hongos y Levaduras del CAA son m:
102 y M: 103, siendo este último el que separa la calidad marginalmente
aceptable de la rechazable, por lo que al tener en cuenta que todas las muestras
lo sobrepasan, con excepción del Salame tipo Milán envasado al vacío en origen,
se podría decir que no tienen una calidad aceptable para el consumo.

En las muestras de Bondiola obtenidas en locales fraccionadores se obtuvo un

menor recuento que en las envasadas en vacío en la fábrica. Como ya se
mencionó, una muestra fue abierta in situ y feteada en una máquina que recién
higienizada. El resultado de esta muestra puede haber descendido el promedio
de las muestras de fiambrería dado que el n muestral tomado fue bajo y puede
ser que la muestra medida no represente al mensurando definido (CITAC; 1995),
Sin embargo, en la muestra de Jamón cocido de fiambrería que se fue obtenida
en las mismas condiciones se reportó un bajo recuento (150 UFC/g) y aun así
no se aprecia una diferencia en el promedio de las muestras, este sigue siendo
ampliamente superior al de las muestras envasadas al vacío en origen. Puede
tratarse de problemas de higiene en la empresa productora, dado que los
distintos tipos de fiambres son de diferentes marcas entre sí.

La vida de anaquel de un producto depende de la concentración inicial de

microorganismos deteriorantes y las condiciones de almacenamiento. Habría
que tener en cuenta que el gran crecimiento de microorganismos aerobios que
se desarrollaron en las muestras pueden tener actividad metabólica que
provoquen acidez, decoloración, producción de gas, perdida de sabores y olores,
35
exudado lechoso, hinchazón del empaque, cambios del pH. (Buelvas Salgado et
al; 2012) Estos cambios no afectan la inocuidad de los alimentos pero si su
calidad nutricional y sensorial pudiendo ocasionar un vencimiento anterior a lo
establecido al momento de la fabricación. Las alteraciones que afectan a la
textura, sabor, olor o color del alimento son fácilmente observables por el
consumidor llevándolo a tirar el mismo en caso de ya haberlo comprado o
directamente no adquirirlo, generando pérdidas económicas para el productor y
expendedor del mismo. En cualquiera de las 2 situaciones se están
desperdiciando recursos.

El crecimiento obtenido se puede deber a contaminación cruzada con otros

productos dentro de las heladeras exhibidoras o a una mala manipulación al
momento del feteado. No se puede descartar que la presencia de levaduras no
provenga de un problema en el proceso de producción o en la aplicación de
POES que permite la supervivencia de los microorganismos deteriorantes
presentes en superficies que resisten la efectividad de los programas de limpieza
y desinfección, remociones mecánicas y químicas causando la formación de
biopelículas(Ossa et al; 2010) y que el envasado al vacío haya retardado la
acción bacteriana dado que extrae el oxígeno que es el primer factor de
oxidación y putrefacción de los alimentos. El mantenimiento de la cadena de frio
en los fiambres es un punto crítico de control que no siempre se toma en cuenta
y que su interrupción crea las condiciones de temperatura para la multiplicación
de microorganismos (Ossa et al; 2010) ya que la mayoría de los patógenos
crecen a en el rango de temperatura comprendido entre los 5 °C a 60 °C. Sin
embargo, hay que tomar en consideración que los microorganismos psicrófilos
pueden crecer hasta los 10°C, es decir, aun cuidando la cadena de frio. Con los
ensayos realizados no se puede confirmar el motivo exacto.

36
8. Conclusión:

En vista a los resultados se puede afirmar que la hipótesis fue refutada.

En cuanto a los patógenos evaluados, en todas las muestras se encontraban

ausentes.

Se puede inferir por los resultados obtenidos en el laboratorio, que los fiambres
analizados se van a encontrar disminuidos en su calidad nutricional y/o
organoléptica debido al crecimiento de estos microorganismos. Sin embargo, el
consumidor no es consciente de esto ya que no es posible de observar a simple
vista ni se produce una ETA. A su vez, estas alteraciones van a significar una
pérdida económica dado que se reduce la vida de anaquel del alimento.

En el único caso que se observa mayor crecimiento de hongos y levaduras en el

envasado al vacío que en el expendido en fiambrería es en la bondiola. Con los
datos obtenidos en este trabajo, no hay forma de aseverar el motivo de esta
diferencia entre la Bondiola y el resto de los fiambres estudiados, aunque se
puede sospechar que sea debido a que la empresa productora tiene problemas
con las POES.

Solamente se puede concluir que las muestras fueron aptas para el consumo de
acuerdo al CAA.

Consideraciones Finales

En un futuro trabajo se tendría que caracterizar las especies de microorganismos

presentes en las muestras para poder hablar en más detalle del motivo de su
presencia, ya que no es lo mismo que las levaduras encontradas sean utilizadas
en el proceso tecnológico de los fiambres a que se encontraron presentes por
contaminación cruzada o deficiencia del proceso de elaboración del producto.

Me hubiera interesado poder evaluar la relación con las BPM pero dado a que
no tuve acceso a las empresas productoras de las muestras, no se pudo realizar
el seguimiento necesario de las mismas para poder asegurar algo verídico.

37
Sería interesante poder acercarse en otro trabajo a este tema desde un análisis
de la manipulación que sufren los fiambres en los locales fraccionadores y la
capacitación de los empleados a la hora de manipular alimentos.

38
9. Bibliografía:
 Alfonso F.; Imbrogno, A.; Villalba, H. (2010) Resultados Preliminares del
Consumo de Fiambres de Cerdo en el Área de Influencia de la Facultad
de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Lomas de Zamora;
Veterinaria Cuyana Vol. 5; pág. 31.
 ANMAT (2011). Análisis microbiológico de los Alimentos, Metodología
Analítica Oficial, Microorganismos Patógenos, Vol. 1 y 2.
 ANMAT (2014) Análisis microbiológico de los Alimentos, Metodología
Analítica Oficial, Microorganismos Indicadores Vol. 3; [153 pantallas]
Disponible en el URL:
http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_al
imentos_Vol_III.pdf (visto 16/05/2017)
 ANMAT (2011). Boletín para Consumidores, Nº 50.
 ANMAT (2006). El boletín del Inspector Bromatológico, N° 3.
 ANMAT; Enfermedades Transmitidas por Alimentos, Ficha Técnica N° 8:
Síndrome Urémico Hemolítico; [14 pantallas] Disponible en el URL:
http://www.anmat.gov.ar/alimentos/ficha_enfermedades_alimentos_SUH
.pdf (Visto 19/12/2016)
 ANMAT (2006).Guía de Interpretación de Resultados Microbiológicos de
Alimentos [21 pantallas] Disponible en el URL:
http://www.anmat.gov.ar/Alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_
microbiologicos.pdf (visto 16/09/2016)
 ANMAT; Higiene e Inocuidad de los Alimentos: Procedimientos
Operativos Estandarizados de Saneamiento (POES); El Boletín del
Inspector Bromatológico N° 9; [6 pantallas] Disponible en URL:
http://www.anmat.gov.ar/webanmat/boletinesbromatologicos/gacetilla_9_
higiene.pdf (Visto: 18/05/2017)
 Begoña, Marcos Muntal (2007). Mejora de la seguridad alimentaria en
productos cárnicos listos para el consumo mediante la aplicación
combinada de tecnologías de conservación emergentes; [101 pantallas]
Disponible en el URL: http://hdl.handle.net/10803/7797 (visto 13/06/2016)

39
 Blázquez, Irene Ortega; 2014; Análisis microbiológico de alimentos
cárnicos; Universidad de Jaén, Facultad de Ciencias Experimentales; [39
pantallas] Disponible en el URL: http://hdl.handle.net/10953.1/560 (visto
15/08/2016)
 Buelvas Salgado, G. A., Patiño Gómez, J. H., Restrepo Flores, C. E.
(2012). Efecto de la cadena de frío sobre el crecimiento de bacterias
ácido-lácticas, la calidad fisicoquímica y la alteración de jamones cocidos
lonchados empacados al vacío; Revista Lasallista de Investigación - Vol.
9 N°. 2; pp 55•64.
 Caballero Torres, Ángel E. (2008). Temas de Higiene de los Alimentos;
Editorial Ciencias Médicas; La Habana; pp. 216-230.
 Camacho, A., Giles M., Ortegón A., Palao M., Serrano B. y Velázquez O.
(2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed.;
Facultad de Química, UNAM; México.
 Cátala, Ramón; Gavara, Rafael (2001) Nuevos envases. De la protección
pasiva a la defensa activa de los alimentos envasados; Arbor CLXVIII,
661; pp. 109-127. [19 pantallas] Disponible en el URL:
http://arbor.revistas.csic.es (Visto 16/09/2016)
 CITAC (1995) Cuantificación de la Incertidumbre en Mediciones
Analíticas; Londres; ISBN 0-948926-08-2
 Código alimentario Argentino. Disponible en el URL:
http://www.anmat.gov.ar/alimentos/normativas_alimentos_caa.asp (visto
17/09/16)
 Comerio, Ricardo Mario; Mac Cormack, Walter (2004). Algunos
micromicetes del suelo y de alimentos deteriorados en la Antártida
Argentina; Revista Iberoamericana de Micología N° 21: pp 128-134.
 Diez AM, Santos EM, Jaime I, Rovira J. (2008). Application of organic acid
salts and highpressure treatments to improve the preservation of blood
sausage; Food Microbiology Vol. 25 n ° 1; pp. 54-61.
 FAO; Alimentos Sanos y Seguros; [18 pantallas]. Disponible en el URL:
http://www.fao.org/docrep/014/am401s/am401s05.pdf (Visto 17/09/2015)

40
 Fenoglio, Daniel (2014). Evolución de la Industria Porcina; Anuario GITEP
2014; pág. 31. [43 pantallas] Disponible en el URL:
http://www.gitep.com.ar/descargas/anuarios/anuario2014.pdf (Visto
26/11/2016).
 Gonzales Flores, Tania; Rojas Herrera, Rafael Antonio (2005).
Enfermedades transmitidas por alimentos y PCR: prevención y
diagnóstico; Salud pública de México, vol.47, n°.5, pp. 388-390.
 International Standard ISO 4832 (2006) Microbiology of food and animal
feeding stuff – Horizontal method for the enumeration of coliform – Colony
count technique.
 International Standard ISO/TS 6579-2 (2012). Microbiology of food and
animal feeding stuff – Horizontal method for the detection of salmonella
spp.
 International Standard. ISO 6887. (1999). Microbiology of food and animal
feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspension and decimal
dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the
preparation of the initial suspension and decimal dilutions. First edition.
 International Standard ISO 6888-1 (1999). Microbiology of food and
animal feeding stuff – Horizontal method for the enumeration of coagulase-
positive Staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) – Part
1: Techniques using Baird Parker agar medium.
 International Standard ISO 15213 (2003) Microbiology of food and animal
feeding stuff – Horizontal method for the enumeration of sulfite-reducing
bacteria growing under anaerobic conditions.
 International Standard ISO 21527-1 (2008) Microbiology of food and
animal feeding stuff – Horizontal method for the enumeration of yeasts and
moulds – Part 1: Colony count in products with water activity greater than
0,95.
 Loureiro, V., Querol, A. (1999). The prevalence and control of spoilage
yeasts in foods and beverages; Trends in Food Science & Technology Vol.
10, pp. 356-365.

41
 Ministerio de Agroindustria; Sistemas de Gestión de Calidad en el Sector
Agroalimentario BPM-POES-MIP-HACCP; (2016); [64 pantalla]
Disponible en el URL:
http://www.agroindustria.gob.ar/sitio/areas/escuelagro/_archivos//000010
_Alimentos/000000_Sistemas%20de%20Gestion%20de%20Calidad%20
en%20el%20Sector%20Agroalimentario.pdf (Visto: 19/05/2017)
 Odriozola, J. (2008). Mercado del NEA - Comportamientos de compra y
consumo de productos y subproductos porcinos. Mem. IV Curso FANUS,
Situación Actual de la Producción y Consumo del Cerdo, Bolsa de
Cereales, pp. 47 - 60
 Orberá Ratón, Teresa de los Milagros (2004). Acción perjudicial de las
levaduras sobre los alimentos; Rev Cubana Salud Pública Vol.30 n°.3;
Ciudad de La Habana. versión On-line ISSN 0864-3466
 Organización Panamericana de Salud (OPS): Sistemas de Vigilancia
Epidemiológica. (2014). [1 pantalla]. Disponible en el URL:
http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=
5807&Itemid=41178&lang=es Fecha de consulta: 28/09/2015
 Organización Mundial de la Salud (OMS); Salmonella (no tifoidea) Nota
descriptiva Nº139; (2013); [1 pantalla] Disponible en el URL:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/es/ (visto: 25/02/2017)
 Ospina Meneses, Silvia Marcela; Cartagena Valenzuela, José Régulo
(2008). La atmósfera modificada: una alternativa para la conservación de
los alimentos; Revista Lasallista de Investigación, Vol. 5 N°. 2, pp 112-123
 Ossa, Juliana; Coral, Adriana; Vanegas, María (2010) Microbiota de
jamones de cerdo cocidos asociada al deterioro por abombamiento del
empaque; Rev. MVZ Córdoba Vol.15 n°2, pp. 2078-2086.
 Pérez de Castro, Ana María (2010) Reacción en cadena de la polimerasa
(Polymerase Chain Reaction, PCR); Universidad Politécnica de Valencia;
[10 pantallas] Disponible en el URL:
https://riunet.upv.es/handle/10251/10700 (visto 19/12/2016)
 Pitt JI, Hocking AD (1997). Fungi and Food Spoilage, Second edition.
Blackie Academic & Professional; London.

42
 Gonzales, Diego (2012). Principios fundamentales de la conservación y
procesado de los Alimentos; [74 pantallas] Disponible en el URL:
https://es.slideshare.net/diegogonzalez549221/1-principios-
fundamentales-de-la-conservacion-y-procesado-de (visto 15/02/17)
 SENASA (2013). E. Coli Verotoxigénica. Actividades de Control; Dirección
General de Laboratorios y Control Técnico; Series Temáticas Vol. 5; pp
10 – 24.
 Wrent, Petra (2015). Desarrollo de Métodos Moleculares para la
Detección y Tipificación de Cepas de Levaduras con Interés Industrial;
Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas.
[185 pantallas] Disponible en el URL:
https://www.researchgate.net/publication/301658636_Development_of_
molecular_methods_for_the_detection_and_strain_typing_of_yeasts_wit
h_industrial_interest

43
10. Anexo I: Resultado Completos

En todos los casos se registró crecimiento de bacterias, pero estas eran no

típicas. En alguna excepción las colonias sospechosos siguieron la marcha
correspondiente para comprobar si se trataba de alguna de las bacterias
buscadas, en los casos en que luego de esto dio negativo, se informa como que
no hubo crecimiento.

Tabla n° 9: Resultados microbiológicos de Jamón Cocido al vacío.

Tabla n° 10: Resultados microbiológicos de Jamón Cocido de Fiambrería.

* Conteo estimado fuera del rango del ensayo realizado

44
Tabla n° 11: Resultados microbiológicos de Bondiola al Vacío.

* Conteo estimado fuera del rango del ensayo realizado

Tabla n° 12: Resultados microbiológicos de Bondiola de Fiambrería.

* Conteo estimado fuera del rango del ensayo realizado

Tabla n° 13: Resultados microbiológicos de Salame tipo Milán al Vacío.

45
Tabla n° 14: Resultados microbiológicos de Salame tipo Milán de Fiambrería.

* Conteo estimado fuera del rango del ensayo realizado

46
11. Anexo II: Fotos

Foto 1: Muestra de Jamón Cocido al Vacío n° 5. Crecimiento de colonia

sospechosa en medio agar Baird Parker.

Foto 2: Muestra Bondiola al Vacío n° 3. Crecimiento en medio agar Baird Parker.

47
Foto 3: Confirmación de colonia sospechosa de Coliforme en muestra de
Bondiola al Vacío n° 3. Crecimiento en Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis.

48
Foto 4: Crecimiento Bondiola al Vacío n° 3. Crecimiento en medio agar Dicloran
Rosa de Bengala Cloranfenicol.

Foto 5: Crecimiento Bondiola al Vacío n° 3. Crecimiento en medio agar Dicloran

Rosa de Bengala Cloranfenicol.

49
Foto 6: Crecimiento Bondiola al Vacío n° 5. Crecimiento en medio agar Dicloran
Rosa de Bengala Cloranfenicol.

Foto 7: Crecimiento Bondiola de Fiambrería n° 1. Crecimiento en medio agar

Baird Parker.

50
Foto 8: Crecimiento Bondiola de fiambrería n° 4. Crecimiento en medio agar
Baird Parker.

Foto 9: Crecimiento Bondiola de fiambrería n° 2. Crecimiento en medio agar

Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol.

51
Foto 10: Validación del medio Shigella-Salmonela (SS).

Foto 11: Crecimiento característico de Salmonella spp. En medio agar SS.

52
Foto 12: Crecimiento de muestra de Salame al Vacío n° 1 en agar SS, luego de
incubar en caldo Rappaport-Vassiliadis.

Foto 13: Confirmación de colonia sospechosa de Salmonella spp. de muestra de

Bondiola de Fiambrería n° 5 en caldo TSI.

53
Foto 14: Confirmación de colonia sospechosa de Salmonella spp. de muestra de
Bondiola de Fiambrería n° 5 en caldo LIA.

Foto 15: Confirmación de colonia sospechosa de Salmonella spp. de muestra

de Bondiola de Fiambrería n° 5 en caldo Triptófano con la prueba del INDOL.

54
12. Anexo III: Planilla de trabajo de la corrida del PCR

55