UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES

FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA Y CIENCIAS

DEL MAR

Efecto del extracto de Avicennia germinans

(mangle negro) en el crecimiento de Vibrio
spp. aislados de Litopenaeus vannamei

PROYECTO DE TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE

BACHILER DE INGENIERA PESQUERA ACUICOLA

FRIXIA MICHELL MOLINA SILVA

TUMBES, PERÚ
2019

1
 RESPONSABLE

___________________________________ EJECUTORA
Frixia Michell Molina Silva

__________________________________ ASESOR
Mg. Alberto Ordinola Zapata

__________________________________ CO-ASESOR
Dr. Héctor Alfredo Sánchez Suárez

2
 CERTIFICACIÓN

Mg. Alberto Ordinola Zapata

Docente ordinario de la Universidad Nacional de Tumbes, adscrito a la Facultad
de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar, Departamento Académico de
Acuicultura.

CERTIFICA:

Que el proyecto de tesis:

Efecto del extracto de mangle negro (Avicennia germinans) en el

crecimiento de Vibrio spp. aislados de Litopenaeus vannamei, presentado
por la alumna FRIXIA MICHELL MOLINA SILVA de la Escuela Académico
Profesional de Ingeniería Pesquera Acuícola, ha sido asesorado y revisado por
mi persona, por tanto, queda autorizado para su presentación e inscripción en
la Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar de la Universidad
Nacional de Tumbes para su revisión y aprobación correspondiente.

Tumbes, 16 de setiembre de 2019.

________________________________________
Mg. Alberto Ordinola Zapata
Asesor del Proyecto de Tesis

3
 JURADO DICTAMINADOR

……………………………………….. ____________________
PRESIDENTE

. ………………………………………… ____________________
SECRETARIO

. ………………………………………… ____________________
VOCAL

4
 ÍNDICE

Pág
1. Situación problemática.................................................................................6
2. Planteamiento del problema........................................................................7
3. Justificación..................................................................................................7
4. Objetivos.......................................................................................................7
5. Revisión de literatura....................................................................................8
6. Formulación de hipótesis y definición de variables...................................11
7. Metodología................................................................................................12
8. Cronograma................................................................................................20
9. Presupuesto...............................................................................................21
10. Referencias bibliográficas..........................................................................23
Anexos

5
1. Situación problemática

Según World Bank (2014), en el mundo, el gran problema que amenaza a la

acuicultura son las enfermedades las cuales originan pérdidas millonarias
que han sido estimadas en 6000 millones de dólares por año.

Flegel (2012) y Krishnani et al. (2015), señalan que los virus y bacterias
causan las principales enfermedades infecciosas en acuicultura, entre ellas
las originadas por Vibrio spp., para combatirlas se hace uso indiscriminado
de antibióticos como tratamiento preventivo (profiláctico) y contra
enfermedades no bacterianas (Letchumanan et al., 2015; Luis-Villaseñor
et al., 2015).

El abuso de los antibióticos ha causado el desarrollo de bacterias

resistentes o multirresistentes a antibióticos (Krishnani et al., 2015; Stalin &
Srinivasan, 2016; Watts et al., 2017).

Autores como Jeyasanta et al. (2017); Millanao et al. (2011); Shakerian et al.
(2018), indican que los antibióticos utilizados habitualmente en el tratamiento
de vibriosis son poco efectivos, pues existen cada vez más cepas de Vibrio
spp. resistentes.

Por esa razón se han buscado soluciones alternativas al uso de antibióticos

en la acuicultura, habiéndose ensayado prebióticos, simbióticos, probióticos,
fitobióticos y otros suplementos dietarios. Existe una intensa investigación
respecto al uso de los fitobióticos (generalmente como aceites esenciales o
extractos vegetales) como una de las alternativas más prometedoras.

Respecto a los fitobióticos, se conoce que hay miles de plantas que tienen
propiedades antibacterianas, entre ellas el mangle negro (Avicennia
germinans)(Aljaghthmi et al., 2018; Mulia et al., 2018), que cuentan con
estudios en los cuales se ha reconocido sus propiedades antibióticas
principalmente contra bacterias patógenas de humanos o de peces, sin
embargo aún no se ha evidenciado su uso contra Vibrio spp. en langostino.

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2. Planteamiento del problema de investigación

¿Qué efecto tendrá el extracto de Avicennia germinans (mangle negro) en el

crecimiento del Vibrio spp. aislado de Litopenaeus vannamei?

3. Justificación de la investigación

Esta investigación se justifica dado que Vibrio spp. actualmente, originan

enfermedades y pérdidas en el cultivo de langostino y ante la cual los
antibióticos cada vez son menos efectivos. Por lo que es importante
encontrar alternativas para su tratamiento sin usar antibióticos, por ello se
pretende evaluar el potencial antibacteriano del extracto de Avicennia
germinans (mangle negro) frente a Vibrio spp. patógenos para L. vannamei.
La evaluación del potencial de los mismos es el primer paso para desarrollar
productos alternativos comerciales (sin uso de antibióticos) que puedan
ayudar a tratar las vibriosis en langostinos de cautiverio en la región
Tumbes.

4. Objetivos

4.1 Objetivo general.

- Determinar el efecto que el extracto de Avicennia germinans
(mangle negro) en el crecimiento de Vibrio spp. aislados de
Litopenaeus vannamei.

4.2 Objetivos específicos.

- Obtener cepas de Vibrio spp. de langostinos de cultivo y silvestres
de Tumbes que muestren signos de vibriosis.
- Determinar la resistencia de las cepas de Vibrio spp. aisladas
frente a diversos antibióticos.
- Determinar el efecto que tendrá el extracto de Avicennia germinans
(mangle negro) en el crecimiento de Vibrio spp. aislados de
Litopenaeus vannamei.

7
5. Revisión de literatura

Existe múltiple literatura científica que reporta el uso de fitobióticos

extraidos de plantas de mangle como antibacterianos en humanos,
animales terrestres e incluso en organismos acuáticos; algunos de
dichos estudios se indican a continuación:

Kannappan et al. (2018), evaluaron el efecto de extracto de hojas de

mangle (Rhizophora apiculata) contra Vibrio harveyi in vitro e in vivo en
poslarvas de Penaeus monodon, El ensayo in vitro se realizó mediante
la técnica de difusión de pozo de agar, inoculando cada placa con 50 µl
de V. harveyi ( 1x108 UFC/ml) y colocando en los pozos 200 µl del
extracto de mangle, las placas fueron incubadas a 37 °C por 48 h,
después de lo cual se midió el diámetro de los halos de inhibición
excluyendo el diámetro del pozo. También se determinó la concentración
mínima inhibitoria (MIC) y la concentración mínima bactericida (MBC) del
extracto en placas sembradas con 20 µl de V. harveyi (2,19x107
UFC/ml), asimismo se realizó ensayo in vivo con 1000 PL10 de P.
monodon en bateas con agua a 20 ‰ de salinidad, en un grupo de ellas
e agregó sólo 2,19x107 UFC/ml de V. harveyi, en otro igual cantidad de
V. harveyi y 2 mg/10 L de extracto de mangle, en un tercer grupo se
agregó sólo 200 µg/ml del extracto y en un cuarto no se agregó ni V.
harveyi ni el extracto. Los resultados mostraron que el extracto tuvo
efecto inhibidor in vitro con diámetros de los halos de inhibición de 6 a 14
mm, con MIC de 200 µg/ml (halo de inhibición de 6 mm) y MBC de 300
µg/ml (halo de inhibición de 12 mm). Los resultados in vivo mostraron
que la mortalidad en el tratamiento infectado con V. harveyi y tratado con
extracto de mangle fue de 57,88 %, siendo inferior a la del tratamiento
infectado pero no tratado con el extracto, también se observó que el
tratamiento en el que se aplicó sólo el extracto tuvo una mortalidades
similar a la del control, mostrando que el extracto no tuvo efecto negativo
en la supervivencia de las poslarvas de P. monodon.

8
Prayitno et al. (2017), determinaron el efecto de un extracto de hojas de
mangle (Rhizophora apiculata) en el control de Vibrio harveyi que infecta
al cangrejo Scylla serrata, para ello obtuvieron un macerado metanólico
de hojas secas de mangle, la que fue concentrada en un rota evaporador
y luego aplicado in vitro mediante la técnica de difusión de disco en agar
marino, aplicando 15 µl del extracto a concentraciones de 300, 600 y
900 µg/ml con solución de buffer de fosfato (PBS) como control negativo.
El ensayo in vivo se realizó con 48 cangrejos inyectados
intramuscularmente con V. harveyi (105 UFC/ml) y al aparecer los
primeros signos de enfermedad aplicaron baños de 30 min en el extracto
de mangle a concentraciones de 0, 300, 600 y 900 mg/l. Encontrando
que en el ensayo in vitro el extracto produjo halos de inhibición con
diámetros entre 11,37 y 13,67 mm, demostrando mediana actividad
contra V. harveyi al compararlo con los estándares del Clinical and
Laboratory Standards Institute ( resistente ≤12 mm, intermedio: 13-16
mm, sensible ≥ 17 mm), mientras que en el ensayo in vivo se mostró que
luego de 14 días post-infección, la supervivencia fue progresivamente
mayor de acuerdo a la mayor concentración del extracto empleado,
lográndose 100 % de supervivencia en la dosis de 900 mg/l. Esto mostró
que el extracto de mangle pudo curar la infección de V. harveyi en S.
serrata.

Aljaghthmi et al.(2018), determinaron el efecto de un extracto de hojas

de mangle negro (Avicennia marina) en el control de Vibrio harveyi que
infecta al cangrejo Scylla serrata, para ello obtuvieron un macerado
metanólico de hojas secas de mangle, la que fue concentrada en un rota
evaporador y luego aplicado in vitro mediante la técnica de difusión de
disco en agar marino, aplicando 15 µl del extracto a concentraciones de
300, 600 y 900 µg/ml con solución de buffer de fosfato (PBS) como
control negativo. El ensayo in vivo se realizó con 48 cangrejos
inyectados intramuscularmente con V. harveyi (105 UFC/ml) y al
aparecer los primeros signos de enfermedad aplicaron baños de 30 min
en el extracto de mangle a concentraciones de 0, 300, 600 y 900 mg/l.
Encontrando que en el ensayo in vitro el extracto produjo halos de

9
inhibición con diámetros entre 11,37 y 13,67 mm, demostrando mediana
actividad contra V. harveyi al compararlo con los estándares del Clinical
and Laboratory Standards Institute ( resistente ≤12 mm, intermedio: 13-
16 mm, sensible ≥ 17 mm), mientras que en el ensayo in vivo se mostró
que luego de 14 días post-infección, la supervivencia fue
progresivamente mayor de acuerdo a la mayor concentración del
extracto empleado, lográndose 100 % de supervivencia en la dosis de
900 mg/l. Esto mostró que el extracto de mangle pudo curar la infección
de V. harveyi en S. serrata.

Sumardi et al. (2018), determinaron el efecto de un extracto de hojas de

mangle negro (Avicennia marina) en el control de Vibrio harveyi que
infecta al cangrejo Scylla serrata, para ello obtuvieron un macerado
metanólico de hojas secas de mangle, la que fue concentrada en un rota
evaporador y luego aplicado in vitro mediante la técnica de difusión de
disco en agar marino, aplicando 15 µl del extracto a concentraciones de
300, 600 y 900 µg/ml con solución de buffer de fosfato (PBS) como
control negativo. El ensayo in vivo se realizó con 48 cangrejos
inyectados intramuscularmente con V. harveyi (105 UFC/ml) y al
aparecer los primeros signos de enfermedad aplicaron baños de 30 min
en el extracto de mangle a concentraciones de 0, 300, 600 y 900 mg/l.
Encontrando que en el ensayo in vitro el extracto produjo halos de
inhibición con diámetros entre 11,37 y 13,67 mm, demostrando mediana
actividad contra V. harveyi al compararlo con los estándares del Clinical
and Laboratory Standards Institute ( resistente ≤12 mm, intermedio: 13-
16 mm, sensible ≥ 17 mm), mientras que en el ensayo in vivo se mostró
que luego de 14 días post-infección, la supervivencia fue
progresivamente mayor de acuerdo a la mayor concentración del
extracto empleado, lográndose 100 % de supervivencia en la dosis de
900 mg/l. Esto mostró que el extracto de mangle pudo curar la infección
de V. harveyi en S. serrata.

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6. Formulación de la hipótesis y definición de variables

6.1 formulación de la hipótesis

El extracto de Avicennia germinans (mangle negro) inhibe al

crecimiento de Vibrio spp. aislado de Litopenaeus vannamei.

6.2 Variables y operacionalización

a) Definición conceptual:

Variable independiente: aplicación del extracto de

Avicennia germinans (mangle negro)
Definición conceptual: Indica si se va a aplicar o no al
alimento, el extracto de mangle negro.

Definición operacional: Se determinará por inspección

visual u olfatoria del extracto.

Variable dependiente: crecimiento de Vibrio spp.

Definición conceptual: Es el cambio en el número de
células de la colonia de Vibrio spp.

Definición operacional: Se determinará midiendo el

diámetro del halo de inhibición que forme el extracto de
mangle en las placas petri sembradas con Vibrio spp. en el
ensayo in vitro, así como en el número de UFC/g de Vibrio
spp. en el intestino de langostinos que han recibido el
extracto de mangle negro en el ensayo in vivo.

11
7. Metodología

a) Diseño metodológico:

7.1 Preparación de medios de cultivo y materiales para la siembra

Un día antes de la recolección de los langostinos se preparará el
material necesario para el muestreo, así se preparará citrato de sodio
al 10 %, para lo cual se pesará 1 g de citrato de sodio, se transferirá a
un tubo falcón de 15 ml y se disolverá en agua destilada hasta
obtener un volumen de solución de 10 ml. El tubo será colocado en
refrigeración a 4 °C hasta su uso.
Las placas Petri, matraces, microtubos de centrífuga, pinzas y tijeras
de acero inoxidable y maceradores serán empacados y esterilizados
en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
Se preparará medio TCBS en cantidad suficiente para la cantidad de
placas Petri que se utilizarán en el muestreo, teniendo en cuenta que
por cada placa se requerirá entre 20 a 25 ml de medio. El medio se
preparará disolviendo en un matraz, agar TCBS en agua destilada, en
cantidad de 88 g por cada litro de medio, al cual se agregará cloruro
de sodio para alcanzar una concentración de 2,5 %. El medio se
disolverá calentándolo hasta ebullición para que se disuelva todo el
agar, luego se dejará reposar, el medio no necesita esterilización. El
medio tibio será vertido en las placas petri, las que se sellarán usando
papel parafilm y se colocarán en forma invertida en refrigeración a 4
°C hasta su uso.
Se preparará medio TSA en cantidad suficiente para realizar los
subcultivos, disolviendo en un matraz, agar TSA en agua destilada, en
cantidad de 40 g por cada litro de medio, al cual se agregará cloruro
de sodio para alcanzar una concentración de 2,5 %. El medio se
disolverá calentándolo hasta ebullición para que se disuelva todo el
agar, luego se esterilizará a 121 °C por 15 minutos. El medio tibio
será vertido en las placas Petri, las que se sellarán usando papel
parafilm y se colocarán en forma invertida en refrigeración a 4 °C
hasta su uso.

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7.2 Recolección de langostinos
Los langostinos de cultivo se obtendrán de empresas langostineras
que acepten colaborar en la investigación, las que estarán ubicadas
en la región Tumbes (Perú). Se seleccionaran los estanques que
tengan más problemas de enfermedades, de los cuales se obtendrán
langostinos con signos externos de vibriosis así como aquellos
aparentemente sanos; los que serán colocados en bolsas o baldes
con agua del propio estanque para ser transportadas rápidamente al
Laboratorio de Acuicultura II o de Microcultivos en la Facultad de
Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar de la Universidad Nacional de
Tumbes en la localidad de Puerto Pizarro.
En el caso de los langostinos silvestres, estos serán capturados con
el apoyo de pescadores artesanales en los canales de marea de
Puerto
Pizarro. Luego de su captura se procederá de manera similar a la
utilizada con los langostinos de cultivo.

7.3 Obtención de muestras de hemolinfa, hepatopáncreas,

intestino y tejido de las heridas
De cada langostino recolectado se registrará su peso y características
externas como heridas, coloración, erosiones, luminiscencia, entre
otros (Formulario del anexo 1). También se obtendrá una muestra de
hemolinfa para lo cual se colocará 0,1 ml de anticoagulante (citrato de
sodio al 10 % helado) en una jeringa de 1 ml y se obtendrá con ella
una muestra de al menos 0,1 ml de hemolinfa del seno ventral del
langostino. La jeringa será codificada y mantenida en congelación
hasta la siembra correspondiente. También se disectará el langostino
y se extraerá todo su hepatopáncreas, el cual será pesado,
colocándolo en un microtubo de centrífuga de 1,5 ml previamente
tarado, luego se tomará un fragmento de 0,1 g de hepatopáncreas
que será colocado en un microtubo de centrífuga de 1,5 ml. También
se extraerá el intestino que será colocado en un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml previamente tarado. De las heridas y

13
erosiones se obtendrá una muestra que será colocado en tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml.
En el caso de las muestras tomadas de hepatopáncreas, intestino así
como de heridas y erosiones, estas serán maceradas en el mismo
microtubo empleando maceradores de acero esterilizados y se
adicionará solución salina al 2,5 % hasta alcanzar 1 ml.

7.4 Aislamiento de cepas de Vibrio spp.

En el caso de cada muestra de hemolinfa, se sembrarán 100 µl de la
solución de hemolinfa y anticoagulante en su respectiva placa petri
conteniendo medio agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS). La
muestra será extendida en estrías con un asa de siembra sobre la
superficie del medio. Luego las placas Petri serán selladas con
parafilm y dejadas incubar en posición invertida por 24 h a 37 °C.
En el caso de las muestras de hepatopáncreas, intestino, y de heridas
y erosiones, el microtubo en que se encuentra el macerado será
codificado y marcado como solución madre, de ésta se prepararán en
microtubos de 1,5 ml, diluciones sucesivas desde 10 -1 hasta 10-4; de
cada una de estas diluciones se tomarán 100 µl y se sembrarán en
placas Petri con medio TCBS.
Luego de la siembra las placas Petri se sellarán con parafilm y se
dejarán incubar en posición invertida por 24 h a 37 °C.

7.5 Purificación de cepas bacterianas.

El procedimiento de purificación en TCBS consistirá en que luego de
la incubación se observarán las placas Petri para seleccionar las
cepas más representativas. Estas serán subcultivadas en medio agar
tripticasa soya (TSA), para lo cual se transferirá cada colonia
seleccionada a una nueva placa Petri conteniendo TSA la que será
sembrada en estrías con un asa de siembra. Las placas Petri se
sellarán con parafilm y se dejarán incubar por 24 h a 37 °C, luego del
cual se observarán si las colonias que se forman son de mismo tipo,
caso contrario se volverá a sembrar las subcolonias que se obtengan

14
en nuevas placas petri conteniendo TSA, hasta obtener un
monocultivo bacteriano.

7.6 Conservación de cepas bacterianas.

Para la conservación de la cepa de Vibrio spp., se tomará una colonia
bacteriana de las cepas purificadas y se colocará en un microtubo con
1 ml de caldo LB, dejándose incubar por 24 h a 37 °C. También se
realizarán al menos dos réplicas de respaldo para cada una de estas
colonias para lo cual se tomará 10 μl de la suspensión bacteriana
del primer microtubo y se colocará en otro microtubo conteniendo 1 ml
de caldo LB, se incubará nuevamente por 24 h a 37 °C. A cada
microtubo, luego de las 24 h de incubación se adicionará glicerol
helado hasta alcanzar una concentración de 15 % y se conservará a
-20 °C, hasta su uso

7.7 Aislamiento de cepas de Vibrio spp. resistentes a antibióticos

Este paso se realizará según el protocolo seguido por Aguirre (2019),
y que consiste en que se tomará una colonia y se sembrará en un
microtubo de centrífuga de 1,5 ml con 1 ml de caldo tripticasa soya
(TSB). Este se dejará crecer por 24 a 48 h hasta que alcance un nivel
de turbidez que supere al estándar de MacFarland 0,5.
Se empleará el método de disco de difusión, que consiste en que las
colonias a sembrar que se hallan en los microtubos se centrifugarán a
10 000 xg por 3 min, para separar el pellet bacteriano del medio TSB,
luego el pellet será resuspendido en un microtubo de 1,5 ml con
solución salina al 2,5 % y se tratará de igualar su turbidez (por
inspección visual) con la que tiene el estándar de MacFarland 0,5
(equivalente a una concentración de 1x10 8 cél./ml) para lo cual en
caso ser necesario se diluirá la solución bacteriana con la solución
salina al 2,5 %. La muestra bacteriana estandarizada se usará para la
siembra en placas petri conteniendo medio Müeller-Hinton (preparado
disolviendo 38 g en 1litro agua destilada). Para ello se tomará 100 µl
de la muestra bacteriana y se extenderá sobre toda la placa petri con

15
un asa de drigalski o en todo caso con un cotonete esterilizado. A
continuación se aplicarán sobre la placa sembrada discos antibióticos
comerciales conforme a la tabla 1:

Tabla 1. Antibióticos a utilizar en el ensayo de resistencia a

antibióticos
Grupo Antibiótico Clave Cantidad por
disco (µg)
I. Inhibidores de la Ampicilina Amp 10
pared celular Fosfomicina Fos 50

II. Inhibidores de la Cloranfenicol Clor 30

síntesis de Florfenicol Flo 25
proteínas Oxitetraciclina Otc 30
Gentamicina Gen 10
Tetraciclina Tet 30

III. Inhibidores de la Ácido nalidíxico Nal 30

síntesis de ADN Enrofloxacina Enro 5
Norfloxacina Nor 10

Luego de aplicar los discos, se esperará 24 h para observar el

crecimiento de las bacterias y la formación de halos de inhibición en el
caso de que no sean resistentes. Los diámetros de los halos de
inhibición generados por los discos de sensibilidad se medirán
utilizando una regla o vernier. Las cepas de Vibrio spp. que muestren
ser resistentes a uno o más antibióticos serán colocadas en
microtubos de 1,5 ml con medio TSB y almacenadas en refrigeración
para su posterior uso.

7.8 Obtención de extracto de mangle negro.

Se obtendrá hojas de mangle negro, las cuales deberán estar sanas
y sin signos de lesiones o erosiones, las hojas serán lavadas para
retirar polvo y otros contaminantes. Una parte de las hojas se
procesarán en fresco y otras serán dejadas secar bajo sombra.
En el caso de las hojas frescas, éstas serán molidas en una licuadora,
en proporción de 1:3 (volumen de hojas/volumen de agua destilada),
para obtener el jugo de las mismas.

16
En el caso de las hojas secas, estas serán molidas en un molino
hasta polvo fino. Se tomará 5 g de las hojas molidas y se someterá a
extracción con 50 ml de alcohol etílico. La extracción se realizará
usando dos solventes, por un lado agua hirviendo y por otro alcohol
etílico. Se tomará 5 g del polvo de hojas secas y se dejará macerar
en 50 ml de alcohol. También se tomará 5 g de polvo de hojas secas
que serán colocadas en 200 ml de agua hirviendo por 10 min. El
sobrenadante será separado por filtración usando papel whatmann
N°1.
Los extractos obtenidos serán almacenados en botellas color ambar
etiquetadas adecuadamente y mantenidas en refrigeración hasta su
uso.

7.9 Evaluación del efecto inhibitorio in vitro de extractos

vegetales.
Para determinar el efecto inhibitorio de los extractos vegetales
obtenidos, se empleará el método de difusión en pozo de agar como
lo realizaron Lamari et al. (2014) y Rebouças et al. (2011) con
modificaciones; se procederá de manera similar a la seguida en el
procedimiento sobre determinación de resistencia a antibióticos en
Vibrio spp. (ítem 7.7) con la salvedad que en lugar de usarse discos
antibióticos se emplearán discos de papel filtro de 6 mm
esterilizados, a los que se agregarán los extractos vegetales
preparados en diferentes concentraciones (diluciones desde 10 0 a 10-3
de las soluciones madre en agua destilada). El ensayo se realizará
por triplicado para cada extracto y dilución, se usará como control
negativo discos de papel filtro esterilizados a los que se añadirá agua
destilada y como control positivo un disco antibiótico al cual fuera más
sensible la cepa de Vibrio spp. ensayada. Luego de 24 h de
crecimiento de Vibrio spp. se medirá los diámetros de los halos de
inhibición.

17
7.10 Evaluación del efecto inhibitorio in vivo de extractos
vegetales.
Para evaluar el efecto inhibitorio in vivo de los extractos vegetales se
efectuarán experimentos sucesivos en acuarios (debido al espacio
limitado en el Laboratorio de Acuicultura II para instalar una cantidad
muy alta de acuarios en simultáneo) utilizando juveniles de L.
vannamei, los cuales serán infectados con cepas de Vibrio spp.
Resistentes y sensibles a antibióticos y se les administrará alimento
balanceado impregnado con los extractos vegetales. Para ello, se
seleccionará para cada planta la concentración que mayor efecto
inhibitorio haya mostrado en el ensayo in vitro, para ser utilizadas en
el ensayo in vivo; las que serán utilizadas contra las dos cepas de
Vibrio spp. a las que se hace mención en el ítem anterior (7.9).
Los juveniles de langostinos del experimento serán infectados con las
cepas de Vibrio spp. señaladas mediante su inmersión por 10
minutos en agua conteniendo 106 UFC/ml, luego de lo cual serán
distribuidos en acuarios de 70 l en cantidad de 8 langostinos/acuario.
Para la preparación del alimento suplementado con los extractos
vegetales se seguirá la metodología empleada por Chaweepack et al.
(2015), con modificaciones, consistente en preparar soluciones
etanólicas de los extractos vegetales en concentraciones de 2,5; 5 y
10 g del extracto/kg de alimento, estos se aplicarán a los pellets de
alimento comercial mezclándolos hasta empaparlos, luego se les
dejará secar a temperatura ambiente por alrededor de 30 min. A
continuación el pellet será recubierto con aceite de pescado en dosis
de 10 g/kg para evitar el lixiviado de los extractos y camuflar el olor de
los extractos.
Al día siguiente de la infección de los langostinos con Vibrio spp. se
iniciará la alimentación con el alimento al cual se aplicó extractos
vegetales respectivamente, el tratamiento se extenderá por 7 días,
luego de lo cual se registrará la supervivencia, peso y recuento de
Vibrio spp. de los langostinos en experimentación. En el experimento
se tendrá como control negativo, tres acuarios en los cuales los

18
langostinos infectados recibirán solo alimento balanceado sin ningún
tipo de medicación.

7.11 Plan de procesamiento y análisis de datos.

Los resultados de los análisis anteriores serán organizados en tablas
y figuras para una mejor comprensión. Se elaborarán tablas en las
que se muestren la cantidad y porcentaje de cepas de Vibrio spp. que
mostraron resistencia a antibióticos.
Para el ensayo de inhibición in vitro se realizarán varios experimentos
bajo el diseño completamente al azar (DCA), en el caso de los
extractos vegetales se ensayarán por cada extracto cinco diluciones
(100 a 10-4) las cuales serán ensayadas contra seis cepas de Vibrio
spp. (Tres sensibles a antibióticos y tres resistentes a los mismos)
más abundantes en el intestino de langostinos enfermos.
La evaluación estadística se realizará usando análisis de varianza y
prueba de Duncan y Tuckey con α = 5 %.

19
 8. cronograma

Actividades Mese
s
1 2 3 4 5
Obtención de langostinos X X X
Aislamiento y cultivo de Vibrio spp. XXXX XX
Caracterización de las cepas de Vibrio XXX
spp.
Obtención de extractos de mangle negro XXX
Ensayo de inhibición in vitro X X
Ensayo de inhibición in vivo XXX
Redacción del informe final de XXXX XXXX
investigación

20
 9. Presupuesto
SUB-
CADENA P.U.PARCIAL TOTAL TOTAL
GASTO DESCRIPCION CANT UNIDAD (S/) (S/) (S/) (S/)
2 GASTOS PRESUPUESTARIOS           3,616.60
2.3 BIENES Y SERVICIOS           3,616.60
2.3.1 COMPRA DE BIENES           3,606.60
2.3.1 1 ALIMENTOS Y BEBIDAS           35.00
2.3.1.1.1 ALIMENTOS Y BEBIDAS         35.00  
2.3.1.1.1.2 ALIMENTOS Y BEBIDAS PARA CONSUMO ANIMAL       35.00    
  Aceite de pescado (frasco x 100 ml) 1 frasco 30.00 30.00    
Alimento balanceado para langostino de 40 % de
  proteína 1 kg 5.00 5.00    
2.3.1.5 MATERIALES Y UTILES           92.00
2.3.1.5.1 DE OFICINA         80.00  
2.3.1.5.1.1 REPUESTOS Y ACCESORIOS       45.00  
  Frasco de tinta canon original código GI-190<BK> 1 Frasco 45.00 45.00    
PAPELERIA EN GENERAL, UTILES Y MATERIALES
2.3.1.5.1.2
DE OFICINA       35.00    
  Cinta de maskingtape (fina) 4 unidad 4.00 16.00    
  Marcador de tinta indeleble faber (caja x 12 unid) 4 unidad 2.00 8.00    
  Papel bond A4 (75 gramos) 0.5 millar 22.00 11.00    
2.3.1.5.3 ASEO, LIMPIEZA Y COCINA         12.00  
2.3.1.5.3.1 ASEO, LIMPIEZA Y TOCADOR       12.00    
  Papel toalla 3 rollo 4.00 12.00    
2.3.1.8 SUMINISTROS MEDICOS           3415.60
MATERIAL, INSUMOS, INSTRUMENTAL Y
2.3.1.8.2 ACCESORIOS MEDICOS, QUIRURGICOS,
ODONTOLOGICOS Y DE LABORATORIO         3415.60  
MATERIAL, INSUMOS, INSTRUMENTAL Y
2.3.1.8.2.1 ACCESORIOS MEDICOS, QUIRURGICOS,
ODONTOLOGICOS Y DE LABORATORIO       3415.60    
  Agar Muller Hinton (Frasco x 500 g) 1 frasco 260.00 260.00    
  Agar TCBS (frasco x 500 g) 1 frasco 320.00 320.00    
  Agar TSA (frasco x 500 g) 1 frasco 250.00 250.00    
  Agua destilada 4 galón 25.00 100.00    
  Alcohol al 96% 2 litros 4.00 8.00    
  Caldo TSB (Frasco x 500 g) 1 frasco 250.00 250.00    
  Cloruro de sodio grado químico (frasco x 500 g) 1 frasco 100.00 100.00    
  Cubreobjetos (caja x 100 unidades) 1 caja 20.00 20.00    
  Glicerol (frasco x 250 ml) 1 frasco 80.00 80.00    
  Grilla portatubos (para tubos 1,5 ml)(80 pozos/rack) 2 pack 15.00 30.00    
  Guantes de nitrilo (Talla M) (Caja X 100 Unid) 1 caja 50.00 50.00    
  Guantes de nitrilo (Talla S) (Caja X 100 Unid) 1 caja 50.00 50.00    
  Hojas de bisturí (caja x 50 unid) 1 caja 10.00 10.00    
  Jeringa de 1 ml 30 unidad 0.20 6.00    
  Hipoclorito de sodio al 5% 1 galón 14.00 14.00    
Microtubos de centrífuga de 0.2 ml (tubos eppendorf)
  (bolsa x 500 unid) 2 bolsa 60.00 120.00    
Microtubos de centrífuga de 1.5 ml (tubos eppendorf)
  (bolsa x 500 unid) 2 bolsa 60.00 120.00    
  Papel filtro whatman N° 1 (pliego) 4 pliego 100.00 400.00    
  Papel aluminio 6 rollo 15.00 90.00    
  Papel kraft 20 pliego 1.00 20.00    
  Papel parafilm 3 caja 40.00 120.00    
  Placas petri de vidrio de 10 cm de diámetro 80 unidad 4.72 377.60    
  Portaobjetos (caja x 50 unidades) 1 caja 15.00 15.00    
Puntas con filtro para micropipeta de 1000 µl (caja x 96
  unid) 5 Cajas 40.00 200.00    
Puntas con filtro para micropipeta de 200 µl (caja x 96
  unid) 5 Cajas 30.00 150.00    
  Sensidiscos Acido Nalidixico (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Ampicilina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Cloranfenicol (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    

21
  Sensidiscos De Enrofloxacina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Florfenicol (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Fosfomicina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Gentamicina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Norfloxacina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Oxitetraciclina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Sensidiscos De Tetraciclina (Cartucho X 50 Discos ) 1 cartucho 15.00 15.00    
  Tubo falcon de 15 ml (bolsa x 50 unidades) 1 bolsa 55.00 55.00    
  Tubo falcon de 50 ml (bolsa x 25 unidades) 1 bolsa 50.00 50.00    
2.3.1 99 COMPRA DE OTROS BIENES           64.00
2.3.1 99.1 COMPRA DE OTROS BIENES         64.00  
2.3.1 99.1.99 OTROS BIENES       64.00    
  Manguera siliconada para aireador 20 metro 2.00 40.00    
  Piedra difusora cilíndrica de 1 pulgada de altura 12 unidad 2.00 24.00    
2.3.2. CONTRATACIÓN DE SERVICIOS           10.00
SERVICIOS BÁSICOS, COMUNICACIONES,
2.3.2.2 PUBLICIDAD Y DIFUSIÓN           10.00
SERVICIOS DE PUBLICIDAD, IMPRESIONES,
2.3.2.2.4 DIFUSIÓN E IMAGEN INSTITUCIONAL       10.00  
2.3.2.2.4.2 OTROS SERVICIOS DE PUBLICIDAD Y DIFUSION       10.00    
  Fotocopias 200 páginas 0.05 10.00    

22
 10. Referencias bibliográficas

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2570REPLACEM00NAME0Reantaso0Melba.pdf

26
 11. anexos

Anexo 1. Formato de recolección de datos de los langostinos

muestreados

FORMULARIO 1
RECOLECCIÓN DE DATOS DE EJEMPLARES MUESTREADOS

N° Registro:
Nombre del responsable:
___________________________________________
Lugar de recolección: _____________________________________________
Fecha: ___/____/_____ Hora: _________

ESPECIE:
1) Litopenaeus vannamei 2) Litopenaeus stylirostris
3) Litopenaeus occidentalis 4) Farfantepenaeus
californiensis
5) Farfantepenaeus 6) No se puede determinar
brevirrostris

SEXO: Macho Hembra Indeterminado

MEDIDAS:
LT (cm): _____________ Peso (g): _____________

OBSERVACIONES EXTERNAS:

1) Color del animal:__________________________

2) Expansión de cromatóforos: Si ( ) No ( )
3) Deformidades en rostro, abdomen o apéndices: Si ( ) No ( )
Indique: _____________________________________________________
4) Flexión del músculo abdominal (calambre) : Si ( ) No ( )
5) Color de las branquias: blancas ( ) marrón ( ) negras( )
Amarillas ( )
Otro ( ) Indique: _____________________________________________
6) Color de los apéndices (pereiópodos, pleópodos y urópodos):
Normal ( ) Rojo ( ) Negro ( )
Otro ( ) Indique:____________________________
7) Color de las antenas : normal ( ) rojo ( )
Otro ( ) Indique: ____________________________________________
8) Transparencia de los músculos del abdomen y del cefalotórax:

27
 Transparente ( ) Blanquecino ( )
Otro ( ) Indique: _________________________
9) Repleción intestinal (porcentaje del intestino que se encuentra lleno):
___________________
10) Textura del exoesqueleto: duro ( ) blando( )
11) Manchas, lesiones, melanosis, astillas clavadas:
Indique:
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
___________________________________________________________

UBICACIÓN DE LESIONES/MELANIZACIÓN
En la figura, señalar las zonas de manchas (M), lesiones (L), melanosis (Me),
astillas clavadas (A).

OBSERVACIONES ADICIONALES:
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

28