Cruzmartinezbruno Tesis Veracruz

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOLOGÍA
Actividad biológica de los extractos etanólicos de dos especies

de zarzamora en Artemia franciscana Kellogg 1906.
TESIS
TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL
QUE PRESENTA:
BRUNO CRUZ MARTÍNEZ
CODIRECTORES: DRA.MARÍA DEL SOCORRO FERNANDEZ

DR.JOSÉ ARMANDO LOZADA GARCÍA
XALAPA, VER.2013
ÍNDICE
Listas de Figuras, Tablas y Gráficas III
Agradecimientos 4
Resumen 6
1. Introducción 7
2. Antecedentes 9
3. Justificación 26
4. Objetivos 27
5. Materiales y Métodos 28
6. Resultados 41
7. Discusión 47
8. Conclusiones 52
9. Sugerencias 53
10. Bibliografía 54
II
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.Rubus coriifolius con flor. 10
Figura 2.Rubus fruticosus var. Brazos con fruto 12
Figura 3.Estructura básica de los compuestos fenólicos 13
Figura 4.Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno que contiene
(Ávalos y Pérez, 2009). 16
Figura 5.Clasificación química de los alcaloides 18
Figura 6.Enumeración de los átomos de carbono en la molécula de colesterol 19
Figura 7.Artemia franciscana 21
Figura 8.Tipo de clima del municipio de Ixhuacán de los Reyes 25
Figura 9.Tipo de suelo del municipio de Ixhuacán de los Reyes 26
Figura 10.Localización del área de colecta en el municipio de Ixhuacán de los Reyes 28
Figura 11. Sitios de colecta 1-4 de hojas de zarzamora en el municipio de Ixhuacán de los
Reyes. 29
Figura 12.Sitio de colecta 5 de hojas de zarzamora en el municipio de Coatepec 30
Figura 13.Eclosión de Artemia franciscana 35
Figura 14. Quistes de Artemia franciscana y nauplio de A. franciscana 35
Figura 15. Nauplio del segundo estadio de Artemia franciscana 36
Figura 16. Nauplio del segundo estadio de Artemia franciscana 36
Figura 17.Artemia franciscana 24 horas después de su eclosión 38
Figura 18.Bioensayo de Artemia franciscana 39
Figura 19. Bioensayo de Artemia franciscana 39
III
LISTA DE TABLAS
Tabla1. Clasificación taxonómica de Artemia franciscana 21
Tabla 2.Nivel de precipitación del municipio de Ixhuacán de los Reyes 25
Tabla 3.Descripción, coordenadas de las colectas de zarzamora. 29
Tabla 4.Soluciones para la elaboración del agua de mar artificial 34
Tabla 5.Rendimiento del extracto de Rubus coriifolius 41
Tabla 6.Rendimiento del extracto de Rubus fruticosus var. Brazos 41
Tabla 7.Caracterización fitoquímico preliminar de los extractos de Rubus coriifolius 42
Tabla 8.Caracterización fitoquímico preliminar de los extractos de Rubus fruticosus var.

Brazos 42
Tabla 9.CL50 en el bioensayo con artemia de los extractos etanólicos de las especies de Rubus y
la CL50 más/menos su respectivo error estándar 45
LISTA DE GRÁFICAS
Gráfica 1.Cantidad de flavonoides presentes en los extractos de las 2 especies de Rubus

estudiadas 43
Gráfica 2.Índice de oxidación de los extractos de las especies de Rubus y un equivalente de

quercetina. 44
Gráfica 3.Porcentaje de mortalidad provocado por los extractos etanólicos foliares obtenidos de
las muestras colectadas en los 5 sitios. 45
IV
Agradecimientos
Quiero agradecer al Laboratorio de Toxicología por abrirme las puertas y apoyarme tanto en el
transcurso final de mis estudios; así como a la Dra. Maricarmen y a la Dra. Palmeros por
apoyarme, brindarme consejos y puntos de vista que me enriquecieron como persona, alumno y
futuro biólogo.
De manera personal, quiero agradecer a mis Co-Directores de Tesis. A la Dra. María del Socorro
Fernández por todos los meses de apoyo, guía, esfuerzo, consejos y presiones que me han
ayudado en mi formación académica y sobretodo personal. Gracias por creer en mí y estar a mi
lado tanto como maestra y amiga. Al Dr. Armando por sus comentarios y sus insistencias, las
cuales me han a darme cuenta de actitudes que no me servirán en las siguientes etapas de mi vida;
gracias por el afecto depositado, por la estima que siempre me hizo sentir -y a sus alumnos en
general -; es un gran ejemplo de persona a la cual espero poder imitar, particularmente en el amor
que le profesa a su profesión. De todo corazón gracias Dr. Armando y Dra. Socorro; sin ustedes
puedo afirmar, sin temor a equivocarme, que no me sentiría hoy tan capaz y con esta visión
renovada de la vida. Por eso y muchas otras cosas, les repito:¡gracias!
Gracias a las Maestras Guillermina, Marta e Imelda por su apoyo constante y guía en mis
experimentos que realice en el laboratorio. Sé que les di mucho trabajo y que había días que era
una molestia pero siempre estuvieron ahí para apoyarme con los brazos abiertos y una sonrisa;
gracias por sus platicas que, aparte de amenizar el ambiente, me hicieron sentir muy bien recibido
en el laboratorio. Sin ustedes no sé qué hubiera hecho (posiblemente explotar algunas partes de la
facultad o la facultad completa); muchísimas gracias.
Agradecimientos de manera especial al Maestro Alvar y a la Dra. Cutiño, quienes me enseñaron

tanto en mi desarrollo como estudiante de la carrera de Biología; me mostraron cosas de sumo
interés, de forma que espero poder tener tanto conocimiento algún día y, lo más importante, darlo
a conocer o enseñar de la manera en la que lo han hecho ustedes.
A mi padre, que hoy en día puedo afirmar que tiene razón en tantas cosas que me ha enseñado,
tantos consejos y tanto amor sin el cual no sé dónde me encontraría en este momento. Mi padre,
que no puede imaginar el agradecimiento que le tengo a la vida porque me otorgó el placer de
que sea mi padre, mi mentor, mi guía, mi piedra; gracias a él es que sé que, sea lo que venga,
podré salir adelante. Gracias a mi padre por enseñarme - entre tantas cosas - la fortaleza para no
dejarme vencer y caer por nada ni nadie.
A mi madre, que con su cariño, regaños, sonrisas y enseñanzas me ha mostrado de lo que soy
capaz, de lo que quiero ser y de mantenerme firme ante las circunstancias diversas de la vida. Le
agradezco nunca haberse dado por vencida conmigo, aunque a veces no aprendía pero seguía
firmemente mostrándome el camino; le estaré eternamente agradecido por ser mi madre y por
dejarme ser su hijo. Gracias a mi madre, lo bueno, lo malo, lo triste, lo fantástico, lo asombroso y
lo que venga en mi vida a partir de este momento lo podré valorar más y todo debido a ella.
4
Gracias a mi madre por enseñarme que, mientras me quiera, me ame y me acepte a mí mismo,
nunca estaré solo.
En general, gracias a mis padres por ser mis padres, por ser mis piedras, por ser parte
fundamental de quien soy ahora. Siempre me mantendré firme y honesto a quien soy gracias a
ustedes; por eso, esta tesis se las dedico a ellos porque sé que sin ustedes no estaría donde estoy
hoy.
Gracias a mi segunda madre: mi tía Silvia; no hay palabras suficientes para expresar el amor, el
respeto y la admiración que le tengo. Me enseñó que es necesario seguir aprendiendo y
cultivándonos como seres humanos, profesionistas y sobre todo tener pasión por lo que hacemos.
De igual forma, quiero agradecer a mi hermano Ismael por tantas cosas que hizo por mí, por los
consejos actuales que me da y por el mero hecho de ser mi hermano. Gracias a mi hermano por
ser parte de mi familia y de mi vida. Gracias mis primas Lluvia y Abril que, a pesar de las peleas,
nadie puede negar el amor que nos sentimos; les doy las gracias por haberme brindado su consejo
en todo momento.
Finalmente, quiero agradecer a mi segunda familia, tan importante como la primera, esos amigos,
compañeros de cuarto y de clase que me han apoyado y acompañado en esta etapa de mi vida. Un
especial agradecimiento a Florencia Chena Becerra, Frida K. Hernández Avendaño, Mario
Reynoso Castañeda, Rayenari Torres Chacón, Francisco Javier Magaña, Luis Andrade Bulos,
Luisa Cubría, Gabriel Masegosa, Pablo Palma y Omar Olivares Mora. Sin ustedes esta tesis
tampoco hubiera sido posible, ¡muchísimas gracias!
5
RESUMEN
En Veracruz, en la zona del bosque mesófilo de montaña se encuentran zarzamoras de tipo

silvestre y cultivada; los extractos de hojas y frutos de las especies de Rubus (zarzamoras) han
sido empleados para el tratamiento de diversas enfermedades que presentan en la medicina
tradicional por las diferentes actividades que presentan.
El objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad biológica de los extractos etanólicos
de 2 especies de zarzamora (Rubus coriifolius y Rubus fruticosus var. Brazos) mediante el uso del
bioensayo con Artemia franciscana y realizar una caracterización fitoquímica preliminar.
La caracterización fitoquímica preliminar mostró que todos los extractos contienen flavonoides y
triterpenos/esteroles, mientras que los extractos de R. fruticosus var. Brazos mostró contener
alcaloides. De manera alterna se hizo la cuantificación de flavonoides en los extractos por el
método colorimétrico de cloruro de aluminio; la prueba demostró que los extractos de R.
coriifolius de los sitio de colecta 3 y 1 tuvieron mayor cantidad de flavonoides. También se
realizó un índice de oxidación el cual indico que el extracto de R. coriifolius del sitio 3 tuvo el
menor tiempo con 1.68 segundos.
En el bioensayo con A. franciscana se obtuvieron CL50 de los extractos siendo todos menores a
500µg/mL; el extracto de R. coriifolius sitio 3 tuvo la mayor toxicidad con una CL50 de
46.23µg/mL, mientras que el extracto de R. fruticosus var. Brazos sitio 5 tuvo la menor CL50 con
419.59µg/mL. Los demás extractos presentaron CL50 menores a los 100µg/mL. Estos resultados
nos indican que las dos especies de zarzamora analizadas, los extractos etanólicos tienen
actividad biológica poco tóxica y tóxica.
6
1. INTRODUCCIÓN
La planta de la zarzamora pertenece al género Rubus, uno de los géneros con mayor número de
especies, aproximadamente 750 y con adaptación a diferentes condiciones ambientales ya que se
encuentran distribuidas en todo el mundo, excepto en la Antártica (Espinosa, 2011; Martínez-
Cruz et al. 2011; Deighton et al.¸2000; Moreno et al., 2011; Díaz, 2011; Cancino et al., 2011).
Para México se han descrito 28 especies del género, y algunas de ellas son endémicas. (Cornejo
et al., 2006).
En Veracruz, en la zona del bosque mesófilo de montaña se encuentran zarzamoras de tipo

silvestre que han sido identificadas dentro del género Rubus; en dicha zona también hay
zarzamoras cultivadas y ambas se consumen principalmente como fruto fresco, mermeladas,
tortillas, atole y un licor conocido como “Morita” (Leyva, 2009).
Varias especies de Rubus han sido usadas en la medicina tradicional griega, china, mexicana y en
otras partes del mundo (Gudej y Tomczyk, 2004; Patel et al., 2004; Cornejo et al., 2006;
Espinosa, 2011).En este contexto en México actualmente se han registrado alrededor de 4,500 a
5,000 especies de plantas medicinales (Cortes, 2005; Barbosa, 2007), de éstas especies sólo el
11% se ha estudiado químicamente, el 2.6% de forma biodirigida y sólo el 1.9% a nivel
farmacológico y toxicológico. (Barbosa, 2007).
Los extractos, tanto de hojas como de frutos, de distintas especies de Rubus se han utilizado para
el tratamiento de varias enfermedades (Espinosa, 2011), como la Diabetes mellitus, reumatismo,
hemorroides, etc. se usan por su actividad astringente, hipoglucémica, como agente
antiinflamatorio de la mucosa de la cavidad oral y de la garganta, antidiarreico y trastornos
similares (Gudej y Tomczyk, 2004; Süntar et al., 2009; Cai et al., 2012).También, las hojas de la
zarzamora han sido usadas por sus propiedades antiinflamatorias, antivirales y antimicrobianas,
así como por su actividad antiproliferativa contra células de cáncer (Martini et al., 2009).
Para algunas especies de zarzamoras como R. coriifolius, R. chamaemorus, R. ideaus y R.

ulmifolius se han descrito hasta la fecha actividades antiprotozoaria in vitro e in vivo,
antimicrobiana y antiinflamatoria (Cornejo et al. 2006).
En los últimos años, el interés en las moras y otras especies del género Rubus ha crecido gracias a
sus contenidos altos de antocianinas, compuestos fenólicos y flavonoides (Espinosa,
2011).Debido a esto, estudios recientes se han enfocado en la identificación de componentes
7
fenólicos de las hojas de Rubus así como en la determinación de su actividad antioxidativa
(Martini et al., 2009); sin embargo, hay pocos estudios realizados a los extractos de las especies
de Rubus bajo el bioensayo de Artemia franciscana el cual es útil para el desarrollo de productos
nuevos de origen natural.
En la última década, se ha incorporado este bioensayo de gran utilidad y eficacia ya que requiere
pequeñas cantidades de muestra y permite la evaluación rápida de extractos crudos y fracciones,
conduciendo con seguridad a los principios activos y descartando todo lo que no sea de interés.
Este es un bioensayo general de uso amplio que determina el efecto letal de los materiales en
larvas de artemia, y de esta manera se predice su habilidad para producir la muerte de células
cancerígenas en cultivo de tejidos, matar insectos y/o ejercer un amplio rango de efectos
farmacológicos (Pino y Lazo, 2010).
8
2. ANTECEDENTES
2.1 Género Rubus
Este género agrupa plantas perennes; herbáceas, trepadoras o arbustivas, rara vez erectas o con
más frecuencia arqueadas, semitrepadoras, con presencia de unas pocos taxones herbáceos, a
veces rastreros. Los tallos son perennes y a menudo estoloníferos, están cubiertos de espinas de
formas y tamaños diversos; hojas alternas, con estípulas a menudo unidas a la base del peciolo o
al tallo, láminas trifolioladas o palmaticompuestas con 5 a 7 foliolos, con menos frecuencia
pinnaticompuestas o simples; flores hermafroditas o rara vez unisexuales, dispuestas en racimos,
corimbos, cimas o panículas, en ocasiones solitarias, bractéolas ausentes.
Frutos por lo general en forma de drupas jugosas, pequeñas, por lo común algo concrescentes en
la base, que en conjunto forman frutos agregados (polidrupas), éstos se desprenden con
frecuencia íntegros y acompañados o no del receptáculo; las semillas son ovoide globosas, con
testa delgada, membranosa y cotiledones plano-convexos (Rzedowski y Rzedowski, 2005; Díaz,
2011).
Este género es de taxonomía sumamente complicada, pues a menudo existen dificultades en la

circunscripción de las especies y mientras algunos autores le adscriben alrededor de 700, otros
reconocen sólo alrededor de 250 (Rzedowski y Rzedowski, 2005; Alice y Campbell, 1999).
Focke en 1914 dividió el género Rubus en 12 subgéneros; de ellos, los tres más grandes son
Idaeobatus (frambuesas, 117 especies), Malachobatus (115 especies) y Rubus (moras, 132
especies) (Díaz, 2011; Alice y Campbel, l999; Moreno et al., 2011).
Representa un género diverso de plantas distribuidas globalmente como especies y genotipos

silvestres y cultivados (Garzón et al., 2009); de importancia económica y ecológica por sus frutos
variados, especies ornamentales, invasivas, y en una sucesión del bosque temprano (Alice y
Campbel, l999).
Se encuentra distribuido principalmente en las comarcas de clima templado y frío del Hemisferio
Norte, pero también presente en zonas montañosas intertropicales (Rzedowski y Rzedowski,
2005); en México se encuentra distribuidas en zonas boscosas del centro y sur del país (López,
2009).
Estudios fitoquímicos mostraron el contenido químico de las partes aéreas de algunas especies de
Rubus, los cuales contienen flavonoides (quercetina, kaempferol, ácido cafeico, ácido gálico y
9
ácido clorogénico), ácidos fenólicos, taninos, aminoácidos, azúcares, pectinas, ácidos
carboxílicos, antocianinas, catequinas, vitamina C, ácidos grasos saturados e insaturados (Süntar,
et al., 2009; Buřičová et al., 2011).De igual forma, se han aislado terpenos, flavonoides,
galotaninos, esteroles, cetonas, ácidos carboxílicos, alcoholes, proantocianidinas, polifenoles,
antrones, y alcaloides con actividad biológica importante (Cornejo et al., 2006).
Se han realizado estudios en extractos de diversas especies de Rubus los cuales mostraron
actividad antimicrobiana (Brandi et al., 2007).Extractos de R. chamaaemorus, R. ideaus, y R.
ulmifolius tienen efecto antibacterial in vitro contra Staphylococcus aureus, epidermidis,
Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus subtilis y Candida albicans(Cornejo et al., 2006).
Hay estudios farmacéuticos que han demostrado que los extractos de diclorometano:metanol
(1:1) a partir de R. coriifolius tienen actividad antiprotozoaria in vitro contra Entamoeba
histolytica y Giardia lambia, también tiene actividad antiinflamatoria in vitro. R. coreanus
presenta actividad antiviral contra el virus de la Hepatitis B y también presenta efecto analgésico
(Cornejo et al., 2006).
2.1.1 Rubus coriifolius
Se trata de una planta con hojas de textura coriácea y sin tomento blanquecino en el envés; los
tallos son densamente pubescentes pero carecen de pelos glandulares; la inflorescencia es una
panícula terminal amplia sin aguijones en sus ejes, o bien, éstos están escasamente representados,
como se muestra en la figura 1 (Rzedowski y Rzedowski, 2005).
Figura 1. Rubus coriifolius con flor.
10
En México, hay presencia de R. coriifolius de acuerdo a la información presentada por el INEGI,
Rzedowski y Rzedowski (2005), Franco et al. (2008).Esta especie se localiza en los estados de
Michoacán, Veracruz, Morelos y Chiapas, se encuentra distribuida desde México hasta
Guatemala, (Barbosa, 2007; García et al., 2008).
En la medicina tradicional mexicana se utilizan gran variedad de plantas para tratar desordenes
gastrointestinales tales como: diarrea y disentería; en los altos de Chiapas utilizan la raíz de R.
coriifolius para tratar la diarrea con sangre, la planta entera contra la diarrea y las hojas para la
tos; la planta se utiliza con menos frecuencia para el vómito, la debilidad e infecciones en la boca,
dientes y garganta (Barbosa, 2007).
En este sentido, se ha demostrado las propiedades giardicidas in vitro que posee R. coriifolius, así
como, los compuestos de tipo flavonoides aislados de esta planta camperol, (-)-epicatequina y
tilirósido los cuales son los responsables de dicha propiedad giardicida; siendo una de las
especies utilizadas por los mayas para el tratamiento de la diarrea causada por protozoarios (E.
histolytica y G. lamblia) (Barbosa, 2007).
2.1.2 Rubus fruticosus var. Brazos
R. fruticosus es una planta de tallos más o menos erectos, a menudo muy largos, que s arquean al
primer o segundo año de crecimiento sin llegar a ser rastreros. Estos tallos son ligeramente
angulares, con cuatro a cinco aristas. Las hojas están compuestas por cinco foliolos, son alternas
compuestas, divididas, pentalobuladas, con bordes pronunciados y aserrados, con espinas en la
nervadura central del envés. Las flores son grandes, compuestas, actinomorfas, hermafroditas,
pentámeras, blancas o rosadas, terminales o axilares, forman inflorescencias en racimos,
paniculares o solitarias. El cáliz es persistente, los estambres son numerosos y se presentan como
corona en la base del hipanto. Las flores son auto-fértiles y se desarrollan en tallos de dos años
(López, 2009; Farinango, 2010).
11
La variedad Brazos de R. fruticosus (figura 2) es perenne, posee raíces subterráneas sin forma
definida e irregulares, de gran capacidad exploratoria, lo que favorece el arraigue inmediato en
los sitios de plantación (Farinango, 2010).
Figura 2.Rubus fruticosus var. Brazos con fruto
Los tallos primarios son anuales o bianauales y se originan de la brotación de yemas radiculares,
a estos tallos se los denomina “primocañas”. De estos tallos brotan las ramas secundarias y
terciarias conocidas como “floricanes” donde se concentra la producción. (Farinango, 2010).
Patel et al. en 2004 indican que las partes aéreas de R. fruticosus tienen actividad
hipoglucemiante; mientras que en los trabajos de Mukherjee et al. (1984), Gudej y Tomczyk
(2004), Patel et al. (2004) se describieron algunos metabolitos secundarios presentes en Rubus
fruticosus como el ácido rubínico, β-amirina, ácido ursólico, ácido 2α-hidroxiursólico,
quercetina, ácido elágico, kaempferol.
2.2 Metabolitos secundarios

2.2.1 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos constituyen uno de los grupos de metabolitos secundarios más
numerosos y ubicuos de las plantas; estos compuestos son esenciales para su fisiología, ya que
contribuyen a su morfología, crecimiento, y reproducción. Además, los compuestos fenólicos
12
están involucrados en los mecanismos de defensa de las plantas frente a agentes externos como la
radiación ultravioleta, y la agresión de patógenos y predadores (Granado, 2010).
Se han descrito más de 8,000 polifenoles distintos que pueden clasificarse en diferentes grupos en
función del número de anillos fenólicos que contienen y el tipo de sustituyente unido a estos
anillos. Las principales clases de polifenoles por ser los más ampliamente distribuidos en los
alimentos son: flavonoides, ácidos y alcoholes fenólicos, estilbenos y lignanos (Granado, 2010).
Están formados por un anillo aromático unido por lo menos aun grupo oxhidrilo
(Bedascarrasbure et al., 2004) como se muestra en la figura 3; son solubles en agua porque la
mayoría de las veces se encuentra unidos a azúcares formando glicósidos, y normalmente se
localizan en las vacuolas (Valencia, 1995).
Los polifenoles poseen acciones molusquicidas, antihelmínticas, antihepatotóxicas,

antinflamatorias, antidiarreicas, antiúlcera, antivirales, antialérgicas y vasodilatadoras. Se ha
verificado que inhiben la replicación del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y del
Virus Simplex Humano (HSV), inhiben las glucosil transferasas de Streptococcus mutans (caries
dental).Inhiben la autoxidación del ascorbato, también inhiben efectos citotóxicos, la promoción
del crecimiento tumoral y la enzima xantina mono-amina oxidasa (Paladino, 2007).
La actividad antioxidante de los fenoles es el origen de funciones biológicas tales como la

actividad antimutagénica, anticancerígena y antienvejecimiento, pues capturan los radicales
libres, de manera que neutralizan peligrosas especies reactivas de oxígeno e iones metálicos
(Gracia-Nava, 2002; Paladino 2007).
Figura 3. Estructura básica de los compuestos fenólicos
13
2.2.1.1 Flavonoides
Los flavonoides (del latín flavus, “amarillo”) constituyen el grupo más abundante dentro de los
compuestos fenólicos con más de 6.500 compuestos identificados (Sánchez, 2009). Se
distribuyen en las plantas, siendo importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las
plantas al protegerlas contra agentes agresores externos, microorganismos, animales herbívoros y
del medio ambiente (Gracia-Nava, 2002); universalmente se encuentran en la cutícula de la hoja
y células epidérmicas donde aseguran protección contra el efecto de la radiación ultravioleta
(Teleguario, 2008; Wang, Bowman y Ding, 2007),protección frente a la acción de los patógenos
y de los animales herbívoros, aunque pueden atraer a los animales polinizadores (Sánchez, 2009).
Son la subclase de polifenoles más grande y abundante del mundo vegetal (Álvarez y Orallo,
2003); pueden ser subdivididos en 13 clases (Drewnowski y Gomez, 2000).
La estructura química básica de los flavonoides consiste de un esqueleto del tipo C6-C3-C6,
donde los componentes C6 son anillos aromáticos unidos por tres átomos de carbono que pueden
formar o no un tercer anillo del tipo pirano o pirona (anillo C). En este sentido las clases distintas
de flavonoides en la naturaleza se diferencian en el anillo C. Así tenemos que hay flavonas,
isoflavonas, flavonoles, flavanonas, flavanoles, flavanonoles, antocianidinas (Barbosa, 2007;
Leyva, 2009; Granado 2010; Naveda, 2010).
La variedad de las propiedades biológicas de los flavonoides ha llamado poderosamente la

atención de los investigadores, de modo que hoy día, es el grupo de polifenoles más estudiado
(Álvarez y Orallo, 2003); se han descrito para los flavonoides propiedades muy apreciadas en
medicina, como: antioxidantes, anticarcinogénicos, antiinflamatorias, antiagregantes,
antihemorrágicas, vasodilatadoras, antineoplásicas, antivirales, antibacterianas, antialérgicas,
antiprotozoarias, hepatoprotectoras, antifúngicas, disminución de la peroxidación lipídica,
quelantes, antitrombótica y propiedades de curación de heridas(Barbosa, 2007; Pourmorad et al.,
2006; Süntar et al., 2009; Drewnowski y Gomez, 2000; Teleguario, 2008;Justil et al., 2010;
Gracia-Nava, 2002; Bedascarrasbure et al., 2004; Kuskoski et al., 2005; Álvarez y Orallo, 2003).
Los flavonoides también son capaces de actuar como moduladores de diversa rutas de
señalización celular, activándolas o inhibiéndolas. De hecho, algunos autores proponen que el
efecto beneficioso de los flavonoides para la salud reside en la capacidad de sus metabolitos
14
generados para modular ciertas rutas de señalización celular, más que en su poder supresor de
radicales libres (Sánchez, 2009).
Para los extractos de las hojas de Rubus se ha reportado la presencia de ácido gálico, ácido
elágico, quercetina-3-δ –glucósido, (+) catequina, (-)-epicatequina, epicatequina galato,
procianidina B1 (Buřičová, 2011).
2.2.2 Terpenos
Los terpenos son otro grupo importante de compuestos secundarios entre los que se encuentran
las lactonas sesquiterpénicas, los glicósidos cardíacos y los carotenos. Tienen funciones en las
plantas como hormonas (giberelinas) o, de modo más restringido, como atrayentes de
polinizadores (Cortes, 2005).Constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios con
más de 40.000 moléculas diferentes (Ávalos y Perez, 2009).
Suelen ser insolubles en agua y todos ellos derivan de la unión de unidades de isopreno (5 átomos
de C) (Fig. 4). De esta forma, los terpenos se clasifican por el número de unidades de isopreno
(C5) que contienen: los terpenos de 10 C contienen dos unidades C5 y se llaman monoterpenos;
los de 15 C tienen tres unidades de isopreno y se denominan sesquiterpenos, y los de 20 C tienen
cuatro unidades C5 y son los diterpenos. Los triterpenos tienen 30 C, los tetraterpenos tienen 40
C y se habla de politerpenos cuando contienen más de 8 unidades de isopreno. Los terpenos
incluyen hormonas (giberelinas y ácido abscísico), pigmentos carotenoides (carotenos y
xantofilas), esteroles (ergosterol, sitosterol, colesterol), derivados de los esteroles (glicósidos
cardiacos), latex y aceites esenciales (proporcionan el olor y el sabor característico de las
plantas). Aunque las citoquininas y las clorofilas no son terpenos, contienen en su estructura una
cadena lateral que es un terpeno. A la vista de esta variedad de compuestos, es evidente que
muchos terpenos tienen unos valores fisiológicos y comerciales importantes (Ávalos y Perez,
2009).
15
Figura 4. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno que contiene
(Ávalos y Pérez, 2009).
16
2.2.2.1 Triterpenos
Los triterpenos son productos naturales que se encuentran en las plantas, son unidades de
isopreno. Los triterpenos tienen 6unidades isoprénicas (30 átomos de carbono). Estos compuestos
presentan gran variedad de tipos estructurales (Santizo, 2004).
Constituyen los llamados aceites esenciales que están compuestos de varias substancias orgánicas
volátiles o aromáticas; pueden estar constituidos por alcoholes, acetonas, cetonas, éteres y
aldehídos que se producen y almacenan en los canales secretores de las plantas. Se les extrae,
preferentemente, por arrastre de vapor o por solventes orgánicos. Las plantas con aceites
esenciales se ubican principalmente en las familias de las Labiadas y las Umbeliferas. Las
propiedades curativas son variadas y abundantes (Santizo, 2004).
Los triterpenos y sus glicósidos han sido obtenidos de especies de Rubus. Octacosanol, β-
sitosterol, ácido ursólico fueron reportados para R. ellipticus. Otros ejemplos son el ácido
rubeánico extraido de R. fruticosus, R. moluccanus entre otros (Patel et al., 2004).
En cuanto a la actividad biológica que presentan estos metabolitos se puede mencionar el trabajo
realizado por de la Torre et al. (2010), en el cual mostraron la actividad fungicida del extracto
obtenido a partir de M. urquiolae produciendo efecto antifúngico a partir de los 20 μL; acorde a
Ramos et al. (2007) demostraron que el extracto metanólico de hueso de P. americana var. Hass
tiene efecto larvicidad sobre los estadios 3° tardio y 4° temprano de A. aegypti con una dosis
letal media (CL50) de 20.39ppm
2.2.3 Alcaloides
Actualmente se conocen más de 4,000 alcaloides, aunque su presencia probablemente quede

reducida a menos del 10% de las especies botánicas (Santizo, 2004). En la figura 6 se muestran la
clasificación química de los alcaloides según su estructura (Haro, 2008).
17
Figura 5. Clasificación química de los alcaloides
Estos compuestos contienen nitrógeno en su molécula, en la cual uno o más átomos de N están
presentes en amidas primarias, secundarias o terciarias, y estas usualmente les confieren,
basicidad a los alcaloides que con frecuencia se presentan combinados con ácidos orgánicos o
taninos. Los alcaloides son sustancias más o menos tóxicas que actúan primariamente sobre el
sistema nervioso central, tienen un carácter básico, contienen nitrógeno heterocíclico y son
sintetizados en plantas partiendo de aminoácidos y derivados inmediatos (Haro, 2008; Santizo,
2004); están presentes en todos los órganos de la planta, pero pueden encontrarse
mayoritariamente en hojas (cocaina, nicotina, pilocarpina), en flores (escopolamina, atropina), en
frutos (alcaloides del opio, peletiarina, coniina), en semilla (piperina, arecolina), en corteza
(quinina, tubocurarina), en la raíz (emetina y cefalina) (Arango, 2008). Sirven para la
preservación y participación en el crecimiento vegetal, ya sea por su capacidad de formar
18
quelatos o intervenir en fenómenos de óxido-reducción y como mecanismos de defensas ante
amenazas externas (Haro, 2008)
Hay estudios diversos sobre la actividad biológica de los alcaloides, como son los casos de la
actividad leishmanicida de la mezcla de alcaloides de Ervatamia coronaria sobre amastigotes del
parásito L. braziliensis mostrando una inhibición de 67.6% a 10 µg/mL 1hora post-infección y de
83% en el tratamiento durante3 días en la misma concentración (Moreno et al., 2008); en la
evaluación antifúngica del extracto alcaloideo de Lupinus mexicanus realizado por Zamora-
Natera et al. (2008) demostró que la concentración de 5 mg/ml del extracto inhibió el
crecimiento micelial de R. solani y de S. rolfsii al 100 y 72.5% respectivamente.
2.2.4 Esteroles
En la naturaleza se encuentran una gran cantidad y diversidad de sustancias con el núcleo

esteroide, las cuales incluyen a los esteroles(o 3-hidroxiesteroides), los esteroides con grupos
carbonilo (también denominado soxa-ocetoesteroides ), los esteroides con grupos amino en el
núcleo o la cadena lateral (alcaloides esteroidales) y los cardenólidos (o cardiotónicos) entre otros
(Santizo, 2004).
La mayoría de esteroles naturales o esteroles insaturados poseen una cadena lateral de 8 a 10

átomos de carbono y un enlace doble en el C-5 como se muestra en la figura 6 (Santizo, 2004).
Figura 6.Enumeración de los átomos de carbono en la molécula de colesterol
19
Estos a su vez se encuentran en forma libre, esterificados con ácidos grasos oglicósidados. Los
esteroles se derivan biogenéticamente de la AcetilCoA (Ruta del Acetato) vía mevalonato y
escualeno. Los esteroles vegetales tienen como precursor inmediato al cicloartenol, mientras que
los animales tienen al lanosterol. De una forma análoga se originan los triterpenoides. En la
biogénesis de los esteroles también están implicados procesos tales como hidrogenaciones y
deshidrogenaciones C-C, metilaciones (vía S-adenosilmetionina), hidroxilaciones, etc (Santizo,
2004).
En los estudios de la actividad biológica de los esteroles se encuentra el trabajo realizado por
Salazar en 2012,quien mostró que los extractos de Waltheria berteroi presentaron una
CL50inferior a 1,000 μg/mL en el crustáceo A. salina, el extracto alcohólico de las flores tuvo una
CL50de 48,45 μg/mL, mientras que el extracto alcohólico del tallo mostró actividad antibacteriana
frente a: Enterobacter cloacae, Acinetobacter calcoaceticus, Enterococcus faecalis, Micrococcus
luteus, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa; sin embargo ninguno de los extractos
presentó actividad antifúngica.
2.3 Artemia franciscana
El género Artemia, conocido como “camarón de salmuera” o “brine shrimp”, es el crustáceo

branquiópodo más ampliamente distribuido en el mundo (Cisneros 2002). En la tabla 1se muestra
la clasificación taxonómica de A. franciscana.
Artemia es un animal euritérmico (fig. 7), pero generalmente prefiere ambientes relativamente
cálidos, no soportan temperaturas inferiores a 5ºC.
20
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Artemia franciscana
La clasificación taxonómica de Artemia franciscana
Filo Arthropoda
Subfilo Crustacea
Clase Branchiopoda
Orden Anostraca
Familia Artemiidae
Género Artemia Leach
Especie franciscana Kellog
Puede fácilmente permanecer a temperaturas por encima de 30ºC y sobrevivir a 35ºC y 37ºC.
También presenta características eurihalinas, y logra vivir a salinidades tan altas como 340 ppm.
Figura7. Artemia franciscana
21
Es un típico animal euroxibionte. Se ha reportado que vive en ambientes con menos de 1,0 mg/L
de oxígeno, así como por encima del punto de saturación, cuando la flora de algas incrementa el
nivel de oxígeno.
En condiciones de laboratorio puede tolerar agua fresca por varias horas, posee mecanismos
fisiológicos para vivir a concentraciones bajas de sal.
En relación al pH, Artemia se establece en ambientes con pH neutro a alcalinos. Se conoce muy
poco acerca de la influencia del pH en los estadios juveniles y adultos. Para los quistes en
particular, la eficiencia de eclosión decrece cuando el pH es inferior a ocho.
Debido a las condiciones ambientales difíciles que debe soportar, Artemia ha desarrollado tres
mecanismos eficientes de adaptación:
 Osmorregulación. El sistema osmorregulador es el más notable que se conoce en el reino

animal, gracias a él las artemias viven en concentraciones salinas que ningún otro ser vivo
es capaz de soportar, excepto ciertas bacterias y microalgas.
 Pigmentos respiratorios. La hemoglobina presente en la hemolinfa le garantiza una gran
habilidad de captación del oxígeno escaso presente en las aguas salinas.
 La oviparidad. Es la responsable de la preservación de la especie, debido a que en el
verano, cuando los cuerpos de agua hiperhalinos se secan, solamente los adultos mueren y
no los quistes, los que pueden resistir en estado de diapausa por varios años. (Cisneros,
2002; Sarabia, 2002; Bartolomé, 2005)
Dentro de los organismos utilizados para determinar la actividad biológica se encuentra A.

franciscana (Bartolomé y Sánchez, 2007), por más de 40 años en estudios toxicológicos y
ecotoxicológicos (Meyer et al., 1982). Se ha estudiado su biología y usos potenciales en diversos
campos ya que es un modelo experimental práctico y económico para la determinación de la
bioactividad de compuestos sintéticos y productos naturales (Pino y Lazo, 2010).
2.3.1 Bioensayo con Artemia franciscana
Debido a la facilidad de su cultivo, ciclo de vida corto y a su distribución cosmopolita, A.

franciscana ha ganado popularidad para su uso en estudios de toxicología, y también es una
alternativa al uso de otros invertebrados por la posibilidad de obtener organismos neonatos de
forma sincrónica y con una condición sinológica uniforme. Otra característica que hace a este
22
organismo útil en estudios de toxicología es que puede ser cultivado en salinidades que varían
entre 5 y 150 unidades practicas de salinidad (ups) y se adapta a un amplio intervalo de
condiciones ambientales (Bartolomé, 2005; Jimenez et al., 2006; Pacheco, 2011).
Este método se caracterizó por su rapidez, confiabilidad y bajo costo para su ejecución, es
utilizado como vía inicial de tamizaje citotóxico de extractos para discriminar aquellas muestras
de elevada toxicidad (Martínez-Hormasa et al., 2006); dado que se ha demostrado que existe una
relación directa entre los valores de la CL50 calculada y las pruebas anticancerígenas realizadas
utilizando sistemas de cultivo in vitro, como las pruebas de disco de papa y células 9KB, 9PS,
3PS; además presenta el potencial de detectar agentes antitumorales nuevos (Ticona et al, 1998;
Kanegusuku et al., 2002; Cantillo et al.¸2007; Jacques et al., 2004; Cock y Kalt, 2010).
En 1982, Meyer et al. desarrollaron este bioensayo para la determinación de citotoxicidad, siendo
los primeros en introducir el uso de las larvas de Artemia sp. en sustitución de animales
superiores en la evaluación de extractos vegetales y la selección de especies vegetales como
fuentes de principios activos (Pino y Lazo, 2010; Martínez et al., 2011).
Según investigaciones se reporta, que valores de CL50 menores a 1,000 μg/mL son considerados
buenos resultados en cuanto a la actividad antitumoral, ya que este bioensayo se utiliza para la
preevaluación de extractos vegetales en el descubrimiento de compuestos con propiedades
antitumorales (Salazar, 2012).Martínez et al. (2011) indican que los extractos que tengan valores
de CL50 inferiores a 500μg/mL pudieran contar con actividad antitumoral. Acorde a Moshi et al.
2010 la prueba con Artemia sp. proporciona una evidencia circunstancial de que aquellos
extractos de plantas con una CL50 debajo de 20 μg/mL tienen probabilidad de dar lugar a
compuestos anticancerígenos.
A. franciscana también es útil para identificar actividades plaguicidas y farmacológicas, porque

responde a un rango amplio de compuestos químicos y farmacológicamente diversos; es por ello
que resulta tan importante su aplicación en estudios para identificar sustancias de origen natural
(Pino y Lazo, 2010).Así, el modelo de Artemia es una de las múltiples estrategias que se pueden
utilizar para la selección de especies vegetales y conocer si sus compuestos activos son útil para
los propósito mencionados (Martínez et al., 2011).
La utilidad del bioensayo general de Artemia se ha usado como un indicador en los bioensayos de
varios centenares de compuestos activos realizados por diferentes autores para conocer su
23
actividad biológica (Pino y Lazo, 2010; Kanegusuku et al., 2002).El ensayo también permite la
evaluación rápida del extracto crudo y de sus fracciones, e inferir si las diferentes estructura
químicas responden a la actividad o las interacciones entre compuestos (Pino y Lazo, 2010).
Como ya se mencionó, el bioensayo de artemia ha servido para identificar especies vegetales y

también de hongos con actividad biológica importante como se demostró en los trabajos de
diferentes autores (Cantillo et al., 2007; Cock y Kalt, 2010; Fernandez et al., 2009; Jaques et al.,
2004; Kanegusuku et al., 2002; Lachumy et al., 2010; Martínez et al., 2011; Moshi et al., 2010;
Oliveroet al., 2009).
El bioensayo de letalidad de A. franciscana se basa en la sensibilidad de las larvas de este

crustáceo cultivadas en el laboratorio, de causar la muerte de tóxicos. Este método fue propuesto
por Michael et al. en 1956 y posteriormente desarrollado por Vanhaecke et al. en 1981 así como
Sleet y Brendel en 1983, con el propósito de contar con una herramienta útil y sencilla para la
determinación de toxicidad.
Este método, en el cual se determina el valor CL50siendo indicatorio de la gravedad y magnitud

de los efectos tóxicos inmediatos de compuestos y extractos en medio salino(Bartolomé y
Sánchez, 2007); ha sido utilizado para la detección de toxinas de hongos y cianobacterias,
toxicidad de extractos de plantas, metales pesados, para predecir citoxicidad de compuestos puros
y elementos teratogénicos (Jiménez et al., 2006; González et al., 2007; Fernández-Calines et al.,
2009; Olivero et al., 2009; Cock y Kalt, 2010). Así, en las últimas dos décadas se ha establecido
como un método seguro, practico y económico (Jaques, 2004).
El proceso se lleva a cabo administrando varias dosis del compuesto, ordinariamente se da una
sola dosis, y el porcentaje de animales que mueren en cada grupo dentro de un periodo
seleccionado, que suele ser de 24 horas, se representa gráficamente en función de la dosis. A
partir de esta curva, se determina la dosis que mata al 50% de los animales y se la designa como
CL50. Se escoge este valor de dosis-mortalidad porque puede determinarse con más precisión. La
curva es casi una línea recta a nivel de la CL50 (Jaques, 2004).
2.4 Área de colecta en Ixhuacán de los Reyes
El municipio de Ixhuacán de los Reyes se encuentra entre los paralelos 19° 17’ y 19° 28’ de
latitud norte; los meridianos 96° 58’ y 97° 11’ de longitud oeste; altitud entre 800y 3,700 m. Al
norte colinda con los municipios de Ayahualulco y Xico; al este con los municipios de Xico,
24
Teocelo, Ayahualulco, Cosautlán de Carvajal y Tlaltetela; al sur con el municipio de Tlaltetela y
el estado de Puebla; al oeste con el estado de Puebla y el municipio de Ayahualulco.
El área de colecta presenta un clima semicálido húmedo con una temperatura media anual de
18°C (figura 8); el suelo es de tipo andosol húmico (figura 9). En la tabla 2 se muestra el nivel de
precipitación del municipio.
Tabla 2. Nivel de precipitación del municipio de Ixhuacán de los Reyes
Lluvias En el mes más seco % de lluvia invernal

Todo el año mayor a 40 mm mayor al 18% del total anual
En verano menor de 40 mm mayor al 10.2% del total anual
Entre verano e invierno mayor a 40 mm menor al 18% del total anual
En verano menor de 40 mm mayor al 10.2% del total anual
Figura8. Tipo de clima del municipio de Ixhuacán de los Reyes
25
Figura 9. Tipo de suelo del municipio de Ixhuacán de los Reyes
3. JUSTIFICACIÓN
Debido a que se desconoce la actividad biológica de los extractos etanólicos foliares de la

zarzamora R. coriifolius y R. fruticosus var. Brazos que se encuentran en el municipio de
Ixhuacán de los Reyes, Veracruz, el presente estudio usó el bioensayo de artemia para analizar su
actividad biológica y se realizó una caracterización fitoquímica preliminar para conocer los
grupos principales de metabolitos secundarios que presentan los extractos
26
4. OBJETIVOS
 Generales
 Determinar la actividad biológica de los extractos etanólicos de Rubus coriifolius
y Rubus fruticosus var. Brazos en Artemia franciscana
 Específicos
 Realizar pruebas preliminares fitoquímicas a los extractos etanólicos de R.
coriifoliusy R. fruticosus var. Brazos
 Cuantificar el contenido de flavonoides de los extractos etanólicos de R.
coriifolius y R. fruticosus var. Brazos
 Determinar la índice oxidativo de los extractos etanólicos de R. coriifolius y R.
fruticosus var. Brazos.
 Determinar la CL50de los extractos etanólicos de R. coriifolius y R. fruticosus var.
Brazos en A. franciscana
27
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1.Colecta de Rubus coriifolius y Rubus fruticosus var. Brazos.
La colecta del material vegetal se llevó a cabo en 5 sitios, de los cuales 4 están ubicados en el
municipio de Ixhuacán de los Reyes y uno en el municipio de Coatepec, Veracruz. En la figura
10 se muestra el área de colecta en el municipio de Ixhuacán de los Reyes.
Figura 10. Localización del área de colecta en el municipio de Ixhuacán de los Reyes
La colecta de R. coriifolius se realizó en los sitios 1-3 y de R. fruticosus var. Brazos en los sitios
4 y 5.La descripción de los sitios de colecta se muestra en la tabla 2, y en las figuras 11 y 12 se
muestran las fotos satelitales de los sitios de colecta.
28
Tabla 3. Descripción, coordenadas de las colectas de zarzamora.
Sitio de colecta y especie Descripción del lugar de colecta Coordenadas
Sitio 1 R. coriifolius Se encuentra a un costado del camino, una N 19° 23’ 17.5’’ W 97° 03’
pared con una separaba la zona boscosa del 22.4’’. Altura 1519 msnm.
camino.
Sitio 2 R. coriifolius Se encuentra en la división de un potrero con N 19° 21’ 55.4’’ W 97° 04’
una ligera pendiente; sin bosque cercano. 01.9’’. Altura 1524 msnm.
Sitio 3 R. coriifolius Se localiza debajo de una loma con bosque el N 19° 22’ 03.3’’ W 97° 04’
cual limita con un potrero. 27.8’’. Altura 1605 msnm.
Sitio 4 R. fruticosus Es un sembradío que encuentra en un terreno N 19°22'11.78" W 97°
elevado a un costado del camino. 4'11.87". Altura 1569 msnm.
Sitio 5 R. fruticosus Este sitio se localiza en el UNCADER de N 19°27'50.95" W 96°58'0.41".
Coatepec, Veracruz. Altura 1230 msnm.
Figura 11. Sitios de colecta 1-4 de hojas de zarzamora en el municipio de Ixhuacán de los
Reyes.
29
Figura 12. Sitio de colecta 5 de hojas de zarzamora en el municipio de Coatepec.
Las hojas colectadas fueron seleccionadas para que no presentaran daño alguno; una vez tomadas
las muestras se procedía al prensado mediante papel periódico y 2 placas de cartón duro para su
transporte al laboratorio. Se colectaron ejemplares para realizar la identificación en los herbarios
de la ciudad de Xalapa, Veracruz. En cada sitio de colecta se tomo fotos de los ejemplares, las
coordenadas y se realizó una pequeña descripción del lugar.
La identificación del material colectado se realizó en el herbario del INECOL, donde se

realizaron las acotaciones, hasta encontrar la especie que coincidió con la muestra tomando
también en cuenta donde fue colectado el ejemplar empleado para dicha acotación; arrojando
como resultado que la especie es R. coriifolius. Mientras que la identificación de R. fruticosus
var. Brazos fue llevada a cabo por el Dr. Tadeusz Goszczyñski Dulski encargado de la plantación
de zarzamoras en el UNCADER de Coatepec.
5.2.Extracción de metabolitos secundarios de las especies de Rubus
La extracción etanólica de las hojas de R. coriifolius y R. fruticosus var. Brazos se realizó por el
método Soxhlet, el cual es un lavado continuo con el solvente en un sistema cerrado. Para
llevarlo a cabo, las muestras de las hojas colectadas fueron secadas en una estufa a 60-70°C
30
durante 2 días, una vez secas se realizo su pulverización con el uso de una licuadora y se guardo
el material en bolsas herméticas hasta su uso.
Para la extracción se hizo un cartucho con papel filtro del No. 1 en el cual se colocaron 20g. de la
muestra pulverizada y se colocó dentro del extractor Soxhlet. Se usaron 250ml de etanol como
solvente y se llevo a cabo el proceso por 8 horas continuas; una vez terminado se guardo el
extracto en un frasco ámbar dejándose en un refrigerador a 4°C hasta su siguiente uso.
La concentración del extracto obtenido por el método Soxhlet se realizó con un rotavapor a
presión disminuida hasta llevar la muestra a sequedad; una vez seca se peso para poder obtener el
rendimiento que se obtuvo en la extracción de metabolitos secundarios a partir de las hojas.
Después, la muestra se resuspende en 50mL de etanol y se calcularon los µg/mL que tuvo el
extracto concentrado.
El rendimiento se obtiene con la siguiente fórmula:
Siendo; P1 el peso del material seco y P2 el peso del extracto seco Rendimiento en % = P2 / P1 x
100.
5.3.Caracterización preliminar fitoquímica (Domínguez, 1979)

5.3.1 Determinación de Alcaloides
Se agrego 1mL del extracto obtenido a 3 tubos, a cada uno se le agregaron 5 gotas del reactivo de
Mayer, 5 gotas del reactivo de Dragendorff y 5 gotas del reactivo de Wagner. Mezclar y observar
los tubos durante 2 horas. La presencia de alcaloides fue positiva por la presencia de un
precipitado color blanco a crema para la prueba de Mayer, presencia de precipitado rojo a naranja
en la prueba de Dragendorff y presencia de precipitado color marrón a pardo oscuro en la prueba
de Wagner.
5.3.2 Determinación de Flavoniodes
La presencia de flavonoides se determinó el ensayo Shinoda. Se agregó 1mL del extracto

obtenido a un tubo al cual se le adiciona magnesio metálico y 0.5mL de ácido clorhídrico
concentrado. La prueba fue positiva por la presencia de color amarillo, rojo, rosa o morado en los
primeros 3 minutos.
31
5.3.3 Determinación de Saponinas
Se agregaron 5mL del extracto obtenido a un tubo, el cual se calentó en baño maría (60°C)
durante 30 minutos. Enfriar, tapar los tubos, agitar vigorosamente 30 a 40 segundos. Los tubos se
dejaron reposar durante 30 minutos y se observó la formación de espuma. Si una capa de espuma
mayor de 3 cm persiste en la superficie líquida después de 30 minutos se presume la presencia de
saponinas.
5.3.4 Determinación de triterpenos/esteroles
3mL del extracto obtenido se llevaron a sequedad y se resuspendendieron en una solución al 1%

en cloroformo. A un tubo se agregaron 2.5mL de la solución y se adicionaron unas gotas de ácido
acético y 3 mL de ácido acético glacial-ácido sulfúrico 50:1. La prueba es positiva al reactivo de
Lieberman.Bouchard si presenta anillo verde, interfase marrón.
5.3.5 Determinación de Cumarinas
Se agregó 1mL del extracto obtenido a un tubo y hervir; se deja enfriar y se aplica con un
microcapilar 2 manchas en papel filtro, a una de las manchas se le agrega 1 gota de KOH 0.5M.
La prueba es positiva si hay fluorescencia a la longitud de onda de 336nm.
De las pruebas fitoquímicas preliminares se registró la abundancia del metabolito secundario de

la siguiente manera:
Presentes en gran cantidad: +++
Presentes en mediana cantidad: ++
Presentes en pequeña cantidad: +
Ausentes: -
5.4.Cuantificación de flavonoides
El método colorimétrico de cloruro de aluminio fue usado para la determinación de flavonoides.

Cada extracto (0.5 mL) en etanol fue mezclado por separado con 1.5mL de etanol al 95%, 0.1mL
de cloruro de aluminio al 10%, 0.1 mL de acetato de potasio 1 M y 2.8mL de agua destilada. La
32
mezcla se incubo por 30 minutos a temperatura ambiente; la absorbancia de la mezcla fue medida
a 415nm. La curva de calibración fue preparada mediante soluciones de quercetina a
concentraciones de 12.5, 25, 50, 10 y 200 µg/mL en etanol al 80% (Pourmorad et al., 2006;
Grosso et al., 2007; Kosalec et al., 2004; Chang et al., 2002).
5.5.Prueba de índice de oxidación
Esta prueba se realizó para determinar de las propiedades antioxidantes del extracto. Se tomaron
2 mL del extracto concentrado, los cuales se mezclaron con48 mL de agua destilada. En un tubo
de ensayo limpio y seco previamente enjuagado con mezcla sulfocrómica, se midió 0,5 mL del
extracto diluido, 0,5 mL de agua destilada y 1 mL de ácido sulfúrico al 20%. Todos los tubos se
sometieron a refrigeración en baño de hielo a 18 a 20ºC. Haciendo uso de una micropipeta de 50-
200 μL, se adicionaron 50 μL de solución de permanganato de potasio (0,1 N), estandarizada
frente a oxalato de sodio; a continuación, se puso en marcha un cronómetro y se tomo el tiempo
de desaparición del color. Todas las pruebas se realizaron por triplicado (Grosso et al., 2007).
5.6.Bioensayo en Artemia franciscana

 Preparación de agua de mar artificial
Para la prueba se realizó la preparación de agua de mar artificial para la eclosión y el desarrollo
de Artemia; de acuerdo a la norma mexicana NMX-AA-110-1995-SCFI, para lo cual se
prepararon las soluciones A y B presentes en la tabla 4:
33
Tabla 4. Soluciones de agua de mar artificial
Solución A Solución B
Sales Cantidad (gr) Sales Cantidad (gr)
NaCl 23.90 NaSO4 10H2O 9.06
MgCl2 6H2O 10.83 NaHCO3 0.20
CaCl2 anhidro 1.15 NaF 0.0003
SrCl2 6H2O 0.004 H3BO3 0.0027
KCl 0.682 Agua destilada 100mL
KBr 0.099
Agua destilada 856mL
Se vierte la solución B en la solución A y se toma el pH ajustándolo a 8.5 +0.5.Una vez

terminada, el agua de mar artificial se filtra y se guarda a temperatura ambiente en un recipiente
tapado.
La eclosión de quistes (fig. 13) se realizó en una estufa a 27°C + 3°C con una lámpara de luz
blanca; para lo cual se colocaron en un recipiente de cristal 100mL de agua de mar artificial con
0.1g de quistes previamente rehidratados por 1 hora en agua corriente.
Los quistes se dejaron eclosionar (fig. 14) dentro de la estufa con un flujo constante de oxígeno y
la lámpara de luz blanca a una distancia de 15-30cm durante 24 horas. Una vez pasadas 24 horas,
se dejó el sistema funcionando otras 24 horas para que las artemias llegaran a su segundo estadio
larval, como se observa en la fig.15 y 16, y de esta manera se emplearon en las pruebas
toxicológicas.
34
Figura13. Eclosión de Artemia franciscana
Figura 14. Quistes de Artemia franciscana y nauplio de A. franciscana
35
Figura15. Nauplio del segundo estadio de Artemia franciscana
Figura 16. Nauplio del segundo estadio de Artemia franciscana
36
 Pruebas de calidad de lote (modificado de Cisneros 2002)
Estas pruebas se realizaron para verificar si la cepa empleada para el bioensayo con artemia
reunía las características necesarias en cuanto a la calidad que presento en los aspectos de
eficiencia de eclosión (EE), porcentaje de eclosión (PE) y tasa de eclosión (TS), para de esta
manera validar su uso en el bioensayo.
La determinación de la EE se realizó al lote de artemias eclosionadas se tomando 3 submuestras

de 0.25mL y se contabilizo la cantidad de artemias presentes. Se procedió a usar la siguiente
fórmula para obtener la EE: N x 4 x 10 x 100, donde N = cantidad de artemias
La determinación del PE del lote de artemias eclosionadas se realizó tomando 3 submuestras de

0.25ml con 3 repeticiones. Se contabilizo el número de artemias presentes y embriones no
eclosionados; se añadió hipoclorito de sodio para poder distinguir embriones no eclosionados de
quistes. Se procedió a usar la siguiente formula No. de nauplios x 100 / No. de nauplios + No. de
embriones no eclosionados.
La determinación de la TS se realizó empezando a contabilizar una submuestras de 0.25ml a

partir de las 15 horas de iniciado el proceso de eclosión de las artemias y continuando dicho
conteo cada hora hasta cumplir las 24 horas de iniciado el proceso. Se empleo la formula: T90 –
T10, donde T90 es el tiempo que se requirió para que apareciera el 90% de los nauplios y T10 es
el tiempo que se requirió para que apareciera el 10% de los nauplios.
 Bioensayo en Artemia franciscana
La eclosión de quistes de artemia se realizó como se muestra en la figura17; una vez eclosionados
los quistes se mantuvieron bajo las mismas condiciones de luz y oxigenación durante 24 horas
más (figura18); pasadas 48 horas desde el inicio de la incubación se procede a realizar la prueba
toxicológica sobre un grupo de 10 individuos por muestra; dichas muestras son hechas en frascos
con capacidad mayor a 20ml, sin demasiada opacidad, usando agua de mar artificial previamente
oxigenada durante 1 hora.
Se realizaron 3 pruebas con 3 repeticiones por extracto obtenido a las siguientes concentraciones
0ppm, 25ppm, 50ppm, 75ppm, 100ppm; dichas concentraciones fueron seleccionadas después de
37
haber sido realizado un ensayo exploratorio con concentraciones diferentes, mostrando una
mortalidad total a 116ppm.
Figura 17.Artemia franciscana 24 horas después de su eclosión
Para la prueba se usaron individuos con una movilidad alta, la cual era indicativa de un buen
estado físico. Los individuos se tomaron de una submuestra vaciada en un recipiente de vidrio y
fueron colocados en sus respectivos tratamientos.
Al terminar de colocar los 10 individuos en cada tratamiento, los recipientes se volvieron a

colocar dentro de la estufa bajo las mismas condiciones lumínicas y de temperatura que en el
proceso de eclosión para garantizar el rendimiento óptimo de las artemias (fig. 18 y 19).Los
individuos se contabilizaron a las 24 horas de transcurrida la prueba tomando como individuos
afectados aquellos que no presentaran movilidad por más de 3 segundos y se realizó nuevamente
un conteo de individuos a las 48 horas tomando los mismos parámetros para individuos
afectados.
38
Figura 18. Bioensayo de Artemia franciscana
Figura19. Bioensayo deArtemia franciscana
39
Teniendo los datos de los individuos afectados por muestra con sus respectivas repeticiones se
prosiguió a realizar el análisis Probit para obtener así la CL50 de cada extracto.
5.9.Análisis estadístico
Los resultados del bioensayo en A. franciscana fueron analizados por el método Probit en el
programa BioStat 2009 obteniendo la CL50 de los extractos empleados. Se hicieron análisis de
varianza entre los resultados del rendimiento de extracción de las plantas, cuantificación de
flavonoides, índice de oxidación y el bioensayo de Artemia. También se realizaron análisis de
coeficiente de correlación de Pearson entre la cuantificación de flavonoides (CF)/concentración
letal media (CL50), CF/índice de oxidación (IO) y IO/CL50.
40
6. RESULTADOS
6.1.Rendimiento de los extractos de las especies de Rubus.
El rendimiento obtenido con los extractos realizados de las plantas de R. coriifolius, fueron de
29.7% en el sitio de colecta 1, 26.3% en el sitio 2 y 30.7% en el sitio 3; con los extractos de R.
fruticosus var. Brazos el rendimiento del sitio 4 fue de 15.7% y en el sitio 5 de 46.2%En la tabla
5 y 6 se muestran los rendimientos obtenidos de las 2 especies estudiadas.
Tabla 5. Rendimiento del extracto de Rubus coriifolius
Sitio Peso (g) Extracto (g) Rendimiento (%)
Sitio 1 20 5.94 29.7

Sitio 2 20 5.26 26.3
Sitio 3 20 6.14 30.7
Tabla 6. Rendimiento del extracto de Rubus fruticosus var. Brazos
Sitio Peso (g) Extracto (g) Rendimiento (%)
Sitio 4 20 3.14 15.7

Sitio 5 20 9.25 46.25
6.1.Caracterización fitoquímica
Todos los extractos mostraron contener flavonoides y triterpenos/esteroles, mientras que los
extractos de R. fruticosus var. Brazos mostraron contener de alcaloides. No se detecto la
presencia de saponinas y cumarinas en ninguno de los extractos. En las tablas 7 y 8 se muestran
los resultados de las pruebas fitoquímicas preliminares.
41
Tabla 7. Caracterización fitoquímico preliminar de los extractos de Rubus coriifolius
Sitio Flavonoides Cumarinas Saponinas Triterpenos/ Alcaloides

Esteroles
Shinoda Flourescencia Prueba de Lieberman- Mayer Dragen Wagner
espuma Bouchard dorff
Sitio 1 +++ - - +++ - - -
Sitio 2 +++ - - +++ - - -
Sitio 3 +++ - - +++ - - -
Tabla 8.Caracterización fitoquímico preliminar de los extractos de Rubus fruticosus var. Brazos
Sitio Flavonoides Cumarinas Saponinas Triterpenos/ Alcaloides

Esteroles
Shinoda Flourescencia Prueba de Lieberman- Mayer Dragen Wagner
espuma Bouchard dorff
Sitio 4 +++ - - +++ + +++ +++
Sitio 5 +++ - - +++ +++ + ++
6.2.Cuantificación de flavonoides
La cuantificación de flavonoides de todos los extractos demostró que el extracto del sitio 3 cuenta
con la mayor cantidad de flavonoides, con un total de 158.85µg/mL mientras que los extractos
del sitio 2, sitio 4 y sitio 5 mostraron la menor cantidad, con un total de 144.36µg/mL; el extracto
del Sitio 1 mostró una cantidad intermedia de 153.35µg/mL. El análisis estadístico mostró que no
hubo diferencia significativa entre la cantidad de flavonoides presentes en los extractos. En la
gráfica 1 se muestra la cantidad de flavonoides presentes en los extractos trabajados.
42
200
180
160
140
120
µg/mL
100
Desviación estándar
80
Cantidad de flavonoides
60
40
20
0
R. coriifolius R. coriifolius R. coriifolius Rubus R. fruticosus
Sitio 1 Sitio 2 Sitio 3 fruticosus Sitio 5
Sitio 4
Grafica 1. Cantidad de flavonoides presentes en los extractos de las 2 especies de Rubus

estudiadas
6.3.Índice de oxidación
El índice de oxidación permitió evaluar la actividad antioxidativa de los extractos, esta actividad
se determinó por la reducción de la solución ácida del permanganato de potasio, condición que se
fija con la evolución de iones manganeso, con el registro del tiempo de la desaparición del color.
El extracto de R. coriifolius del sitio 3 fue el que tuvo menor tiempo en el índice de oxidación
con 1.68segundos, mientras que el extracto de R. fruticosus var. Brazos del sitio 5 presento el
mayor tiempo de los extractos con 2.76segundos; se empleo un equivalente de quercetina de 150
µg/mL el cual tuvo un tiempo de 3.95segundos. Se hizo el análisis estadístico el cual mostró que
hubo diferencia significativa entre los índices de oxidación de los extractos; en los grupos la
diferencia se presento entre el extracto del sitio 1 con el extracto del sitio 5, y entre el sitio 3 y el
sitio 5.En la grafica 2 se muestran los tiempos obtenidos de todos los extractos y el equivalente
de quercetina
43
6
5
Tiempo en segundos
3
Desviación estándar
Índice de oxidación
2
0
R. R. R. Rubus R. Eq. de
coriifolius coriifolius coriifolius fruticosus fruticosus quercetina
Sitio 1 Sitio 2 Sitio 3 Sitio 4 Sitio 5
Grafica 2. Índice de oxidación de los extractos de las especies de Rubus y un equivalente de

quercetina.
6.4.Pruebas de la calidad del lote de A. franciscana
Los resultados de la descapsulación de los quistes de la cepa de artemia empleada fueron los
siguientes: la eficiencia de eclosión (EE) fue de 612,880 nauplios/g.; el porcentaje de eclosión
(PE) fue de un 89.55% y la tasa de eclosión (TS) fue de 8 horas. Los resultados obtenidos
mostraron que la cepa es de buena calidad y viable para su uso comparando los resultados con
Cisneros (2002), Mechaly et al. (2004)y Galván (2008).
6.5.Bioensayo deArtemia franciscana
En el bioensayo con A. franciscana de acuerdo al análisis Probit, se observó que el extracto de

Rubus con mayor toxicidad fue el del sitio 3 perteneciente a la especie R. coriifolius con una CL50
de 46.23+12.25µg/mL mientras que la que tuvo menor toxicidad fue la del sitio 5 perteneciente a
la especie R. fruticosus var. Brazos mostrando una CL50 de 419.59+62.59µg/mL. Los demás
extractos presentaron una CL50 intermedia entro el sitio 3 y el 5. El análisis estadístico mostró
que hubo diferencia significativa marginal entre las CL50 de los extractos. En la tabla 9 se
muestran las CL50 de todos los extractos de las especies de Rubus utilizados en el bioensayo con
44
artemia con su respectivo error estándar sumado y restado. En la grafica 3 se muestran el
porcentaje de mortalidad de los extractos probados.
Tabla 9. CL50 en el bioensayo con artemia de los extractos etanólicos de las especies de Rubus y
la CL50 más/menos su respectivo error estándar.
Planta CL50 Error estándar CL50 + E.E CL50 - E.E

(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
Sitio 1 Rubus coriifolius 63.38 8.37 71.75 55.01
Sitio 4 Rubus fruticosus 73.50 3.89 77.39 69.61

var. Brazos
Sitio 5 Rubus fruticosus 419.59 62.59 482.18 357
var. Brazos
90%
80%
70%
60% R. coriifolius Sitio 3

30% R. fruticosus Sitio 4

R. fruticosus Sitio 5
20%
10%
0%
0 25 50 75 100
Grafica 3. Porcentaje de mortalidad provocado por los extractos etanólicos foliares obtenidos de
las muestras colectadas en los 5 sitios.
45
6.6.Análisis de coeficientes de correlación
El coeficiente de correlación de Pearson fue positivo entre la CL50 y el índice de oxidación con
un índice de 0.9006; siendo este coeficiente negativo en las correlaciones entre la CL50 y la
cuantificación de flavonoides con -0.4867 y la cuantificación de flavonoides y el índice de
oxidación con -0.7357. Se entiende que al ser positivo el índice arrojado por la prueba al
aumentar uno de los factores analizados el otro aumentara también; mientras que si es negativo el
índice al aumentar un factor el otro disminuirá.
46
7. DISCUSIÓN
El interés en estudiar de las plantas medicinales se ha incrementado en los últimos años debido a
la presencia de metabolitos secundarios, los cuales pueden tener actividad biológica importante,
acorde a Cai et al. (2012), Cortes (2005), Cornejo et al. (2006) y Bonkanka (2007). Muchos
estudios se han sido realizado en extractos de plantas para evaluar su actividad microbiana y su
uso potencial en varias aplicaciones incluyendo la conservación de los alimentos (Brandi et al.,
2007); lo anterior ha permitido determinar que los extractos de las plantas constituyen un recurso
importante de compuestos biológicamente activos que pudieran presentar propiedades benéficas
para el ser humano (Martini et al., 2009).
A la par, en los últimos años también se ha aumentado el interés en la identificación fitoquímica

de los compuestos vegetales que pudieran tener efectos positivos en la salud (Soto et al., 2010).
De igual manera ha surgido interés en el potencial terapéutico de las plantas medicinales como
antioxidantes en la reducción de radicales libres, los cuales pueden contribuir a más de cien
desordenes humanos como la aterosclerosis, la artritis, la isquemia, lesión del sistema nervioso
central, gastritis y cáncer(Pourmorad et al., 2006).A pesar de lo mencionado anteriormente el
potencial de las plantas superiores como fuente de nuevas drogas sigue siendo en gran parte
inexplorado (Lachumy et al., 2010).
En el presente trabajo se realizó el estudio de los extractos etanólicos foliares de dos especies de
zarzamora (Rubus) presentes en el estado de Veracruz. En este contexto se han realizado diversos
estudios, mostrando que las plantas del género Rubus cuentan con actividad antimicrobiana,
antifúngica, antigiardia, antiinflamatoria, captación de radicales libres, entre otras actividades
biológicas a resaltar (Süntar et al., 2011; Liu et al., 2005; Barbosa, 2007; Brandi et al., 2007;
Buřičová et al., 2011; Cai et al., 2012; Ding, 2011; Deighton, 2000; Cornejo et al., 2006;
Martínez-Cruz et al., 2011; Martini et al., 2009; Garzón et al., 2009; Patel et al., 2004; Sultana et
al., 2010).
El proceso realizado en la extracción de los metabolitos secundarios se mostró que el rendimiento

de las hojas de zarzamoras estudiadas estaban entre un 46.25 y 15.7%; comparando estos
resultados con los reportados en los trabajos de Liu et al. (2005) y Süntar et al. (2011) los cuales
encontraron que las hojas de las especies de R. suavissimus y R. sanctus tuvieron un rendimiento
de 31 y 17.6% respectivamente, nos indican que el rendimiento obtenido con las especies
trabajadas fue bueno y de una extracción alta de metabolitos secundarios. El extracto de R.
fruticosus var. Brazos del sitio 5 fue el que presentó el mayor rendimiento, mientras que R.
fruticosus var. Brazos del sitio 4 mostró menor rendimiento con 15.7%, el cual es ligeramente
menor al reportado por Süntar et al. (2011).
En el estudio fitoquímico realizado a los extractos se encontró la presencia de metabolitos

secundarios pertenecientes a los grupos de los alcaloides, flavonoides y triterpenos/esteroles
teniendo presencia en todos los extractos los dos últimos grupos. Lo anterior concuerda con
estudios diversos realizados a las especies del género Rubus, de las cuales se aislaron varios
productos naturales incluyendo 1-cafeoilxilosa, cianidina 3-glucósidos, ácido 9,10-dihidro-1,2,
47
3,4, 6,7, 8-heptahidroxi-10-oxo-9- antraceno acetico, ácido acético 9,10-dihidro-1, 2, 3,4, 6,7, 8-
heptahidroxi-10-oxo-9-antraceno, di-p-cumaroil putrescina, ácido 13,16-dihidroxi-19-kaurenoico,
ácido 9,13-dihidroxi-16-kauren-19-oico, 13, 17-dihidroxi-15-kauren-19-oico, 3,7-dihidroxi-12-
oleanen-28-oico, 2,19-dihidroxi-3- oxo-1 ,12-ursadien-28-oico, 9CI, 3,19-dihidroxi-12-ursene-24
,28-dioico, 3,7-dihidroxi-12-Ursen-28-oico, el ácido elágico, 5-Hidroxitriptófano, 10,11-
epoxyguaiane, 5-eudesmen-11-ol, 2,3-dihidroxi -19 - oxo-18 ,19-seco-11, 13 (18)-ursadien-28-
oico, 2,3: 4,6-bis (hexahidroxidifenol) glucosa, ácido coreanogenico, cianidina 3,5-diglicósidos, y
3, 6-dicafeoilglucosa. (Sultana et al., 2010); kaempferol, quercetina, miricetina, astragalina,
kaempferol-3-O-galactósidó (Trifolin), quercetina-3-O-galactósido, quercetina-3-β-glucurónido,
kaempferol-3-β-glucurónido, α-amirina, ß-amirina, campesterol, cicloartenol, colesterol, ß-
sitosterol,3-metil-2-butenol, pentanol, cis-3-hexanol, 6-metilheptanol, octanol, 2-heptanol,
dodecanol, n-butanol, 1-octano3-ol, decanal, ácido málico, ácido cítrico, ácido isocítrico (Patel et
al., 2004); ácidos fenolicos, antocianinas, catequinas, vitamina C, aminoácidos, azúcares,
pectinas, ácidos carboxílicos y ácidos grasos saturados y no saturados (Süntar et al., 2011); ácido
gálico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido cumárico, rutina (Martini et al., 2009); entre otros
descritos por Gudej y Tomczyk (2004), Buřičová et al. (2011) y Barbosa (2007).
De los compuestos descritos por diferentes autores para el género Rubus sobresalen los
flavonoides; los cuales son la subclase de polifenoles más grande y abundante del mundo vegetal
(Barbosa, 2007). Estudios in vivo demuestran que los flavonoides potencialmente presentan
numerosas actividades farmacológicas, destacando las acciones protectora vascular,
antiaterogénica, antianginosa, antitumoral, analgésica, antiinflamatoria, antialérgica, antiulcerosa
y hepatoprotectora, entre otras (Bonkaka, 2007). Recientemente se ha observado que los
flavonoides además de ser capaces de captar radicales libres, y por tanto actuar como
antioxidantes, también pueden llevar a cabo reacciones pro-oxidantes ejerciendo efectos
citotóxicos sobre células y tejidos, este efecto pro-oxidante es el responsable de la citotoxicidad y
del efecto proapoptótico que presentan los flavonoides aislados de algunas hierbas medicinales
(Sánchez, 2009).
En cuanto a la capacidad antioxidativa se ha demostrado que las hojas de algunas especies de

Rubus muestran capacidad antioxidativa mayor que sus respectivos frutos según lo indicado por
Wang y Lin (2000),los cuales realizaron un estudio de la actividad antioxidante de frutos y hojas
mediante la prueba ORAC, encontrando que los extractos de las hojas secas presentaron valores
entre 383.2 a 728.8 (µmol de Equivalente de Trolox/g) mientras que los extractos de los frutos
mostraron valores entre 91.4 y 146.4 (µmol ET/g). Park et al. en 2012 utilizando la prueba de
actividad antioxidante con DPPH(2,2-Difenil-1-Picrilhidrazil) encontraron que los extractos de
las hojas de R. buergeri presentaron valores 30 veces más elevados que los extractos de sus
frutos; también se encontró la existencia de una correlación linear entre el contenido total
fenólico y la actividad ORAC del fruto de la zarzamora y sus hojas (Wang y Lin, 2000). Reyes et
al. en 2005 y Venskutonis et al. en 2006 encontraron que existía una fuerte correlación entre la
prueba de capacidad antioxidativa y el contenido polifenólico en extractos de zarzamora y los
extractos de las hojas de frambuesa. Estas evidencias corroboran el resultado obtenido por el
índice de correlación de Pearson obtenido del análisis de la cuantificación de flavonoides y el
48
índice de oxidación, en el cual se aprecia que el tiempo de reducción del permanganato es menor
conforme mayor sea la cantidad de flavonoides presentes en el extracto; de igual manera muestra
que la acción antioxidante de las especies de Rubus se debe a la presencia de los compuestos
fenólicos, y que dicha actividad se incrementa con el aumento de estos compuestos.
En la prueba de cuantificación de flavonoides se encontró que los extractos poseían entre

158.85+26.32 a 144.36+0 µg/mL en equivalente de quercetina; mientras que Pourmorad et
al.(2006) en su trabajo encontraron que los extractos de Mellilotus officinalis, Adiantum capillus-
veneris, Plantago major, Equisetum maximum, Urtica dioica presentaban un contenido de
flavonoides de entre 25.15+0.18 a 78.3+4.5mg/g en equivalente de quercetina; lo que nos indica
diferencia entre la cantidad de flavonoides presentes en los extractos de R. coriifolius y R.
fruticosus var. Brazos con respecto a las plantas estudiadas por Pourmorad et al. en este método
colorimétrico se identifican de manera específica la cantidad de flavonas y flavonoles con los que
cuentan los extractos a analizar, siendo relevante con la información de los diferentes flavonoides
presentes en los extractos de las especies del género Rubus, resaltándose el efecto de dichos
flavonoides en los resultados de las demás pruebas.
Gudej y Tomczyk en 2004 trabajaron con especies del género Rubus utilizando el método de
Christ-Müller para la determinación del contenido total de flavonoides siendo calculado como
quercetina e hiperósido; mostrando que las especies de R. fruticosus, R. caesius, R. nessensis, R.
odoratus, R. fruticosus var. Gazda y R. fruticosus var. Thornfree presentaron entre 0.73 a 0.32
usando el equivalente de quercetina y entre 1.05 a 0.46 usando el equivalente de hipersodio del
contenido total de flavonoides (% de peso seco). En el análisis comparativo entre la cantidad de
flavonoides en cada uno de los sitios no se encontró una diferencia significativa, lo cual pudiera
deberse a que los sitios cuentan con un tipo de suelo, clima y nivel de precipitación anual igual.
En el trabajo de Reyes et al. en 2005 los datos que reportan difieren de los resultados obtenidos,
ya que ellos demostraron que existía una diferencia en la cantidad de polifenóles acorde al sitio
de la colecta siendo analizados los extractos del fruto de R. fruticosus var. Brazos de diferentes
sitios de colecta, mostrando que el extracto del sitio de Zitacuaro presenta una menor cantidad de
polifenoles a los del sitio de Ziracuaretiro con 14.2 y 19.2 µmol de equivalente de catequina/g.
Estas diferencias pueden deberse a que la biosíntesis de los metabolitos secundarios en las plantas
se ve afectado por diversos factores que ejercen una influencia importante, como: la temporada,
los factores ecológicos y ambientales (temperatura, humedad, altitud, el suelo y la microflora del
suelo) las áreas donde las plantas crecen (Jiménez et al., 2012).En el caso específico de este
estudio se puede asumir que los factores no influyeron en la producción de flavonoides entre los
sitios.
La selección de la cepa viable de artemia para el bioensayo se determinó por las características de
eclosión las cuales son: el porcentaje de eclosión (PE), tasa de eclosión (TS) y eficiencia de
eclosión (EE) acorde a Cisneros (2002); en este aspecto se encontró que la cepa usada presentó
los siguientes resultados
49
En cuanto al porcentaje de eclosión (PE) se encontró que la cepa empleada contaba con un
89.55% comparándolo con los resultados obtenidos de Cisneros (2002) presentó un porcentaje
menor siendo el encontrado en la cepa empleada en dicho estudio de 99%. En el estudio de
Mechaly et al. en 2004 se obtuvo un PE del 74.5%, lo cual nos indica que la cepa empleada tiene
un buen porcentaje de eclosión muy cercano al presentado por Galván (2008) con un 90%.
La tasa de eclosión (TS) fue de 8 horas la cual fue superior a la presentada por Cisneros en 2002
de 19 horas, mientras que Galván en 2008 mostro una TS de 13-15 horas; en este aspecto se
observa que la cepa empleada tiene en menor tiempo con respecto a las utilizadas por los
anteriores autores.
La eficiencia de eclosión (EE) que se obtuvo fue de 612,880 nauplios por gramo siendo casi el
doble comparándolo con Cisneros (2002) el cual se obtuvo 382,000 nauplios por gramo y casi el
triple que Mechaly et al. (2004) donde la producción de nauplios por gramo fue de 180,000
mientras que en el estudio de Galván (2008) la cepa empleada genero 567,110 nauplios por
gramo. La cepa empleada tuvo una mejor EE que la de los otros autores.
Acorde a Galván (2008) los resultados de PE, EE y TS varían de acuerdo a las condiciones de
incubación y al manejo al que se someten los quistes. Aunque el tiempo empleado para hacer los
conteos difieren entre autores (24-48 horas), los resultados obtenidos indican que la cepa
utilizada es viable para hacer el bioensayo en A. franciscana.
La prueba con A. franciscana es una prueba biológica general, particularmente útil para la
identificación de compuestos activos; permitiendo la evaluación rápida de la relación estructura-
actividad, y son fácilmente observables las interacciones entre compuestos (Pino y Lazo, 2010;
Lachumy, 2010) y ha sido validado por que ha permitido el descubrimiento de centenares de
compuestos activos (Pino y Lazo, 2010).
En el bioensayo con A. franciscana se emplean estadios larvales tempranos para su ejecución

pues presentan una sensibilidad mayor que en etapa adulta (Koutsatis y Aoyama, 2008; Pino y
Lazo, 2010; Pérez et al., 2010). Este ensayo es utilizado como vía inicial de tamizaje citotóxico
de extractos para discriminar aquellas muestras de elevada toxicidad, debido a que presenta
buena correlación con la toxicidad in vitro (Martínez-Hormasa et al., 2006).
Este ensayo se ha utilizado para la pre-evaluación de extractos vegetales con el descubrimiento

de compuestos antitumorales. Inicialmente, se determinó que existe una correlación positiva entre
la mortalidad de las larvas de artemia y la citotoxicidad frente a las células 9KB (carcinoma
nasofaríngeo humano) y la línea celular 3PS(P388) (leucemia in vivo) (Pino y Lazo, 2010;
Acostaet al., 2011; Gonzales et al., 2007; Martínez-Hormasa et al., 2006); tal vez es más
significante la fuerte correlación entre la letalidad en la prueba en artemia y la inhibición de
crecimiento in vitro de tumores sólidos de líneas celulares humanas demostrado por el National
Cancer Institute (NCI, USA) el cual demostró el valor de la prueba en artemia como un tamizaje
general para la búsqueda de drogas antitumorales (Jaques, 2004).
50
Moshi et al. en 2010 indicaron que en un estudio realizado por Moshi et al. en 2004 usando el
bioensayo de artemia determinaron la CL50 de Phyllanthus engleri siendo de 0.47 μg/mL, planta
de la cual recientemente se produjo la englerina A, un componente selectivo anticáncer contra
cáncer de células de riñón, lo cual proporciono mayor evidencia del potencial de este bioensayo
para predecir la presencia de componentes anticancerigenos en extractos de plantas.
En general, los valores de dosis eficaz media (DE50) para las citotoxicidades son
aproximadamente una décima parte de los valores de CL50 encontrados en los ensayos con A.
franciscana (Pino y Lazo); este ensayo también ha demostrado buena correlación al evaluar
extractos de plantas con la toxicidad aguda oral en ratones (Fernández et al., 2009).
Con vistas a correlacionar la acción tóxica mostrada por extractos de plantas con otras
actividades biológicas o con la presencia de determinados componentes químicos, varios autores
reportan una clasificación de la toxicidad según el valor de la CL50 del extracto. Aunque estas
clasificaciones poseen variaciones entre sí, todas coinciden en agrupar los extractos con CL50 de
acuerdo con las categorías siguientes: extremadamente tóxico < 10 μg/mL, muy tóxico 10-100
μg/mL, moderadamente tóxico 100-1 000 μg/mL y no tóxico > 1000 μg/mL (Bartolomé y
Sánchez, 2007; Fernández-Calienes et al., 2009; Moshi et al., 2010); considerando activos los
que presenten CL50 menores a 1000μg/mL (Martínez et al., 2011); estos hallazgos refuerzan la
importancia de la utilización de este ensayo como prueba alternativa de toxicidad (Fernández-
Calienes et al., 2009).Actualmente los ensayos en artemia se consideran una herramienta útil para
la evaluación preliminar de la toxicidad de extractos de plantas, la detección de distintos tipos de
actividad biológica y para aislar e identificar sustancias vegetales bioactivas (Cortes, 2005).
Los resultados obtenidos con los extractos etanólicos de R. coriifolius y R. fruticosus var. Brazos
empleando el bioensayo de artemia mostraron que las CL50) se encontraron entre 46.23 a
419.59μg/mL, mientras otros autores empleando diferentes especies de Rubus obtuvieron las
siguientes concentraciones: Kanegusuku et al. en 2002 usando extractos metanólicos de las hojas
de R. imperialis encontró una CL50 de 387.10μg/mL empleando el bioensayo de artemia;
Ramírez, et al.en 2007, Moshi et al. en 2010, usando extractos de diferentes partes de la planta
encontraron CL50 de 223.6μg/mL y de 41.7-19.8μg/mL respectivamente empleando el bioensayo
de artemia; mientras que otros autores como Cornejo et al. en 2006 encontraron una DL50>6g/kg
en el extracto etanólico de R. liebmanii empleando 2 especies de roedores, indicando que no
observaron alteraciones físicas en el hígado, riñón, pulmón o variación del peso; Barbosa en 2007
realizó una prueba antigiardia encontrando que el extracto metanólico de R. coriifolius tiene una
CL50 de 77.82μg/mL.
De los resultados obtenidos se puede apreciar que tanto la especie silvestre R. coriifolius y la
especie cultivada Rubus fruticosus var. Brazos presentan actividad biológica; en este aspecto
Gudej y Tomczyk en 2004 sugieren que las hojas tanto de especies cultivadas como silvestres de
Rubus pueden ser igual de valiosas que aquellas que han sido estudiadas por presentar
propiedades medicinales.
51
8. CONCLUSIONES
 El rendimiento de las plantas colectadas por sitio y de mayor a menor rendimiento fueron
los siguientes: Sitio 5 R. fruticosus var. Brazos > Sitio 3 R. coriifolius > Sitio 1 R.
coriifolius > Sitio 2 R. coriifolius> Sitio 4 R. fruticosus var. Brazos; siendo el rendimiento
del Sitio 1 de un 29.7%, Sitio 2 de un 26.3%, Sitio 3 de un 30.7%, Sitio 4 de un 15.7% y
Sitio 5 de un 46.25%.
 El estudio preliminar fitoquímico realizado mostró que los principales metabolitos
secundarios presentes fueron: flavonoides y triterpenos/esteroles para las especies
analizadas; mientras que se observó la presencia de alcaloides únicamente en los extractos
de R. fruticosus var. Brazos.
 Se encontró que la cantidad de flavonoides presentes en los extractos estudiados de mayor
a menor fueron los siguientes: Sitio 3 R. coriifolius > Sitio 1 R. coriifolius> Sitio 2 R.
coriifolius, Sitio 4 R. fruticosus var. Brazos y Sitio 5 R. fruticosus var. Brazos. La
cantidad de flavonoides de los extractos fue de 158.85+26.32 para el Sitio 3, de
153.35+15.64 para el sitio 1 y para los sitios 2, 4 y 5 fue de 144.36+0 µg/ml.
 Los índices de oxidación (medidos en segundos) de los extractos fueron los siguientes de
menor a mayor tiempo: Sitio 3 < Sitio 4 < Sitio 1 < Sitio 2 < Sitio 5 <equivalente de
quercetina. Siendo los tiempos registrados de los extractos entre 1.68a 3.95 segundos.
 La cepa de artemia empleada para el bioensayo fue de buena calidad presentando una
eficiencia de eclosión (EE) de 612,880 nauplios por gramo, una tasa de eclosión (TS) de 8
horas y un porcentaje de eclosión (PE) del 89.55%.
 En el bioensayo de artemia se encontró que los extractos etanólicos de las especies de R.
coriifolius y R. fruticosus var. Brazos mostraron una gama de toxicidades contra el
organismo prueba, siendo las CL50 registradas entre 46.23 a 419.59µg/mL. En orden de
menor a mayor las CL50 fueron las siguientes acorde a su sitio: Sitio 3 > Sitio 1 >Sitio 2 >
Sitio 4 > Sitio 5.Las concentraciones letales medias (CL50) de los extractos fueron para el
Sitio 1 de 63.38µg/mL, Sitio 2 de 82.07µg/mL, Sitio 3 de 46.23µg/mL, Sitio 4 de
73.50µg/mL y del Sitio 5 de 419.59µg/mL.
 De acuerdo con los resultados encontrados en el bioensayo de Artemia se puede concluir
que los extractos etanólicos de las 2 especies, R. coriifolius y R. fruticosus var. Brazos
presentan actividad biológica; esto es acorde a la información que presentan para
interpretar las CL50 Martínez et al. en 2011; Salazar en 2012 en sus trabajos.
52
9. SUGERENCIAS
 Seguir con estudios especializados para la identificación y fraccionamiento de los

componentes de los extractos de R. coriifolius y R. fruticosus var. Brazos.
 Realizar pruebas de actividad antimicrobia, actividad antioxidante, entre otras, a los
extractos de R. coriifolius y R. fruticosus var. Brazos de los sitios 1 al 4 por los resultados
obtenidos de CL50 en el bioensayo con Artemia franciscana.; también debido a la
información presente del género y sus cualidades benéficas
 Realizar estudios citotóxicos a los extractos de R. coriifolius del sitio 3 ya que presentó la
menor CL50 de los extractos estudiados.
53
10. BIBLIOGRAFÍA
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Actividad biológica de los extractos etanólicos de dos especies

TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

BRUNO CRUZ MARTÍNEZ

CODIRECTORES: DRA.MARÍA DEL SOCORRO FERNANDEZ

Listas de Figuras, Tablas y Gráficas III

Figura 1.Rubus coriifolius con flor. 10

Figura 2.Rubus fruticosus var. Brazos con fruto 12

Figura 3.Estructura básica de los compuestos fenólicos 13

Figura 5.Clasificación química de los alcaloides 18

Figura 6.Enumeración de los átomos de carbono en la molécula de colesterol 19

Figura 7.Artemia franciscana 21

Figura 8.Tipo de clima del municipio de Ixhuacán de los Reyes 25

Figura 9.Tipo de suelo del municipio de Ixhuacán de los Reyes 26

Figura 10.Localización del área de colecta en el municipio de Ixhuacán de los Reyes 28

Figura 12.Sitio de colecta 5 de hojas de zarzamora en el municipio de Coatepec 30

Figura 13.Eclosión de Artemia franciscana 35

Figura 14. Quistes de Artemia franciscana y nauplio de A. franciscana 35

Figura 15. Nauplio del segundo estadio de Artemia franciscana 36

Figura 16. Nauplio del segundo estadio de Artemia franciscana 36

Figura 17.Artemia franciscana 24 horas después de su eclosión 38

Figura 18.Bioensayo de Artemia franciscana 39

Figura 19. Bioensayo de Artemia franciscana 39

Tabla1. Clasificación taxonómica de Artemia franciscana 21

Tabla 2.Nivel de precipitación del municipio de Ixhuacán de los Reyes 25

Tabla 3.Descripción, coordenadas de las colectas de zarzamora. 29

Tabla 4.Soluciones para la elaboración del agua de mar artificial 34

Tabla 5.Rendimiento del extracto de Rubus coriifolius 41

Tabla 6.Rendimiento del extracto de Rubus fruticosus var. Brazos 41

Tabla 7.Caracterización fitoquímico preliminar de los extractos de Rubus coriifolius 42

Tabla 8.Caracterización fitoquímico preliminar de los extractos de Rubus fruticosus var.

Gráfica 1.Cantidad de flavonoides presentes en los extractos de las 2 especies de Rubus

Gráfica 2.Índice de oxidación de los extractos de las especies de Rubus y un equivalente de

Agradecimientos de manera especial al Maestro Alvar y a la Dra. Cutiño, quienes me enseñaron

En Veracruz, en la zona del bosque mesófilo de montaña se encuentran zarzamoras de tipo

En Veracruz, en la zona del bosque mesófilo de montaña se encuentran zarzamoras de tipo

Para algunas especies de zarzamoras como R. coriifolius, R. chamaemorus, R. ideaus y R.

Este género es de taxonomía sumamente complicada, pues a menudo existen dificultades en la

Representa un género diverso de plantas distribuidas globalmente como especies y genotipos

2.1.1 Rubus coriifolius

Figura 1. Rubus coriifolius con flor.

2.1.2 Rubus fruticosus var. Brazos

Figura 2.Rubus fruticosus var. Brazos con fruto

2.2 Metabolitos secundarios

Los polifenoles poseen acciones molusquicidas, antihelmínticas, antihepatotóxicas,

La actividad antioxidante de los fenoles es el origen de funciones biológicas tales como la

Figura 3. Estructura básica de los compuestos fenólicos

La variedad de las propiedades biológicas de los flavonoides ha llamado poderosamente la

Actualmente se conocen más de 4,000 alcaloides, aunque su presencia probablemente quede

En la naturaleza se encuentran una gran cantidad y diversidad de sustancias con el núcleo

La mayoría de esteroles naturales o esteroles insaturados poseen una cadena lateral de 8 a 10

Figura 6.Enumeración de los átomos de carbono en la molécula de colesterol

2.3 Artemia franciscana

El género Artemia, conocido como “camarón de salmuera” o “brine shrimp”, es el crustáceo

La clasificación taxonómica de Artemia franciscana

Género Artemia Leach

Especie franciscana Kellog