Documento Completo Versión PDF - pdf-PDFA

Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Veterinarias
Tesis de Doctorado
“Farmacocinética y Farmacodinamia intracelular de

antimicrobianos utilizados en la terapia de la mastitis
subclínica bovina producida por Staphylococcus aureus”
Luis Alejandro Moncada Cárdenas
2017
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
Trabajo de Tesis realizado como requisito para optar al título de

DOCTOR EN CIENCIAS VETERINARIAS
“Farmacocinética y Farmacodinamia intracelular de antimicrobianos

utilizados en la terapia de la mastitis subclínica bovina producida
por Staphylococcus aureus”
Autor: M.V. MONCADA CÁRDENAS, Luis Alejandro
Director: Doctora Nora Mestorino
Lugar de trabajo: Cátedra de Farmacología, Farmacotecnia y

Terapéutica .Facultad de Ciencias Veterinarias.
Universidad Nacional de La Plata
Miembros del Jurado:

Doctor. Alejandro Luis Soraci
Doctor. Luis Calvinho
Doctora. Magdalena Rambaud
ii
TÍTULOS Y RESÚMENES
Título: Farmacocinética y Farmacodinamia intracelular de antimicrobianos utilizados en la

terapia de la mastitis subclínica bovina por Staphylococcus aureus
Palabras claves: Mastitis subclínica, Staphylococcus aureus, Intracelular, Farmacocinética,

Farmacodinamia, Antibacterianos.
iii
RESUMEN
El presente trabajo de tesis doctoral, tuvo como objetivo realizar un aporte al

conocimiento de la farmacocinética (PK) intracelular (IC) de azitromicina, danofloxacina y
penicilina G, así como, establecer la relación entre ésta y la interacción farmacodinámica
(PD) frente a cepas de Staphylococcus aureus aisladas de vacas portadoras de mastitis
subclínica. Se aislaron un total de 220 cepas, de las que se seleccionaron 10 cepas que
cumplían con las características morfológicas y bioquímicas propias de S. aureus y que
fueron además, sensibles a todos los grupos de antibacterianos ensayados. Las 10 cepas
seleccionadas fueron sometidas a pruebas de sensibilidad para determinar la CIM de cada
uno de los antibacterianos (ATB) a pH fisiológico de 7.4, así como suponer condiciones de pH
intracitoplasmático y fagolisosomal, estas pruebas se repitieron a pH 5.0 y 6.5. De igual
forma, en las mismas tres condiciones de pH, se realizaron estudios encaminados a
determinar la cinética de muerte bacteriana por medio de curvas de letalidad y la
determinación del efecto post antibiótico (PAE) de cada uno de los antibacterianos.
Posteriormente, en leucocitos polimorfonucleares (PMN) extraídos de sangre y leche bovina,
se realizaron pruebas de infección controlada con S. aureus, con la finalidad de medir el
efecto que surten los ATB a nivel IC. Así como determinar la velocidad de penetración del
ATB al interior celular, la cantidad de ATB que penetra al interior celular y su eflujo. Esto
permitió realizar una integración de los parámetros PK – PD a nivel IC. La cuantificación de
los analitos se llevó a cabo mediante métodos microbiológicos y por cromatografía líquida
de alta eficacia (HPLC). Nuestros estudios nos permitieron cuantificar la cantidad de ATB que
penetra al interior celular y observar el efecto que tienen a ese nivel sobre las cepas de S.
aureus fagocitadas. Se determinó que las cepas de S. aureus intracelulares tratadas con dosis
terapéuticas de los 3 antibacterianos, por espacio de 5 horas, sufrieron una reducción de
entre 1.8 a 2 Log 10. Este estudio permite concluir entonces que azitromicina, danofloxacina y
penicilna G, presentan penetracion intracelular, y su eficacia difiere en las concentraciones
que estos alcanzan a nivel IC y el tiempo de permanencia dentro de la celula.
iv
ABSTRACT
The present doctoral thesis aimed at contributing to the knowledge of the

pharmacokinetics (PK) intracellular (IC) of azithromycin, danofloxacin and penicillin G, and
establish the relationship of the pharmacodynamic interaction (PD) versus Staphylococcus
aureus strains isolated from infected cows with subclinical mastitis. A total of 220 strains
were isolated. Ten strains that met morphological and biochemical characteristics typical of
S. aureus and were sensitive to all antibacterial groups were selected. The ten selected
strains were tested for sensitivity to determine the CIM for each of the three antibiotics
(ATB) at a physiological pH of 7.4, and assuming both intracytoplasmic and phagolysosomal
pH conditions, these experiments were repeated at pH 6.5 and 5.0 Likewise, at the same
three pH conditions, studies to determine death kinetics of bacteria by killing curves and
recognition of post antibiotic effect (PAE) of each of the antibiotics were performed.
Subsequently, testing with controlled infection of S. aureus in order to measure the effect
that supply the ATB at IC level were performed in polymorphonuclear leukocyte (PMN)
extracted from blood and bovine milk, including determining the rate of penetration of the
ATB into the cell, the amount of ATB that penetrates the cell interior and its efflux. This
allows integration of PK - PD parameters at IC level. In all cases, quantitation of the analytes
was performed by microbiological and high-performance liquid chromatography (HPLC)
methods. Our studies allow us to quantify the amount of ATB that penetrates the cell
interior and observe the effect at that level on strains of S. aureus phagocytosed. It was
determined that the intracellular S. aureus strains treated with a therapeutic doses of 3
antibacterial, for 5 hours were reduced by between 1.8 to 2 Log 10 .
This study allows to conclude that azithromycin, danofloxacin and penicilna G, they
have intracellular penetration, and their effectiveness differs in that these concentrations
reach IC level and residence time within the cell.
v
DEDICATORIA
PARA:
JUSTO PASTOR Y CARMEN ELISA
Dioses vivos, por enseñarme a vivir, a pensar, a soñar y sobre todo por tolerar toda mi impaciencia y
desacato.
LUZ AMPARO, CARLOS ALBERTO, LILIA BIBIANA, DANIELITO
Compañeros de viaje, por permitirme ser parte de su hermoso árbol de vida y estar siempre en esos
precisos momentos.
JUAN FELIPE
Por todos los días, los meses y los años que me perdí de tu entrañable compañía.
SANTI
Porque… ya sabes, todo es posible!
A LA RAYUELA DE LA VIDA MISMA.
vi
AGRADECIMIENTOS
A la Dra NORA MESTORINO. Directora de esta tesis, infatigable investigadora y generoso ser
humano, porque sin su confianza, apoyo, colaboración, circunspección, y sobre todo, amor
por su trabajo, este proyecto no hubiera sido posible.
A la Universidad Nacional de La Plata por darme la posibilidad de realizar mi Tesis Doctoral, a

la Facultad de Ciencias Veterinarias, y especialmente a la cátedra de farmacología,
farmacotecnia y terapéutica, lugar donde llevé adelante este proyecto.
Al Dr Jorge Errecalde por recibirme en su grupo de trabajo y permitirme trabajar a su lado

con humor y gentileza.
A Martin Daniele. Gran amigo, compañero de viajes y tertulias, transcendental ayuda en

muchos de los ensayos de esta tesis y gran apoyo en los momentos difíciles.
A la Dra Laura Marchetti. Admirable compañera, ecuánime profesional y generoso ser

humano a quien debo gran parte de este trabajo.
A Martin Dadé. Por su gran ayuda en la facultad de medicina, pero sobretodo por brindarme
su hogar y entretenidas noches de lectura.
A todos mis compañeros de trabajo de la Cátedra de farmacología, farmacotecnia y

terapéutica, a los que están y los que estuvieron, que aportaron su tiempo y trabajo, para
que este proyecto se hiciera realidad. Especialmente a Martín Quintero, Bárbara Huber,
Mariana Lucas, Andrea Lambertini, Carlos valle y Naty Gonzales.
A la Cátedra de Farmacología Básica de la facultad de medicina de la UNLP, donde me

abrieron las puertas y estuvieron dispuestos a ayudarme siempre, especialmente al Dr
Guillermo Schinella.
A Edwin Salgado, Walter Ledezma y Martita! Mis grandes amigos en la ciudad de la plata.
Por ultimo y en especial a mis padres y mis hermanos por su apoyo y paciencia.
A TODOS MIL Y UN MILLON DE GRACIAS!!!
vii
INDICE
TÍTULOS Y RESÚMENES ..................................................................................................... iii

RESUMEN. ..................................................................................................................... iv
AGRADECIMIENTOS. ........................................................................................................ vii
INDICE ............................................................................................................................ viii
INDICE DE FIGURAS. .......................................................................................................... xi
INDICE DE TABLAS............................................................................................................ xx
ABREVIATURAS Y SIMBOLOS. ......................................................................................... xxv
1. INTRODUCCION ........................................................................................................ 28
1.1. MASTITIS BOVINA .......................................................................................................28
1.1.1. Generalidades .........................................................................................................28
1.1.2. Impacto de la mastitis en la República Argentina ........................................................................... 33
1.1.3. Género Staphylococcus ................................................................................................................. 39
1.1.4. Identificación de la problemática................................................................................................. 49
1.2. USO DE ANTIMICROBIANOS EN LA MASTITIS BOVINA ..................................................55
1.2.1. Tratamiento parenteral ................................................................................................................ 58
1.2.2. Tratamiento intramamario........................................................................................................... 63
1.3. PENETRACIÓN INTRACELULAR DE LOS ANTIMICROBIANOS ...........................................67
1.3.1. Parámetros físicoquímicos que controlan la penetración intracelular de antibióticos ............. 67
1.3.2. Mecanismos de penetración intracelular de los antibióticos.......................................................... 70
1.3.3. Penetración de los diferentes grupos antibióticos en el interior de los PMN ................................ 72
1.4. BASES FARMACOLÓGICAS PARA HACER FRENTE A LA PROBLEMÁTICA .......................... 74
1.4.1. Parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos ...................................................................... 76
2. HIPÓTESIS .................................................................................................................... 84
2.1. Premisas ..........................................................................................................................84
2.2. Formulación de hipótesis ..................................................................................................85
3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 86
3.1. Objetivos generales .........................................................................................................86
3.2. Objetivos específicos ...................................................................................................86
4. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 88
4.1 MATERIALES ......................................................................................................................88
4.1.1 Productos biológicos y materiales para microbiología ..................................................................... 88
4.1.2 Reactivos, solventes y diluyentes ...................................................................................................... 88
4.1.3 Material descartable y de laboratorio .............................................................................................. 89
4.1.4 Instrumental....................................................................................................................................... 91
4.1.5 Equipamiento Informático................................................................................................................. 92
4.2. MÉTODOS........................................................................................................................92
4.2.1 Selección de cepas y pruebas bioquímicas........................................................................................ 92
viii
4.2.1.1. Tinción de Gram ............................................................................................................................. 93
4.2.1.2. Prueba de catalasa ......................................................................................................................... 95
4.2.1.3. Prueba de coagulasa ...................................................................................................................... 96
4.2.2. Estudio de susceptibilidad por antibiograma .................................................................................. 97
4.2.2.9. Selección de los antimicrobianos a evaluar ................................................................................ 103
4.2.3. Determinación de la Concentración mínima inhibitoria (CIM) ..................................................... 104
4.2.4. Determinación de la Concentración Bactericida Mínima (CBM) ................................................... 111
4.2.5. Curvas de letalidad bacteriana (CLB).............................................................................................. 112
4.2.6. Determinación del Efecto Posantibiótico (PAE) ............................................................................. 122
4.2.7. Captación y actividad intracelular de los antimicrobianos seleccionados. ................................... 134
4.2.8. Cinética intracelular .................................................................................................................... 146
4.2.9. Diseño y corroboración a campo de un régimen de dosificación racional ............................... 147
4. RESULTADOS .......................................................................................................... 148

5.1. SELECCIÓN DE LOS AISLAMIENTOS DE Staphylococcus aureus .......................................... 148
5.2. PRUEBA CUANTITATIVA PARA EVALUAR LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA ............... 152
5.3. CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA ................................................................... 157
5.4. CURVAS DE LETALIDAD O MUERTE BACTERIANA ........................................................ 161
5.4.1. AZITROMICINA ................................................................................................................................ 162
5.4.2. DANOFLOXACINA ............................................................................................................................ 204
5.4.3. PENICILINA G ................................................................................................................................... 247
5.5. ÍNDICE DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA................................................................................... 292
5.6 EFECTO POSTANTIBIOTICO .............................................................................................. 309
5.6.1. EFECTO POSTANTIBIOTICO IN-VITRO. ............................................................................................ 310
5.6.1. EFECTO POSTANTIBIOTICO IN-VIVO ........................................................................................... 319
5.7. CAPTACION Y ACTIVIDAD INTRACELULAR DE LOS ANTIBACTERIANOS ........................ 328
5.8. CINETICA INTRACELULAR DE LOS ANTIBACTERIANOS Y ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA. 338
5.8.1. AZITROMICINA ............................................................................................................................ 338
5.8.2. DANOFLOXACINA........................................................................................................................ 340
5.8.3. PENICILINA G ............................................................................................................................... 342
6. DISCUSION ............................................................................................................. 346

6.1. ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD POR ANTIBIOGRAMA.................................................. 346
6.2. SELECCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS. DETERMINACION DE LAS CONCENTRACIONES
MINIMAS INHIBITORIAS ........................................................................................................ 354
6.2.1 Azitromicina .................................................................................................................................... 354
6.2.2. Danofloxacina ................................................................................................................................. 358
6.2.3. Penicilina G...................................................................................................................................... 363
6.3 CURVAS DE LETALIDAD BACTERIANA................................................................................ 367
6.3.1. Azitromicina .................................................................................................................................... 368
6.3.2. Danofloxacina. ................................................................................................................................ 370
6.3.3. Penicilina G...................................................................................................................................... 373
6.3.4. ÍNDICE DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA ....................................................................................... 375
6.4. EFECTO POSTANTIBIOTICO (PAE) ..................................................................................... 380
6.4.1. EVALUACION DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES ...................................................................... 380
6.4.2. EVALUACION DE RESULTADOS DE PAE “IN VITRO” ....................................................................... 383
6.4.3. EVALUACION DE RESULTADOS DE PAE “In Vivo” .......................................................................... 385
6.5 CAPTACION Y ACTIVIDAD DEL ANTIBACTERIANO A NIVEL INTRACELULAR ......................... 388
ix
6.5.1. Técnicas para determinar la penetración de los antibióticos en el interior celular ..................... 389
6.5.1.1 AZITROMICINA ............................................................................................................................. 390
6.5.1.2. DANOFLOXACINA ........................................................................................................................ 391
6.5.1.3. PENICILINA G ................................................................................................................................ 392
6.6. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ANTIMICROBIANOS A NIVEL INTRACELULAR .......... 393
6.7. CINETICA INTRACELULAR DE LOS ANTIBACTERIANOS Y ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA . 398
6.7.1. AZITROMICINA ............................................................................................................................ 398
6.7.2. DANOFLOXACINA........................................................................................................................ 400
6.7.3. PENICILINA G ............................................................................................................................... 402
7. CONCLUSIONES. ..................................................................................................... 405

8. BIBLIOGRAFIA. ....................................................................................................... 408
x
INDICE DE FIGURAS.
Figura 1. Interacción de los factores que participan en la transmisión de la mastitis: vaca, medio
ambiente y microorganismos.
Figura 2. Morfología y tinción de Gram del género Staphylococcus.
Figura 3. Cultivo de Staphylococcus spp.
Figura 4. Principales factores de virulencia de S. aureus.
Figura 5. Desarrollo de la mastitis y de la defensa de la vaca contra la infección. El S. aureus.
Figura 6. Localización intracelular de algunos microorganismos.
Figura 7: Triángulo de Davis: Interacción huésped-microorganismo-antimicrobiano. Adaptado de Van
Bambeke F, 1999.
Figura 8: Factores determinantes de la actividad antimicrobiana. Adaptado de Van Bambeke F, 1999.
Figura 9: Parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos que gobiernan la eficacia antimicrobiana:
C máx /CIM, ABC/CIM y T>CIM.
Figura 10. Diferencias estructurales entre bacterias Gram+ y Gram–.
Figura 11. Antibiograma correspondiente a un aislamiento de S. aureus causante de mastitis
Figura 12. Preparación de diluciones seriadas de los antimicrobianos para la determinación de la CIM
por el método de macrodilución en caldo.
Figura 13. Lectura y determinación de la CIM.
Figura 14. Colonias de S. aureus en agar sangre.
Figura 15. Presencia de halos de hemolisis alrededor de las colonias de S. aureus en agar sangre.
Figura 16. Apariencia de S. aureus a la prueba de Gram.
Figura 17. Comparativo entre una prueba positiva y una negativa a la prueba de catalasa, la emisión
de burbujas (Imagen inferior) indica positividad en la prueba.
Figura 18. Prueba de coagulasa en tubo.
Figura 19. Resultado de la prueba de determinación de la CIM por el método de macrodilución
Figura 20. CIM de azitromicina frente a S. aureus a diferentes pHs.
Figura 21. CIM de danofloxacina frente a S. aureus a diferentes pHs.
Figura 22. CIM de penicilina G frente a S. aureus a diferentes pH.
Figura 23. Curvas de muerte bacteriana promedio para las cepas de Staphylococcus aureus (n=6)
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH a pH 7.4.
Figura 24. Curvas de muerte bacteriana para Staphylococcus aureus ATCC 29213 frente a
azitromicina en CMH a pH 7.4.
Figura 25. Modelado de Gompertz realizado a los aislamientos salvajes, A: curva de crecimiento
control (sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.125 CIM de azitromicina (0.25 µg/mL), C:
curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL), D: curva de crecimiento frente a
0.5 CIM (1 µg/mL).
xi
Figura 26. Modelado de Gompertz realizado al S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento control
(sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.125 CIM de azitromicina (0.25 µg/mL), C: curva
de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL), D: curva de crecimiento frente a 0.5
CIM (1 µg/mL).
Figura 27. Modelado Sigmoideo realizado a las curvas de muerte bacteriana de los aislamientos de S.
aureus salvajes, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (2 µg/mL), B: 2x CIM de azitromicina (4
µg/mL), C: 4x CIM de azitromicina (8 µg/mL), D: 8x CIM de azitromicina (16 µg/mL).
Figura 28. Modelado Sigmoideo realizado a las curvas de muerte bacteriana de S. aureus ATCC
29213, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (2 µg/mL), B: 2x CIM de azitromicina (4 µg/mL),
C: 4x CIM de azitromicina (8 µg/mL), D: 8x CIM de azitromicina (16 µg/mL).
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH a pH 6.5.
Azitromicina en CMH a pH 6.5.
control (sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (2 µg/mL), C:
curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (4 µg/mL).
Figura 32. Modelado de Gompertz realizado a Staphylococcus aureus ATCC 29213, A: curva de
crecimiento control (sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (2
µg/mL), C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (4 µg/mL).
aureus salvajes, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (8 µg/mL), B: 2xCIM de azitromicina (16
µg/mL), C: 4xCIM de azitromicina (32 µg/mL), D: 8xCIM de azitromicina (64 µg/mL).
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH a pH 5.
Azitromicina en CMH a pH 5.
control (sin azitromicina) a pH 5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (16
µg/mL) a pH 5, C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (32 µg/mL) a pH 5.
crecimiento control (sin azitromicina) a pH 5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
azitromicina (16 µg/mL) a pH 5, C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (32 µg/mL)
a pH 5.
aureus salvajes a pH 5. A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (64 µg/mL), B: 2x CIM de
azitromicina (128 µg/mL), C: 4x CIM de azitromicina (256 µg/mL).
Figura 40. Modelado Sigmoideo realizado a las curvas de muerte bacteriana de S. aureus ATCC 29213
a pH 5, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (64 µg/mL), B: 2x CIM de azitromicina (128
µg/mL), C: 4x CIM de azitromicina (256 µg/mL).
xii
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH suplementado
con leche bovina.
Azitromicina en CMH suplementado con leche bovina.
Figura 43. Modelado de Gompertz realizado a los aislamientos salvajes de S. aureus, A: curva de
crecimiento control (sin azitromicina) en CMH suplementado con leche, B: curva de crecimiento
frente a 0.125 CIM de azitromicina (1 µg/mL) en CMH suplementado con leche.
crecimiento control (sin azitromicina) en CMH suplementado con leche bovina, B: curva de
crecimiento frente a 0.125 CIM de azitromicina (1 µg/mL) en el mismo medio de cultivo que la curva
control.
aureus salvajes en CMH suplementado con leche bovina. A: S. aureus frente a 0.25xCIM de
azitromicina (2 µg/mL), B: 0.5xCIM de azitromicina (4 µg/mL), C: 1xCIM de azitromicina (8 µg/mL), D:
2xCIM de azitromicina (16 µg/mL), E: 4xCIM de azitromicina (32 µg/mL) y F: 8xCIM de azitromicina
(64 µg/mL).
29213, en CMH suplementado con leche bovina. A: S. aureus frente a 0.25xCIM de azitromicina (2
µg/mL), B: 0.5xCIM de azitromicina (4 µg/mL), C: 1xCIM de azitromicina (8 µg/mL), D: 2xCIM de
azitromicina (16 µg/mL), E: 4xCIM de azitromicina (32 µg/mL) y F: 8xCIM de azitromicina (64 µg/mL).
con 40% de suero bovino.
Azitromicina en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
crecimiento control (sin azitromicina) en CMH suplementado con suero bovino, B: curva de
crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL) en CMH suplementado con suero bovino.
crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL) en el mismo medio de cultivo que la curva
control.
aureus salvajes en CMH suplementado con suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de
azitromicina (1 µg/mL), B: 1xCIM de azitromicina (2 µg/mL), C: 2xCIM de azitromicina (4 µg/mL), D:
(32 µg/mL).
Figura 52. Modelado Sigmoideo realizado a las curvas de muerte bacteriana del S. aureus ATCC
29213 en CMH suplementado con suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de azitromicina (1
µg/mL), B: 1xCIM de azitromicina (2 µg/mL), C: 2xCIM de azitromicina (4 µg/mL), D: 4xCIM de
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Danofloxacina en CMH pH 7.4.
xiii
Danofloxacina en CMH pH 7.4.
crecimiento control (sin danofloxacina) en CMH pH 7.4, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH pH 7.4.
danofloxacina (0.25 µg/mL) en el mismo medio de cultivo que la curva control.
aureus salvajes en CMH pH 7.4. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM
de danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (4
µg/mL), E: 8xCIM de danofloxacina (8 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (16 µg/mL).
29213 en CMH pH 7.4. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de
danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (4 µg/mL),
E: 8xCIM de danofloxacina (8 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (16 µg/mL).
Figura 60. Curvas de crecimiento y de muerte bacteriana para Staphylococcus aureus ATCC 29213
frente a Danofloxacina en CMH pH 6.5.
danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH pH 6.5, C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de
aureus salvajes en CMH pH 6.5. A: S. aureus frente a 1xCIM de danofloxacina (1 µg/mL), B: 2xCIM de
danofloxacina (2 µg/mL), C: 4xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), D: 8xCIM de danofloxacina (8 µg/mL)
Y E: 16xCIM de danofloxacina (16 µg/mL).
Figura 65. Curvas de crecimiento y de muerte bacteriana promedios para las cepas de
Staphylococcus aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a
Danofloxacina en CMH pH 5.
frente a Danofloxacina en CMH pH 5.
crecimiento control (sin danofloxacina) en CMH pH 5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
danofloxacina (0.5 µg/mL) en CMH pH 5, C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de danofloxacina
(1 µg/mL) y D: curva de crecimiento frente a 1 CIM de danofloxacina (2 µg/mL) en CMH pH 5.
xiv
aureus salvajes en CMH pH 5. A: S. aureus frente a 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), B: 4xCIM de
danofloxacina (8 µg/mL), C: 8xCIM de danofloxacina (16 µg/mL) y D: 16xCIM de danofloxacina (32
µg/mL).
29213 en CMH pH 6.5. A: S. aureus frente a 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), B: 4xCIM de
µg/mL).
Figura 71. Curvas de crecimiento y de muerte bacteriana promedios para las cepas de Staphylococcus
aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Danofloxacina en leche.
frente a Danofloxacina en leche.
crecimiento control (sin danofloxacina) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
danofloxacina (0.25 µg/mL) en leche.
(sin danofloxacina) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de danofloxacina (0.25
µg/mL) en leche.
aureus salvajes en leche. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de
en leche. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de danofloxacina (1
µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), E: 8xCIM de
danofloxacina (4 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (8 µg/mL).
aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Danofloxacina en CMH
suplementado con 40% de suero bovino.
Figura 78. Curvas de crecimiento y de muerte bacteriana promedios para el Staphylococcus aureus
ATCC 29213 frente a Danofloxacina en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
crecimiento control (sin danofloxacina) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a
0.25 CIM de danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH-40% suero bovino.
Figura 80. Modelado de Gompertz realizado a S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento control
(sin danofloxacina) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH-40% suero bovino.
aureus salvajes en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de
danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (4
xv
µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), E: 8xCIM de danofloxacina (4 µg/mL) y F: 16xCIM de
danofloxacina (8 µg/mL).
en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5
µg/mL), B: 1xCIM de danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), D: 4xCIM de
danofloxacina (2 µg/mL), E: 8xCIM de danofloxacina (4 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (8
µg/mL).
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Penicilina G en CMH pH 7.4.
Figura 84. Curvas de muerte bacteriana para Staphylococcus aureus ATCC 29213 frente a Penicilina G
en CMH pH 7.4.
crecimiento control (sin penicilina G) en CMH pH 7.4, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
PenG (0.066 µg/mL); C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL).
PenG (0.066 µg/mL); C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL) en el mismo
medio de cultivo que la curva control.
aureus salvajes en CMH pH 7.4. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG
(0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL), E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL)
y F: 32xCIM de PenG (8 µg/mL).
29213 en CMH pH 7.4. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5
µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL), E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL) y F:
32xCIM de PenG (8 µg/mL).
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a PenG en CMH pH 6.5.
frente a PenG en CMH pH 6.5.
crecimiento control (sin PenG) en CMH pH 6.5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG
(0.066 µg/mL) en CMH pH 6.5, C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL) en
CMH pH 6.5.
(0.066 µg/mL) y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL) en el mismo medio
de cultivo que la curva control.
(0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y E: 16xCIM de PenG (4
µg/mL).
xvi
µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL).
aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a PenicilinaG en CMH pH 5.
frente a Penicilina G en CMH pH 5.
Figura 97. Modelado de Gompertz realizado a los aislamientos salvajes de S. aureus: curva de
crecimiento control (sin PenG) en CMH pH 5
Figura 98. Modelado de Gompertz realizado a Staphylococcus aureus ATCC 29213: curva de
crecimiento control (sin PenG) en CMH pH 5.
aureus salvajes en CMH pH 5. A: 0.25xCIM; B: 0.5XCIM; C:1XCIM (0.125 µg/mL); D: 2xCIM; E: 4xCIM;
F: 8XCIM y G: 16xCIM de PenG respectivamente.
Figura 100. Modelado Sigmoideo realizado a las curvas de muerte bacteriana de los aislamientos de
S. aureus ATCC 29213 en CMH pH 5. A: 0.25xCIM; B: 0.5XCIM; C:1XCIM (0.125 µg/mL); D: 2xCIM; E:
4xCIM; F: 8XCIM y G: 16xCIM de PenG respectivamente.
Staphylococcus aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Pencilina
G en leche.
frente a Penicilina G en leche.
crecimiento control (sin PenG) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG (0.066
µg/mL) en leche y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL).
Figura 104. Modelado de Gompertz realizado al S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento
control (sin PenG) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG (0.066 µg/mL) en
leche y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL).
S. aureus salvajes en leche. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5
µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y, E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL).
29213 en leche. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5 µg/mL), C:
4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y, E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL).
Staphylococcus aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a PenG en
CMH suplementado con 40% de suero bovino.
ATCC 29213 frente a PenG en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
crecimiento control (sin PenG) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM
de PenG (0.066 µg/mL) en CMH-40% suero bovino y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de
PenG (0.125 µg/mL) en CMH-40% suero bovino.
xvii
Figura 110. Modelado de Gompertz realizado a S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento
control (sin PenG) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG
(0.066 µg/mL) en CMH-40% suero bovino y C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de PenG (0.125
µg/mL) en CMH-40% suero bovino.
S. aureus salvajes en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 1xCIM de
PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2
µg/mL), E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL) y F: 16xCIM de PenG (8 µg/mL).
29213 en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25
µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL), E:
16xCIM de PenG (4 µg/mL) y F: 16xCIM de PenG (8 µg/mL).
Figura 113: Representación gráfica del efecto antibacteriano de azitromicina frente a cepas de S.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en CMH-pH 7.4.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en CMH-pH 5.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en leche bovina.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en CMH
Figura 118. Representación gráfica del efecto antibacteriano de danofloxacina frente a cepas de S.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en CMH-pH 5.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en leche.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en suero bovino.
Figura 123. Representación gráfica del efecto antibacteriano de penicilina G frente a cepas de S.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en CMH a pH 7.4.
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en leche.
xviii
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al inicio de las curvas de muerte construidas en suero bovino.
Figura 128. Estimación del EPA (horas) como la diferencia de tiempo en el que los inóculos de S.
aureus ATCC 29213 (A) y de aislamientos salvajes (n = 2)(B) expuestos a azitromicina incrementaron
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin azitromicina) en CMH.
Figura 129. Estimación del PAE (horas) como la diferencia de tiempo en el que los inóculos de S.
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin azitromicina) en leche.
aureus ATCC 29213 (A) y de aislamientos salvajes (n = 2)(B) expuestos a danofloxacina incrementaron
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin danofloxacina) en CMH.
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin danofloxacina) en leche.
aureus ATCC 29213 (A) y de aislamientos salvajes (n = 2)(B) expuestos a penicilina G incrementaron el
número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin penicilina G) en CMH.
número de bacterias viables en 1 log10 respecto de controles (sin penicilina G) en leche.
Figura 134. Evolución de las ufc/mL de Staphylococcus aureus en un modelo de infección en muslo
de ratones para evaluar la duración del PAE in vivo.
Figura 135. Rectas de calibración mediante ajuste lineal del área de pico cromatográfico de
estándares de danofloxacina en ácido fosfórico 0.05 M (A), en suero (B) y en músculo (C) en un rango
de concentración 10 a 500 ng/0.2 mL.
Figura 136. Perfil de las concentraciones séricas y tisulares seguido por DAN tras su administración
intramuscular en ratones. Integración con la evolución de las ufc/mL de Staphylococcus aureus ATCC
control y tratadas con DAN obtenidas luego de realizar la infección en los ratones para evaluar el PAE
de la danofloxacina in vivo.
xix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Datos de calidad y precio por litro entregado por la industria

Tabla 2. Especies del género Staphylococcus
Tabla 3. Subespecies del género Staphylococcus
Tabla 4: Partición de los antimicrobianos en plasma y leche en animales en periodo de lactancia.
Adaptado de Ziv G, 1980ª.
Tabla 5: Clasificación de los agentes antimicrobianos desde el punto de vista PK/PD. Adaptado de
Jacobs M, 2004.
Tabla 6: Valores de referencia establecidos por el CLSI (2009) para los diámetros de los halos de
inhibición de la cepa S. aureus ATCC 25923.
Tabla 7: Valores de referencia utilizados para la interpretación de los resultados obtenidos a partir
de los estudios de susceptibilidad por antibiograma frente a S. aureus.
Tabla 8. Solventes y dilyentes empleados para la preparación de las soluciones stock de Azitromicina,
Danofloxacina y Penicilina G.
Tabla 9. Rangos aceptables establecidos por CLSI en 2008 como CIMs de S. aureus ATCC 29213.
Tabla 10. Resultados de la prueba de susceptibilidad por antibiograma efectuado frente a las 68
cepas de S.aureus.
Tabla 11. CIM 50 Y CIM 90 de los diferentes antimicrobianos frente a Staphylococcus aureus a
diferentes pHs.
Tabla 12. CIM de azitromicina (expresada en µg/mL) a pH 7.4, 6.5 y 5.0
Tabla 13. CIM de danofloxacina (expresada en µg/mL) a pH 7.4, 6.5 y 5.0
Tabla 14. CIM de Penicilina G frente a Staphylococcus aureus a pH 7.4, 6.5 y 5.0
Tabla 15. Estadística descriptiva para la concentración inhibitoria mínima (CIM) de azitromicina,
danofloxacina y penicilina G frente a S. aureus a diferentes pHs del medio de cultivo.
Tabla 16. Efecto del pH sobre la CIM y la CMB de Azitromicina frente a Staphylococcus aureus
Tabla 17. Efecto del pH sobre la CIM y la CMB de Danofloxacina frente a Staphylococcus aureus
Tabla 18. Efecto del pH sobre la CIM y la CMB de Penicilina G frente a Staphylococcus aureus
Tabla 19. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de
Staphylococcus aureus en CMH a pH 7.4 frente a concentraciones inferiores a la CIM.
Tabla 20. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus
aureus en CMH a pH 7.4 frente a diferentes concentraciones múltiplos de la CIM de azitromicina.
Staphylococcus aureus en CMH a pH 6.5 frente a concentraciones inferiores a la CIM.
aureus en CMH a pH 6.5 frente a diferentes concentraciones múltiplos de la CIM de azitromicina.
xx
Staphylococcus aureus en CMH a pH 5 frente a concentraciones inferiores a la CIM (64 µg/mL).
aureus en CMH a pH 5 frente a diferentes concentraciones (CIM -64µg/mL-, 2 y 4 veces la CIM) de
azitromicina.
Staphylococcus aureus en CMH suplementado con leche bovina frente a concentraciones inferiores a
la CIM (8 µg/mL).
aureus en CMH suplementado con leche bovina frente a diferentes concentraciones (0.25, 0.5, CIM -
8µg/mL-, 2, 4 y 8 veces la CIM) de azitromicina
Staphylococcus aureus en CMH suplementado con suero bovino frente a concentraciones inferiores a
la CIM (2 µg/mL).
aureus en CMH suplementado con suero bovino frente a diferentes concentraciones (0.5, CIM -2
µg/mL-, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de azitromicina
Staphylococcus aureus, en CMH pH 7.4 sin danofloxacina y frente a concentraciones inferiores a la
CIM (0.25 µg/mL).
aureus en CMH pH 7.4 frente a diferentes concentraciones (0.5, CIM -1 µg/mL-, 2, 4, 8 y 16 veces la
CIM) de danofloxacina
Staphylococcus aureus en CMH pH 6.5 sin danofloxacina y frente a concentraciones inferiores a la
CIM.
aureus en CMH pH 6.5 frente a diferentes concentraciones (0.5, CIM -1 µg/mL, 2, 4, 8 y 16 veces la
CIM) de danofloxacina
Staphylococcus aureus en CMH pH 5 sin danofloxacina y frente a concentraciones inferiores a la CIM.
aureus en CMH pH 5 frente a diferentes concentraciones (2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
Staphylococcus aureus en leche sin danofloxacina y frente a concentraciones inferiores a la CIM.
aureus en leche frente a diferentes concentraciones (0.5, 1, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de
danofloxacina
Staphylococcus aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino sin danofloxacina y frente a
concentraciones inferiores a la CIM.
xxi
aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino frente a diferentes concentraciones (0.5,
CIM, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
Staphylococcus aureus en CMH pH 7.4 sin penicilina G y frente a concentraciones inferiores a la CIM
(0.25 µg/mL).
aureus en CMH pH 7.4 frente a diferentes concentraciones (CIM -0.25 µg/mL-, 2, 4, 8, 16 y 32 veces
la CIM) de pencilina G
Staphylococcus aureus en CMH pH 6.5 sin PenG y frente a concentraciones inferiores a la CIM.
aureus en CMH pH 6.5 frente a diferentes concentraciones (CIM -0.25 µg/mL, 2, 4, 8 y 16 veces la
CIM) de penicilina G.
Staphylococcus aureus en CMH pH 5 sin Penicilina G.
aureus en CMH pH 5 frente a diferentes concentraciones (0.25, 0.5. 1, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de
Penicilina G
Staphylococcus aureus en leche sin PenG y frente a concentraciones inferiores a la CIM.
aureus en leche frente a diferentes concentraciones (1, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de Penicilina G.
Staphylococcus aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino sin PenG y frente a
aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino frente a diferentes concentraciones (0.5, 1,
2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de Penicilina G.
Tabla 49. Resumen de los parámetros cinéticos de crecimiento de Staphylococcus aureus frente a
diferentes pHs, en leche y en presencia de suero bovino frente a diferentes concentraciones sub-CIM
de azitromicina.
de danofloxacina.
de penG.
Tabla 52. Índice de la actividad antibacteriana (E) de azitromicina (concentraciones sub-CIM, CIM y
supra-CIM) frente a S. aureus en CMH-pH 7.4.
xxii
supra-CIM) frente a S. aureus en CMH-pH 5.
supra-CIM) frente a S. aureus en leche bovina empleada como caldo de cultivo.
supra-CIM) frente a S. aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
Tabla 57. Índice de la actividad antibacteriana (E) de danofloxacina (concentraciones sub-CIM, CIM y
supra-CIM) frente a S. aureus en CMH-pH 5.
Tabla 60 Índice de la actividad antibacteriana (E) de danofloxacina (concentraciones sub-CIM, CIM y
supra-CIM) frente a S. aureus en leche.
supra-CIM) frente a S. aureus en suero bovino.
Tabla 62 Índice de la actividad antibacteriana (E) de penicilina G (concentraciones sub-CIM, CIM y
supra-CIM) frente a S. aureus en CMH pH 7.4.
Tabla 65. Índice de la actividad antibacteriana (E) de penicilina G (concentraciones sub-CIM, CIM y
supra-CIM) frente a S. aureus en Leche.
supra-CIM) frente a S. aureus en suero bovino.
Tabla 67. PAE presentado por azitromicina frente a S. aureus cepa ATCC 29213 y cepas aisladas a
campo en CMH-pH 7.4.
Tabla 68. PAE presentado por azitromicina en leche frente a S. aureus ATCC 29213 y cepas aisladas
de vacas portadoras de mastitis subclínica.
Tabla 69. PAE de danofloxacina en CMH frente S. aureus ATCC 29213 y cepas aisladas de animales
portadores de mastitis subclínica
Tabla 70. PAE presentado por danofloxacina en leche frente a S. aureus ATCC 29213 y cepas aisladas
Tabla 73. Determinación del PAE in vivo para danofloxacina mediante un modelo de infección en
muslo de ratón neutropénico (Promedio ± DE).
xxiii
Tabla 74. PAEs de danofloxacina obtenidos in vivo aplicando un modelo de infección por
Staphylococcus aureus en muslo de ratón
Tabla 75. Resultados de la re-validación de danofloxacina en suero y en músculo de ratón
Tabla 76. Concentraciones séricas individuales y promedio ± DE obtenidas tras la administración de
10 mg/kg de DAN por la vía intramuscular
Tabla 77. Concentraciones musculares individuales y promedio ± DE en músculo de ratones tras la
administración de 10 mg/kg de DAN por la vía intramuscular
xxiv
ABREVIATURAS Y SIMBOLOS.
ABCC 0-24 . Área bajo la curva control de crecimiento bacteriano, sin antimicrobiano en
función del tiempo de t 0 a t 24
ABC/CIM. Predictor de eficacia Área bajo la curva concentración tiempo en relación a la
concentración inhibitoria mínima
ABC 0-∞ . Área bajo la curva concentración en función del tiempo extrapolada al infinito
ABC 0-24 . Área bajo la curva concentración en función del tiempo desde el tiempo 0 a 24 hs.
AUBCA. Area bajo la curva de los valores de NA (número de bacterias viables en presencia de
antibiótico) en función del tiempo desde t 0 hasta t 2 .
AMH. Agar Mueller Hinton
AMC. Amoxicilina con ácido clavulánico
ANOVA. Análisis de la varianza
ATB. Antimicrobiano
AZT. Azitromicina
CBM. Concentración bactericida mínima
CCCP. NaCN, FNa, 2,4 dinitrofenol, iodoacetamida, carbonil cianida m-clorofenilhidrazona.
CIM. Concentración inhibitoria mínima
CIM 50 . Concentración inhibitoria mínima capaz de inhibir al 50% de los aislamientos
evaluados
CIM 90 . Concentración inhibitoria mínima capaz de inhibir al 90% de los aislamientos
evaluados
CI50. Concentración antibiótica a la que se alcanza 50% del máximo efecto bactericida.
CLB. Curva de letalidad bacteriana
CLSI. Acrónimo del Instituto de Estandarización de Procedimientos de Laboratorios Clínicos
de E.E.U.U. (ex NCCLS)
C máx . Concentración plasmática máxima
C máx /CIM. Predictor de eficacia Concentración máxima en relación a la CIM.
CMH. Caldo Mueller Hinton.
CV. Coeficiente de variación
DAN. Danofloxacina
DE. Desviación estándar
DEL. Días en leche.
d. Días
xxv
E. Indice de actividad antibacteriana.
EDTA. Acido etilendiamino tetra acético.
Emax. Efecto bactericida máximo.
ESC. Efecto sub-CIM
EPL. Efecto de potenciación leucocitaria
ETA. Eficacia total del antibiótico
F. Biodisponibilidad
FMLP. Formil-metionil-leucil-fenilalanina
FQ. Fluoroquinolonas
g. Gramo
h. Hora/s
HPLC. Acrónimo inglés de cromatografía líquida de alta resolución
I. Sensibilidad intermedia
Kc. Constante de velocidad de crecimiento bacteriano en ausencia de antibiótico.
Kmax. Constante de máxima velocidad bactericida.
Kg. Kilogramo
LEFyT. Laboratorio de Estudios Farmacológicos y Toxicológicos de la Cátedra de
Farmacología de la facultad de Veterinaria de la Universidad Nacional de la Plata.
LMR. Límite máximo de residuos
Log 10 . Logarítmo en base 10
mg. Miligramos
min. Minutos
mL. Mililitro
mm. Milímetro
NC. Número de bacterias viables en ausencia de antibiótico.
NA. Número de bacterias viables en presencia de antibiótico.
Nmax. Máximo desarrollo bacteriano en ausencia de antibiótico.
ºC. Grados celcius
PAE. Efecto post-antibiótico
PD. Acrónimo del inglés de farmacodinamia
pH. Logaritmo de la inversa de la concentración de hidrogeniones
PK. Acrónimo del inglés de farmacocinética
PK/PD. Relación farmacocinética -farmacodinámica
xxvi
PMA. Forbol-miristato-acetato
R. Resistente
s. Segundos
S. Sensible
S. aureus contracción de Staphylococcus aureus
SARM. Staphylococcus aureus meticilino resistente
T˃CIM. Porcentaje de tiempo durante el cual la concentración sérica excede la CIM del
patógeno
Tlag. Fase de latencia.
TI50. Tiempo al que se alcanza el 50% del máximo efecto bactericida.
TN50. Tiempo al que se alcanza el 50% del máximo crecimiento bacteriano.
T máx . Tiempo al que se produce la concentración plasmática máxima
t 0 : tiempo de inicio del ensayo (0 horas)
t 2 : tiempo de la finalización del ensayo (24 horas)
UFC. Unidades formadoras de colonias
UFC/mL. Unidades formadoras de colonias por mililitro
µg. Microgramo
μL. Microlitro
˃. Mayor que
˂ . Menor que
±. Más o menos
≤ . Menor o igual que
≥ . Mayor o igual que
% . Porcentaje
1N. solución 1 Normal.
xxvii
1. INTRODUCCION
1.1. MASTITIS BOVINA
1.1.1. Generalidades
La mastitis bovina, es definida por la Federación Internacional de Lechería (1999)

como una inflamación de la glándula mamaria que tiene por objetivo final la eliminación del
agente patógeno y/o la restauración de la funcionalidad del órgano, cuando éste se ha visto
afectado. Dicha inflamación, puede ser ocasionada por microorganismos patógenos
transmisibles, por lesiones traumáticas, disturbios metabólico-nutricionales, situaciones de
estrés, cambios fisiológicos asociados con una terminación temprana de la lactancia y,
menos frecuente, por alergia y neoplasmas (Philpot y Nickerson, 1993; National Mastitis
Council, 2004).
Se caracteriza por daños del epitelio glandular, seguido por una inflamación clínica o
subclínica, pudiendo presentarse cambios patológicos localizados o generalizados
dependiendo de la magnitud del daño (Giesecke, 1975). Según el grado de la inflamación, la
mastitis se clasifica en mastitis clínica, subclínica o infección latente.
Clásicamente ha sido considerada como una “enfermedad multifactorial” (Hans

Andresen, 2001), debido a que el riesgo de infección depende de la habilidad de la vaca para
rechazarla; del tipo, número y patogenicidad de las bacterias presentes en el rodeo y,
fundamentalmente de las condiciones del medio ambiente y del manejo en general, tanto
del tambo como del ordeño en particular.
La presentación de la mastitis se ve favorecida por diversas circunstancias que

propician la distribución del microorganismo patógeno en el interior de la glándula mamaria,
lo cual sucede principalmente durante el ordeñe, momento en que se ven alterados los
mecanismos naturales de resistencia del conducto del pezón (Figura 1).
Puede afirmarse que un 80-90% de los casos de mastitis son ocasionados por la
invasión de microorganismos patógenos específicos en los pezones y tejidos de la ubre
28
(Loor et al., 1999). Mientras que el resto son resultado de lesiones traumáticas, con o sin
invasión secundaria de microorganismos (Bramley y Dodd, 1984; Gasque y Blanco, 2001).
Figura 1. Interacción de los factores que participan en la transmisión de la mastitis: vaca,

medio ambiente y microorganismos.
No obstante el conocimiento generado en los últimos años acerca de la patogénesis y

epidemiología de los principales agentes bacterianos causantes de mastitis subclínica, se
dispone de escasa información sobre el impacto diferencial de cada patógeno en la
producción de leche. Estudios en los cuales se ha evaluado la relación entre resultados
bacteriológicos positivos en vacas infectadas que presentan mastitis subclínica (Gröhn et al.,
2004; Reksen et al., 2008), han reportado que los diferentes géneros bacterianos inducen
una disminución de la producción de distinta magnitud, tanto en vacas como en vaquillonas.
El detrimento económico directo atribuible a casos de mastitis, se compone

principalmente de la disminución de la producción a corto plazo y de las pérdidas que se
manifiestan a largo plazo. En estas últimas, debido a que normalmente prevalece un bajo
estándar de producción, la vaca generalmente experimenta un secado prematuro del o los
cuartos afectados, o incluso puede morir.
29
Este tipo de eventos, están íntimamente relacionados con descarte de leche durante
los tratamientos antibióticos y el período de supresión, costos del propio tratamiento, y el
trabajo extra dispensado al animal (Seegers et al., 2003). La disminución en la producción de
leche de los animales afectados, es a su vez, el componente más importante dentro del total
de pérdidas económicas que genera la enfermedad.
Evaluando el impacto económico de la mastitis, (Seegers et al., 2003) recopilaron

datos acerca de los niveles de pérdidas reportados en diferentes investigaciones llevadas a
cabo bajo diversas condiciones de producción. Esa sistematización de los hallazgos, mostró
que las pérdidas de producción a lo largo de una lactancia oscilaban entre 0.5 a 2% en vacas
de 1 solo parto, y hasta un 5.8 % en vacas de 2 o más partos.
Generalmente los estudios dirigidos a estimar el efecto sobre la producción de la

mastitis, se han basado en mediciones mensuales de la producción individual (Houben et al.,
2003), lo cual impide por ejemplo, capturar datos de la evolución de la producción diaria
entre controles lecheros o cuantificar el descarte de leche con antibióticos, con la
consecuente subestimación de la pérdida (Fetrow, 2000). Actualmente, la aplicación de
nuevas tecnologías en las unidades de ordeño, con capacidad de realizar la medición diaria
de la leche producida, implica una mejora en los registros y un avance en la forma de
modelar el efecto de distintas enfermedades sobre la curva de lactación. Mediante modelos
matemáticos se puede comparar no sólo animales enfermos versus sanos, sino también sus
producciones anteriores y posteriores al día del evento, posibilitando así la detección de las
pérdidas acontecidas en el corto plazo para ser compensadas en el largo plazo.
Wilson et al., en 2004 utilizaron un enfoque similar para determinar el efecto de la

mastitis clínica en la producción diaria de leche, reportando una pérdida de 597 kg por
lactancia en vacas de dos o más lactancias. Los autores hallaron también que la producción
diaria, previa a la presentación del caso clínico, fue superior en las vacas que padecieron la
enfermedad que en las que no evidenciaron mastitis. La estimación final de la pérdida en las
vacas afectadas, teniendo en cuenta la producción potencial de los animales, alcanzó a 1.181
kg por lactancia. Similares resultados fueron obtenidos por Hagnestam et al. (2007), quienes
calcularon hasta un 9% de pérdidas en la producción de leche a 305 días para vaquillonas en
su primer lactancia, y hasta un 11% en vacas multíparas.
30
La cuantificación de la disminución de producción láctea como consecuencia de la
aparición de un caso clínico ha sido realizada, inicialmente, sobre infecciones experimentales
(Louis et al., 1990). Solo un estudio informado en 2004, evaluó este efecto a partir de
infecciones naturales acontecidas en rodeos comerciales (Gröhn et al., 2004). Los autores
comunicaron que los diferentes géneros bacterianos inducen una disminución de la
producción de distinta magnitud, tanto en vacas como en vaquillonas. Es así que,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella spp. Streptococcus spp. y Trueperella
pyogenes fueron los responsables de las mayores pérdidas en producción.
Si bien en algunos países como Holanda o Noruega, S. aureus, continúa siendo el

patógeno más frecuentemente aislado en mastitis clínicas y subclínicas, los patógenos de
origen ambiental, definidos así por tener como reservorio el ambiente en el que conviven las
vacas, surgen como actores centrales en las formas clínicas de la mastitis (Bradley y Green,
2001; Gröhn et al. 2004; Kalmus et al., 2006).
Los principales microorganismos reconocidos dentro de este grupo son Streptococcus

uberis, Streptococcus equinus, especies del género Enterococcus y enterobacterias como
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, y
especies de Citrobacter, Serratia y Proteus.
Streptococcus dysgalactiae ha sido descripto como una especie de naturaleza tanto

infecciosa como ambiental (Calvinho 2007).
Dentro de los patógenos no comunes del medio ambiente, podemos mencionar a

Trueperella pyogenes, Pseudomona aeruginosa, levaduras, Nocardia asteroides, y el alga
incolora Prototheca sp., entre otros (Hans Andresen, 2001).
Según la fisiopatología y epidemiología de los agentes patógenos involucrados en la

mastitis, Poutrel y Rainard (1982), se permitieron dividirlos en dos grandes grupos:
patógenos mayores y patógenos menores. Dentro del primer grupo ubican a Staphylococcus
aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis,
Trueperella pyogenes, asociados a las mayores pérdidas económicas, mientras que el
segundo agrupa a Corynebacterium bovis y Staphylococcus coagulasa negativa.
31
En general, existe una gran variedad de microorganismos catalogados como
patógenos contagiosos productores de mastitis, sin embargo, los más comunes son
Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae; otros que también se incluyen son
Mycoplasma bovis y Trueperella pyogenes (Bedolla y Castañeda, 2002). La fisiopatología
relacionada con la infección producida por dichos patógenos hace que esta se manifieste
frecuentemente como mastitis subclínica, en la cual la vaca parece saludable, la ubre no
muestra ningún signo de inflamación y la leche parece normal, sin que existan cambios
organolépticos en la misma. En este caso, el dolor y la inflamación no se detectan
observando la ubre. El número de células somáticas en la leche, indicativo de la respuesta
inflamatoria, resulta elevado, al igual que el número de bacterias, lo que va acompañado de
una disminución del nivel de producción de la secreción láctea, así como de la alteración de
la composición de dicho producto (Loor et al., 1999).
La mastitis subclínica solo se detecta aplicando pruebas de laboratorio que

demuestren la presencia de productos de la inflamación (leucocitos, fibrina, suero) o de
microorganismos infecciosos, así como de cambios en la composición química de la leche
(Bofill et al., 1988; Philpot y Nickerson, 1993).
La mastitis subclínica es la más persistente del grupo de las mastitis, con un gran
impacto en la calidad higiénico-sanitaria de la leche (Ariznabarreta et al., 2002). Este tipo de
mastitis es de ocurrencia frecuente y puede conducir a grandes pérdidas económicas debido
al reducido rendimiento de leche, y caída del precio de la misma dado el número elevado de
células somáticas presentes en los tanques de leche (Wellenberg et al., 2002).
Tan solo en los Estados Unidos, los costos anuales derivados de la presentación de
mastitis en los rodeos, han sido estimados entre 1.5-2.0 billones de dólares americanos
(Kerr et al., 2001; Nash et al., 2003; Biesenkamp-Uhe et al., 2007). Mientras que las pérdidas
de producción de leche, por mastitis subclínica, y los costos elevados por el temprano
reemplazo de vacas asociado con un conteo elevado de células somáticas han sido
estimados en 960 millones de dólares americanos (Wellenberg et al., 2002). Romero (2004),
reportó que los costos de mastitis en Estados Unidos son de alrededor de 107 a 180 dólares
por vaca/año.
32
Es particularmente significativo el hecho que las pérdidas por esta enfermedad
representan el doble de las pérdidas por infertilidad y problemas de reproducción (Chaves,
2009). Existe consenso en que las pérdidas económicas ocasionadas por la mastitis son
debidas a la sumatoria de varias causas, como disminución de la producción, litros de leche
descartada, reemplazos tempranos con la consecuente pérdida genética que generan,
reducción del precio de venta, gastos en tratamientos, en servicio veterinario y en mano de
obra; considerándose la primera como la más importante (Halasa et al., 2007; Klostermann
et al., 2010, Larriestra y Vissi, 2012, Saran y Chaffer, 2000).
La mastitis continúa siendo la enfermedad más prevalente y costosa en las

explotaciones lecheras en la mayor parte del mundo.
1.1.2. Impacto de la mastitis en la República Argentina
En el país, la mayor cuenca lechera, se encuentra ubicada en la región pampeana, la

cual abarca las provincias de Buenos Aires, Córdoba, Santa Fe, Entre Ríos y La Pampa. En
ellas, se encuentran ubicados, prácticamente la totalidad de los tambos e industrias del
sector lechero.
La estructura de producción primaria de leche en Argentina hasta hace unos pocos

años, se caracterizaba por un elevado número de tambos localizados en diversas cuencas,
mientras que la industria procesadora estaba estratificada, con pocas grandes empresas y
varios centenares de pequeñas y medianas empresas (Gutman et al., 2003).
Actualmente, las producciones individuales muestran un fuerte incremento y, con

ellas, la glándula mamaria de los animales se expone durante cada vez mayor tiempo al vacío
del ordeño. A su vez, las vacas por unidad de superficie tienden a incrementarse y son a
menudo manejadas en ambientes muy contaminados.
En términos generales, la rutina de ordeño, la infraestructura y el manejo de los

rodeos continúan sin evidenciar cambios radicales, que se ajusten a las nuevas necesidades
de la industria lechera, situación tal que trae aparejada una serie de consecuencias sanitarias
33
que se evidencian en un crecimiento muy por encima de los valores óptimos de células
somáticas y vacas en tratamiento.
Según datos reportados por la Industria Lechera, desde octubre de 2010 a

septiembre de 2011, se perciben algunos puntos preocupantes en cuanto a la calidad de la
leche que se produce en el país. Estas cifras son realmente alarmantes, ya que provienen de
unas 18 industrias, con una media de 6.616 tambos, los cuales entregaron durante ese
período un promedio de 575 millones de litros mensuales. A continuación, en la Tabla 1, se
presentan los datos de calidad en referencia al conteo de células somáticas informados.
Tabla 1. Datos de calidad y precio por litro entregado por la industria

Empresas Tambos Vol. Mensual $/lt UFC CCS
(mill. de litros) (x1.000) (x1.000)
Oct – 10 18 6604 626,4 1,320 58,5 339,7
Nov – 10 18 6581 588,1 1,325 58,8 339,6
Dic – 10 18 6567 576,8 1,348 61,8 362,1
Ene – 11 18 6565 546 1,378 69,5 402,3
Feb – 11 18 6550 481,1 1,419 72,3 430,9
Mar – 11 18 6572 510 1,539 61,6 417,5
Abr – 11 18 6593 513,5 1,567 59,4 397,4
May – 11 18 6577 555 1,568 62,8 384
Jun – 11 18 6620 572,3 1,543 64,8 385,6
Jul – 11 18 6670 613 1,514 67 383,3
Ago – 11 18 6751 664,1 1,497 65,2 371,4
Sep – 11 18 6741 658,9 1,496 62,7 344,4
Gran Promedio 6616 575,4 1,460 63,7 379,9
Fuente: MAGyP – Subsecretaría de Lechería. Octubre de 2011.
Como podemos apreciar en la tabla, los valores de CCS promediaron las 380 mil/mL,
indicando que en Argentina existe una gran prevalencia de mastitis subclínica y por lo tanto
continúa perdiendo un gran volumen de producción sólo por el nivel de infección mastítica
de sus rodeos.
Haciendo referencia al estudio realizado por Philpot (1993), en el cual se calcularon

las pérdidas de producción según el nivel de células somáticas en tanque, podríamos estimar
que en este caso se estarían perdiendo alrededor de 14 millones de litros mensuales (2.5%
del total). Si consideramos, a la vez, un valor promedio de USD 0.5 por litro de leche, la
situación nos estaría indicando una pérdida cercana a los USD 11 millones por mes a nivel
local.
34
Actualmente no hay un trabajo completo que aclare lo que ocurre a nivel nacional
cuando se habla de mastitis clínicas, sin embargo, contamos con análisis de los casos clínicos
en la práctica diaria, en los que se evidencia la misma tendencia en aquellos tambos que
llevan registro de este dato (Castro, 2012).
Según un relevamiento de datos realizado por Castro en el año 2012, en el caso de

las vaquillonas, el promedio de días en leche (DEL) desde el parto hasta el primer caso de
mastitis fue de 22 días y en general, estas nunca recuperaron el nivel productivo de sus
compañeras libres de la enfermedad. Es así como las pérdidas de producción en esta
categoría animal rondaron los 316 litros. En vacas, sin embargo, el promedio de DEL al
primer caso de mastitis fue de 81 días y las pérdidas rondaron los 345 litros.
El trabajo presentado por Castro (2012), es particularmente interesante porque

permite observar dos aspectos fundamentales, el primero es que dependiendo de la bacteria
que intervenga, la baja en la producción puede comenzar incluso una semana antes del
diagnóstico de la mastitis clínica y segundo, que aquellos animales, especialmente vacas,
que tuvieron al menos un caso de mastitis en los días previos a manifestarlo, estaban en
niveles de producción mayor que las que nunca tuvieron mastitis.
Esto prueba que por norma general, las vacas más productoras son las más
susceptibles y que, con el aumento de la producción individual, aumentan los casos de
mastitis.
Si bien, como se ha mencionado, en el país no se cuenta con información actualizada

referente a la situación de los patógenos más prevalentes asociados a Mastitis Bovina, una
revisión publicada por Calvinho y Tirante (2005) sobre la prevalencia de microorganismos
patógenos de mastitis bovina y la evolución del estado de salud de la glándula mamaria en
Argentina, presenta que hasta la década del 90, S. aureus era el patógeno más
frecuentemente encontrado en los aislamientos de mastitis bovina. En esa revisión, los
autores igualmente resaltaron que, en su mayoría la información recopilada pertenecía a
trabajos realizados en muestras tomadas y/o analizadas a conveniencia, por lo que dicha
información podría no ajustarse exactamente a la prevalencia real de los patógenos
presentes en los rodeos en general. Se sabe en términos generales, salvo contadas
35
excepciones, que en los rodeos con bajo recuento de células somáticas hay una menor
presencia de infecciones por S. aureus y Streptococcus agalactiae; y una mayor incidencia de
infecciones provocadas por patógenos ambientales (Erskine et al., 1988).
Durante el trascurso de los últimos 30 años, se ha ido presentando una

transformación del sector lechero en la República Argentina, consistente en la disminución
del número de tambos, con la subsecuente generación de nuevas unidades productivas cada
vez más intensificadas, lo cual, sumado a la expansión de la frontera agrícola, ha ido
generando un aumento en la concentración de animales expuestos a distintas condiciones
de confinamiento que generan un gran desafío para el control de los patógenos ambientales
(Mozeris et al, 2008). Strep. dysgalactiae y Strep. uberis, se consideran estreptococos
ambientales dado que tienen como reservorio y ruta de acceso el ambiente en el que
conviven las vacas (Khan et al., 2003, Lopez-Benavidez et al., 2007). Sin embargo, la
transmisión vaca a vaca ha sido planteada desde hace tiempo para Strep. dysgalactiae y
recientemente para Strep. uberis (Zadoks et al., 2003; Rato et al., 2008).
Estudios efectuados hacia fines de la década del 70 sobre muestras de leche

provenientes de 40 establecimientos lecheros (12 con ordeño manual y 28 con ordeño
mecánico) del Depto. Las Colonias, Provincia de Santa Fe, mostraron una elevada
prevalencia de Staphylococcus aureus (54%), Streptococcus agalactiae (23%) y
Pseudomonas aeruginosa (13%) (Tessi et al., 1979).
En otro relevamiento realizado en 1977 en la Provincia de Córdoba (Río Cuarto,

Tercero Arriba, Juárez Celman y Gral. San Martín), sobre 30 establecimientos lecheros (18
con ordeño mecánico y 12 con ordeño manual), el patógeno aislado en mayor frecuencia fue
nuevamente S. aureus (43.27%), seguido por distintas especies del género Streptococcus
(Streptococcus uberis -19.2%-, S. agalactiae -13.5%- y S. dysgalactiae -5.3%-) (González et al.,
1980).
Posteriormente a fines del 80 se realizó el seguimiento a partir de 1.150 vacas

provenientes de 39 tambos pertenecientes a los deptos Castellanos y Las Colonias de la
provincia de Santa Fe, donde fue encontrado nuevamente un predominio de S. aureus
(21.7%) entre los patógenos mayores aislados, seguido por microorganismos del género
36
Streptococcus (12.5%, -Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus agalactiae, 5.9 y 2.7%,
respectivamente). Dentro de los patógenos menores se aislaron Corynebacterium spp.
(43.9%), Micrococcus spp. (9.7%) y Staphylococcus coagulasa negativos (SCN) (6,6%)
(Calvinho et al., 1991a). Los patógenos mayores se distribuyeron en el 95% de los tambos y
en el 22.6% de las vacas y dentro de ellos el más difundido fue S. aureus (87% de los
tambos), seguido por S. dysgalactiae (51% de los tambos) (Calvinho et al., 1991a). De los
establecimientos evaluados en dichas investigaciones solamente el 20% aplicaba el
programa de control de mastitis basado en los cinco puntos que se ha mantenido como
tradicional: desinfección de pezones post ordeño, terapia antibiótica de casos clínicos,
control periodico de la máquina de ordeñar, terapia antibiótica de la vaca seca y descarte de
animales con infecciones intramamarias crónicas (Booth, 1981).
Posteriormente Giraudo et al. (1995), realizaron un relevamiento en 17

establecimientos lecheros de la zona centro sur de la provincia de Córdoba, en donde se
recolectaron muestras de leche del 10 al 20% de las vacas en ordeño, aplicando una técnica
de muestreo sistemático. Los investigadores determinaron que los patógenos más
frecuentemente aislados correspondían a distintas especies de SCN (12.2%), especies de
Streptococos (8.13%) y en tercer lugar S. aureus (5.9%).
También se han caracterizado a los microorganismos causantes de mastitis subclínica

en la provincia de Buenos Aires, Santa Fe y Entre Ríos (Tirante et al., 1998; Chaves et al.,
2001). En un estudio realizado sobre 7.580 muestras compuestas de vacas pertenecientes a
38 rodeos lecheros ubicados en la provincia de Buenos Aires y Entre Ríos entre diciembre de
1996 y octubre de 1997, más del 50% de los microorganismos aislados eran especies de
Staphylococcus. Los patógenos mayores (FIL, 1999) más frecuentemente aislados fueron S.
aureus (31.6%) y S. agalactiae (11.6%) (Tirante et al. 1998). Un análisis retrospectivo basado
en el cultivo de muestras compuestas de cuartos de 16.065 vacas en ordeño pertenecientes
a 74 establecimientos lecheros (63 ubicados en la provincia de Buenos Aires, 7 en la
provincia de Entre Ríos y 2 en la provincia de Santa Fe) tomadas entre diciembre de 1996 a
marzo de 2000, reveló una prevalencia de S. aureus de 21.9%, S. agalactiae 5.8% (hallado en
el 68.9% de los rodeos estudiados), Streptococcus no agalactiae 4.3%. Los patógenos
37
menores más frecuentemente aislados fueron: Staphylococcus spp. 13.6% y
Corynebacterium spp 14.3% (Chaves et al., 2001).
Dentro de los estudios más recientes, se describe uno sobre la incidencia de mastitis
clínica dentro de los primeros 30 días de lactancia (Izak y Ackermann, 2010), que fue
realizado en rodeos localizados en las provincias de Santa Fe, Córdoba y Buenos Aires. En el
cual se registró menos de 200.000 células somáticas en leche del tanque durante el último
año, rodeos libres de Strep. agalactiae y que se mantenían controladas las infecciones por S.
aureus. En este estudio el organismo más frecuentemente aislado fue Strep. uberis (32.9%),
seguido por Strep. Dysgalactiae (18.06%). Resultados que manifiestan una tendencia al
incremento de las mastitis medioambientales.
Taverna et al., (2001) evaluaron la evolución del recuento de células somáticas (RCS),
leche de camiones cisterna provenientes de la cuenca central de Santa Fe (periodo junio de
1997 a junio de 1998), mostraron una media geométrica de 416.869 células/mL. La
población de tambos que componían los camiones cisterna contaba con una producción
diaria de 3.5 millones de litros (aproximadamente el 50% del total de la producción de la
cuenca lechera central) (Taverna et al., 2001). Un año más tarde, el RCS promedio fue
407.000 células/mL, en donde el 53% de la leche incluida presentaba RCS inferiores a las
400.000 células/mL (Taverna et al., 2001). En el caso de establecimientos lecheros ubicados
en el noroeste de Santa Fe y sur de Santiago del Estero mostraron una evolución de los RCS
desde valores promedio de 687.000 células/mL en 1993 a 375.000 células/mL en 2002.
Durante ese último año un 25% de los tambos mostró RCS por debajo de las 300.000
células/mL; mientras que sólo el 6% superó las 600.000 células/mL (Revelli et al., 2004).
Si bien se puede observar una ligera tendencia a disminuir el RCS, S. aureus continúa
siendo el patógeno mas prevalente en los casos de mastitis a lo largo del tiempo,
produciendo estragos, repercutiendo en menor producción, menor calidad y mayores
pérdidas económicas. Esta situación fomentó la necesidad de mejorar las condiciones
sanitarias inherentes a esta actividad y adecuar la calidad de la leche a las exigencias
internacionales, con la puesta en marcha de programas y planes de control en diferentes
provincias (Dupuy et al., 1989). La inclusión del RCS en los sistemas de pago en la década del
90 fue el punto de inflexión para el mejoramiento de la calidad sanitaria de la leche.
38
De manera que, la mastitis subclínica es comúnmente de larga duración, difícil de
detectar, reduce drásticamente la producción de leche, afecta adversamente la calidad de la
misma, puede servir como reservorio para infectar a otros animales en el rodeo y
fundamentalmente resulta difícil de tratar con antimicrobianos.
1.1.3. Género Staphylococcus
El nombre deriva de las palabras griegas staphyle y coccus cuyo significado

etimológico es racimo de uvas y grano, respectivamente. Rosenbach en 1884, fue
probablemente la primera persona que cultivó a un estafilococo puro y que estudió sus
características en el laboratorio (Kloos y Schleifer, 1986). Observó que los aislados formaban
dos tipos de colonias, únicamente diferenciables por el color: naranjas y blancas. Propuso el
nombre de Staphylococcus pyogenes aureus para la primera y Staphylococcus pyogenes
albus para la segunda. Winslow y Winslow, en 1908, clasificaron los estafilococos cuyas
colonias eran naranjas dentro del género Aureococcus y los de colonias blancas dentro del
género Albococcus, describiendo al Albococcus epidermidis.
Posteriormente en 1920, Winslow et al., incluyeron al género Staphylococcus en la

familia Micrococcaceae. Hucker en 1948, al realizar la revisión de la sexta edición del Manual
de Bergey’s, concluyó que los Staphylococcus y los micrococos no eran distintos, dio
prioridad al nombre genérico de Micrococcus e incluyó a los Staphylococcus dentro de este
género. En este mismo año, Abd-eI-Malek y Gibson llamaron al grupo de estafilococos y
micrococos “complejo Staphylococcus-Micrococcus”, considerando a los Staphylococcus
como patógenos y a los micrococos como saprófitos.
En 1955, Evans et al., propusieron separar estos organismos basándose en la

necesidad de oxígeno para su crecimiento. Situaron las especies que eran aerobias
facultativas en el género Staphylococcus y las aerobias estrictas en el género Micrococcus.
Esta clasificación fue aceptada por Breed et al. en la séptima edición del Manual de Bergey’s
(1957), en donde se reconocían dos especies de estafilococos: Staphylococcus aureus,
coagulasa positivo y con capacidad de fermentar el manitol y Staphylococcus epidermidis,
39
coagulasa negativo e incapaz de fermentar el manitol. El uso de la taxonomía numérica en
1959 indicó que los Staphylococcus coagulasa positivos constituían un grupo homogéneo,
mientras que los Staphylococcus coagulasa negativos no lo eran (Hill, 1968).
Baird-Parker (1963), fue el primero en reconocer tipos específicos dentro del grupo
heterogéneo de los estafilococos coagulasa negativos (ECN). Dividió a los estafilococos en
seis subgrupos basándose en pruebas fisiológicas y bioquímicas. Así, el subgrupo I contenía
la especie S. aureus (coagulasa y fosfatasa positivas, generalmente producían ácido a partir
de manitol aeróbica y anaeróbicamente); los subgrupos II hasta VI eran tipos distinguibles de
ECN, que se diferenciaban en la producción de fosfatasa y acetoína, así como en la capacidad
de producir ácido aeróbicamente a partir de la lactosa, maltosa y manitol.
En 1965, Baird-Parker definió a los subgrupos del II hasta el VI como biotipos del 1 al
5, e indicó que la mayoría de estos biotipos merecerían tener el rango de especies.
En la actualidad el género Staphylococcus pertenece a:
• Phylum 2 del Dominio Bacteria

• Clase Bacilli
• Orden: Bacilliales
• Familia Staphylococcaceae [Staphylococcus 2008]
Según el Manual de Bergey´s, 2001 tiene las siguientes características:
• Son cocos Gram positivos, dispuestos de a pares, tétradas o grupos irregulares
semejantes a un racimo de uva (Figura 2).
• Catalasa positivos, excepto por S. aureus subsp. Anaerobius y S. saccharolyicus
• Anaerobios facultativos.
• Inmóviles.
• Producen ácidos a partir de glucosa, tanto en aerobiosis como anaerobiosis.
• Toleran altas concentraciones de NaCl (hasta un 10%).
• Temperatura óptima de crecimiento entre 30-37 ºC.
• Las colonias son lisas, mantecosas, redondas, ligeramente convexas, de 1 a 4
mm de diámetro (Figura 3).
Algunas cepas producen pigmentos que van desde el anaranjado al amarillo pálido (Zinsser,
1994; Koneman et al., 1999).
40
Figura 2. Morfología y tinción de Gram del género Staphylococcus
(www.cdc.org/ncidod/diseases/submenu/sub_staphylococcus)
Figura 3. Cultivo de Staphylococcus spp. (http://microblogogia.blogspot.com.ar/)
En la actualidad, el género Staphylococcus consta de 45 especies y 24 subespecies

validadas, de los cuales la mayoría son SCN (Euzeby, 2011) (Tablas 2 y 3).
41
Tabla 2. Especies del género Staphylococcus
S. agnetis S. fleurettii S. piscifermentans

S. arlettae S. gallinarum S. pseudintermedius
S. aureus S. haemolycus S. pulveri
S. auricularis S. hominis S. rostri
S. capitis S. hiycus S. sacccharolitucus
S. caprae S. intermedius S. saprofhyticcus
S. camosus S. kloosee S. schleiferi
S. caseolyticas S. lentus S. sciuri
S.chromogenes S. lugdunensis S. simiae
S. conhii S. lutrae S. simulans
S. condimenti S. microti S. stpaenovicii
S. delfhini S. muscae S. succinus
S. epidirmis S. npaelensis S. vitulinus
S. equorum S. pasteuri S. warneri
S. felis S. petenkofferi S. xilosus
Tabla 3. Subespecies del género Staphylococcus
S. aureus subsp anaerobius S. hyicus subsp chromogenes

S. aureus subsp aureus S. hyicus subsp hyicus
S. capitis subsp capitis S. saprophyticus subsp bovis
S. capitis subsp urealyticus S. saprophyticus subsp saprophyticus
S. camosus subsp camosus S. schleiferi subsp coagulans
S. camosus subsp utilis S. schleiferi subsp schleiferi
S. cohnii subsp cohnii S. sciuri subsp carmaticus
S. cohnii subsp urealitycus S. sciuri subsp lentus
S. equorum subsp equorum S. sciuri subsp rodentus
S. equorum subsp linens S. sciuri subsp sciuri
S. hominis subsp hominis S. succinus subsp casei
S. hominis subsp novibiosepticus S. succinus subsp succinus
Dentro de los Staphylococcus coagulasa positivos (SCP), podemos citar a S. aureus, S.

intermedius y algunas excepciones de S. hyicus (Bergey’s, 1984). Siendo S. aureus, uno de los
más representativos del grupo, catalasa positivo y productor de pigmentos que otorgan a las
colonias un color amarillo intenso característico (Madigan et al., 2003).
42
1.1.3.1 Staphylococcus y mastitis
El hábitat primario de estos patógenos se halla en la piel de la glándula mamaria y en

las lesiones del pezón, de manera que el principal reservorio son las ubres infectadas, donde
los microorganismos se adaptan, sobreviven y crecen. Así la infección ocurre principalmente
durante el ordeñe, diseminándose de vaca en vaca, a través de las pezoneras, unidades de
ordeñe, los paños y esponjas de lavado, las manos de los tamberos/operarios u otros objetos
infectados; siendo mínima la transmisión durante el intervalo entre ordeñes (Zadoks, 2002;
Bedolla y Castañeda, 2003).
Frecuentemente los patógenos contagiosos causan infecciones por largos periodos

de tiempo (semanas, meses y hasta años), siendo muy insidiosas (National Mastitis Council,
1997a), razón por la cual, los microorganismos contagiosos han sido la causa primaria de los
tradicionales esfuerzos dirigidos al control de la mastitis (National Mastitis Council, 1995).
Como patógenos oportunistas de gran impacto en la mastitis, se encuentra el grupo

de los denominados Staphylococcus coagulasa negativos (ECN). Estas bacterias son de
elevado interés, debido a que al día de hoy son los microorganismos más frecuentemente
aislados en vacas y novillas de los rebaños, por lo que son considerados actualmente como
patógenos emergentes de la mastitis bovina (Pyöräla S. et al., 2009).
Normalmente los ECN se encuentran en la piel sana del pezón y en las manos del
ordeñador. A menudo son denominados microorganismos oportunistas, ya que habitan
zonas donde les es sencillo colonizar el canal del pezón y penetrar hasta los tejidos
secretores.
La implementación de programas de control de mastitis durante los últimos 30 años

condujo a una reducción de la incidencia general de la mastitis clínica, llegando en algunos
casos a una disminución del 90%. Sin embargo, mientras que la enfermedad clínica
ocasionada por patógenos mayores (Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae)
descendió significativamente, los patógenos considerados menores como los ECN han ido en
aumento; tomando cada vez mayor fuerza como generadores de mastitis en bovinos. Las
especies más comunes de ECN aisladas de mastitis bovina son Staphylococcus chromogenes,
Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus hyicus y Staphylococcus simulans (Pyöräla S. et
43
al., 2009). Parece ser que existen diferencias en cuanto a la patogenicidad de las distintas
especies de ECN, las que se evalúa mediante técnicas de diagnóstico molecular (Zadoks y
Schukken, 2006). Se encontraron especies de ECN aislados de mastitis bovina con diferente
susceptibilidad antimicrobiana y diversos factores de virulencia (Taponen S. et al., 2009).
Sin embrgo, el Staphylococcus aureus, constituye la principal causa de mastitis a

nivel mundial, encontrándose en más del 80% de los casos. Este microorganismo
generalmente causa mastitis subclínica y crónica, aunque también puede generar formas
sobreagudas y agudas, pudiendo evolucionar hasta la gangrena, pero ocasionando la muerte
en raros casos (Martínez, 1984; Morin y Hurley, 1994).
La infección por Staphylococcus aureus es típicamente crónica, puesto que es capaz

de sobrevivir en células alveolares, en neutrófilos y macrófagos de la glándula mamaria
bovina durante largo periodo de tiempo (Hebert et al., 2000). Estos microorganismos
además, son capaces de multiplicarse en el interior de las vacuolas citoplasmáticas de la
célula alveolar, usando como propio el citoesqueleto membranoso de la célula huésped.
También, pueden adoptar “formas L” que, al no poseer pared celular, resisten a los agentes
antibacterianos que actúan sobre los componentes de la pared bacteriana (Sears y Smith,
1990). Por otra parte, tienen la capacidad de formar una cápsula de características
lipoproteicas (proteína A) e hidrofóbicas que dificulta la fagocitosis y constituye el principal
factor de infecciosidad y supervivencia en la ubre (Corbellini, 1996; Zandarín et al., 1996).
Los factores de virulencia de S. aureus son variados y suponen siempre retos tanto
clínicos como farmacológicos, ya que limitan ostensiblemente el éxito bacteriológico y
clínico de los tratamientos.
En la figura 4, se resumen los principales factores de virulencia asociados a S. aureus.
44
Figura 4. Principales factores de virulencia de S. aureus. Adaptado de
(http://2014hs.igem.org/Team:Elan_Vital_South_Korea/p_background)
Otro factor sumamente importante es la capacidad de formar biofilms. La definición

de un biofilm bacteriano señala que es "una comunidad microbiana sésil”, caracterizada por
células que están adheridas irreversiblemente a un substrato o interfase, o unas con otras,
encerradas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares que ellas mismas han
producido. Exhiben un fenotipo alterado en relación con la tasa de crecimiento y
transcripción génica (Nazar, 2007). La formación de un biofilm supone una secuencia
coordinada de sucesos que incluye una fijación inicial a la superficie primaria, la formación
de microcolonias, su expansión y la posterior diseminación de bacterias (Tu Quoc et al.,
2007).
Aunque aún se comprende poco la regulación de la formación del biofilm, se supone

compleja y multifactorial (Clarke y Foster, 2006). En la fase de proliferación se ocasiona una
acumulación de células en multicapa rodeadas de una matriz polimérica de polisacárido
(O’Gara y Humphreys, 2001), la que contiene también proteínas de superficie responsables
de la fijación de las bacterias a los distintos sustratos (Oliveira et al., 2006). De vez en cuando
algunas bacterias se desprenden del biofilm y difunden al medio ambiente (Otto. M, 2008).
El S. aureus y la mayoría de los SCN aislados a partir de mastitis subclínica tienen la

habilidad de formar biofilm.
45
Dos componentes de la superficie han sido identificados como factores importantes
que intervienen en la formación de biofilm por Staphylococcus: el polisacárido de adhesión
intercelular (PIA) (Stevens et al., 2008) y la proteína asociada a biofilm (BAP) (Ziebuhr et al.,
2006). Las proteínas codificadas por los genes icaADBC (operón de adhesión intercelular)
median en la biosíntesis de la matriz de exopolisacáridos PIA que juegan un papel
importante en la adhesión célula-célula.
La formación de biofilms, está fuertemente asociada con la virulencia en cepas

clínicas de Staphylococcus coagulasa negativos, causantes de mastitis bovina.
S. aureus aislados que poseen el gen bap son fuertes formadores de biofilm y son
más a menudo asociados con la persistencia de Infecciones intramamarias (Cucarella et al.,
2004). Se especula que la proteína BAP se proyecta desde la superficie de la célula
bacteriana, promoviendo la interacción con superficies de la célula huésped, u otras
bacterias (Cucarella et al., 2001).
Homólogos a la proteína BAP se han identificado también en cepas de S. epidermidis,

S. chromogenes, S. hyicus, S. simulans y S. xylosus aisladas de mastitis por hibridación usando
el gen bap de S. aureus como sonda (Tormo et al., 2005). BAP está implicada en la unión
primaria así como en la siguiente etapa de agregación bacteriana, posiblemente en
cooperación con PIA (Cucarella et al., 2001; Cucarella et al., 2004). Sin embargo, BAP
también puede mediar la formación de biofilms en ausencia de PIA, lo que indica que la
expresión de bap representa un mecanismo alternativo de formación de biofilm (Tormo et
al., 2005). Es evidente que los Staphylococcus pueden utilizar diferentes mecanismos para
formar biofilms. En varios estudios, la presencia de genes del operón icaADBC no se
correlaciona completamente con la producción in vitro de biofilm, lo que indica que otros
mecanismos están probablemente involucrados (Vasudevan et al., 2003; Chokr et al., 2006).
Una vez que las bacterias o sus toxinas llegan al epitelio secretor se producen daños
de grados variables en las células alveolares. Este patógeno suele tener los factores de
virulencia más poderosos, entre ellos las hemolisinas (alfa, gamma y delta), proteínas que
tienen la propiedad de incorporarse a la estructura de la membrana celular de la célula
afectada, formando poros que modifican la permeabilidad al agua e iones, lo que lleva a la
46
lisis osmótica. También pueden producir beta-hemolisina, que es una esfingomielin-
fosfolipasa que altera la estructura lipídica de la membrana celular (Almeida y Matthews,
1996). A esto debemos agregar su capacidad de generar diversas enzimas (coagulasas, factor
aglutinante, estafilocinasas, hialuronidasas, fosfatasas, nucleasas, proteasas, lipasas,
catalasas, lisozima). También producen leucocidinas y enterotoxinas (A, B, C, D y E). Todas
estas sustancias le confirieren la propiedad de ser altamente invasivo (Bergey, 1984; Morin y
Hurley, 1994; Velasco y Yamasaki, 2001).
De manera tal que, la mastitis por Staphylococcus aureus produce daños tisulares y
disminución de la producción de leche, con pérdidas del 45% por cuarto y del 15% por vaca
infectada; constituyendo esta leche y las ubres afectadas, la principal fuente de contagio de
dichos agentes etiológicos (National Mastitis Council, 2000b). Las bacterias dañan el sistema
de conductos y tienden a producir cicatrices, que resultan en sacos de infección encerrados
en la ubre, difíciles de alcanzar por los antibióticos (Figura 5).
Prácticamente, en todos los casos, las bacterias causantes de mastitis penetran a la

glándula mamaria a través del canal del pezón, que funciona como la primera y más
importante barrera de defensa de la misma. De allí la gran importancia de reducir la carga
microbiana de la piel del pezón y preservar la funcionalidad del canal y del esfínter del
pezón, antes que las bacterias penetren y colonicen el parénquima. En este último caso,
ocurre la respuesta inflamatoria y con ella el daño al epitelio secretor y la disminución de la
calidad de la leche (Corbellini, 2000).
Una vez que las bacterias y/o sus toxinas han superado la línea de defensa del canal
del pezón y alcanzan los tejidos altos, afectan la segunda línea de defensa, que incluye
factores humorales inespecíficos presentes en la leche (lactoferrina, inmuno-lacto-
peroxidasa, lisozima, fracciones del complemento y otros compuestos químicos) y
mecanismos de defensa inmunológicos o específicos, ya sea de tipo humoral
(inmunoglobulinas y otros factores solubles) o de base celular, incluyendo el sistema
fagocítico (macrófagos (MA), Polimorfonucleares (PMN) y el sistema linfoideo (-L- linfocitos
T, B y sin clasificar)).
47
Figura 5. Desarrollo de la mastitis y de la defensa de la vaca contra la infección. El S. aureus invade el
tejido mamario formando bolsones inaccesibles a la destrucción natural o a los antibióticos.
Fuente: http://www.infocarne.com/bovino/mastitis.asp
Normalmente, podemos encontrar PMN, MA, L y escasas células epiteliales (CE) en la

leche de cuartos mamarios sanos. Ellos constituyen las llamadas “Células Somáticas” (CS). En
la leche proveniente de cuartos no infectados, el conteo de CS (CCS) es menor a 100.000/mL,
consistiendo en un 12 % de PMN, 60 % de MA y 28 % de L. La proporción de CE es del 12-15
% durante las primeras 4 semanas de lactancia y menor al 2 % a medida que transcurre la
misma (Corbellini, 2000).
Es decir, la mastitis no se trata de una simple enfermedad, sino de un verdadero

complejo multifactorial que involucra a la vaca, al productor, a la industria, a los
laboratorios farmacéuticos, al consumidor y finalmente al medio ambiente. El control de la
mastitis necesita del trabajo mancomunado entre todos los sectores involucrados.
48
1.1.4. Identificación de la problemática.
Como mencionamos, el problema de mayor impacto sanitario y económico en las

explotaciones lecheras a nivel mundial es sin duda la mastitis subclínica. Un buen manejo del
tambo es fundamental en la disminución de la prevalencia para esta patología. Sin embargo,
si bien se trabaja cada vez más en tratamientos alternativos a los quimioterápicos, los
antibióticos siguen siendo una herramienta esencial, y su uso racional es aún una necesidad
imprescindible.
Cuando se administran antibacterianos, para el tratamiento de enfermadedes

infecciosas en general y en particular para el tratamiento de la mastitis bovina, se identifican
cuatro problemas concretos:
1) Uso ineficiente de agentes antimicrobianos:

• Tratamientos sin diagnóstico
• Uso innecesario de antibacterianos
• No utilización cuando son indicados
• Administración de dosis inadecuadas
• Establecimiento de periodos inter-dosis inadecuados
• Asociación ineficiente o francamente antagónica de drogas
• Desconocimiento del concepto de tiempo de retirada o lo que es peor, caso
omiso del mismo.
2) Desconocimiento del comportamiento farmacocinético/farmacodinámico
• No se logra alcanzar las concentraciones adecuadas
• No se logra el tiempo de contacto adecuado
• El antimicrobiano es incapaz de llegar al sitio de localización de la bacteria
• El antimicrobiano es inactivo a nivel subcelular donde se ubica la bacteria
• La molécula es secuestrada en sitios diferentes del blanco farmacológico.
3) Falta de confirmación de cura bacteriológica.
4) Inexistencia de un severo control de residuos medicamentosos.
49
El fracaso terapéutico generalmente está relacionado con un uso totalmente
irracional de los antimicrobianos en explotaciones lecheras, alcanzando a varios sectores:
1) Sector productivo: ocasionando, como mencionamos, importantes pérdidas

económicas.
2) Sector industrial: ya que como vimos, la elaboración de subproductos a partir de

materia prima de deficiente calidad, acarrea pérdidas económicas de magnitud y
fundamentalmente impide la inserción en mercados internacionales. Las empresas
padecen desde simples pérdidas, hasta desastres financieros y deterioros de su
prestigio.
3) Salud pública: Este sector se ve seriamente afectado y aquí tenemos varios tópicos a
considerar:
a.- Las infecciones e intoxicaciones alimentarias continúan representando graves

problemas en salud pública, aún en los países más desarrollados. El mayor peligro que tiene
la leche contaminada con Staphylococcus reside en que algunas cepas de estos
microorganismos pueden producir una enterotoxina capaz de causar en el hombre
gastroenteritis agudas.
b.- La presencia de residuos de antibióticos, que en el organismo podrán provocar

desde alteraciones en la flora normal (por aumento de la presión de selección entre las
poblaciones bacterianas) hasta reacciones alérgicas frente a dichos antimicrobianos en los
consumidores ya sensibilizados, fundamentalmente en la población infantil.
c.- La transferencia e intercambio de determinantes genéticos de antibiótico-

resistencia entre el sistema animal-hombre-ambiente.
Clásicamente el enfoque general de esta problemática se ha dirigido a la

identificación del problema, sin avanzar en acciones que conlleven a controlar las causas que
lo originan. No se tiene en cuenta que, una vez producidos los efectos indeseables, ya se han
generado las pérdidas de los sectores involucrados.
Producir leche de buena calidad no solamente importa por su impacto en la salud

pública, sino que también es un factor que estabiliza el desarrollo socio-económico en áreas
50
rurales, particularmente en los países en desarrollo (De Boer, 1981; McDowell, 1981, Larrea,
2011). Las exigencias de crecientes cantidades de alimentos que tiene la población mundial,
en cierta forma tienden a opacar una necesidad paralela en cuanto a las cualidades
nutritivas e higiénicas necesarias para satisfacer los requerimientos nutricionales inherentes
a ésta.
Si bien son incuestionables las cualidades nutritivas de la leche y los productos

lácteos, es muy importante entender que, desde su síntesis en la glándula mamaria hasta su
llegada al consumidor, estas cualidades están sometidas a un sin número de riesgos que
hacen peligrar la calidad original.
Estos riesgos son: la contaminación y multiplicación de microorganismos patógenos,

alteración físico-química de sus componentes, adquisición de olores extraños y malos
sabores; y contaminación con sustancias químicas (pesticidas, antibióticos, metales,
detergentes, desinfectantes, partículas de suciedad, etc.). Todos estos riesgos, ya sea en
forma aislada o en conjunto, conspiran en forma negativa contra la calidad higiénica y
nutricional del producto y, consecuentemente, atentan la salud pública y economía de
cualquier país.
De ahí que el desafío para quienes trabajamos y convivimos a diario en este tema, no
sólo es producir mayor cantidad de leche sino, también, de la mejor calidad higiénica. Para
ello deben contemplarse aspectos fundamentales, como lo son la higiene microbiológica,
higiene química e higiene estética, conjunto de factores que deben contribuir
favorablemente a la mejora del sector lechero argentino, con el beneficio consecuente en el
desarrollo físico e intelectual de las futuras generaciones.
Las implicaciones en la salud pública por el consumo de leche o derivados

provenientes de vacas mastíticas en tratamiento han sido bien documentadas (Errecalde,
1996; Giesecke, 1983, 1985; Heeschen et al., 1985; Mestorino y Erreclade, 2012). La leche
mastítica es nutricionalmente inferior a la leche normal y estéticamente inaceptable
(Giesecke, 1983). El mayor peligro que tiene la contaminación de la leche con Staphylococus,
reside en que algunas cepas de estos microorganismos pueden producir una enterotoxina
capaz de causar en el ser humano gastroenteritis agudas. Esta enterotoxina es termoestable
51
y los Staphylococus que la producen se encuentran con mucha frecuencia en operarios
aparentemente sanos y en el ganado lechero. Este tipo de intoxicación alimentaria puede
producirse, incluso, en leches correctamente pasteurizadas, bastando para ello que la leche
haya permanecido en la temperatura favorable para la multiplicación de los Staphylococus
durante el período necesario para la producción de una cantidad peligrosa de enterotoxina.
Por otra parte los residuos de antimicrobianos también inciden en los procesos de
industrialización, retrasando o suprimiendo el proceso de fermentación del yoghurt y queso;
y reduciendo la calidad de la manteca (Du Preez, 1980). También existe preocupación por las
eventuales toxicidades de los residuos lácteos. Los sabores indeseables reducen el valor de
los mismos y la presencia de bajos niveles de antibióticos puede causar problemas de salud
en los consumidores, la cual se ve afectada, también, por la transmisión de microorganismos
patógenos desde la ubre enferma al hombre, pudiendo provocar enfermedades como
endocarditis, meningoencefalitis, enteritis y artritis (Zurich, L y San Martín, B. 2004).
Otro de los peligros que representa la infección y consecuente terapia infructuosa de

este microorganismo, es su gran habilidad para evadir los mecanismos de defensa del
hospedador y sobrevivir a los tratamientos antimicrobianos implementados. Es por esta
razón, que con gran frecuencia existen infecciones persistentes por S. aureus, que además
de perdurar por largos periodos de tiempo en el animal afectado, representan un riesgo
potencial en la transferencia de genes de resistencia bacteriana a otros animales, al
ambiente inmediato y al hombre (Waage et al., 2002).
Estas consideraciones nos incitan a desarrollar el conocimiento con miras hacia el

control de infecciones intracelulares, tomando como modelo al Staphylococcus aureus,
microorganismo incluido en los programas de vigilancia y seguimiento de la resistencia a los
agentes antimicrobianos como bacteria patógena zoonótica emergente (OIE, capítulo 6.7
del Código Sanitario para los animales terrestres).
El tratamiento antibacteriano frente a microorganismos capaces de mantenerse y

prosperar en el medio intracelular, por lo tanto, significa un reto de grandes proporciones,
ya que las bacterias en este estado son especialmente refractarias a los mecanismos
inmunes (tanto humorales como celulares). Estas infecciones no solo son perjudiciales para
52
el huésped sino que constituyen una verdadera fuente de reserva para infecciones
recurrentes. La pobre acción de los antimicrobianos a nivel intracelular posibilita la
supervivencia de los microorganismos, y esto a su vez predispone el camino para la selección
de cepas resistentes.
Las reflexiones acerca de si todos los antimicrobianos pueden o no ser efectivos

contra las infecciones intracelulares, o acerca de cuáles son los parámetros
farmacodinámicos y farmacocinéticos que rigen esta actividad y también, cómo la
quimioterapia puede ser mejorada en este aspecto, son las bases del presente
razonamiento.
1.1.4.1. Localización intracelular de los microorganismos
Numerosos estudios han demostrado que los microorganismos pueden desarrollar

diferentes estrategias para asegurar su supervivencia. Algunos de ellos se adaptan para vivir
exclusivamente en el interior de la células, por lo que se denominan intracelulares obligados
(Toxoplasma gondii, Mycobacterium leprae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnettii, Rickettsia spp., etc). Otros microorganismos
(Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Listeria spp., Legionella pneumophila, algunas
especies de Salmonella y Staphylococcus aureus) pueden residir tanto dentro como fuera
del medio celular y han sido denominados intracelulares facultativos y finalmente están los
microorganismos extracelulares, que cumplen su ciclo vital extracelularmente (Troue y
Tulkens, 1981). Este último grupo se encuentra en continua revisión ya que pueden
transformarse en facultativos, por ejemplo el Streptococcus pyogenes, clásicamente
considerado de vida extracelular, actualmente se puede localizar en el interior celular, como
ocurre en los procesos de faringitis crónica en humanos (Okadaet al., 1998).
Los fagocitos, como células especializadas en la lucha contra las infecciones

bacterianas, constituyen la primera línea de defensa del organismo frente a estos agentes
externos. Los mecanismos microbiocidas de éstas células incluyen en primer lugar la
fagocitosis o inclusión del microorganismo en el interior celular, y luego la acción bactericida
53
propiamente dicha, la que puede ser dependiente de oxígeno (producción de radicales
superóxido y peróxido de hidrógeno) o independiente de oxígeno (enzimas hidrolíticas).
A su vez los microorganismos intracelulares, pueden evadir la acción microbiocida de

los fagocitos por diferentes mecanismos. Unos inhiben la fusión del fagosoma con el
lisosoma, por lo que las bacterias proliferan intracelularmente y sobreviven o en los
lisosomas (M. leprae) o en los fagosomas (M. tuberculosis, Chlamydia spp.); también pueden
producir toxinas, que causan exocitosis o rotura de la membrana del lisosoma o del
fagosoma; o bien producir enzimas inactivantes de los productos de oxidación del fagocito,
como las catalasas, que desdoblan el peróxido de hidrógeno producido por los fagocitos en
agua y oxígeno (S. aureus) (Mandell, 1975). Dentro de la célula, los microorganismos pueden
localizarse en diferentes lugares: en el fagosoma o en el fagolisosoma, como S. aureus o
Haemophilus influenzae; en el citosol, como Salmonella spp., Rickettsia spp.; o pueden ser
capaces de traspasar la membrana del fagosoma (Trypanosoma cruzi), aunque la mayoría de
los microorganismos permanecen en el lisosoma (Moulder, 1985; Reinoso et al., 1995)
(Figura 6).
Figura 6. Localización intracelular de algunos microorganismos
Numerosos investigadores, desde el comienzo de la era antimicrobiana, han dirigido

sus estudios hacia el conocimiento de la relación antimicrobiano - sistema inmunitario,
54
llegando a postular que los antimicrobianos habitualmente son menos efectivos en ausencia
de fagocitos funcionales, o por el contrario, que la presencia de antimicrobianos incrementa
la fagocitosis y el efecto bactericida de los leucocitos sin modificar su capacidad
quimiotáctica (Mandell et al, 2001). Según los primeros estudios realizados acerca de la
interacción antibiótico-bacteria intracelular-fagocito, los microorganismos intracelulares que
sobrevivían dentro de los fagocitos estaban protegidos del efecto bactericida de la mayoría
de los antimicrobianos hasta entonces conocidos (Magoffin y Spink, 1951; Solberg, 1972).
Mandell propuso en 1973 para este suceso dos explicaciones, por un lado podría ser que la
bacteria intracelular tuviera su metabolismo alterado y por lo tanto los antimicrobianos no
podrían actuar, o bien, los antimicrobianos no serían capaces de penetrar en el fagosoma.
Más tarde Mandell observó que la bencilpenicilina era inactiva frente al S. aureus fagocitado,
mientras que la rifampicina mostraba actividad, por lo que llegó a la conclusión de que la
incapacidad de la bencilpenicilina para actuar sobre las bacterias fagocitadas se debía, en
parte, a la incapacidad de llegar al lugar de localización de la bacteria (Mandell 1973).
Los resultados de Mandell fueron el punto de partida para el desarrollo de toda una
línea de investigación orientada al estudio de la penetración y localización intracelular de los
antimicrobianos.
1.2. USO DE ANTIMICROBIANOS EN LA MASTITIS BOVINA
Pese a las décadas de investigación y planes integrales de control, como hemos

mencionado, la mastitis bovina continúa siendo un problema a nivel mundial.
Las estrategias para reducir el impacto de las infecciones intramamarias causadas por
S. aureus consisten en reducir la incidencia de nuevas infecciones o disminuir la duración de
las infecciones existentes (Sol et al., 1997).
La terapia con antibióticos ha sido y continúa siendo la más adecuada en el

tratamiento de la mastitis. Ante la instauración de una terapia con antibióticos se debería
elegir el agente al cual el microorganismo es altamente susceptible, fijar la dosis y duración
55
del tratamiento según las características farmacocinéticas/farmacodinámicas del
medicamento seleccionado. Y finalmente, cumplir rigurosamente con los períodos de
retirada (Errecalde, 2000; Mestorino y Errecalde, 2012).
Cuando se decide tratar una mastitis, el tratamiento debe ser integral y completo.
Para lo cual es fundamental realizar un buen diagnóstico, evaluando cuidadosamente la
susceptibilidad bacteriana y eligiendo el antimicrobiano o combinación antimicrobiana más
adecuada. Se debe considerar especialmente el terreno mamario y las posibilidades de
penetración del producto elegido, no solamente en la glándula mamaria, sino la llegada a
sitios más profundos en donde pueda encontrar al microorganismo, es decir en
polimorfonucleares y aún más profundamente en los fagolisosomas.
El plan de administración implementado es fundamental, pues debe permitir el

“tiempo de contacto ideal” o la “concentración adecuada” para que el medicamento logre
atacar al microorganismo causal. Además se debe poner especial atención al periodo de
descarte de la leche, el cual debe ser respetado meticulosamente, ya que nos permitirá
enviar al mercado leche con niveles de inhibidores por debajo de los máximos niveles
residuales permitidos (Errecalde, 2000).
Es decir, la eficacia de la terapia antimicrobiana en mastitis depende de varios

factores, tales como el tipo de compuesto, la dosis empleada, la vía de administración, y la
duración del tratamiento (Mestorino, 1993; Ziv, 1978).
Las vacas infectadas, portadoras de S. aureus son una fuente permanente de infección
para el resto del rodeo y pueden incrementar la incidencia de infecciones. Cuanto más
crónica es la enfermedad y más edad tiene la vaca, peor es el pronóstico. Se dice que por
cada mes de persistencia de la infección, la probabilidad de cura disminuye en un 20%,
considerando que originalmente era del 100% (Pyorälä, 1995).
El promedio de los índices de cura de mastitis por S. aureus tratadas durante la

lactancia es del 40% y en casos crónicos es menor al 15% (Pyorälä, 1995). Los resultados del
tratamiento al secado son un poco más alentadores pero siguen siendo bajos (Pyorälä,
1995).
56
La baja eficacia terapéutica puede atribuirse a la pobre penetración de algunos
antimicrobianos en los sitios donde hay fibrosis, inflamación o abscesos, a la inactivación
farmacológica por componentes propios de la sangre o la leche, a la localización intracelular
del S. aureus, a la supervivencia en células fagocíticas y a la inducción de formas L durante el
tratamiento (Nickerson et al., 1999). A pesar de lo difícil que es combatir al S. aureus hay que
recalcar que luego de la erradicación del mismo es excepcional la aparición de nuevos casos
(Pyorälä, 1995).
Los antimicrobianos pueden ser administrados por dos vías: intramamaria o

parenteral. La terapia combinada es aquella en la cual se administran los antimicrobianos
por ambas vías en forma simultánea. Se ha postulado que este tipo de terapia es preferible
en los casos de mastitis por S. aureus pues de esta manera se lograría una mejor penetración
del antimicrobiano en el tejido glandular (Ziv, 1980; Taponem et al., 2003).
La vía intramamaria (IMM), es aceptada como de elección en el tratamiento de

mastitis subclínicas o crónicas, y que en el caso de mastitis agudas, frecuentemente fracasa
debido a la pobre y despareja distribución del medicamento a través del intenso crecimiento
del parénquima mamario, o por el bloqueo que producen los productos inflamatorios. En
estas circunstancias, se prefiere la terapia parenteral (Ziv, 1980a, 1980b). No debemos
olvidar que el éxito de la terapia parenteral depende del pasaje de los principios químicos
desde la sangre a la leche (Mestorino, 1993). De ahí la importancia de que el médico
veterinario tratante tenga conocimientos sólidos sobre determinados conceptos
farmacológicos. Por ejemplo, los aminoglucósidos (estreptomicina, gentamicina, kanamicina,
neomicina), que son bases hidrosolubles, aplicados de manera parenteral, no presentan
buena difusión hacia el interior de la glándula mamaria ni a la interfase leche célula acinar, y
en mucha menor medida al interior celular, por lo que su aplicación no tiene efecto
terapéutico tangible. Adicionalmente, la actividad antibacteriana de los aminoglucósidos se
ve reducida casi por completo en presencia de suero, leche o pus (Fang y Vikerpur, 1995).
La llegada del antimicrobiano al interior de la glándula, ya sea luego de la

administración sistémica o IMM, depende principalmente de las propiedades fisicoquímicas
del compuesto que inciden directamente en su comportamiento PK. Estas propiedades son:
57
liposolubilidad del antimicrobiano, grado de ionización y porcentaje de unión a las proteínas
plasmáticas y a las proteínas tisulares (Ziv, 1980a).
Tradicionalmente, la mastitis subclínica por S. aureus es tratada en el período de

secado mediante la aplicación intramamaria (IMM) de antimicrobianos. Aunque esta
maniobra continúa siendo una herramienta fundamental en el control de la mastitis por S.
aureus, el tratamiento exitoso de la mastitis subclínica durante la lactancia permitiría reducir
la duración de las infecciones existentes. De esta manera se lograría mejorar la calidad de la
leche obtenida, reducir la probabilidad de contagio y evitar la cronicidad en aquellas
infecciones tratadas a tiempo.
Entre las desventajas del tratamiento de la mastitis subclínica por S. aureus durante la
lactancia se destaca la relación costo-beneficio de la estrategia utilizada. Los costos incluyen
el correcto diagnóstico de las vacas infectadas y los estudios de susceptibilidad de las cepas
involucradas, los costos de los tratamientos antimicrobianos, la presencia de residuos
químicos en la leche, el descarte de la misma y la necesidad de realizar un diagnóstico post-
tratamiento que garantice el éxito de la terapia (Ziv y Sulman, 1974). Adicionalmente, existe
el riesgo latente de que el tratamiento falle, razón por la cual deben diseñarse protocolos
terapéuticos racionales que optimicen el uso de los antimicrobianos, ya sea en el
tratamiento de secado como en el de lactancia.
A pesar de que los antimicrobianos se han instaurado en la terapéutica antimastítica

hace más de 50 años, el conocimiento PK y PD de los mismos en la leche es aún limitado.
1.2.1. Tratamiento parenteral
La administración sistémica para el tratamiento de la mastitis comenzó a utilizarse en

la década del 70 (Ziv, 1980a).
En los casos agudos, la administración IMM frecuentemente, como mencionamos,

fracasa dada la pobre y despareja distribución del medicamento (Ziv, 1980b). En estas
circunstancias, se prefiere la terapia parenteral (Ziv, 1980b).
58
Desde el punto de vista clínico, el éxito de la terapia parenteral depende
principalmente del pasaje de los antimicrobianos desde la sangre a la leche (Ziv, 1980a,
1980b; Mestorino, 1993; Lucas, 2009). Las concentraciones antimicrobianas en tejidos
altamente vascularizados son equivalentes a las determinadas en plasma sanguíneo. Por el
contrario, en los sitios donde la vascularización es escasa o en aquellos que están separados
del compartimento central por membranas biológicas, los niveles farmacológicos no serán
equivalentes (Ziv, 1980a; 1980b).
El tiempo durante el cual las concentraciones en la glándula mamaria son efectivas

depende principalmente de las características fisicoquímicas del fármaco, la dosis utilizada,
la biodisponibilidad de la molécula, la capacidad de penetración en la glándula mamaria y la
susceptibilidad del agente causal (Ziv, 1980a).
La capacidad de penetración en la glándula mamaria, o la biodisponibilidad láctea

(F láctea ) se obtiene a partir de relacionar el ABC 0-∞ (área bajo la curva extrapolada al infinito)
en leche y el ABC 0-∞ en plasma, tal como se observa en la ecuación 1.
ABC0-∞(leche)
Fláctea = Ec. 1
ABC0-∞(plasma)
De esta manera se puede determinar la relación que existe entre la cantidad de

antimicrobiano que es absorbido y la cantidad que atraviesa la glándula mamaria y llega a la
leche que se encuentra en su interior (Mestorino, 1993).
Aquellos antimicrobianos que presentan un alto volumen de distribución son los que
mejor penetran en el interior de la glándula mamaria (Ziv, 1980a). Sin embargo, las
diferencias en el grado de penetración sangre:leche ocurren aún entre compuestos que
están química y estructuralmente relacionados. Estas diferencias pueden explicarse a través
del principio de difusión pasiva (Ziv, 1980a).
Los antimicrobianos atraviesan las membranas biológicas por difusión pasiva o por
transporte especializado. En la difusión pasiva las moléculas del antimicrobiano atraviesan la
membrana biológica a través de la bicapa lipídica o a través de los canales o poros que se
encuentran en la membrana y cuyo interior es hidrófilo (Ziv, 1980a).
59
Los compuestos liposolubles, polares o no polares, atraviesan la membrana por
difusión pasiva a través de la porción lipídica. La transferencia en este caso es directamente
proporcional al gradiente de concentración y al coeficiente de partición de la molécula (Ziv,
1980; Mestorino y Errecalde, 2012).
Los ácidos orgánicos débiles y las bases se encuentran en la leche y en el plasma en

su forma ionizada o no ionizada. La fracción no ionizada es generalmente más liposoluble
que la ionizada y difunde mejor a través de la membrana biológica (Ziv, 1980a; Mestorino y
Errecalde, 2012). La proporción del fármaco que se encuentra en la forma no ionizada
depende del pK a de la molécula y del pH del medio en el que la misma está disuelta. Cuando
las moléculas atraviesan la membrana por difusión simple, se distribuyen de acuerdo al
grado de ionización, a la carga que tenga la forma ionizada y al porcentaje de unión a las
proteínas o macromoléculas que se encuentran en la solución que baña la membrana
biológica. Esto último se debe a que las moléculas unidas a proteínas o tejidos no son
capaces de atravesar las membranas (Ziv, 1980a). Estas mismas consideraciones se deben
tener en cuenta a la hora de evaluar la penetración de los agentes antimicrobianos a sitios
subcelulares (Mestorino y Errecalde, 2012).
La relación entre las concentraciones teóricas de un fármaco a ambos lados de una

membrana biológica, pueden ser calculadas de acuerdo a la ecuación de Jacobs, que para
ácidos orgánicos tales como penicilina G (pK a =2.8) es la siguiente (Ziv, 1980a):
1+ 10 pHleche - pKa
Relación leche:plasma = Ec. 2
1+ 10 pHplasma - pKa
La ecuación de Jacobs aplicable en el caso de bases orgánicas, por ejemplo

macrólidos (pK a =entre 8.2-8.8) es la siguiente (Ziv, 1980a):
1+ 10 pKa - pHleche
Relación leche:plasma = Ec. 3
1+ 10 pKa - pHplasma
La sangre tiene un pH de 7.4 y la leche tiene un pH de 6.5-6.6 (el citosol 6.5 y el

fagolisosoma 5). Las bases orgánicas administradas por la vía parenteral tienden a
acumularse en los sitios más ácidos como la leche y permanecen allí en su forma ionizada
60
(atrapamiento iónico), alcanzando de esta manera concentraciones lácteas que superan a las
plasmáticas. Por el contrario, las concentraciones de los ácidos débiles en la leche son
inferiores a las concentraciones de los mismos en el plasma (Erskine, 2002, Mestorino y
Errecalde, 2012).
Es decir que la mayoría de los fármacos pueden estar o no ionizados, de acuerdo a su

pK a y al pH del medio circundante. Los compuestos no ionizados tienen un coeficiente de
partición lípido-agua mayor que los ionizados, y por ello difunden más fácilmente a través de
la membrana (Ziv, 1980a).
Las moléculas anfotéricas, como por ejemplo danofloxacina (pK a = 6,2 - 9,4), no
dependen de la relación pK a /pH y por lo tanto su distribución estará determinada
fundamentalmente por el grado de liposolubilidad de la molécula y consecuentemente por
el coeficiente de partición lípido-agua (Ziv, 1980a; Mestorino y Errecalde, 2012).
En la Tabla 4 se presentan algunos antimicrobianos con sus relaciones leche:plasma

teóricas y experimentales. Mediante la observación de la tabla se puede concluir que la
difusión de los ácidos orgánicos hacia la leche es altamente predecible, pero que la difusión
de las bases orgánicas puede predecirse sólo cuando éstas se encuentran mayormente no
ionizadas en plasma y presentan un grado de liposolubilidad moderado (Ziv, 1980a).
61
Tabla 4: Partición de los antimicrobianos en plasma y leche en animales en periodo de lactancia.
Adaptado de Ziv G, 1980a
ANTIMICROBIANO NATURALEZA PK a LIPOSOLUBILIDAD LECHE:PLASMA
QUÍMICA (teórico- experimental)
Sulfanilamida Ácido 10,4 Moderada 1,00 – 0,97
Sulfatiazol Ácido 7,1 Moderada 0,37 – 0,35
Sulfadiazina Ácido 6,5 Moderada 0,28 - 0,21
Penicilina G Ácido 2,8 Moderada 0,16 – 0,20
Penicilina V Ácido 2,8 Moderada 0,16 – 0,22
Cloxacilina Ácido 2,8 Alta 0,16 – 0,22
Ampicilina Ácido 2,8; 7,2 Alta 0,26 – 0,26
Amoxicilina Ácido 2,8; 7,2 Alta 0,26 – 0,26
Cefacetril Ácido 2,4 Moderada 0,12 – 0,15
Cefapirina Ácido 2,6 Moderada 0,14 – 0,18
Rifamicina Ácido 2,8; 6,7 Moderada 0,25 – 0,25
Rifampicina Ácido 7,9 Alta 0,85 – 1,10
Novobiocina Ácido 4,3 Alta 0,30 – 0,33
Penetamato Base 8,5 Alta 5,7 – 6,1
Estreptomicina Base 8,9 Baja 7,5 – 0,5
Polimixina Base 10,0 Muy baja 8,0 – 0,3
Eritromicina Base 8,8 Alta 6,5 – 8,5
Tilosina Base 7,1 Alta 5,0 – 4,5
Espiramicina Base 8,2 Alta 4,8 – 4,6
Lincomicina Base 7,6 Alta 4,2 – 4,4
Cloranfenicol Alcohol - Alta 1,0 – 1,0
Tetraciclina Anfotérica - Moderada 0,4; 0,8 – 0,6; 1,4
En el caso de una base débil, tras su administración parenteral, por ejemplo por vía
intramuscular (IM), se produce una rápida penetración desde la sangre hacia la leche
caracterizada por una pronta aparición de concentraciones mensurables en este fluido, por
una relación C máx (plasma) / C máx (leche) menor o igual a 1, por un t- lag entre la C máx (plasma) y la
C máx (leche) corto y por una relación ABC (plasma) / ABC (leche) menor o igual a 1 (Ziv, 1980a).
Durante el proceso mastítico y a medida que aumenta el grado de inflamación, la

composición química de la leche presenta cambios. Hay pasaje de iones, proteínas y células
de la inflamación desde la sangre hacia la luz glandular por el aumento de la permeabilidad
vascular. Las propiedades físicas de la leche también se ven afectadas y se produce un
aumento del pH, de la conductividad y de la viscosidad; mientras que la densidad y el
potencial de oxidación-reducción disminuyen (Korhonem y Kaartinen, 1985).
62
En la leche mastítica es esperable que el pasaje de las bases orgánicas se vea
disminuido, pues el pH aumenta y esto va en detrimento del atrapamiento iónico de estos
fármacos en la leche. Sin embargo, la liposolubilidad de este tipo de moléculas permite
suponer que la relación leche:plasma será siempre mayor o igual a 1(Ziv, 1980a).
En el caso de los ácidos orgánicos, la penetración se ve favorecida por el aumento del

pH lácteo. Sin embargo, estos compuestos alcanzarán relaciones superiores a 1 tan solo
cuando el pH lácteo sea superior a 7.4. Es por ello que las bases débiles son las más
adecuadas para tratar la mastitis por la vía parenteral (Ziv, 1980a).
1.2.2. Tratamiento intramamario
La vía IMM es la ruta de administración más utilizada en el tratamiento

antimicrobiano de la mastitis (Gruet et al., 2001). Sin embargo, existen muchos productos
que han sido lanzados al mercado sin el soporte científico necesario acerca de su
comportamiento PK y su eficacia clínica y bacteriológica.
Las ventajas de la administración por la vía IMM son las altas concentraciones
alcanzadas en la leche y la menor pérdida de principio activo debido a los procesos de
absorción y transferencia a través de las membranas biológicas (Gruet et al., 2001). Mientras
que las desventajas de esta vía pueden ser la despareja distribución de varios compuestos en
el interior de la ubre, el riesgo de contaminación por inoculación de bacterias a través del
canal del pezón y la posible irritación del tejido mamario por el fármaco o la formulación
utilizada (Gruet et al., 2001). Incluso, estudios in vitro han demostrado que los
antimicrobianos administrados por esta vía pueden afectar el proceso de fagocitosis a nivel
intramamario (Nickerson 1998).
Luego de la administración de una infusión IMM, el contacto entre el agente

antimicrobiano y el patógeno dentro de la glándula está supeditado a una serie de eventos
sucesivos (Ziv, 1980c):
63
1. Fase farmacéutica: Es aquella que comienza luego de la administración del
fármaco e incluye los siguientes pasos:
1.1. Desintegración del formulado.
1.2. Disolución del fármaco.
1.3. Excreción del fármaco en la leche.
2. Fase farmacocinética: Presupone la presencia del fármaco disponible en la leche

(disponibilidad farmacéutica) y comprende los siguientes eventos:
2.1. Absorción (leche: plasma)
2.2. Distribución (local y sistémica)
2.3. Metabolismo (sistémico)
2.4. Excreción (local y sistémica)
3. Fase farmacodinámica
El tipo de excipiente que contiene el formulado es el que determina la tasa de

liberación del fármaco y la fase farmacéutica es la que gobierna la forma inicial de la curva
de concentraciones versus tiempo del antimicrobiano en la leche (Ziv, 1980c; Mestorino,
1993; Mestorino y Errecalde, 2012).
Las formulaciones IMM utilizadas para el tratamiento de la mastitis durante el

período de lactancia contienen excipientes de liberación rápida, pues el objetivo es erradicar
la infección del tejido glandular y minimizar el período de descarte de la leche (Ziv, 1980c).
En los tratamientos IMM administrados al momento del secado, el proceso de

liberación del principio activo se prolonga temporalmente y tiene mayor influencia sobre la
forma inicial de la curva de concentración en función del tiempo (Ziv, 1980c). El excipiente
utilizado puede estar compuesto por aceite vegetal o mineral. La ventaja de los excipientes
que contienen aceite mineral, como por ejemplo los aceites de parafina o de glicerina, radica
en que demoran la liberación del principio activo y prolongan su permanencia en el interior
de la glándula (Nickerson 1998).
64
Luego de la administración de jeringas IMM, parte del formulado se perderá junto
con la leche extraída en los primeros ordeños post-tratamiento. Esta pérdida es despreciable
en el caso de los tratamientos efectuados al secado, pues las vacas son apartadas de la
rutina de ordeño. Sin embargo, con la interrupción de la rutina de ordeño se desencadenan
cambios fisiológicos en la glándula mamaria que pueden afectar a las fases farmacéutica y
PK.
El inicio de la fase PK presupone la existencia del fármaco disponible en la secreción

láctea y depende de la desintegración del formulado y la disolución del fármaco. Estos
procesos determinan la disponibilidad farmacológica.
La cantidad de fármaco recuperado en la leche está influenciada por varios factores,

entre los cuales se pueden nombrar el tipo de excipiente utilizado en la formulación, la tasa
de pasaje leche:plasma, el tamaño de la ubre y la cantidad de leche que en ella está
contenida (Ziv, 1980c).
El pasaje del antimicrobiano presente en leche implica el movimiento del fármaco a

través de una membrana biológica ya sea por difusión pasiva o transporte especializado. Los
factores que afectan el pasaje de los antimicrobianos desde la leche hacia el plasma o hacia
el interior celular, son los mismos que afectan la transferencia de los mismos desde la sangre
hacia la leche. Estos factores son el pK a de la molécula, la liposolubilidad de la fracción no
ionizada y el porcentaje de unión al tejido mamario (Ziv, 1980c; Mestorino y Errecalde,
2012). Los fármacos hidrosolubles atraviesan la membrana principalmente a través de los
canales proteicos (poros). Los fármacos liposolubles (polares y no polares) atraviesan la
membrana a través de la región lipoproteica y el pasaje de los mismos es directamente
proporcional al gradiente de concentración y a la liposolubilidad de la molécula. La fracción
no ionizada generalmente es más liposoluble que la ionizada y atraviesa la membrana
lipídica con mayor facilidad.
La capacidad de atravesar la barrera leche:plasma es expresada como coeficiente de

liposolubilidad por porcentaje de fracción no ionizada y la tasa de pasaje real puede ser
cuantificada mediante la relación C máx (plasma) / C máx (leche) o mediante la relación ABC (plasma) /
ABC (leche) (Ziv, 1980a).
65
El fenómeno de absorción leche:plasma trae como consecuencia la presencia del
agente antimicrobiano en plasma sanguíneo. En la circulación sistémica, el fármaco seguirá
los fenómenos PKs que se suceden luego de la absorción (distribución, metabolismo y
excreción) (Ziv, 1980b; Mestorino y Errecalde, 2012).
El fenómeno de distribución del antimicrobiano en el interior de la glándula se

produce por difusión pasiva de las moléculas a través de los componentes lipofílicos e
hidrofílicos de la secreción glandular. Este fenómeno se ve afectado por la unión del fármaco
al tejido mamario y/o a los componentes de la leche (Ziv, 1980c).
El proceso de excreción del antimicrobiano desde la glándula mamaria está

gobernado por el tipo de base utilizada, la cantidad de leche producida, las características
propias de la molécula, la salud de la glándula mamaria y el número de ordeños realizados
(Ziv, 1980c; Mestorino, 1993; Lucas, 2009; Turic, 2010).
En el caso de tratamiento IMM de secado, la eliminación de los antimicrobianos

desde la glándula mamaria puede ser expresada mediante una curva monoexponencial o
biexponencial. La velocidad de eliminación se ve afectada por la dosis, la naturaleza del
vehículo, las características propias del fármaco, el nivel de unión del antibacteriano al
contenido de la glándula y al tejido glandular (Ziv, 1980c; Mattie et al., 1997).
De manera que el fármaco seleccionado para el tratamiento de la mastitis deberá

tener un espectro apropiado, alcanzar concentraciones antimicrobianas en el foco de
infección (a nivel intracelular en el caso de mastitis por Staphylococcus aureus) sin afectar
otros sistemas, ser altamente liposolube para lograr una gran penetración a los sitios de
difícil acceso en donde se encuentran los microorganismos, a su vez deberá abandonar
rápidamente el sitio sin dejar residuos perjudiciales, y adicionalmente, deberá ser activo en
presencia de leche, pus y fundamentalmente ser activo a nivel intracelular.
Es decir, para que obtengamos una buena respuesta al tratamiento, el

microambiente del sitio de infección debe ser compatible con el fármaco elegido, por
ejemplo, el sobrenadante de un absceso es ácido, hiperosmótico e hiperiónico con relativa
baja concentración de sodio y cloro; y alta concentración de potasio y fosfato. Estas
condiciones dificultan la acción de la mayoría de los antimicrobianos. Los fármacos que se
66
unen en gran proporción a las proteínas plasmáticas, también lo hacen a las proteínas del
pus, por ejemplo, los aminoglucósidos y las polimixinas (Saran et al., 1995). Por otra parte,
los aminoglucósidos no son muy eficaces en un ambiente anaerobio debido a que dependen
del oxígeno para su transporte al interior de la bacteria.
La actividad antimicrobiana de la gentamicina se ve reducida de 16 a 32 veces si el

pH es ácido y se reduce aún más si hay fuerzas iónicas. De igual forma, los desechos de tejido
pueden proveer el sustrato adecuado a la bacteria para enmascarar los efectos del
trimetroprim y las sulfonamidas (Sumano et al., 1996).
El tamaño y la pureza del inóculo, así como la cantidad de fármaco activo influyen en
la actividad antimicrobiana. Muchas infecciones son polimicrobianas por lo que las
complejas interacciones entre los microorganismos, el húesped y los antimicrobianos
influyen sobre la actividad antimicrobiana en el sitio de infección. Estas condiciones no se
hacen evidentes en las pruebas de susceptibilidad in vitro.
1.3. PENETRACIÓN INTRACELULAR DE LOS ANTIMICROBIANOS
1.3.1. Parámetros físicoquímicos que controlan la penetración intracelular de antibióticos
La capacidad que puede o no tener un antimicrobiano para penetrar y acumularse en

el interior de la célula es una cuestión compleja, que sigue en general los principios
mencionados en el apartado anterior. Es decir, la capacidad de ingreso al ambiente
intracelular depende de factores físicos (peso molecular, constante de disociación,
liposolubilidad o unión a proteínas) y químicos (estructura básica, grupos radicales,
estereoisometría, movilidad electrónica, etc.) (Brown y Percival, 1978).
La lipofilia determina la capacidad de una molécula de atravesar por difusión pasiva

la bicapa lipídica de la célula. Los antimicrobianos muy hidrófilos, como los betalactámicos,
tienen dificultado este paso, mientras que las quinolonas, que en general tienen una lipofilia
moderada, son capaces de difundir a través de la bicapa lipídica. La mayor o menor lipofilia
de las quinolonas determinará, en parte, su mayor o menor concentración intracelular.
67
Otro parámetro fundamental, es la naturaleza ácido-base de las moléculas,
caracterizada por la constante de disociación Ka, cuya expresión logarítmica, es conocida
como el pKa. Para entender su importancia en el proceso de penetración de un
antimicrobiano hay que indicar primero que en el entorno fisiológico descrito existe un
gradiente de pH, el pH del medio extracelular es de 7.0 a 7.4, en el interior de los leucocitos
polimorfonucleares (PMN) es de 6.5-6.98 y en el interior de los lisosomas es de 5.0-5.4
(Molski, 1980). Como hemos mencionado, las formas ionizadas de los ácidos y bases
orgánicas débiles difunden más lentamente a través de las membranas biológicas que sus
formas no ionizadas. Por ello, y por el gradiente de pH existente entre el exterior y el interior
celular, las bases débiles suelen concentrarse y los ácidos débiles eluirse desde el interior
celular, ya que los lisosomas son los compartimientos más ácidos de la célula, con un pH de
alrededor de 5.0, el que es mantenido gracias a una bomba de protones. Entonces,
nuevamente es lógico predecir que las bases débiles se acumularán en el interior de estos
orgánulos, ya que se ionizarán y verán impedido su paso a través de la membrana del
lisosoma; de la misma manera que se acumulaban más en leche que en el plasma sanguíneo.
Por el contrario, los ácidos débiles difunden a través de la membrana plasmática en su forma
no ionizada, y no se acumulan, porque al continuar neutros en el interior celular pueden
difundir nuevamente hacia el exterior. Los betalactámicos son ácidos orgánicos, por lo que
son capaces de atravesar la membrana plasmática, pero en el interior celular no son
protonados y vuelven a salir, formando un equilibrio estable; por lo tanto son capaces de
penetrar, pero no de acumularse. Esto fue demostrado por Renard et als., en 1987,
sintetizando un derivado básico de bencilpenicilina, que fue capaz de penetrar y acumularse
en el interior celular a una concentración entre cuatro y cinco veces superior a la
concentración extracelular.
En el caso de las quinolonas, son moléculas de naturaleza anfotérica, ya que todas

ellas poseen un grupo carboxílico de carácter ácido y un grupo amino de carácter básico. Las
constantes de disociación de las quinolonas pueden definirse molecularmente, por lo que
obtendríamos dos macroconstantes (una para el grupo ácido y otra para el grupo básico), o
de forma submolecular y obtendríamos cuatro microconstantes. Las macroconstantes de
disociación cuantifican la característica básica global de la molécula, pero no pueden asignar
68
el protón a un lugar de unión determinado. Sin embargo, las microconstantes de disociación
describen la capacidad de unión de un protón a un grupo funcional determinado, y son muy
útiles para predecir las concentraciones de cada especie a un pH determinado.
Los estudios y revisiones realizados sobre el paso de las diferentes especies químicas
de quinolonas a través de la bicapa lipídica llegan a conclusiones contradictorias. Algunos
autores afirman que sólo las formas no ionizadas son capaces de atravesar la membrana
plasmática, que en principio es esencialmente impermeable a los iones cargados (Nikaido y
Thanassi, 1993). Mientras, otros autores afirman que los iones híbridos o "zwitteriones"
también pueden atravesar membranas biológicas, ya que su carga neta es nula (Furet et al.,
1996), e incluso en sustancias de peso molecular elevado, la deslocalización de las cargas
podría hacer que sustancias con suficiente lipofilia fueran capaces de difundir a través de las
membranas biológicas (Reymond et al., 1999). Takács-Nováck en 1990, realizó un estudio en
el cual cuantificó el porcentaje de cada microespecie presente a diferentes pHs, y llegó a la
conclusión de que la forma zwitteriónica siempre predomina sobre la neutra, aunque el
valor del cociente zwitterión/neutra depende del tipo de fluoroquinolona. La forma dipolar
es la predominante a pH fisiológico, y además a ese pH es cuando, en general, las
fluoroquinolonas expresan su máxima actividad antimicrobiana. Así pues, a pesar de su
carácter anfotérico, las quinolonas presentan a pH fisiológico una forma zwitteriónica que
les permite difundir pasivamente a través de la membrana plasmática en mayor o menor
grado. Quedaría también explicado por qué el pH extracelular es un factor fundamental a
tener en cuenta en los estudios de incorporación al interior celular.
Otro factor que también influye en la acumulación de los antimicrobianos en el

interior celular es la capacidad de unión a las proteínas. Esta unión, de naturaleza débil
(enlaces electroquímicos), es reversible, pero adquiere la suficiente importancia para
desplazar el equilibrio del antibiótico disuelto en el citosol y convertir a las proteínas en
verdaderos depósitos de antimicrobiano (el antibiótico unido a proteínas es inactivo).
Cuando la concentración de antibiótico libre en el citosol disminuye, el gradiente de
concentraciones se modifica, el equilibrio se desplaza y parte del antibiótico unido a la
proteína se libera. Esta acción es muy interesante al considerar la posibilidad de que las
69
células fagocíticas se conviertan en transportadores fisiológicos de antimicrobianos desde el
torrente circulatorio hasta el lugar de la infección (Reymond et al., 1999).
1.3.2. Mecanismos de penetración intracelular de los antibióticos
Los diferentes mecanismos por medio de los cuales los antimicrobianos pueden
alcanzar el interior celular son: fagocitosis, difusión pasiva a través de la membrana o de
poros acuosos y transporte activo.
Fagocitosis: a través de este mecanismo, el antimicrobiano es incluido en el interior

del PMN cuando fagocita a las bacterias.
Difusión pasiva: el paso a través de la membrana plasmática por difusión pasiva es

un mecanismo de transporte utilizado por aquellos antimicrobianos que a pH fisiológico se
encuentran en forma electroquímica neutra y son lipofílicos. Como ejemplo tenemos a la
rifampicina. En la determinación del mecanismo de difusión pasiva, las variables que se
suelen estudiar son la viabilidad celular, la temperatura y la saturación del proceso de
penetración.
En cuanto a las quinolonas, presentan un proceso de entrada que no es saturable en

los intervalos de concentraciones terapéuticas, lo que abogaría por una difusión simple a
través de la membrana plasmática. La baja temperatura disminuye, en general la
penetración de las quinolonas (excepto para trovafloxacina), y puede atribuirse a una
disminución del paso por difusión pasiva, ya que a 4 °C la membrana plasmática pierde
fluidez por enfriamiento y rigidez de los fosfolípidos que conforman la bicapa (Jonsonet al.,
1980).
Transporte activo: en los estudios para determinar el mecanismo de transporte

activo se utilizan diversos inhibidores metabólicos; unos son inhibidores de fuentes de
energía (NaCN, FNa, 2,4 dinitrofenol, iodoacetamida, carbonil cianida m-clorofenilhidrazona
[CCCP]), otros son desacoplantes de potencial de membrana como la ouabaína, o ionóforos
como el w-clorofenil hidrazona (CCP) y la gramicidina. Los inhibidores energéticos, en
general, afectan el paso de las quinolonas al interior celular, lo que sugiere que estos
70
antimicrobianos pasan al espacio intracelular también por transporte activo (Nikaido y
Thanassi, 1993).
También para caracterizar la penetración de los antibióticos se evalúa la estimulación

de las células empleando diferentes principios como el forbol-miristato-acetato (PMA) que
reestimula a la proteincinasa C dependiente de fosfolípidos; el formil-metionil-leucil-
fenilalanina (FMLP) que estimula la producción de AMPc por una vía dependiente de Ca2+; o
el zimosán que aumenta la actividad del NADPH por la vía de la fosfolipasa A 2 . En el caso de
las quinolonas, la estimulación de los PMN con zimosán o PMA aumenta significativamente
su paso al interior celular. En el caso de ciprofloxacina, Loo et al., en 1997 demostraron que
existe una relación estrecha entre el aumento de la incorporación de la quinolona al interior
celular y la estimulación por PMA del sistema enzimático de una proteincinasa C
dependiente de fosfolípidos. Pascual et al., en 1990, también encontraron un aumento
moderado (50%) en la penetración de ofloxacina y levofloxacina al interior del PMN
previamente estimulado con PMA, aunque (Vazifeh et al., 1999) no determinaron
modificaciones en la incorporación de la levofloxacina tras estimular los leucocitos con PMA
o FMLP. En los macrólidos de tipo cetólidos también se ha observado la influencia de estos y
otros sustratos, como el verapamilo, que modifica los mecanismos de transducción del
leucocito, disminuyendo la acumulación de todos los derivados de la eritromicina
(Abdelghaffar et al., 2001).
Igualmente se ha evaluado la influencia de determinados sustratos simples

(aminoácidos, nucleótidos, azúcares) en la penetración de las quinolonas, para observar
posibles fenómenos de competencia en los transportadores de membrana. Los resultados
son contradictorios, ya que hay autores que encuentran que el paso de ofloxacina disminuye
en presencia de aminoácidos (Pascual, 1989), mientras que otros no encuentran
modificación alguna (Taira et al., 1993). Parece que los nucleótidos, y en concreto la
puromicina y la adenosina, afectan al paso de la mayoría de las quinolonas estudiadas, lo
que nos inclinaría por un transportador común a todas ellas.
Es muy difícil, con estos datos, llegar a conclusiones claras sobre el mecanismo de
transporte de las quinolonas a través de la membrana plasmática, pero parece ser que
existiría más de un mecanismo implicado, aunque en las condiciones fisiológicas es la
71
difusión pasiva la que permite el paso mayoritario de las mismas; sin embargo, no hay que
descartar un transporte activo adicional.
1.3.3. Penetración de los diferentes grupos antibióticos en el interior de los PMN
Betalactámicos: numerosos estudios han demostrado que, tanto las penicilinas como
las cefalosporinas, se acumulan de manera escasa en el interior de los fagocitos, aunque ello
no significa que sean incapaces de atravesar la membrana plasmática (muchos compuestos
tienen lipofilia suficiente para difundir a través de la bicapa lipídica), sino que son incapaces
de quedar retenidos en el interior celular (Jonson et al., 1980, Turnidge, 1998). Todos los
betalactámicos poseen en su estructura fundamental un grupo carboxílico libre, y por lo
tanto se pueden considerar ácidos orgánicos. El pKa de este grupo se encuentra entre 3 y 5,
por lo que cabe esperar que estas moléculas penetren pero sean excluidas del interior
celular, al ser éste más ácido que el medio extracelular (Delcour, 2009). Es decir, los
betalactámicos son capaces de penetrar en el interior de la célula, pero no son retenidos por
ella. De hecho, un derivado básico de la bencilpenicilina, denominado dimetilaminopropil-
bencilpenicilamida, cuyo grupo carboxílico está enmascarado por un radical básico, se
acumula en el interior celular a una concentración de cuatro a cinco veces la extracelular
(Renard et al., 1987).
Aminoglucósidos: Muchos autores han mencionado que no penetran en la célula,

pero estudios en fibroblastos y macrófagos han demostrado que cuando estas células se
incuban durante varios días con aminoglucósidos, éstos antimicrobianos se acumulan,
lentamente pero de forma estable, con valores de concentración intracelular/extracelular
(I/E) de 2 a 4. La localización intracelular, aunque no homogénea, es mayoritariamente en
los lisosomas, por lo que parece que la penetración de los mismos se produce por
pinocitosis. Como los PMN tienen una vida media muy corta, y además no poseen la
capacidad de incluir sustancias por pinocitosis, es improbable que los aminoglucósidos se
acumulen en su interior (Van den Broek, 1989; Labro, 2000). Sin embargo, Hand y King-
Thompson en 1980, hallaron que aunque la acumulación de gentamicina en el interior de los
72
PMN era escasa, este aminoglucósido era capaz de disminuir el número de S. aureus
fagocitados.
Lincosaminas: presentan una gran capacidad de penetrar y acumularse en el interior

de varios tipos celulares. En los PMN el cociente I/E alcanza valores de 40. El mecanismo de
paso a través de la membrana plasmática es rápido, dependiente de energía, aumenta con la
fagocitosis y parece mediado por transportadores de nucleótidos; se localiza
intracelularmente en el citosol y los lisosomas (Koga, 1987; Iskandar y Walters, 2011). Sin
embargo no hay correlación entre la buena penetración y la subsiguiente actividad de
clindamicina frente a S. aureus fagocitado (Hand y Thompson, 1986). Se ha propuesto que
podría deberse a que la clindamicina inactiva los sistemas bactericidas de producción de
superóxido y peróxido de hidrógeno en el PMN, o que el antibiótico es inactivado por el pH
del citosol o el lisosoma, donde se localiza el microorganismo (Hand, 1988).
Macrólidos: la mayoría de ellos presentan la capacidad de penetrar y acumularse en

el interior de diferentes tipos celulares. En los PMN los valores de los cocientes I/E oscilan
entre 20 para claritromicina, 30 para eritromicina y roxitromicina, 20 a 300 para
azitromicina, y 200 a 400 para RU-64004. La penetración es rápida, parece ser dependiente
de energía y mediada por transportadores de nucleótidos (Vazifehet al., 1997; Van Bambeke,
2014). Intracelularmente parecen asociados a los lisosomas en los macrófagos y a los
gránulos azurófilos en los PMN (Vazifeh et al., 1997). La actividad intracelular de la mayoría
de los macrólidos es escasa (Hand. y, and King-Thompson 1986, Carrynet al., 2003; Van
Bambeke, 2014). En la roxitromicina esta baja actividad parece estar asociada a la capacidad
de inhibir en los PMN la producción de superóxido y peróxido de hidrógeno (Mtairag et al.,
1995). En otros macrólidos parece asociarse a la inactivación debida al pH ácido del
fagolisosoma donde se localizan (Pemán et al., 1991). Sin embargo, los nuevos macrólidos
como la azitromicina sí presentan actividad intracelular in vivo frente a S. aureus (Wildfeuer
et al., 1996, Carryn et al., 2003; Van Bambeke, 2014).
Fluoroquinolonas: Las concentraciones celulares de fluoroquinolonas generalmente

son 7 a 16 veces superiores a las extracelulares (Barcia-Macay et al., 2006). Se acumulan
rápidamente pero no hay, aún, una explicación convincente para su mecanismo. Se ha
identificado una ruta específica del transporte en los leucocitos (PMN) para ciprofloxacina,
73
junto con un transportador del aminoácido activado por el acetato del miristato del forbol
(Cao et al., 1992, Walters et al., 1999). Esta captación se podría regular, también, por la
activación de la proteína kinasa C (Koichi Hotta et al., 2002). La salida de la fluoroquinolona
es más rápida que la captación y está mediada probablemente por un transportador del
eflujo, que puede ser inhibido por el probenecid (Takahashi et al., 1998). Las
fluoroquinolonas intracelulares se han podido recuperar en el sobrenadante obtenido luego
del fraccionamiento celular (Loo et al., 1997, Prokesch y Hand, 1982). Esto se puede
interpretar de dos diversas maneras: la salida o eflujo de un compartimiento subcelular
específico es rápido; o las fluoroquinolonas originalmente se localizan en el citosol, pero
probablemente sean capaces de difundir en varios compartimientos subcelulares como lo
hacen en varios órganos del cuerpo.
1.4. BASES FARMACOLÓGICAS PARA HACER FRENTE A LA PROBLEMÁTICA
Históricamente un régimen de dosificación era determinado por parámetros

farmacocinéticos (PK), sin embargo hoy se sabe que la farmacodinamia (PD) juega también,
un rol muy importante. Es decir, la eficacia de los antimicrobianos in vivo, depende de su
perfil PK como también de las propiedades PD de los mismos.
La farmacodinamia (PD) es el estudio de los efectos bioquímicos y patofisiológicos de

los fármacos y sus metabolitos en el organismo (Benet et al., 1996).
Las concentraciones tisulares y en los fluidos orgánicos determinan los efectos

farmacológicos y toxicológicos, mientras que la concentración en el sitio de infección
determina el efecto antimicrobiano (Hyatt et al., 1995). De esta manera la interacción PK/PD
permite relacionar los datos de la actividad microbiológica de un antimicrobiano con el perfil
farmacocinético del mismo. La curva de concentración en función del tiempo del
antimicrobiano se determina en función de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para la
bacteria y los parámetros PKs son expresados en función de la misma. La CIM se define
como la menor concentración del fármaco que es capaz de prevenir el crecimiento del
microorganismo evaluado cuando se realiza la prueba de susceptibilidad por dilución en agar
74
o caldo. La CIM 50 es la concentración inhibitoria mínima capaz de inhibir el 50% de los
aislamientos evaluados, y la CIM 90 es aquella que inhibe el crecimiento del 90% (García
Rodríguez et al., 2000).
Así, se fijan las pautas posológicas para estos fármacos y los puntos de corte que
determinan la sensibilidad o resistencia de los distintos patógenos (Van Bambeke, 1999).
Recordemos que la ocurrencia de un episodio infeccioso depende de las

características del microorganismo causal, principalmente el volumen del inóculo y su
patogenicidad; y de la condición inmunológica del huésped. Es decir, en el tratamiento de las
enfermedades infecciosas, la correcta dosificación no depende solamente de las
características del huésped.
En la Figura 7 se muestra la estrecha relación que existe entre el microorganismo, el

huésped y el fármaco (Van Bambeke et al., 1999)
Figura 7: Triángulo de Davis: Interacción huésped-microorganismo-antimicrobiano.

Adaptado de Van Bambeke F, 1999.
El objetivo de la interacción PK/PD es establecer un protocolo terapéutico racional

que permita optimizar la utilización de los antimicrobianos para maximizar la eficacia clínica
y bacteriológica, minimizando la selección de cepas resistentes. La Administración de
Medicamentos y Alimentos (FDA, Food and Drug Administration) y la Agencia Europea de
medicina (EMA, European Medicine Agency) consideran que la integración PK/PD tiene gran
importancia en el desarrollo de nuevos fármacos y en la reevaluación de fármacos ya
existentes (Van Bambeke et al., 2001).
75
La Figura 8 muestra como la combinación de las propiedades PKs y PDs de los
antimicrobianos gobierna la actividad de los mismos en el sitio de infección y son factores
determinantes del resultado terapéutico.
Figura 8: Factores determinantes de la actividad antimicrobiana. Adaptado de Van Bambeke

F, 1999.
1.4.1. Parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos
Los parámetros farmacocinéticos, área bajo la curva concentración en función del

tiempo desde la hora 0 hasta las 24 horas (ABC 0-24h ) y la concentración máxima observada
(C max ) han sido integrados con el parámetro farmacodinámico in vitro “CIM” para obtener
las relaciones ABC/CIM (ABIC) y Cmax/CIM. Un tercer predictor, es T>CIM (porcentaje de
tiempo sobre CIM). Estos parámetros PK/PD, esquematizados en la Figura 8, son
considerados los principales determinantes de eficacia in vivo (Craig, 2001, Mouton et al.,
2005).
Se ha demostrado que elevados valores de ABIC y Cmax/CIM son importantes para

aquellos antimicrobianos cuya actividad depende de la concentración lograda como son las
fluoroquinolonas y los aminoglucósidos. Algunos antimicrobianos como los betalactámicos,
los macrólidos, glicopéptidos y otras drogas bacteriostáticas tienen efectos dependientes del
tiempo de exposición, donde el lapso de tiempo durante el cual las concentraciones son
mantenidas por encima de la CIM es importante; sin embargo, el aumentar la concentración
76
por arriba de cierto límite no incrementa el efecto bactericida o bacteriostático (Hyatt et al.,
1995; Renard et al., 1996).
Figura 9: Parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos que gobiernan la eficacia

antimicrobiana: C máx /CIM, ABC/CIM y T>CIM
El mecanismo de acción de cada familia de antimicrobianos determina una cinética

de acción específica. Por lo tanto y de acuerdo al criterio PD, los antimicrobianos se
clasifican en agentes cuya actividad bacteriológica es tiempo-dependiente o
concentración-dependiente.
Para los antimicrobianos cuya acción bacteriológica es tiempo-dependiente, el

parámetro PK/PD que mejor se correlaciona con la eficacia es el T>CIM (Craig, 1998; Mouton
et al., 2005), que corresponde al porcentaje (%) de tiempo interdosis durante el cual las
concentraciones del antimicrobiano se encuentran por arriba de la CIM 90 . Cuando se utiliza
este tipo de compuestos la optimización del tratamiento se basa en ajustar los intervalos
interdosis para lograr que la concentración antimicrobiana en el sitio de la infección no caiga
por debajo de la CIM (Van Bambeke y Tulkens, 2001).
Para los compuestos cuya acción bacteriológica es concentración-dependiente, los

parámetros ABC 0-24h /CIM o C máx /CIM son los que mejor predicen la eficacia (Craig, 1998). La
77
optimización del ABC 0-24h /CIM, cuya unidad es horas, se basa esencialmente en adaptar la
dosis diaria total, que es la que gobierna el ABC 0-24h . El parámetro C máx /CIM depende de la
cantidad administrada en la primera dosis (Bambeke y Tulkens, 2001), no tiene unidad
alguna, ya que es una relación. En el sitio de infección, la C máx depende a su vez de la
cantidad relativa de la dosis administrada que alcanza el mismo y de la velocidad a la cual
discurre su acceso.
Una clasificación más compleja involucra al efecto persistente y de esta manera

divide a los antimicrobianos en compuestos acción tiempo-dependiente con nulo a mínimo
efecto persistente, agentes acción tiempo-dependiente con prolongado efecto persistente y
agentes acción concentración-dependiente que poseen efecto persistente prolongado
(Tabla 5) (Jacobs, 2004).
El efecto persistente de los antimicrobianos puede ser de 3 tipos: el efecto post-

antibiótico (PAE), el efecto sub-CIM (ESC) y el efecto de potenciación leucocitaria (EPL). Los
antimicrobianos cuya acción es concentración-dependiente presentan generalmente PAE y
ESC considerables.
La supresión persistente del crecimiento bacteriano que sigue a la exposición de las

bacterias a los antimicrobianos se denomina efecto post-antibiótico (PAE) y es una de las
características PDs más relevantes para la optimización de los regímenes terapéuticos (Craig,
1991). El PAE ha sido demostrado para un número de compuestos entre los cuáles se
destacan los aminoglucósidos, la rifampicina, las fluoroquinolonas, los glucopéptidos y las
tetraciclinas (Aeschlimann et al., 1999; Boswell et al., 1999). El fundamento del PAE es que la
unión del antimicrobiano a las estructuras bacterianas desencadena una serie compleja de
alteraciones ultraestructurales que afectan la morfología y funcionalidad enzimática normal.
Como consecuencia de estos cambios, las bacterias supervivientes no recobran su
funcionamiento normal hasta pasado un tiempo más o menos largo (Pastor, 1992).
El ESC es aquel por el cual las concentraciones inferiores a la CIM producen retrasos
en el crecimiento de las bacterias y afectan la expresión de algunos de sus factores de
virulencia (Shryock et al., 1998). El ESC difícilmente puede integrarse al diseño de planes
78
terapéuticos ya que favorecería la exposición de los microorganismos a concentraciones
subóptimas y con ello al desarrollo de cepas resistentes (Van Bambeke y Tulkens, 2001).
Por último, el EPL es aquel por el cual las bacterias tratadas con antimicrobianos son
más sensibles a la fagocitosis y destrucción por parte del sistema inmune (Van Bambeke y
Tulkens, 2001). Este efecto ha sido demostrado para varios antimicrobianos aunque aún no
es de gran relevancia a la hora de diseñar los planes terapéuticos.
De acuerdo a esta nueva clasificación, la eficacia bacteriológica de los compuestos

tiempo-dependiente con nulo a mínimo efecto persistente se correlaciona mejor con el
T>CIM y en el caso de los agentes con prolongado efecto persistente el parámetro a tener en
cuenta es el ABC 0-24h /CIM (Jacobs, 2004).
Tabla 5: Clasificación de los agentes antimicrobianos desde el punto de vista PK/PD.

Adaptado de Jacobs M, 2004.
ACTIVIDAD BACTERIOLÓGICA PARÁMETRO PK/PD EJEMPLOS
Cefalosporinas
Tiempo- dependiente Porcentaje del intervalo inter-dosis Macrólidos
con PAE nulo a mínimo durante el cual la concentración tradicionalesa
permanece sobre la CIM (T>CIM) Monobactams
Oxazolidonas
Penicilinas
Azitromicinaa
Claritromicinaa
Tiempo- dependiente Área bajo la curva sobre la CIM en Clindamicina
con PAE prolongado función del tiempo desde la hora 0 Ketólidosa
hasta las 24 horas (ABC 0-24h /CIM) Estreptograminas
Tetraciclinas
Vancomicina
Área bajo la curva sobre la CIM en Aminoglucósidos

Concentración dependiente función del tiempo desde la hora 0 Fluoroquinolonas
con PAE prolongado hasta las 24 h (ABC 0-24h /CIM) Metronidazol
Concentración máxima sobre la CIM
(C máx /CIM)
a
Existen discusiones acerca de los parámetros apropiados y en los casos que corresponde, se discute más
adelante
De esta manera, han sido establecidos los parámetros PK/PD que mejor predicen la
eficacia clínica y la prevención de la selección de cepas resistentes para un gran número de
antimicrobianos. Sin embargo, con el objetivo de unificar criterios se ha determinado que un
79
ABC 0-24h /CIM 90 > 100 para cualquier tipo de antimicrobiano empleado, permitiría disminuir
los riesgos de desarrollo de resistencia bacteriana (Ronald, 2000). Por lo tanto, sea cual fuere
el grupo de antimicrobianos utilizados, el parámetro ABC 0-24h /CIM 90 podría aplicarse para el
control de la resistencia bacteriana.
Por otro lado existe una preocupación creciente dado que la selección de
microorganismos patógenos de los animales constituye un riesgo para la eficacia de los
antimicrobianos más utilizados en animales de consumo y es una amenaza para la salud
humana, debido a la transmisión de estos microorganismos por los alimentos. Se sabe que
las estrategias inapropiadas de administración pueden incrementar la velocidad con la cual
las bacterias resistentes a antimicrobianos son seleccionadas. La relación farmacocinética-
farmacodinamia que está asociada con el desarrollo de resistencia ha sido estudiada y para
muchos antimicrobianos (cefalosporinas y fluoroquinolonas) el ABIC desde las 0 hasta las 24
h fue un importante indicador en el desarrollo de resistencia, lo cual mejoró cuando la
exposición al antimicrobiano fue con un ABIC mayor a 100 (Thomas et al., 1998).
Las diferencias en las especies tanto de hospedadores como de bacterias, el estado

inmunitario y la localización de la bacteria (particularmente la localización intracelular)
afectarán la relación farmacocinética-farmacodinamia. Las ABIC y las concentraciones usadas
en la relación Cmax/CIM en la literatura, obtenidas a partir de estudios en ratas
neutropénicas han suministrado estimaciones conservadoras de éxito, cuando son
trasladadas a animales domésticos inmunocompetentes. Más aún, la relación
farmacocinética-farmacodinamia calculada con concentraciones plasmáticas no suministra
predicciones precisas de eficacia en situaciones como en la mastitis estafilocócica. En esta
situación, las concentraciones de antimicrobiano en el compartimiento mamario, y
particularmente en la localización subcelular de las bacterias, son muy diferentes a las del
plasma y la actividad de los antimicrobianos puede también ser afectada por el ambiente
ácido del fagolisosoma.
Como concepto general, se acepta que en los sistemas farmacocinéticos lineales, las
concentraciones plasmáticas del fármaco no unido a proteínas guardan una relación de tipo
lineal con respecto a las concentraciones en el espacio extracelular (Toutain et al., 2002).
80
Esto es relevante en el caso de infecciones bacterianas en las cuales el agente etiológico se
ubica extracelularmente.
Sin embargo, la teoría de la relación lineal entre concentraciones plasmáticas y

extracelulares periféricas no explica cual es la proporción que guardan estas concentraciones
entre sí (Toutain y Lees, 2004).
Por otra parte, factores como el sitio o el órgano de ubicación del agente bacteriano
y su irrigación sanguínea, conjuntamente con el grado de unión y afinidad del fármaco a las
proteínas plasmáticas determinan que las concentraciones plasmáticas totales no siempre
reflejen en forma directa la concentración libre del agente antibacteriano en el sitio de
localización de la bacteria (Mueller et al., 2004; Toutain y Bousquet-Melou, 2004).
Como se ha mencionado con anterioridad, es corriente que la selección de un agente

antimicrobiano y su dosis sean seleccionados tomando en cuenta como parámetro
farmacocinético (PK) los niveles de concentración plasmática total del mismo y un
parámetro farmacodinámico (PD) estático in vitro como su concentración inhibitoria mínima
(CIM) sobre un determinado tipo de microorganismo (Schentag, 1999).
Este parámetro farmacodinámico estático proveerá dentro del ámbito de la

investigación solo una limitada información acerca de la actividad de un agente
antibacteriano, ya que:
- La CIM no aporta ninguna información acerca de la velocidad de la actividad

antibacteriana, como por ejemplo, si esta aumenta al incrementarse las concentraciones
en el sitio de localización de la bacteria y viceversa (Craig, 1998).
- La CIM no provee ningún tipo de información acerca de la persistencia de la actividad

antibacteriana luego que la exposición del microorganismo al antibiótico ha cesado
(efecto posantibiótico) (Craig, 1998).
- La CIM, al referirse a una concentración constante de antimicrobiano solo aporta

información farmacodinámica de tipo cualitativa, ya que hace referencia a una respuesta
de tipo del todo (concentración mayor a CIM) o nada (concentración menor a CIM)
(Craig, 1998).
81
De manera que la CIM no refleja totalmente el contexto in vivo, en donde las
bacterias no están expuestas a una concentración constante de antibacteriano sino que esta
cambia en función del tiempo transcurrido desde su administración, como consecuencia de
los procesos de absorción, distribución, eliminación y excreción (Ping Liu et al., 2005).
Una de las metodologías empleadas para estudiar in vitro el efecto de una

concentración constante de fármacos antibacterianos o bactericidas sobre un número
conocido de bacterias es el estudio de las curvas de muerte bacteriana. En estas la evolución
de una población bacteriana en función del tiempo y en ausencia de antibacteriano son
comparadas con las curvas obtenidas en presencia de un antibiótico (Craig, 2002).
La actividad de un antibiótico sobre una población de gérmenes también varía en

función de factores tales como concentración y tiempo del agente antibacteriano en
contacto con la bacteria; y variaciones del pH del medio (Errecalde 2004; Mestorino y
Errecalde, 2012).
La velocidad de muerte bacteriana difiere según el tipo de mecanismo de acción de

los antibióticos, existiendo diferencias notables entre la provocada por agentes bactericidas
y bacteriostáticos (Drugeon et al., 1990).
El tiempo de latencia (Tlag.) antes del inicio de la acción del principio químico en
cuestión, varía también en función del antibacteriano seleccionado y de la concentración del
mismo en el medio de cultivo (Drugeon et al., 1990).
Así mismo, la duración del efecto posantibiótico varía en función del agente
antibacteriano, su mecanismo de acción, la concentración estudiada y el tiempo de contacto
de este con los gérmenes. También se ha reportado que la cinética de muerte bacteriana en
condiciones in vitro es modificada (aumentada o disminuida) por variaciones del pH, siendo
esta una variable que se debe considerar para simular las condiciones in vivo, ya que se
establecen gradientes de pH entre el interior celular y el entorno extracelular (desde 5 en los
fagolisosomas, 6.5 en el citosol o 7.4 en el espacio extracelular) o bien el medio en donde se
encuentran las bacterias puede ser modificado a causa de diversas alteraciones tisulares
(tejidos inflamados o presencia de material necrótico) provocadas por el mismo agente
infeccioso.
82
Aunque las curvas experimentales de muerte bacteriana permiten realizar una
interpretación dinámica de la interacción fármaco-bacteria, los alcances de este método no
se llegan a explotar en su totalidad hasta que los datos experimentales son analizados por
medio de modelos matemáticos.
En este sentido, la farmacodinamia ha evolucionado desde una concepción

netamente empírica hasta una concepción cuantitativa, permitiendo describir y simular el
efecto de un antibiótico sobre una población bacteriana en función del tiempo mediante la
modelización matemática de los datos experimentales.
La principal ventaja del estudio farmacodinámico de antibióticos mediante la

modelización matemática de las curvas de muerte bacteriana, radica en que se pueden
analizar y comparar los efectos de diferentes perfiles de concentración del agente
seleccionado, al tiempo que proporcionan información más detallada acerca del efecto
antibacteriano en función del tiempo (Mueller, 2004).
Por lo tanto, la construcción de curvas de muerte bacteriana sería un procedimiento

más racional para explicar la interacción fármaco-bacteria in vivo que el clásico parámetro
estático de la MIC.
Es por todo lo mencionado con antelación que fundamentamos nuestro trabajo de

investigación con el objetivo de realizar un aporte al conocimiento del comportamiento
farmacocinético/farmacodinámico a nivel intracelular, de los procesos de acumulación y
de la actividad intracelular de antimicrobianos frente a Staphylococcus aureus aislados de
bovinos portadores de mastitis subclinica.
83
2. HIPÓTESIS
2.1. Premisas
Consideramos que siguiendo los nuevos conocimientos generados durante las 2

últimas décadas, acerca de la terapia antibacteriana, ésta debe ser replanteada desde su
base.
El incremento del conocimiento de la farmacocinética y la farmacodinamia de los

antibacterianos, permitirá desarrollar sistemas de administración que aseguren la eficacia
antibacteriana y el control de la presencia de residuos en leche proveniente de animales
tratados por mastitis subclínica, con mínima emergencia de cepas resistentes.
En un país como Argentina, con una enorme potencialidad ganadera y que debe
volver a transformarse en proveedor internacional de alimentos al mundo globalizado, el
aseguramiento de la calidad de los alimentos de origen animal es un problema insoslayable y
la única forma de resolverlo es a través de la investigación, el desarrollo tecnológico y la
extensión.
El uso irracional de los antimicrobianos se puede combatir mediante la

implementación de esquemas terapéuticos racionales basado en los siguientes aspectos:
1. Perfil microbiológico de la mastitis. El diagnóstico clínico y de laboratorio

(aislamiento, tipificación y antibiograma) es uno de los pilares fundamentales del uso
racional de los agentes antimicrobianos.
2. Farmacocinética/Farmacodinamia de antibióticos en animales productores de

leche portadores de mastitis. La compresión de la relación de los parámetros
farmacocinéticos con los parámetros farmacodinámicos, PK/PD, en estos animales
redundará en un aumento de la eficacia antimicrobiana y en una disminución de la selección
decepas resistentes, aspectos fundamentales que hacen al éxito de la terapia.
3. Diseño de formulaciones y de regímenes terapéuticos más eficaces y seguros. El

desarrollo de nuevos medicamentos debe involucrar más que el descubrimiento de una
nueva sustancia, el aprovechamiento integral de sus efectos sobre el organismo, se debe
84
considerar como se transporta la molécula al sitio apropiado, y una vez allí lograr que esté
disponible para su uso y sea eficaz.
4. Establecimiento de los períodos de retirada adecuados siguiendo los protocolos y

métodos armonizados utilizados en los estados miembros de la comunidad europea.
2.2. Formulación de hipótesis
De acuerdo a las premisas mencionadas el presente trabajo se basó en las siguientes

hipótesis:
1.- La penetración del antimicrobiano a sitios subcelulares es el primer requisito para
generar eficacia antibacteriana frente a Staphylococcus aureus.
2.- Las diferentes condiciones de pH a nivel subcelular afectan la potencia antimicrobiana de

los compuestos utilizados frente a Staphylococcus aureus.
3.- El aumento del tiempo de contacto aumenta proporcionalmente la eficacia del

antimicrobiano frente a Staphylococcus aureus.
4.- Un antibacteriano concentración dependiente necesitará menos tiempo de contacto a

nivel subcelular para eliminar la infección subclínica que un antibacteriano tiempo
dependiente.
5.- Un bactericida rápido será el agente que genere mayor eficacia frente a la mastitis
subclínica por S. aureus.
6.- Cuantificar la concentración de antibiótico a nivel subcelular permite desarrollar

protocolos terapéuticos más racionales y eficientes.
En definitiva, el estudio del tratamiento antibacteriano de la mastitis subclínica

basado en conocimientos farmacocinéticos/farmacodinámicos permitirá el diseño de planes
de administración correctos, maximizando la eficacia terapéutica, repercutiendo en la
producción de alimentos de origen animal libres de microorganismos patógenos y de
residuos perjudiciales para la salud pública e industria.
85
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos generales
Contribuir a una mejor comprensión de la farmacocinética/farmacodinamia de

diversos antibióticos utilizados en mastitis bovina por S. aureus, como modelo de infección
bacteriana intracelular, recurrente de difícil resolución.
Diseñar protocolos terapéuticos de máxima eficacia frente a este tipo de infecciones

bacterias con mínima emergencia de cepas resistentes.
3.2. Objetivos específicos
1. Aislar cepas de Staphylococcus aureus provenientes de animales portadores de

mastitis subclínica.
2. Seleccionar mediante pruebas de susceptibilidad bacteriana, agentes
antimicrobianos entre el siguiente menú: ß-lactámicos: penicilina, amoxicilina,
amoxicilina-clavulánico, cloxacilina, penetamato; macrólidos: azitromicina,
claritromicina, espiramicina, tilmicosina; fluoroquinolonas: enrofloxacina,
danofloxacina, marbofloxacina
3. Calcular la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida
mínima (CBM) de los antibióticos seleccionados frente a las cepas aisladas.
4. Evaluar la incidencia del pH en la CIM
5. Construir curvas de muerte bacteriana mediante el método basado en la
concentración constante de antibiótico.
6. Seleccionar el modelo farmacodinámico adecuado para explicar la interacción
fármaco-bacteria en función del tiempo.
7. Calcular, si lo hubiere, la duración del efecto posantibiótico en función del
microorganismo seleccionado, el antibiótico elegido, la concentración establecida
y el tiempo de contacto fármaco-bacteria.
8. Estudiar “in vitro” los cambios farmacodinámicos producidos por variaciones del
pH del medio.
86
9. Determinar la penetración celular de los antimicrobianos ensayados
10. Evaluar la actividad intracelular de los antimicrobianos ensayados mediante
conteo de microorganismos viables
11. Seleccionar el antimicrobiano más adecuado para el tratamiento de S. aureus,
con base en los datos previamente obtenidos.
12. Diseñar un régimen de dosificación racional para erradicar el Staphylococcus
aureus.
87
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 MATERIALES
4.1.1 Productos biológicos y materiales para microbiología
1. Cepas de referencia Staphylococcus aureus ATCC 25923 y ATCC 29213.

2. Cepa de referencia Micrococcus luteus ATCC 9341.
3. Discos de antibiograma: Penicilina (10UI); Ciprofloxacina (5µg); Gentamicina (10µg);
Azitromicina (15µg); Tetraciclina (30µg); Eritromicina (15µg); Cefotaxima (30µg).
Todos del Laboratorio Britania, Argentina. Amoxiciclina-Ácido clavulánico (20-10µg)
(Pfizer Argentina).
4. Leche bovina cruda libre de antimicrobianos.
5. Medio de cultivo agar para antibióticos No 1 (Laboratório Britania, Argentina).
6. Medios de cultivo agar Mueller Hinton (AMH) (Laboratorio Britania, Argentina).
7. Medio de cultivo caldo Mueller Hinton (CMH) (Laboratorio Britania, Argentina).
8. Medio de cultivo caldo tripticasa soya (Laboratorio Britania, Argentina).
9. Medio de cultivo agar nutritivo (Laboratorio Britania, Argentina).
10. Plasma de conejo.
11. EDTA
12. Plasma sanguíneo bovino libre de antimicrobianos.
13. Sangre bovina libre de antimicrobianos.
14. Ratones de la cepa (C57/h3) (N=100).
4.1.2 Reactivos, solventes y diluyentes
1. Azitromicina, 84% p/p (Romikin, Argentina)

2. Danofloxacina mesilato, 75.27% p/p (Pfizer, USA)
3. Penicilina G, 1596 UI/mg (Sigma Aldrich)
4. Ciclofosfamida 200mg/mL (Criopharma)
5. Solución fisiológica estéril 0.86 g de NaCl en 100 mL de agua destilada
88
6. Agua tridestilada estéril
7. Agua bidestilada estéril
8. Alcohol etílico 96º
9. Metanol PA (Dorwil, Argentina)
10. Metanol calidad HPLC (Mallinckrodt Chemicals Works USA)
11. Acetonitrilo calidad HPLC (JT Backer USA)
12. Ácido fosfórico 85.1% (JT Backer USA)
13. Tetrahidrofurano (JT Backer USA)
14. Fosfato monobásico de sodio (Anhedra, Argentina)
15. Fosfato dibásico de sodio (Anhedra, Argentina)
16. Hidróxido de potasio (Anhedra, Argentina)
17. Heparina sódica (Abbot, Argentina)
18. Ficoll Hypaque 1077 (Sigma Aldrich)
19. Ficoll Hypaque 1119 (Sigma Aldrich)
20. Medio para cultivo celular RPMI 1640 (Sigma Aldrich)
21. Peróxido de hidrógeno 3%
22. Azul Tripan (Sigma Aldrich)
23. Glicerol (Anhedra, Argentina)
24. Ácido sulfúrico (UCB, Bélgica)
25. Acido Clorhidrico 1N (Anhedra, Argentina)
26. Cintas para medición de pH 5-10 (Merck KGaA, Alemania)
4.1.3 Material descartable y de laboratorio
1. Gradillas para tubos de ensayo de 10 y 16 mm de ancho (Deltalab, España)

2. Erlenmeyers graduados de 100, 250, 500 y 1000 mL (IVA, Argentina)
3. Probetas de vidrio de 50, 100, 250, 500 y 1000 mL (IVA, Argentina)
4. Matraces aforados de vidrio de 10, 100 y 250 mL (IVA, Argentina)
5. Jeringas descartables de 10, 20 y 60 mL (Prexajet, Argentina)
6. Agujas hipodérmicas estériles 18G 40 x 1.2 mm y 20G 25 x 0.9 mm (Prexajet,
Argentina)
89
7. Bolsas para extracción de sangre estéril con anticoagulante a base de citrato de sodio
(Rivero, Argentina)
8. Filtros de membrana de 0.45 µm de diámetro de poro (GE Osmonics USA)
9. Puntas para micropipetas de 5-200 µL y 100-1000 µL (Deltalab, España)
10. Pipetas de vidrio estériles de 1, 2, 5, 10 y 20 mL (IVA, Argentina)
11. Pipetas Pasteur de plástico estériles descartables (IVA, Argentina)
12. Tubos de vidrio borosilicato cónicos de 16 x 100 y 10 x 70 mm (IVA, Argentina)
13. Tubos cónicos de polipropileno autoclavables de 15 mL y tapa a rosca (Tecnon,
Argentina)
14. Crioviables estériles, autoclavables, de 3 mL con tapa a rosca (Simport, Canadá)
15. Tapones de goma (Monojet, Sherwood Medical USA)
16. Tapones de polipropileno (Deltalab, España)
17. Tapones de algodón estériles
18. Placas de Petri estériles descartables de 10 cm de diámetro (Massobact, Argentina)
19. Placas de vidrio estériles (25 cm x 25 cm x 2.5 cm de altura)
20. Cilindros de acero inoxidable estériles (10 mm de alto, 6 mm de diámetro interno y 8
mm de diámetro externo)
21. Cuchara espátula de acero inoxidable
22. Calibre Vernier
23. Termómetro de laboratorio 0-100 ºC (IVA, Argentina)
24. Anza de platino (Britania, Argentina)
25. Hisopos estériles
26. Pinzas anatómicas
27. Varillas de vidrio
28. Esferas de vidrio
29. Espátulas de plástico descartables
30. Algodón hidrófilo
31. Cinta adhesiva 15 mm de diámetro
32. Fibra indeleble
33. Bandas elásticas de látex
90
34. Planilla de distribución de muestras y patrones en los cilindros
35. Diagrama guía para la ubicación de números y cilindros
36. Jaulas metálicas estériles, con cama de aserrín estéril.
4.1.4 Instrumental
1. Micropipetas automáticas de 20-200 µL y 100-1000 µL (High Tech Lab, Poland)

2. Balanza de precisión (Sartorius, Germany)
3. Balanza granataria (Acculab USA)
4. Baño termostático modelo Masson (Vicking S.R.L., Argentina)
5. Baño ultrasónico modelo 250 (Acuasonic, VWR Scientific products, USA)
6. Evaporador concentrador de muestras (CHRIST CT 02 – 60 SR, Alemania)
7. Agitador multitubo (Genie, 2 Scientific Industries Inc., USA)
8. Centrifuga (Presvac, Argentina)
9. Centrifuga refrigerada RC 5B PLUS con rotor SLA3000 (Sorvall USA)
10. Equipo de filtración por vacío (Millipore USA)
11. Bomba de vacío
12. Autoclave
13. Estufa de cultivo modelo SL70C (Sanjor, Argentina)
14. Estufa de secado (Elibet, Argentina)
15. Mecheros de Bunsen
16. Espectrofotómetro UV – 2100 PC. (BIOTECK Italia)
17. Freezers -20ºC (Whirlpool, Argentina)
18. Heladera con freezer (Whirlpool, Argentina)
19. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) integrado por:
19.1. Autoinyector Gilson Modelo 234.(Gilson Inc., France)
19.2. Bomba isocrática modelo 307 (Gilson Inc., France)
19.3. Detector fluorescente (Thermo sPAEration products Fluoromonitor IM III)
19.4. Software Uni Point System (Gilson Inc., france)
19.5. Columna cromatográfica Phenomenex Luna 5µm, 1.50 x 4 mm C 18
(Phenomenex)
91
19.6. Pre-columnas Guard filter RP-C 18 (Phenomenex)
4.1.5 Equipamiento Informático
1. Computador personal Toshiba A 105

2. Impresora Epson TX 105
3. Software para análisis farmacocinético y estadístico WinNonlin Professional 6.3
(Scientific consulting Inc., Cary, N.C.)
4. Software estadístico Sigma Plot 12.0 (Systat Software, Inc.)
4.2. MÉTODOS
4.2.1 Selección de cepas y pruebas bioquímicas
El laboratorio de Estudios Farmacológicos y Toxicológicos (LEFyT) de la Cátedra de

Farmacología, cuenta con un importante cepario implementado a lo largo de los últimos
años a partir de aislamientos realizados de muestras de leche procedentes de vacas
portadoras de mastitis subclínica. Estas muestras fueron obtenidas siguiendo los
procedimientos descriptos por el Consejo Nacional de Mastitis de los Estados Unidos (NMC,
National Mastitis Council 1981).
Un total de 220 cepas fueron repicadas en agar Mueller Hinton (AMH) suplementado
con 5% de sangre bovina estéril, y llevadas a incubación durante 24 horas a 35°C.
Posteriormente se realizó una observación macroscópica con el fin de evaluar en cada una
de ellas características como color, tamaño de las colonias, aspecto general y presencia o
ausencia de hemólisis.
El S. aureus en agar sangre presenta óptimo crecimiento a temperaturas entre 34-

37ºC. Tras 18 a 24 horas de incubación, se observan colonias de 1-3 mm de diámetro, de
color blanco amarillento, debido a la producción de carotenoides.
92
En general el aspecto macroscópico de las colonias corresponde a colonias grandes,
cremosas, convexas y de bordes lisos.
Las cepas fueron mantenidas en caldo tripticasa soya con 15% de glicerol a -70°C en
crioviales autoclavables de 2.5 mL de capacidad. Una vez obtenidos los cultivos de cada
aislamiento, procedimos a realizar las pruebas bioquímicas de rutina encaminadas a
confirmar el diagnóstico bacteriológico de género y especie para S. aureus:
• Coloración de Gram
• Prueba de catalasa en placa
• Prueba de coagulasa en tubo.
4.2.1.1. Tinción de Gram
Esta tinción es denominada así en honor al bacteriólogo danés Christian Gram, quien
la desarrolló en 1844 (Bergey et al., 1994). Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram,
las bacterias pueden dividirse en Gram-positivas y Gram-negativas.
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las

diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared bacteriana es la
responsable de la forma y tamaño que caracteriza a cada microorganismo y previene la lisis
celular en medios osmóticamente adversos para el mismo. El material que confiere rigidez a
la pared bacteriana es un peptidoglicano, siendo gruesa en bacterias Gram-positivas debido
a que está constituida por varias capas interconectadas de peptidoglicano con algo de ácido
teicoico. Generalmente, el 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es
peptidoglicano.
Mientras que la pared de las bacterias Gram-negativas, contiene una capa mucho
más delgada, únicamente de peptidoglicano y rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo el 10% - 20% de la pared
de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.
En la Figura 10 se presentan las diferencias estructurales entre bacterias Gram+ y

Gram-.
93
Figura 10. Diferencias estructurales entre bacterias Gram+ y Gram–
(http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v5n2/sanchez.htm).
Procedimiento
Sobre un portaobjetos y con la ayuda de un ansa de platino, correctamente

desinfectada con el mechero de Bunsen, extendemos una gota de la suspensión bacteriana
en caldo nutritivo con 10 % de glicerol. El portaobjetos es pasado varias veces sobre la flama
del mechero hasta secarlo completamente, luego añadimos una gota del colorante cristal
violeta, lo dejamos secar durante un minuto y lo lavamos con agua. Se vuelve a secar,
colocamos sobre la muestra una gota de tinte Gram iodine y secamos nuevamente por un
minuto. Lavamos la lámina con agua directamente de la canilla y la dejamos secar. Añadimos
una gota de alcohol 70%, secamos durante un minuto, y lavamos con agua nuevamente. Una
vez está seca la lámina, añadimos una gota de safranina y dejamos secar por un minuto,
volvemos a lavar con agua, esperamos a que seque y observamos al microscopio.
Interpretación
Las bacterias Gram-positivas tienen una gruesa capa de péptidoglicano y gran

cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o
acetona reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos
grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared
celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular, etc). En contraste,
las bacterias Gram-negativas tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglicano
ligada a una membrana externa formada por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana
94
externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer
colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante, por lo
cual presentan una coloración final de rosa a rojo (Bergey et al., 1994).
4.2.1.2. Prueba de catalasa
La prueba de la catalasa se usa para diferenciar miembros de la familia

Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcacea.
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) en agua

y oxígeno. Es una hemoproteína de estructura similar a la hemoglobina, excepto, porque los
cuatro átomos de hierro de su molécula están en el estado oxidado (Fe3+), en lugar del
estado reducido (Fe2+). Cabe recordar que, exceptuando los estreptococos, la mayor parte
de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales de oxidación

del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule, resulta
letal para las células bacterianas. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno (desprendimiento de burbujas).
Procedimiento
Alistamos una lámina portaobjetos sobre la cual realizamos la prueba y

desinfectamos correctamente el ansa de siembra con el mechero de Bunsen. Obtenemos
una colonia a partir de un cultivo de 24 h en AMH suplementado con 5% de sangre bovina.
Posteriormente sobre esta muestra agregamos una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y
observamos la formación o no de burbujas.
Interpretación
Se considera que la aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia

constituye una reacción positiva. Debido a que algunas bacterias poseen enzimas distintas a
95
la catalasa que pueden descomponer también el peróxido de hidrógeno, la observación de
unas pocas pequeñas burbujas después de 20 a 30 segundos no se considera resultado
positivo. Además, los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual se debe tener el cuidado de no
tomar eritrocitos junto con el material de la colonia.
4.2.1.3. Prueba de coagulasa
La coagulasa es una enzima de composición química desconocida con actividad

similar a la protrombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da como
resultado la formación de un coágulo visible en sistemas apropiados. In vivo la coagulasa
produce una barrera de fibrina alrededor de la localización de la infección estafilocócica,
impidiendo la fagocitosis del agente patógeno. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se
utiliza para identificar S. aureus y diferenciarlo de otras especies de Staphylococcus spp.
Cuando en un tubo de ensayo se prepara una suspensión en plasma de

microorganismos productores de coagulasa con una sustancia de suero (factor de reacción
con la coagulasa), se forma un complejo que a su vez reacciona con el fibrinógeno para
producir el coágulo de fibrina.
Procedimiento
Con un ansa de siembra estéril colectamos una colonia a partir del centro de un
cultivo en AMH. Esta muestra la emulsionamos en un tubo conteniendo 0.5mL de plasma de
conejo, la llevamos a incubación a 35ºC durante 4 horas, y una vez pasado este tiempo,
procedemos a observar la formación del coágulo inclinando ligeramente el tubo. Como cepa
control para la prueba de coagulasa se utilizó S. aureus ATCC 25923.
Los tubos en los cuales se notó una leve formación de coágulo, fueron reincubados a
temperatura ambiente para leer nuevamente los resultados después de 18 horas.
96
Interpretación
La prueba de coagulasa en tubo se consideró positiva si se detectaba cualquier grado

de formación de coágulos. Al inclinar el tubo con suavidad se tuvo en cuenta no agitar,
debido a que la agitación puede deshacer los coágulos parcialmente formados. La fibrinólisis
producida por los microorganismos también puede disolver los coágulos poco después de su
formación.
4.2.2. Estudio de susceptibilidad por antibiograma
El procedimiento utilizado para evaluar la susceptibilidad bacteriana fue el método

de difusión en agar, ya que es el recomendado por el Subcomité de Estudios de
Susceptibilidad Antimicrobiana en Veterinaria del Instituto de Estándares de Laboratorios
Clínicos (de sus siglas en inglés CLSI: Clinical and Laboratory Institute) (CLSI, 2009). Este
procedimiento es una adaptación de lo que se detalla en el documento M2-Performance
Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test (NCCLS, 2000), originalmente descripto
por Bauer, Kirby y colaboradores en 1966.
Consiste en depositar en la superficie del agar, previamente inoculado con el

aislamiento a evaluar, discos de papel impregnados con diferentes antimicrobianos. Al
entrar en contacto con la superficie húmeda del agar, cada disco absorbe agua y el
antimicrobiano difunde radialmente a través del espesor del medio de cultivo. De esta
manera se forma un gradiente de concentración alrededor de cada disco y, luego de 18 –
24horas de incubación, eventualmente se definen zonas de inhibición. La medida de los
diámetros de los halos de inhibición permite interpretar los resultados de acuerdo a las
siguientes categorías: sensible (S), intermedia (I) o resistente (R).
La concentración de antimicrobiano en la interfase entre bacterias en crecimiento y

bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración
inhibitoria mínima (CIM) obtenida por métodos de dilución. Sin embargo, los métodos disco-
placa no permiten una lectura directa del valor de la CIM (García Rodríguez et al., 2000).
97
4.2.2.1. Medio de cultivo
El agar Mueller Hinton (AMH) es el medio adecuado para utilizar en las pruebas de
susceptibilidad (CLSI 2008). Entre las ventajas de este medio de cultivo podemos mencionar:
el correcto desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas, las escasas diferencias entre
los lotes comerciales y la ausencia en su fórmula de timina o timidina, sustancias inhibidoras
de las sulfamidas y del trimetoprim (García Rodríguez et al., 2000; CLSI 2008; 2009).
El medio de cultivo fue preparado siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Luego de ser esterilizado por autoclave, se mantuvo en baño termostático hasta alcanzar
una temperatura de 48 - 50 ºC.
Utilizando una pipeta de vidrio estéril, 25 mL del medio de cultivo fueron trasvasados a
cada una de las placas de Petri. Las mismas se ubicaron sobre una superficie horizontal y
nivelada, con el fin de lograr una capa de agar uniforme de 4 mm de profundidad en toda su
superficie.
Las placas preparadas fueron mantenidas a temperatura ambiente y una vez gelificado
el agar, se llevaron a 4 ºC para su utilización al día siguiente. Para comprobar la esterilidad
del medio de cultivo, 2 placas preparadas con el agar proveniente de cada matraz utilizado
fueron incubadas durante 24 h a 35 ºC.
El control del pH del medio de cultivo gelificado y a temperatura ambiente se realizó

con cintas para control de pH (Merck KGaA, Germany). De esta manera se comprobó que el
medio de cultivo tuviera siempre el pH adecuado: 7.2 – 7.4.
Previo a su utilización, las placas fueron mantenidas a temperatura ambiente durante

2 h.
4.2.2.2. Inóculo bacteriano
El método utilizado para la preparación de los inóculos fue el de suspensión directa de

colonias (CLSI 2008).
El día anterior a la realización del antibiograma, todos los aislamientos a evaluar y un

repique de la cepa de referencia (S. aureus ATCC 25923) fueron sembrados en placas con
98
agar sangre. Las cuales fueron incubadas durante 20 h a una temperatura de 37 °C.
Transcurrido el período de incubación y utilizando un ansa estéril, se tomaron 2 a 4 colonias
de cada aislamiento y cada uno de ellos fue inoculado en 5 mL de caldo tripticasa soya
estéril. Luego de agitar durante unos minutos, se incubó en estufa a 35ºC durante 2 h, se
comparó el inóculo con una turbidez equivalente al 0.5 de la escala de MacFarland en
solución fisiológica (que equivale aproximadamente a 1 x 107 UFC/mL). Cuando la turbidez
fue superior se ajustó con solución fisiológica estéril y cuando fue necesario se agregaron
más colonias del aislamiento correspondiente (CLSI 2008).
A partir de cada aislamiento inoculado en caldo y en el transcurso de los 15 min

posteriores a la preparación, fueron sembradas 2 placas utilizando en cada caso 1 hisopo
estéril y atóxico. El hisopo fue introducido dentro de la suspensión y al retirarlo se rotó
varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de
eliminar el exceso de inóculo. Para obtener un crecimiento uniforme en la placa de Petri, el
hisopo fue deslizado por toda la superficie de la misma en 3 repeticiones rotando la placa
60º cada vez y por último fue deslizado por la periferia del agar. Luego de 3 - 5 min de
secado, pero no más de 15 min, se procedió a depositar los discos (CLSI 2008).
4.2.2.3 Discos de antibiograma
Los frascos o contenedores de los discos de papel se mantuvieron almacenados en

freezer a -20 ºC y libres de humedad (CLSI 2008, 2009).
Una hora antes de su utilización, fueron llevados a temperatura ambiente. Una vez
atemperados y utilizando pinzas estériles, los discos se colocaron sobre la superficie del agar
inoculado ejerciendo una leve presión para asegurar el perfecto contacto con el medio de
cultivo. Con el objetivo de evitar la superposición de los halos de inhibición, y siguiendo las
recomendaciones del CLSI 2008, no se colocaron más de 5 discos en cada placa de Petri de
10 cm de diámetro.
Los discos incluidos en la prueba fueron: penicilina (10 UI), amoxicilina-ácido

clavulánico (20-10 µg), ciprofloxacina (5 µg), azitromicina (15 µg), gentamicina (10 µg),
tetraciclina (30 µg), eritromicina (15 µg) y cefotaxime (30 µg).
99
4.2.2.4. Incubación de las placas
Las placas fueron llevadas a la estufa de cultivo antes de que transcurrieran 15 min
post-colocación de los discos de antimicrobianos. Dentro de la estufa se colocaron en
posición invertida y apiladas en grupos de no más de 5 placas (García Rodríguez, 2000). La
incubación se realizó a 35 ºC y en atmósfera aerobia durante 18 h. Transcurrido este tiempo,
se procedió a la observación y medición inmediata de los halos de inhibición.
4.2.2.5. Lectura de los halos de inhibición
Todas las placas fueron leídas por la misma persona y utilizando el mismo calibre de
Vernier. Como corresponde cuando se utilizan medios traslúcidos, las placas fueron
observadas sobre el reverso y con luz transmitida (CLSI 2008).
Se consideró como zona de inhibición al área circundante a un disco que mostró

ausencia de crecimiento visible a simple vista. Las colonias pequeñas que aparecieron dentro
de los halos no fueron consideradas.
La figura Nº11 muestra la apariencia de la prueba de antibiograma al momento de su

lectura.
Figura 11: Antibiograma correspondiente a un aislamiento de S. aureus

causante de mastitis subclínica
100
4.2.2.6. Controles de calidad
La cepa de referencia utilizada para supervisar la exactitud del método fue S. aureus
ATCC 25923 (CLSI 2002). Al igual que las cepas problema, esta fue mantenida a una
temperatura de -70 ºC en crioviales con caldo tripticasa soya y 15% de glicerol.
Cada vez que se realizaron estudios de antibiograma, se incluyó a la cepa de referencia

entre los aislamientos evaluados. Dos días antes de realizar los antibiogramas, la cepa fue
sembrada en una placa de agar sangre e incubada a 37ºC, durante 18 - 20 h. A partir de este
cultivo puro se realizó un repique de 24 h de incubación que fue utilizado para preparar la
suspensión empleada en la placa para antibiograma (CLSI 2008).
Los halos de inhibición de la cepa de referencia fueron comparados con los intervalos
que el CLSI 2009 (Tabla 2, documento M31-A3) determina como aceptables (Tabla 6).
Tabla 6: Valores de referencia establecidos por el CLSI para los diámetros de los
halos de inhibición de la cepa S. aureus ATCC 25923
ANTIMICROBIANO CONTENIDO DIÁMETRO ACCEPTABLE (mm)
DEL DISCO S. aureus ATCC 25923
Penicilina 10 UI 28-29 b
Gentamicina 10 µg 19-27 a
Azitromicina 15 µg 21-26 b
Eritromicina 15 µg 21-27 b
Tetraciclina 30 µg 24-30 a
a
Valores de referencia tomados del documento CLSI M31-A3
b
Valores de referencia tomados del documento CLSI M100-S23.
Dentro de las novedadesmás relevantes publicadas en enero de 2013 en el documento

M100-S23 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para Staphylococcus spp. se
eliminaron los criterios de interpretación (puntos de corte) de todos los β- lactámicos a
excepción de: penicilina, oxacilina y cefoxitina. Entre los β-lactámicos ahora disponibles,
penicilina: representa a todas las penicilinas lábiles a penicilinasa - oxacilina: representa a
todas las penicilinas estables a penicilinasa - cefoxitina: representa el marcador sustituto de
oxacilina.
Para el control de los inóculos se preparó una dilución correspondiente a la turbidez

0.5 de la escala de MacFarland. Para lo cual se diluyeron 0.5 mL de cloruro de bario 0.048 M
101
(1.173 g de cloruro de bario dihidrato, 1.175% m/v) en 99.5 mL de ácido sulfúrico 0.18 M
(0.36 N, 1% v/v) con agitación constante. La solución obtenida se dividió en alícuotas de 6 mL
que fueron distribuidas en tubos con tapa a rosca y almacenadas en la oscuridad a
temperatura ambiente (CLSI 2008). Mensualmente se controló la absorción a 625 nm, la
debía estar entre 0.08 y 0.10.
4.2.2.7. Interpretación de resultados
Una vez leídas las placas, se procedió a la interpretación de los resultados según los
puntos de corte que establece el CLSI (Tabla 7). La mayoría de los valores de referencia
utilizados corresponden al documento M31-A3 - Performance standards for antimicrobial
disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from animals (CLSI 2008). Los halos
producidos por ciprofloxacina y azitromicina fueron comparados con los puntos de corte que
establece el documento M100-S19 - Disk diffusion supplemental tables (CLSI, 2009).
Tabla 7: Valores de referencia utilizados para la interpretación de los resultados obtenidos a partir de
los estudios de susceptibilidad por antibiograma frente a S. aureus
ANTIMICROBIANO CONCENTRACION DIÁMETRO (mm) OBSERVACIONES
DEL DISCO S I R
Penicilinaa 10 UI ≥ 29 ≤ 28
Gentamicinaa 10 µg ≥ 15 13-14 ≤ 12
Azitromicinab 15 µg ≥ 18 14-17 ≤ 13
Eritromicina 15 µg ≥ 21 ≤ 16
Tetraciclinaa 30 µg ≥ 19 15-18 ≤ 14 Para todas las tetraciclinas
a
Valores de referencia tomados del documento CLSI M31-A3
b
Valores de referencia tomados del documento CLSI M100-S23
El término sensible (S) indica que la infección ocasionada por la cepa evaluada podría
tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales del antimicrobiano (García
Rodríguez, 2000).
El término intermedio (I) o de sensibilidad intermedia indica que el halo de inhibición,

traducido en valores de CIM, se aproxima a la concentración antimicrobiana alcanzable en la
sangre y/o los tejidos. En estos casos podría esperarse buena eficacia clínica cuando el
antimicrobiano utilizado alcanza altas concentraciones en el sitio de infección o cuando la
102
dosis empleada es superior a la habitual (García Rodríguez, 2000). Se incluye en esta
categoría a aquellos antimicrobianos cuyos márgenes de toxicidad son estrechos (CLSI 2008).
El término resistente (R) hace referencia a los microorganismos que no serán inhibidos
por las concentraciones que el antimicrobiano alcanza en la sangre y/o en los tejidos.
También son resistentes aquellos microorganismos que poseen mecanismos de resistencia
específicos frente al antimicrobiano evaluado (García Rodríguez, 2000).
4.2.2.8. Conservación de las cepas
Luego de la realización de los antibiogramas, los aislamientos fueron acondicionados

para su conservación a -70 ºC. Para lo cual, se preparó un caldo tripticasa soya al que se le
agregó un 15% de glicerol. Una vez esterilizado, el caldo fue dispensado en crioviales (2 mL/
criovial) y estos fueron sometidos nuevamente a esterilización por autoclave.
Posteriormente, cada aislamiento fue inoculado en 2 crioviales para su conservación por
duplicado.
Antes de su utilización, todos los aislamientos fueron sembrados en placas de agar

sangre e incubados a 37 ºC durante 24 h.
4.2.2.9. Selección de los antimicrobianos a evaluar
De la totalidad de las cepas evaluadas por la prueba de susceptibilidad por antibiograma,

se seleccionaron un total de 10 al azar, las cuales fueron susceptibles a macrólidos, penicilina
G y fluoroquinolonas, para continuar con los ensayos encaminados a cumplir los objetivos de
esta tesis. Los antimicrobianos seleccionandos para realizar las pruebas ulteriores fueron:
Penicilina G, Azitromicina y Danofloxacina. Estos tres antimicrobianos fueron seleccionados
como representantes de cada uno de los tres grupos de antimicrobianos según la
clasificación basada en pautas farmacocinéticas/farmacodinamicas:
103
1. Antibióticos acción Tiempo dependientes con escaso/nulo efecto postantibiótico:
ß-lactámicos: Penicilina G,
2. Antibióticos acción Tiempo dependientes con prolongado efecto postantibiótico:

Macrólidos azálidos: Azitromicina,
3. Antibióticos acción Concentración dependientes con prolongado efecto

postantibiótico: Fluoroquinolonas: Danofloxacina.
4.2.3. Determinación de la Concentración mínima inhibitoria (CIM)
Con las 10 cepas seleccionadas se procedió a determinar la Concentración Inhibitoria

Mínima (CIM) a través de la prueba cuantitativa de macrodilución en caldo, basada en la
determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones
crecientes del antimicrobiano (García Rodríguez et al., 2000; CLSI 2008). Tradicionalmente
estos métodos cuantitativos se han usado para la determinación de la CIM y la
concentración mínima bactericida (CMB) de los antimicrobianos. En la mayoría de los casos
se preparan diluciones del antimicrobiano en progresión geométrica en base 2, utilizando un
medio de cultivo adecuado. Posteriormente se inocula dicho medio y tras la correspondiente
incubación, para permitir el crecimiento del microorganismo, se realiza la lectura
determinando qué concentración causa la inhibición del crecimiento del microorganismo.
Los métodos de dilución se consideran de referencia para la determinación cuantitativa de la
actividad de los antimicrobianos. Son los métodos indicados cuando, además de la actividad
inhibitoria, se quiere determinar también la actividad bactericida. La gran cantidad de
variables (dependientes del microorganismo, del medio de cultivo, del inóculo) que influyen
en estos métodos son responsables de oscilaciones en el resultado finalmente obtenido.
De esta forma se determinan los valores de CIM para las cepas destinadas al estudio.
Además de evaluar la sensibilidad de los microorganismos a cada antimicrobiano
seleccionado a pH 7.4, que es el habitual del medio reconstituido, se evaluó la modificación
o no de la sensibilidad antimicrobiana a pH 6.5 y 5.0, con el fin de emular las condiciones de
104
acidez a nivel subcelular a las cuales se encuentra enfrentado frecuentemente el S. aureus,
una vez que ha ingresado al interior celular. Como así también se evaluó el comportamiento
bacteriano en presencia de suero bovino (SB) y en leche.
El SB fue obtenido a partir de sangre venosa de bovinos adultos que no habían

recibido tratamiento antibiótico durante los últimos seis meses. La esterilidad de las
muestras de suero fue corroborada por ausencia de desarrollo bacteriano mediante pruebas
bacteriológicas clásicas.
La leche fue obtenida a partir de vacas Holando Argentino en producción, sanas que
tampoco habían recibido tratamiento antibiótico alguno. Fue sometida a a 100 °C por 30
segundos con la finalidad de destruir los inhibidores naturales, fundamentalmente aquellos
termorresistentes como son lisozimas y ribonucleasas. Posteriormente fue comprobada su
esterilidad por ausencia de desarrollo mediante pruebas bacteriológicas al igual que el SB.
4.2.3.1. Modificación del pH del medio de cultivo.
El CMH, se preparó siguiendo las especificaciones del fabricante. Para acidificarlo,

una vez preparado, se agregó 1 mL de HCl 1N a un litro de medio de cultivo para llevar a pH
6.5 y 1.25 mL de HCl 1N a igual volumen de medio de cultivo para obtener un pH 5.
Se realizaron 3 repeticiones para cada pH y para cada antimicrobiano frente a cada

cepa en estudio, siguiendo el protocolo estandarizado por la Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (García Rodríguez et al., 2000).
Procedimiento
Diluciones de los antimicrobianos.
Para la preparación de la solución madre de cada antimicrobiano, la droga pura,

valorada por el fabricante, fue pesada en una balanza analítica y diluida en el volumen
necesario del solvente recomendado por la CLSI (2008).
105
Para el cálculo de la concentración se consideró la pureza de la sustancia, con el fin de
ajustar la masa de activo a pesar. Aplicamos alguna de las siguientes fórmulas propuestas
por la CLSI:
Peso (mg)= Volumen (mL) x Concentración (µg/mL) Ec. 4

Potencia (µg/mg)
Volumen (mL)= Peso (mg) x Concentración (µg/mL) Ec. 5
Potencia (µg/mg)
Como regla general, la solución stock se prepara a una concentración 10 veces superior
a la concentración mayor que se desea evaluar.
A partir de la solución madre, realizamos diluciones seriadas utilizando los diluyentes

recomendados hasta obtener una solución stock de trabajo a una concentración 4 veces
superior a la mayor concentración que se deseaba evaluar. Esta solución de trabajo fue el
punto de partida para las diluciones seriadas que luego fueron confrontadas con el inóculo
bacteriano (CLSI 2008).
Todas las soluciones que contenían antimicrobianos fueron empleadas el mismo día de
su preparación y no fue necesario esterilizarlas debido a que la contaminación de las mismas
es infrecuente (García Rodríguez et al., 2000). A continuación se mencionan los solventes y
diluyentes empleados para la preparación de las soluciones stock y diluciones seriadas de los
antimicrobianos utilizados en la determinación de las CIMs.
Tabla 8. Solventes y diluyentes empleados para la preparación de las soluciones stock de

Azitromicina, Danofloxacina y Penicilina G.
ANTIMICROBIANO SOLVENTE DILUYENTE
AZITROMICINA ETANOL 95% MEDIO DE CULTIVO/AGUA

DANOFLOXACINA AGUA MEDIO DE CULTIVO/AGUA
PENICILINA G ETANOL 95% MEDIO DE CULTIVO/AGUA
106
Selección y preparación del medio de cultivo.
El CMH es el medio de cultivo recomendado para las pruebas de susceptibilidad (CLSI

2008). Este medio ha demostrado muy buena reproducibilidad entre los lotes, posee baja
cantidad de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclinas; y permite buen
crecimiento de la mayoría de los microorganismos patógenos (CLSI 2008).
El medio de cultivo se preparó, siguiendo las recomendaciones del fabricante y fue

distribuido en los tubos de vidrio borosilicato para posteriormente ser esterilizado en
autoclave.
Se empleó una batería de 8 tubos con 1 mL de CMH por cada combinación

microorganismo-antimicrobiano y un tubo sin antimicrobiano como control positivo del
crecimiento bacteriano.
Preparación del inóculo.
Los inóculos bacterianos ajustados a 0.5 de la escala de Mcfarland (como

mencionamos anteriormente), fueron diluidos 1 en 100, es decir 100 µL del inóculo inicial en
9.9 mL de caldo Tripticasa Soya. Estas suspensiones fueron las que se añadieron a la batería
de tubos (que contenían 1 mL de caldo con antimicrobiano) y de esta manera se obtuvieron
concentraciones bacterianas de 5 x 105 UFC/ml. Los inóculos diluidos 1:100 fueron utilizados
dentro de los 15 min posteriores a su preparación, tal como lo indica el (CLSI 2008).
Preparación de las diluciones seriadas e inoculación de los tubos
Antes de preparar los inóculos, se dispuso una batería de 9 tubos con 1mL de CMH
estéril y sin antimicrobiano, por cada aislamiento que se deseaba probar frente a cada uno
de los antimicrobianos seleccionados.
Para preparar las diluciones seriadas, utilizamos una micropipeta P1000 y puntas
desechables estériles, añadimos al tubo número 1 de la batería 1 mL de la solución stock del
antimicrobiano correspondiente. Este primer paso supone la dilución a la mitad de la
solución stock. Tras mezclar adecuadamente transferimos 1 mL al siguiente tubo, proceso
107
que se repitió hasta llegar al octavo tubo, del cual se eliminó 1 mL de medio con
antimicrobiano para mantener el volumen final de 1 mL.
El noveno tubo contenía, en todos los casos, 1 mL de caldo de cultivo sin

antimicrobiano para evaluar el crecimiento normal del microorganismo a modo de control
positivo (García Rodríguez et al., 2000; CLSI, 2008).
Es importante tener en cuenta que antes de inocular cada tubo con la suspensión
bacteriana, las concentraciones en la batería de diluciones debían ser el doble de las
concentraciones finales a evaluar. De esta manera, al ser inoculados los tubos con 1 mL de
suspensión bacteriana, se lograba nuevamente una dilución 1:1 de las concentraciones pre-
existentes en los mismos (García Rodríguez et al., 2000; CLSI, 2008).
Este mismo procedimiento se repitió para los diferentes pHs (7.4; 6.5 y 5) y para CMH
enriquecido con suero bovino estéril (SB).
En el siguiente esquema (Figura 12), se presenta la forma en la cual se realizaron las

diluciones seriadas de los antimicrobianos para la determinación de la CIM.
Figura 12. Preparación de diluciones seriadas de los antimicrobianos para la

determinación de la CIM por el método de macrodilución en caldo
108
Diluciones seriadas de azitromicina.
El solvente utilizado para preparar la solución madre de azitromicina (1000 µg/mL)

fue etanol al 95%. Posteriormente utilizamos CMH estéril como diluyente para realizar las
diluciones seriadas, hasta obtener una solución stock de trabajo de 64 µg/mL. A partir de la
misma se realizaron las diluciones seriadas para obtener un rango de 32 µg/mL a 0.25
µg/mL. El rango final, luego de agregar 1 mL de inóculo bacteriano fue de: 16 µg/mL a 0.125
µg/mL.
Diluciones seriadas de Danofloxacina
Se preparó una solución madre de danofloxacina en agua tridestilada estéril a una

concentración de 1000 µg/mL. Posteriormente utilizamos CMH estéril como diluyente para
realizar las diluciones seriadas, hasta obtener una solución stock de trabajo de 64 µg/mL. A
partir de la cual se obtuvo un rango de diluciones inicial de 32 µg/mL a 0,25 µg/mL. El rango
final, luego agregar 1 mL de inóculo bacteriano a cada tubo fue: 16 µg/mL a 0.125 µg/mL.
Diluciones seriadas de Penicilina G
El solvente de la solución madre de Penicilina G (1000 µg/mL) fue agua tridestilada

estéril. Posteriormente utilizamos CMH estéril como diluyente para realizar las diluciones
seriadas, hasta obtener una solución stock de trabajo de 32 µg/mL. A partir de ésta, se
realizaron nuevas diluciones seriadas hasta obtener un rango inicial de 16 µg/mL a 0.125
µg/mL y un rango final de 8 µg/mL a 0.0625 µg/mL.
Incubación de las diluciones
Una vez inoculados con la suspensión bacteriana correspondiente, los tubos fueron
incubados en estufa de cultivo a 35 ºC durante 18 h (CLSI, 2008).
109
4.2.3.2. Lectura e interpretación
La CIM corresponde a la mínima concentración de antibiótico en donde no se observa

desarrollo (turbidez) tras pasadas las 18 horas de incubación, se expresa en μg/mL.
Posteriormente y teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa cepa, se recurrió a
las tablas (CLSI, 2008) para definir según los valores que en ellas aparecen, si las cepas en
estudio eran sensibles o resistentes a cada antibiótico determinado.
En la Figura 13 se esquematiza la determinación de la CIM por el método de

macrodilucion.
Figura 13: Lectura y determinación de la CIM
Controles de calidad
La cepa de referencia recomendada cuando se realizan estudios de susceptibilidad de

estafilococos por métodos de dilución es S. aureus ATCC 29213 (CLSI, 2008). La misma se
mantuvo a una temperatura de -70 ºC en crioviales con caldo tripticasa soya y 15% de
glicerol.
Cada vez que se realizaron estudios de susceptibilidad por el método de dilución, la

cepa de referencia fue incluida entre los aislamientos evaluados. Dos días antes, la cepa se
sembró en una placa de agar sangre y luego de su incubación a 37 ºC durante 18 a 20 h, se
resembró para obtener un repique de 24 h. Este nuevo repique fue el que se utilizó para
preparar la suspensión empleada en la determinación de la CIM de referencia (CLSI, 2008).
110
Tabla 9 rangos aceptables establecidos por CLSI (2008) como CIMs de S. aureus ATCC 29213.
ANTIMICROBIANOS RANGOS ACEPTABLES (µg/mL)

S. aureus ATCC 29213
Azitromicina 0.5 a 2 (Azitromicina)a
Penicilina G 0.25 a 2 (Penicilina G)b
Danofloxacina 0.06-0,25b
a
Valores de referencia tomados del documento CLSI M100-S17
b
Valores de referencia tomados del documento CLSI M31-A3.
4.2.4. Determinación de la Concentración Bactericida Mínima (CBM)
La concentración bactericida mínima (CBM), se define como la mínima concentración

de antimicrobiano capaz de producir la muerte de la mayoría de los organismos viables (>
99.9%) después de 24 hs de incubación bajo condiciones estandarizadas (CLSI, 2008). Se la
utiliza como un complemento de la CIM, debido a que está sujeta a variables metodológicas.
Para calcularla se emplean procedimientos en los que bacteria y antimicrobiano se
enfrentan en un caldo, como vimos anteriormente. Se parte por lo tanto, del mismo método
que utilizamos para obtener la CIM, para comprobar en los tubos sin crecimiento, qué
concentración de antimicrobiano ha matado, no sólo inhibido, el cultivo bacteriano.
En general la CIM y la CBM, en los antibióticos considerados bactericidas, están

próximas, habitualmente difieren en una o dos diluciones.
El método de macrodilución en tubo es el preferido, porque el inóculo es mayor y se

controlan mejor las variables técnicas.
Procedimiento
Partimos de los tubos sin crecimiento de la batería empleada para determinar la CIM
(es decir del tubo correspondiente a la CIM y de los posteriores en una escala doble de
menor a mayor concentración de antimicrobiano). Tomamos los tubos sembrados sin
crecimiento, los agitamos suavemente y sembramos 100 µL de cada uno de ellos en placas
de Petri con AMH. Para lograr una distribución homogénea en la placa empleamos perlas de
111
vidrio. Incubamos a 35ºC. Se realizó la lectura de las colonias que habían crecido a las 24 h y
se calculó qué número de colonias representaba el 0.1% del inóculo inicial.
Considerando que el inóculo final en la prueba de la CIM fue de 5 x 105 UFC/mL, y

teniendo en cuenta que la CBM se define como la muerte del 99.9% de las bacterias
presentes en el mismo, las placas que presentaron 500 UFC/mL o menos, fueron las que
representaron la concentración bactericida mínima del antimicrobiano evaluado.
Control de calidad
Se empleó, como para la determinación de la CIM, S. aureus ATCC 29213 (CLSI,

2008).
4.2.5. Curvas de letalidad bacteriana (CLB)
Los efectos ejercidos por los antimicrobianos pueden ser medidos “in vitro” e “in
vivo” a través de la exposición de cultivos de microorganismos a distintas concentraciones
fijas de antibióticos, tomando muestras en diferentes tiempos durante un período de 24
horas y determinando la cantidad de bacterias en cada muestra (Vogelman y Craig, 1986). Es
decir, se valora la capacidad de matar en relación con el tiempo y con distintas
concentraciones fijas de antimicrobiano. En este sentido, es un proceso complementario de
la concentración bactericida mínima (CBM). La curva de letalidad o muerte, es un método
cinético de determinación del poder bactericida.
Consiste en enfrentar un inóculo normalizado a concentraciones fijas de

antimicrobiano en un caldo de cultivo, contando con un control sin antibiótico (curva de
crecimiento control). Se hace un recuento bacteriano a diferentes tiempos. Así nos permite
determinar el porcentaje de muerte bacteriana alcanzado por una concentración fija de
antimicrobiano bajo condiciones controladas. Este porcentaje de muerte se determina
midiendo el número de células viables (unidades formadoras de colonias –UFC-) a diferentes
intervalos de tiempo como mencionamos.
112
El poder bactericida se establece cuando se produce una disminución de las UFC en 3
logarítmos decimales en un tiempo determinado. Con esta técnica también se pueden
valorar los fenómenos de persistencia, paradójico y de tolerancia. Utilizando este método se
ha comprobado que los aminoglucósidos y las fluoroquinolonas son rápidamente
bactericidas y concentración dependiente. Es imprescindible previamente haber realizado el
cálculo de la CIM, preferentemente por el método de dilución en caldo (Sociedad Española
de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2001; CLSI 2008).
El “fenómeno paradójico o de Eagle”consiste en la presencia de un mayor número de

bacterias supervivientes a concentraciones superiores a la CBM.
La “tolerancia”es la desaparición de la capacidad de matar de un antibiótico

bactericida en un determinado aislamiento o especie. Su significado clínico es dudoso
aunque puede determinar en algunas infecciones la necesidad de asociar este
antimicrobiano con otro. Esta situación ha sido comprobada en infecciones estafilocócicas
que no responden al tratamiento con un antibiótico.
La “persistencia” se da cuando una pequeña población resiste a la acción bactericida,

suele ser menor del 0.1% y por esto, la definición de CBM se refiere a la muerte del 99.9%
del inóculo. Aparece generalmente con los ß-lactámicos.
Procedimiento
Para cada combinación microorganismo/antimicrobiano, empleamos una batería de

tubos; que se preparó adicionando a cada uno 1mL de CMH, leche o suero bovino, con cada
una de las concentraciones de antimicrobiano a evaluar, según se describe a continuación.
El procedimiento seguido para la CLB se realizó empleando cinco baterías de tubos

por cada cepa analizada para cada antimicrobiano en cuestión. En la primera batería, se
determinó la curva de muerte a pH 7.4, en la segunda a pH 6.5, en la tercera a pH 5, la cuarta
se realizó utilizando leche esterilizada por ebullición como caldo de cultivo y finalmente en la
quinta batería el CMH fue adicionado con 40% de suero bovino estéril y libre de
antimicrobianos.
113
Cada una de estas baterías estuvo conformada por 7 tubos de vidrio conteniendo
concentraciones del antimicrobiano en cuestión, correspondientes a 0.25 CIM, 0.5 CIM, 1
CIM, 2 CIM, 4 CIM y 8 veces la CIM. Un octavo tubo, sin antimicrobiano, fue usado como
control de crecimiento bacteriano.
El inóculo bacteriano se enfrentó al antimicrobiano a diferentes concentraciones y a

determinados intervalos de tiempo (0, 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h). Se tomaron submuestras de
cada uno de los tubos de las baterías y se realizaron diluciones seriadas que fueron
sembradas en placas de Petri con AMH.
Cada placa se incubó a 35°C durante 24 hs. Transcurrido ese tiempo se procedió a
realizar la lectura con el consiguiente conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) a
fin de observar el efecto del antimicrobiano sobre la cepa analizada. El límite de detección
para esta prueba fue de 10 UFC/mL de muestra.
4.2.5.1. Preparación de las diluciones seriadas de los antimicrobianos
Se prepararon diluciones para azitromicina, danofloxacina y penicilina G. Las

concentraciones de los antimicrobianos fueron calculadas individualmente en base a los
valores de las CIMs de los antimicrobianos frente a cada cepa analizada en cada condición de
pH evaluado.
Azitromicina
La solución madre de azitromicina (1000 µg/mL), se elaboró utilizando como solvente

etanol al 95%. Posteriormente y utilizando CMH estéril como diluyente, realizamos
diluciones seriadas, hasta obtener una solución stock de trabajo de 32 µg/mL.
A partir de esta solución de trabajo, se efectuaron diluciones seriadas para lograr el

rango final de estudio para cada uno de los pH analizados. Así para pH 7.4, donde la CIM fue
de 1 µg/mL, trabajamos con un rango de diluciones desde los 8 µg/mL hasta 0.125 µg/mL, las
cuales corresponden a 8 veces la CIM hasta 1/8 de CIM.
114
Para pH 6.5, donde la CIM fue de 8 µg/mL, trabajamos con un rango de diluciones
desde los 64 µg/mL hasta 1 µg/mL, las cuales corresponden nuevamente a 8 veces la CIM
hasta 1/8 de CIM.
desde los 256 µg/mL hasta 8 µg/mL, las cuales corresponden a 4 veces la CIM hasta 1/8 de la
CIM.
Para realizar las CLB en leche y suero utilizamos las diluciones correspondientes a pH
6.5 y 5, respectivamente.
Danofloxacina
La solución madre de Danofloxacina (1000 µg/mL) se elaboró utilizando como

solvente agua tridestilada estéril. Posteriormente y utilizando CMH estéril como diluyente,
realizamos diluciones seriadas, hasta obtener una solución stock de trabajo de 32 µg/mL.
A partir de esta solución de trabajo, se realizaron diluciones seriadas para lograr un

rango final de estudio para cada uno de los pH analizados, según se presenta a continuación:
desde los 8 µg/mL hasta 0.125 µg/mL, es decir se trabajó con concentraciones a 8 veces la
CIM hasta 1/8 de CIM.
desde los 8 µg/mL hasta 0.1251 µg/mL (entre 8 veces la CIM a 1/8 de CIM).
desde los 16 µg/mL hasta 0.25 µg/mL (8 veces la CIM hasta 1/8 de CIM).
Para realizar las CLBs en leche y suero utilizamos las diluciones correspondientes a pH
6.5 y 5, respectivamente.
115
Penicilina G
La solución madre de Penicilina G (1000 µg/mL) se elaboró utilizando como solvente

agua tridestilada estéril. Posteriormente y utilizando CMH estéril como diluyente, realizamos
diluciones seriadas, hasta obtener una solución stock de trabajo de 32 µg/mL.
A partir de esta solución de trabajo, se realizaron diluciones seriadas para cada uno
de los pHs analizados:
Para pH 7.4, donde la CIM fue de 0.25 µg/mL, trabajamos con un rango de diluciones
desde los 2 µg/mL hasta 0.033 µg/mL (8 veces la CIM hasta 1/8 de CIM).
Para pH 6.5, donde la CIM fue de 0.125 µg/mL, trabajamos con un rango de
diluciones desde el 1 µg/mL hasta 0.0156 µg/mL (8 veces la CIM hasta 1/8 de CIM).
Para pH 5.0, donde la CIM fue de 0.066 µg/mL, trabajamos con un rango de
diluciones desde los 0.5 µg/mL hasta 0.008 µg/mL (8 veces la CIM hasta 1/8 de CIM).
La modificación del pH en el medio de cultivo se llevó a cabo una vez estos fueron
preparados según las indicaciones del fabricante, en ese momento, se adicionó 1mL de HCl
1N por litro de medio de cultivo para lograr un pH 6.5; y para obtener un pH 5.0 se le
adicionó 1.25 mL de HCl 1N a igual volumen de medio de cultivo.
Los rangos de diluciones utilizados para la realización de las curvas de muerte

bacteriana en leche y suero bovino, fueron las mismas que para pH 6.5 y 7.4
respectivamente, ya que el pH de estas 2 matrices es similar.
4.2.5.2. Inoculación
El inóculo bacteriano, tanto de las cepas problema (N = 6) como del S. aureus ATCC
fue preparado siguiendo las recomendaciones de documento M26-A Methods for
determining bactericidal activity of antimicrobial agents (NCCLS, 1999a), adicionando a cada
tubo de las baterías mencionadas una concentración constante de UFC/mL. Partimos de
cultivos en AMH de 24 hs. Tomamos de 2 a 4 colonias de cada uno y las resuspendimos en
CMH hasta obtener una suspensión equivalente a 0.5 de la escala de MacFarland (que
equivale aproximadamente a 1 x 107 UFC/mL). Posteriormente se realizó una dilución 1:100
116
con CMH, de modo tal que la dilución final, una vez que se agregó 1 mL de la suspensión a
los tubos con 1 mL de medio de cultivo con antimicrobiano, fue de 5 x 105 UFC/mL.
Los tubos fueron homogenizados por agitación suave antes de cada siembra con el
fin de re-suspender las bacterias que quedasen adheridas a las paredes del mismo.
Para cada cepa y cada antimicrobiano, considerando cada variable (pH, suero, leche)
la prueba fue realizada por duplicado. El inóculo diluido se utilizó antes de 15 minutos tras su
preparación. Los tubos una vez inoculados, se incubaron a 35ºC en estufa de cultivo. A horas
predeterminadas (0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 h) fueron retiradas alícuotas de 100 µL o diluciones
de éstas preparadas en CMH (10-1, 10-2, 10-3 y 10-4) para facilitar el posterior recuento de
UFC, de cada uno de los tubos. Estas submuestras, obtenidas a partir de los tubos de cada
batería, fueron sembradas en placas de Petri con 10 mL de AMH, por medio de esferas de
vidrio estéril para asegurar que el inoculo se extendiera por toda la placa. Las placas ya
sembradas, fueron llevadas a incubación por 24 horas a 35°C.
4.2.5.3. Recuentos e interpretación
Tras haber transcurrido las 24 horas de incubación, realizamos el conteo manual del
número de UFC presentes en cada placa, corrigiendo por el factor de dilución.
Con los datos obtenidos se graficó el logaritmo de las UFC en función del tiempo. Se
consideró efecto bactericida del antimicrobiano cuando se logró una disminución de 3 log 10
(99.9 % de muerte bacteriana) de UFC en el tiempo evaluado.De esta forma pudimos
determinar la existencia o no de actividad bactericida, así como la concentración a la cual se
produjo y en el tiempo en que se presentó.
Además de la determinación de la actividad bactericida, por medio de la elaboración

de las curvas de muerte bacteriana también podemos valorar, como mencionamos, los
fenómenos de persistencia, paradójico y de tolerancia.
117
4.2.5.4. Modelización matemática de las curvas de crecimiento y de muerte bacteriana
En primer lugar realizamos la modelización de las curvas de crecimiento del S. aureus

frente a diversas variables: pH (7.4, 6.5, 5), en leche y en suero.
La microbiología predictiva es una poderosa herramienta para cuantificar y predecir

la velocidad de crecimiento de los microorganismos bajo diversas condiciones ambientales.
Entre los muchos factores que afectan el crecimiento microbiano, en nuestro caso
evaluamos el pH del medio, la acción de químicos (los tres antimicrobianos seleccionados
frente a diversas concentraciones en función del tiempo), y el tiempo de exposición a los
mismos.
Estos modelos matemáticos se construyen midiendo la respuesta de los

microorganismos en función de los principales factores de control, tales como pH,
antimicrobianos, ya sea que actúen solos o combinados. Los modelos, por consiguiente, se
pueden utilizar para predecir el crecimiento microbiano bajo condiciones modificadas que
distan bastante de las específicamente probadas inicialmente.
La aplicación de modelos matemáticos se realiza en dos etapas principales:
1) Modelado de la curva de crecimiento del microorganismo.
2) Descripción de la variación de los distintos parámetros que afectan a dicha curva.
Los modelos se pueden clasificar en tres niveles:
Modelos de nivel primario: Describen cambios en el número de microorganismos en función

del tiempo. Los modelos se pueden cuantificar por ejemplo en UFC/mL. Ejemplos de estos
modelos son la ecuación de Gompertz, la ecuación exponencial y el modelo logístico. La
ecuación de Gompertz es uno de los modelos más utilizados para describir el desarrollo
microbiano (Zwietering et al., 1990) determinando la respuesta de los microorganismos bajo
diversas combinaciones de factores. Permite estimar parámetros tales como tiempo de
latencia (LPD), velocidad específica de crecimiento (µ) y la máxima concentración de células
(MPD) de los microorganismos en esas condiciones.
118
Modelos de nivel secundario: describen las respuestas de los parámetros del modelo
primario al cambiar determinadas condiciones de desarrollo tales como el pH. Ejemplo:
modelo de la raíz cuadrada.
Modelos de nivel terciario: utilizan un software que transforma a los modelos de nivel
primario y secundario en programas más confiables. Estos permiten calcular la respuesta de
los microorganismos en las distintas condiciones, comparar los efectos de dichas condiciones
o contrastar el comportamiento de varios microorganismos.
Estos modelos pueden ser caracterizados como puramente descriptivos o

probabilísticos (empíricos) o basarse en criterios microbiológicos (cinéticos). En estos
últimos se determina toda la curva de desarrollo de los microorganismos presentes. En los
primeros se determinan, si para un determinado microorganismo, las condiciones del medio
son óptimas para su desarrollo o presenta bajas o nulas probabilidades de sobrevivir. Los
modelos cinéticos y los probabilísticos pueden ser relacionados, ya que la probabilidad de
detectar el desarrollo de un microorganismo durante un determinado periodo de tiempo
depende de la germinación, de la fase logarítmica y del tiempo de generación microbiana, o
sea de parámetros cinéticos.
Los modelos matemáticos también pueden ser lineales, no lineales, segregados

(población de células heterogéneas) o no segregados, estructurados (multicomponentes) o
no estructurados (Whiting, 1995).
Para analizar las curvas de crecimiento de Staphylococcus aureus, en ausencia de

antibióticos, aplicamos primero modelos primarios, el modelo de Gompertz, cuya expresión
matemática es:
Log N = a + c. exp (-exp (-b (t-m))) Ec. 6
Donde: Log N es el logaritmo decimal de los recuentos microbianos (Log UFC/mL) al

tiempo t, dado en horas; a es el Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece
indefinidamente (aproximadamente equivale al Log de los niveles iniciales de bacterias) (Log
UFC/mL); c es el Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo se incrementa
indefinidamente (es el número de ciclos Log de crecimiento) (Log UFC/mL); m es el tiempo
119
requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento (horas); b es la velocidad de
crecimiento relativa al tiempo m (h-1).
De estos parámetros, se derivan la velocidad específica de crecimiento (µ = b . c / e)

(Log UFC/mL*horas), (con e = 2,7182), la duración de la fase de latencia (LPD = m -1/b)
(horas) y la máxima densidad poblacional microbiana bajo condiciones particulares (MPD = a
+ c) (Log UFC/mL).
Estos parámetros son específicos para cada microorganismo y su ambiente. La

ecuación fue ajustada a los datos del desarrollo microbiano mediante una regresión no lineal
con el programa Sigma Plot (Sigma Plot 12.0, 2011), ya que los parámetros de la curva de
Gompertz son no lineales.
El programa ajusta los datos a la curva, es decir calcula los parámetros de acuerdo a
un determinado criterio. Los parámetros a, c, b y m son estimados, para obtener un modelo
matemático completo del cual una curva de crecimiento podría ser predicha para cualquier
combinación de condiciones dentro de los límites del experimento. Otros parámetros de
interés como la fase de latencia, pueden derivarse entonces de la curva de predicción.
También los datos experimentales de UFC/mL en función del tiempo en ausencia de

antibiótico pueden ser ajustados con un modelo de crecimiento exponencial:
N = N 0 . exp (Kc . T) Ec. 7
Donde N es el número de UFC/mL a un tiempo determinado, N 0 es la concentración

del inóculo inicial (106 UFC/mL), Kc es la constante de crecimiento de orden uno (h-1) y T es el
tiempo (h).
Luego evaluamos las curvas de muerte bacteriana, es decir en presencia de

antibiótico, para lo cual los datos experimentales de UFC/mL en función del tiempo fueron
ajustados con un modelo sigmoideo menos base:
N = N0– Ec. 8
120
del inóculo inicial (106 UFC/mL), N max es la población bacteriana final, T I50 es el tiempo
necesario para que se alcance 50% de la inhibición bacteriana máxima, ϒ es el coeficiente de
sigmoidicidad y T es el tiempo. Los datos experimentales fueron ajustados con los modelos
de regresión no lineal de mínimos cuadrados empleando el programa informático Sigma
Plot (Sigma Plot 12.0, 2011).
También empleamos el modelo de regresión lineal, ya que es el modelo indicado

principalmente cuando el número de microorganismos se mantiene constante o decrece
durante el tratamiento. La ecuación, en ese caso se expresa como:
Log Nt = log N0 + a t Ec. 9
Donde: Log N t es el logaritmo decimal de los recuentos microbianos finales (Log

UFC/mL) al cabo del tiempo t, dado en horas; Log N 0 es el logaritmo decimal de los
recuentos microbianos iniciales (Log UFC/mL); a corresponde a la pendiente de la regresión
((UFC/ml)-1h-1) (Whiting, 1995) que es negativa cuando hay efecto bactericida.
De manera que los análisis farmacodinámicos de los datos obtenidos a partir de las
curvas de crecimiento y de muerte bacteriana de los aislados de Staphylococcus aureus y de
Referencia nos permitieron estimar
1. La velocidad de crecimiento bacteriano en función del tiempo en ausencia de

antibiótico.
2. La evolución de la población bacteriana en función del tiempo respecto de

una concentración fija de antimicrobiano.
3. La relación efecto antibacteriano versus concentración antibiótica
4. Los valores de las constantes de muerte bacteriana.
Posteriormente evaluamos el índice de actividad antibacteriana (E), que se cuantificó

como la diferencia entre los valores Log 10 del número de bacterias viables (UFC/mL) al inicio
(n t-0 ) y al final del ensayo (n t-24 ) según la siguiente ecuación:
E = n t-24 - n t-0 Ec. 10
121
Para evaluar E, se aplicaron tres puntos de corte teóricos (Sidhu et al., 2011):
a) Efecto bacteriostático: E = 0; no hay cambios en valor de n t-0 :
b) Efecto bactericida: E = -3; hay reducción de ≥ 3 log 10 de n t-0 y
c): Efecto de erradicación virtual de bacterias: E = -4; hay reducción de ≥ 4 Log 10 (99.99%)
respecto del Log de n t-0 .
Cada parámetro farmacodinámico obtenido con un antibiótico a pH 7.4 fue comparado

con su homólogo obtenido a diferentes valores de pH (6.5, 5.0), como así también con su
homólogo en suero y en leche.
4.2.6. Determinación del Efecto Posantibiótico (PAE)
4.2.6.1. Método in vitro
La interacción de los microorganismos y los antimicrobianos es un tema complejo

que actualmente está siendo estudiado con detalle. La unión del antimicrobiano a las
estructuras bacterianas, desencadena una compleja serie de alteraciones y modificaciones
tanto fisiológicas como morfológicas, haciendo que la bacteria sobreviviente no recobre su
funcionamiento normal hasta pasado un tiempo más o menos largo, en comparación con
aquellas bacterias que no han sido tratadas. Así, las células expuestas a la acción del
antimicrobiano pierden su capacidad de multiplicación durante varias horas después que el
antimicrobiano haya sido eliminado, a la vez que experimentan una serie de alteraciones
ultraestructurales que afectan a su morfología y funcionalidad enzimática normal. La
recuperación de estas funciones dependerá de varios factores, siendo los más importantes la
concentración de antimicrobiano y el tiempo de exposición (Pastor et al., 1992).
El estudio de las interacciones entre las bacterias y los antimicrobianos no es nuevo;

las primeras observaciones de este fenómeno datan de los años 1940. Bigger, en 1944, fue el
primero en demostrar que las bacterias Gram-positivas, tras ser expuestas a la acción de la
penicilina, no recobraban su crecimiento normal hasta transcurridas algunas horas después
de haber sido eliminado el antibiótico. Posteriormente, Bundtzen en 1981, lo denominó
122
efecto postantibiótico (PAE), definiéndolo como el retraso del crecimiento bacteriano que se
manifiesta después de una breve exposición de la bacteria a un antimicrobiano. Durante los
años siguientes al descubrimiento del PAE, ésta fue la definición clásica y su determinación
se realizaba mediante el recuento de células viables descrito por Bundtzen, utilizándose
como método de referencia.
Posteriormente, otros autores desarrollaron distintos métodos para la determinación

del PAE (Hanberger et al., 1990; Isaksson et al., 1998). Básicamente todos consisten en
medir el recrecimiento bacteriano una vez que se ha eliminado el antimicrobiano,
diferenciándose entre ellos en la forma de medir dicho crecimiento. Generalmente estas
técnicas se pueden englobar en tres grupos:
1) Las basadas en la medida del crecimiento en sí por distintos procedimientos:

recuento de células viables, bioluminiscencia (Isaksson et al., 1998; Mattie, 1981),
espectrofotometría (Shahet et al., 1978), conductancia eléctrica (Gouldet et al., 1989),
producción de CO 2 en el medio (Gottfredssonet et al., 1991) o por incorporación de isótopos
radiactivos (Odenholtet et al., 1989).
2) Las basadas en la observación de los cambios morfológicos (forma de las bacterias,

grosor de la pared celular) (Gottfredsson et al., 1991).
3) Las basadas en cambios fisiológicos de la célula (producción de enzimas,

betalactamasas, hemolisina, etc.) (Zhanelet et al., 1991).
Cuando la técnica se basa en los cambios morfológicos, se utiliza el término PAE

morfológico, y en este caso el PAE es el tiempo que tarda la bacteria en recuperar su forma
habitual una vez se ha eliminado el antimicrobiano (Gottfredsson et al., 1991). Cuando la
determinación está basada en los cambios fisiológicos o en la inhibición de la actividad
enzimática recibe distintos nombres, dependiendo del parámetro que se éste midiendo:
disminución en la producción de betalactamasas (Post-beta-Lactamase Inhibitor Effect, PLIE),
aumento de la sensibilidad a la acción de los leucocitos polimorfonucleares humanos (Post-
Antibiotic Leucocyte Enhancement, PALE) (Ramadan et al., 1993) o aumento de la
sensibilidad bacteriana a la acción de concentraciones subinhibitorias (Post-Antibiotic Sub-
MIC Effect, PASME) (Odenholt-Torqvist et al., 1993).
123
Procedimiento
Tomamos 4 tubos de vidrio borosilicato estériles, en dos de ellos, depositamos 10mL

de CMH con una cepa de campo de S. aureus en fase logarítmica de crecimiento a una
concentración inicial de 1.5 x 107 UFC/mL. En los otros 2 depositamos la cepa de referencia
de S.aureus ATCC 29213 en las mismas condiciones de medio de cultivo y concentración.
De cada pareja de tubos (cepa problema y cepa de referencia), seleccionamos uno, y

lo expusimos a la acción de uno de los diferentes antimicrobianos en ensayo (Azitromicina,
Danofloxacina y Penicilina G). Empleamos una concentración terapéutica, teniendo en
cuenta los predictores de eficacia definidos por las características farmacocinéticas y
farmacodinámicas (PK/PD) de los diferentes antimicrobianos tal como se documentó en el
apartado 4.2.2.9. (Selección de los antimicrobianos a evaluar). De manera que las
concentraciones utilizadas para la determinación del PAE in vitro para cada antimicrobiano,
fueron:
• Danofloxacina: 10 µg/mL que corresponde a 10 veces la CIM a pH 7.4

• Azitromicina: 5 µg/mL que corresponde a 5 veces la CIM a pH 7.4
• Penicilina G: 1 µg/mL que corresponde a 4 veces la CIM a pH 7.4
Control del número de microorganismos al tiempo 0
Los tubos tratados con antimicrobiano y los tubos control, fueron incubados por un
periodo de 2 horas a 37ºC en baño con agitación constante. Una vez finalizado este periodo
de tiempo, se realizó el control del número de microorganismos en los dos cultivos (control y
tratado) mediante recuento en placa. Para ello retiramos una alícuota de 100µL de cada
tubo y los sembramos con perlas de vidrio en una placa de Petri descartable de 10 cm con 10
mL de AMH. Las placas, fueron incubadas a 37° durante 24 horas, para una vez transcurrido
este tiempo, realizar el conteo manual del número de UFC presente en cada uno de los
cultivos.
124
Retirada del Antimicrobiano
Transcurridas las dos primeras horas y realizado el control del número de UFC en
cada cultivo, procedimos a retirar el antimicrobiano del cultivo tratado (considerando este
momento como tiempo cero del ensayo). El antimicrobiano fue retirado mediante la técnica
de dilución del cultivo descripta por Isaksson en 1998, la cual consiste en diluir el cultivo con
los microorganismos y el antimicrobiano. La dilución depende de la concentración de
antimicrobiano, utilizándose normalmente 10-3. Para ello se tomaron 100µL de cada cultivo
(control y tratado) y los diluimos en 9.9 mL de CMH. Posteriormente se extrajeron 2 mL de
cada suspensión diluida y los resuspendimos en 18 mL de CMH. Así, finalmente obtuvimos 2
tubos con 20 mL de CMH (Control y tratado) tanto para la cepa de referencia como para la
cepa problema. El procedimiento completo, lo realizamos por triplicado.
Los 4 tubos, fueron llevados nuevamente a incubación durante 6 horas a 37°C en

baño con agitación constante. A cada hora hasta las 6 horas retiramos de cada uno de los
tubos, una alícuota de 100µL para realizar el conteo de UFC, sembrando en placas de Petri
con 10mL de AMH. Incubamos a 37°C durante 24 horas, para posteriormente efectuar la
lectura manual delas UFC en cada una de las placas. El procedimiento se realizó por
duplicado.
Interpretación
Todas las curvas de crecimiento y de PAE se elaboraron a partir de recuentos

bacterianos que se hicieron cada hora desde el tiempo t-2 (adición del antimicrobiano) hasta
la hora 6.
El cálculo de la duración del PAE se efectuó utilizando la fórmula descrita por Mc.
Donnald (1977).
PAE = T- C Ec. 12
Donde T es el tiempo (en horas) que tarda el cultivo de microorganismos tratados en

incrementar 1 logaritmo su concentración a partir del tiempo 0 (dilución del
125
antimicrobiano); C es tiempo (en horas) que tarda el cultivo control en incrementar 1
logaritmo su concentración a partir del tiempo 0.
Este procedimiento se realizó en CMH y en leche, teniendo en cuenta las variaciones

en la CIM al pH de la leche, que fue tomado como 6.5.
4.2.6.2. Método in vivo

4.2.6.2.1. Modelo de infección en muslo de ratón neutropénico
Aunque el modelo de infección en muslo de ratón neutropénico ha adquirido

importancia en las últimas décadas, este había sido empleado previamente, en la década del
50, con ratones sin inmunodeprimir (Eagle et al., 1950).
El modelo actual de esta técnica conserva la mayoría de las características originales,

más algunas variaciones importantes efectuadas especialmente por Craig et al., 1993.
La modificación metodológica más importante del modelo de infección en muslo de

ratón fue implementada por Craig et al., en 1993. Inquietos por las fallas terapéuticas
observadas en los pacientes leucopénicos infectados por P. aeruginosa y tratados con
aminoglucósidos, postularon que dicho fenómeno obedecía a la selección, durante el
tratamiento, de subpoblaciones bacterianas resistentes no detectadas por las pruebas de
susceptibilidad in vitro. Normalmente, dichas subpoblaciones son erradicadas por la
respuesta bactericida del sistema inmune, pero ese no es el caso en pacientes
inmunocomprometidos; sólo un modelo neutropénico permitiría acercarse al
comportamiento microbiológico de este último grupo de pacientes.
En nuestro caso, decidimos comprobar la existencia del PAE in vivo de danofloxacina,

puesto que se trata de un antimicrobiano acción bactericida dependiente de la
concentración. Para lo cual, determinamos las concentraciones de danofloxacina en suero y
muslo de ratones (cepa C57/h3) inmunodeprimidos expuestos a concentraciones
terapéuticas del antimicrobiano e infectados experimentalmente con S. aureus ATCC 29213.
Se relacionaron las concentraciones de danofloxacina en los tejidos con las UFC presentes en
el muslo a diferentes horas de exposición.
126
Entre las ventajas de este modelo podemos mencionar que el efecto del sistema
inmune queda anulado, el muslo del ratón puede extraerse fácilmente, cuantificar el
número de UFC en el homogenizado de muslo no presenta grandes dificultades y nos
permite comprobar la posible actividad subinhibitoria del antimicrobiano.
Procedimiento.
Selección del antimicrobiano
Para la determinación del PAE in vivo, frente a S. aureus seleccionamos

Danofloxacina, teniendo en cuenta que presentó un PAE in vitro más prolongado que los
otros dos antimicrobianos, no mostró variaciones significativas en las pruebas de
susceptibilidad a los diferentes pH y fue el antimicrobiano que arrojó los mejores resultados
a nivel de eficacia farmacológica en las curvas de muerte bacteriana.
Animales experimentales
Utilizamos 100 ratones (cepa C57/h3) de seis semanas de edad, sanos, de ambos
sexos, con un peso promedio de 23 a 27 g. Los animales (libres de patógenos específicos
(SPF)) fueron comprados al Bioterio de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de
La Plata. El manejo de los mismos se realizó según las normas internacionales estipuladas
por los comités de ética profesional para el manejo y uso de animales de experimentación
(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eighth Edition, 2010).
Mantenimiento de los animales
Los animales experimentales fueron alojados en grupos de 6 individuos en jaulas

metálicas estériles de 25cm de alto, 30cm de ancho y 30 cm de frente, con cama de aserrín
estéril. Durante el tiempo del experimento, se mantuvieron a temperatura ambiente, con
aporte de comida, mediante comederos metálicos tipo canasto y agua, mediante chupete,
estériles y “ad libitum”. Como alimento se utilizó balanceado seco sin coccidiostático, para
127
que no interfiriera con el tratamiento antibiótico. Diariamente se recambió el aserrín a todas
las jaulas y se chequeó el correcto estado sanitario de los animales.
Neutropenia
Los 100 ratones recibieron una terapia inmunosupresora, siguiendo la técnica

descripta por Craig en 1993. Para lo cual se aplicó a cada ratón, ciclofosfamida por la vía
intraperitoneal, a razón de dos dosis de 150 y 100 mg/kg, los días 0 y 3 respectivamente.
Este esquema de dosificación logra un porcentaje de reducción de leucocitos del 70-84%
(<100 neutrófilos/mm3) en el día del inicio del ensayo del PAE (día 4). De manera que,
prácticamente se anula el sistema inmunológico, evitando una posible interferencia en la
infección bacteriana.
Infección
El día 4 del experimento, se inyectó intramuscularmente en el muslo 0.1 mL de CMH

enriquecido con S. aureus ATCC 25923 en fase de crecimiento exponencial a una
concentración de 1x 107 UFC/mL. Este tiempo fue considerado como T-2. Paralelamente, se
realizó el control del número de microorganismos en el CMH, mediante recuento en placa.
Para ello retiramos una alícuota de 100 µL y la sembramos con perlas de vidrio en una placa
de Petri descartable de 10 cm con 10 mL de AMH. Las placas, fueron incubadas a 37° durante
24 horas, para una vez transcurrido este tiempo, realizar el conteo manual del número de
UFC presente en cada uno de los cultivos.
Tratamiento antimicrobiano
Al cabo de 2 horas de realizada la infección, momento considerado tiempo 0 del

ensayo (T0), los ratones fueron separados en 2 grupos:
Grupo 1: Integrado por 44 ratones, que recibieron 0.2 mL de solución salina

conteniendo 0.3 mg de danofloxacina (10 mg/kg) por la vía intramuscular (IM), a nivel del
muslo.
128
Para preparar la solución de danofloxacina, partimos de una solución conteniendo 6
mg/mL del antimicrobiano disuelto en agua tridestilada estéril. A partir de esta solución
realizamos diluciones en solución salina fisiológica estéril hasta obtener una solución final de
1.5 mg/mL (lo que equivale a 0.3 mg en 0.2 mL de solución).
Grupo 2: Fue el grupo control o testigo, 22 ratones fueron inoculados por la vía IM a
nivel del muslo con 0.2 mL de solución salina sin antimicrobiano. A estos individuos, se les
realizó una marca en el extremo caudal de la cola con azul de metileno con la finalidad de
diferenciarlos del grupo tratado.
Sacrificio de los animales y extracción de los muslos.
Los animales del Grupo 1 (Tratados) fueron sacrificados en lotes de 4 individuos a los
siguientes tiempos: 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 horas. Y los animales del Grupo 2
(Control) fueron sacrificados de a pares a los mismos tiempos que el Grupo 1.
Todos los animales fueron alocados y sacrificados, siguiendo la normativa dispuesta

por el AVMA en su guía para la eutanasia de animales 2013. Se eligió la técnica de
dislocación cervical, ya que ésta es apropiada para aves, ratones, conejos o ratas inmaduras,
o especies pequeñas similares. Consiste en separar el cráneo y el cerebro de la médula
espinal aplicando presión a la base posterior del cráneo (Clifford, 1984). Cuando la
separación de la médula ocurre, el SNC deja de estimular la respiración y el corazón,
conduciendo a la muerte.
Inmediatamente después del sacrificio de cada animal experimental y con ayuda de

material quirúrgico (pinzas, bisturí y tijeras estériles) se extrajo el muslo infectado,
separándolo de la piel.
Cada uno de los muslos fue pesado y homogeneizado correctamente con la ayuda de
un homogeneizador T25 (Ultra Turrax) en solución salina estéril en relación 1:10 p/v. El
homogenato obtenido fue envasado en tubos estériles y perfectamente identificados. Una
alícuota del homogenato fue utilizada como se describe a continuación y el resto fue
almacenado a -20ºC hasta su ensayo cromatográfico.
129
A partir de los homogenatos obtenidos para cada tiempo de sacrificio, se sembraron
100 µL en placas de Petri conteniendo 10mL de AMH y tras 24 horas de incubación a 37ºC,
se procedió al recuento de las UFC. Se obtuvieron así, las concentraciones de
microorganismos por cada gramo de muslo en los distintos tiempos.
Niveles séricos y tisulares de danofloxacina en ratones inmunosuprimidos
Al momento del sacrificio de cada ratón, además de extraer el muslo infectado, se

extrajo sangre con el fin de determinar las concentraciones séricas de danofloxacina (DAN)
en ratones que recibieron una dosis de 10 mg/kg.
La cuantificación de danofloxacina en suero y en el homogenato de músculo de

ratón, tras su extracción en fase líquida, fue realizada por cromatografía líquida de alta
presión con detección por fluorescencia; siguiendo una metodología analítica validada en el
Laboratorio de Estudios Farmacológicos y Toxicológicos (LEFyT) (Mestorino et al., 2009).
Extracción del analito
En un tubo cónico borosiliconado, se diluyeron 0.2 mL de la muestra con 0.3 mL de

acetonitrilo, esta solución se mezcló en vortex durante 1 minuto y luego se centrifugó
durante 15 minutos a 2.195 g. Retiramos suavemente el sobrenadante obtenido y lo
trasvasamos a otro tubo cónico de vidrio para diluirlo con 0.3 mL de agua deionizada. La
dilución se mezcló con vortex durante 1 minuto y 200 µL del sobrenadante fueron
inyectados directamente en el cromatógrafo.
La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizado las siguientes condiciones:

Columna Phenomenex Luna C18 5µm (150 x 4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA);
Guarda columna: C18 Phenomenex. Se empleó una fase móvil compuesta por 950 mL de
fosfato de sodio 0.05 M ajustado a pH 3.5 (con ácido fosfórico 85%), 50 mL de acetonitrilo y
30 mL de tetrahidrofurano, bombeada a un flujo de 1.5 mL/min. Se trabajó a temperatura
ambiente con detección por fluorescencia (280 nm de excitación y 440 nm de emisión). El
tiempo de corrida para cada muestra fue de 10 min.
130
Las concentraciones de danofloxacina fueron determinadas por interpolación de
áreas en la curva de calibración estándar obtenida de fortificar suero blanco con
concentraciones conocidas de analito.
El método analítico fue validado evaluando los siguientes parámetros: linealidad,

precisión, exactitud y especificidad.
Adecuabilidad del sistema
Se preparó una solución estándar de danofloxacina y se determinó la precisión del

sistema cromatográfico mediante la colocación de veinte (20) inyecciones. De esta manera
se evaluó la eficiencia de la columna y del sistema, a través del conocimiento del coeficiente
de variación existente.
Linealidad
Se preparó por duplicado una batería de 6 diluciones stock del analito en un rango de
concentraciones preestablecidas. Las cuales fueron inyectadas en el HPLC a los efectos de
obtener curvas de calibración en las que se pudo evaluar: coeficiente de variación,
coeficiente de correlación, medias y desviación estándar de cada concentración.
Límite de detección (LOD)
Se denomina LOD a la menor cantidad de analito que puede ser detectada pero no
necesariamente cuantificada. Este fue estimado a través del análisis de 20 alícuotas de suero
control, libre de antimicrobiano. Fue medido el ruido de la línea de base; y fueron calculados
los promedios y desvíos estándares (DS), correspondiéndose el LOD con 3 DS (signo/ruido ≥
3/1).
131
Exactitud y precisión intradía
Para testear la exactitud y precisión intradía de los ensayos realizados, se prepararon

por sextuplicado 3 sets de sueros fortificados, compuestos por la concentración
correspondiente al límite de cuantificación además de otras concentraciones conocidas del
analito; todos ellos fueron analizados en el HPLC. Sus concentraciones fueron obtenidas a
partir de la curva de calibración stock.
La exactitud se define como el porcentaje de recuperación de la concentración actual

(% RE), es decir, la cercanía existente entre las medidas de los valores experimentales y las
concentraciones reales. Resulta aceptable cuando dicho valor se encuentra en el rango de
85-115 %) (Mestorino et al., 2009).
En cuanto a la precisión (expresada como el coeficiente de variación, %CV) debe estar

por debajo del 20 % para las 4 concentraciones. Esta fue determinada a fin de estimar la
variación cromatográfica existente entre corrida y corrida del método utilizado.
Exactitud y precisión inter-ensayo
Se prepararon muestras de control de calidad (QC) de los analitos en plasma, se

ensayaron por sextuplicado en tres ocasiones separadas. Fueron estimadas la exactitud y la
consecuente precisión inter-ensayo, considerando aceptable los valores mencionados en la
evaluación de la exactitud y la precisión intradía.
Especificidad
Se inyectaron 6 muestras diferentes de suero blanco y 6 muestras de suero cargado

con el estándar de danofloxacina, y se compararon las áreas cromatográficas al tiempo de
retención (TR) de cada molécula a ensayar.
132
Límite de cuantificación (LOQ)
El LOQ es definido como el nivel donde la reproducibilidad de las muestras replicadas

no excede un coeficiente de variación de 20%, y cuya exactitud es de un 85-115% luego del
análisis de 12 réplicas de muestras fortificadas con la menor concentración.
La eficiencia de extracción fue determinada por comparación entre las áreas

cromatográficas obtenidas con los sueros fortificados con diferentes concentraciones y
aquellas obtenidas de inyecciones directas de soluciones estándares en cantidades
equivalentes.
4.2.6.2.2. Estimación del PAE In Vivo
A partir de la determinación de los niveles de danofloxacina en suero, se registró el

tiempo en que los niveles de antimicrobiano en sangre cayeron por debajo de la CIM 90 de
danofloxacina para S. aureus. Las constantes PK para danofloxacina (semivida de eliminación
(T½λ), área bajo la curva de concentración en función del tiempo –ABC- y concentración
máxima –C max -), se calcularon utilizando un modelo no compartimental.
A partir de las curvas de crecimiento bacteriano (homogenatos de los muslos control)

y de las curvas de muerte bacteriana (homogenatos de los muslos tratados); aplicando la
EC.12 (PAE = T – C) se determinó el PAE in vivo. Donde en este caso, T es el tiempo necesario
para que el número de UFC en los muslos de ratones tratados aumente 1 log 10 a partir del
tiempo en que los niveles de antimicrobiano en sangre descendieron por debajo de la CIM y
C es el tiempo necesario para que el número de UFC en los muslos de ratones controles
aumenten 1 log 10 su concentración a partir del tiempo 0.
133
4.2.7. Captación y actividad intracelular de los antimicrobianos seleccionados.
4.2.7.1. Preparación del inóculo bacteriano
Se procedió según se explicó en el apartado 4.2.2.2., es decir, preparación del inóculo

por suspensión directa de colonias (CLSI 2008). Para lo cual, se repicó el S. aureus ATCC
29213 en placas de Petri con AMH. Al día siguiente, se tomaron 2-3 colonias con un anza
estéril y se resuspendieron, pero en este caso, en medio RPMI 1640, hasta ajustarlo a una
concentración de 0.5 de la escala de Mac Farland (0.5-1 x 107-8 UFC/mL).
4.2.7.2. Preparación de las células
Se aislaron polimorfonucleares (PMNs) a partir de sangre y de leche bovina, los

cuales fueron resuspendidos en medio RPMI 1640, hasta alcanzar una concentración de 5 x
106/mL.
4.2.7.2.1. Separación de PMNs de sangre bovina
En un tubo cónico de polipropileno estéril, se colocaron 3 mL de histopaque 1119 y 3

mL de histopaque 1077, teniendo cuidado de no mezclar los reactivos. Luego sobre este
último, se agregaron 6 mL de sangre bovina completa, heparinizada, teniendo cuidado de no
mezclar la sangre con los reactivos. La sangre se obtuvo de bovinos sanos que no hubiesen
recibido tratamiento antimicrobiano alguno durante los últimos 3 meses antes del inicio del
ensayo.
Centrifugamos durante 40 min a 600 g, así las células de la serie granulocítica se

ubican entre el histopaque 1077 y el histopaque 1119, mientras que los linfocitos, otras
células mononucleares y las plaquetas se ubican en la zona entre el plasma y el 1077.
Retiramos suavemente con una pipeta Pasteur estéril la zona correspondiente a los
PMNs y los trasvasamos a otro tubo cónico de polipropileno. Agregamos 10 mL de PBS pH
134
7.4 estéril, centrifugamos durante 15 min a 1600 rpm, descartamos el sobrenadante y
resuspendimos el pellet celular en 5 mL de medio RPMI 1640.
Luego de tener las células aisladas en el medio, efectuamos el conteo celular para
observar cantidad y evaluar la viabilidad de los PMNs utilizando una cámara de Neubauer.
Conteo y evaluación de la viabilidad celular
Tomamos una alícuota de 10 μL de la suspensión celular y le adicionamos 10 μL de

colorante azul de tripán para realizar el recuento de las células en una cámara
hemocitométrica de Neubauer.
El azul tripán, es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas, para

ensayos de viabilidad, permitiendo diferenciar células vivas de células muertas. Las células
vivas o tejidos con membrana celular intacta no se colorean, debido a que dicha membrana
es selectivamente permeable respecto a los compuestos que pueden atravesarla, de ahí que
las células viables, es decir, con membrana intacta, no permiten la incorporación del
colorante azul de tripán. Por el contrario, sí este colorante atraviesa la membrana de las
células, indica que la misma no está intacta y por tanto las células no son viables,
apareciendo de un distintivo color azul bajo el microscopio.
Debido a que las células vivas excluyen al colorante y no se tiñen, este método
también se llama método de tinción por exclusión.
La lectura de las células viables y no viables fue realizada en microscopio óptico y el

cálculo del número de células/mL fue determinado a partir de la siguiente ecuación:
V x FN x FT/#Q. EC.13
Donde: V corresponde al número de células viables contadas; FN es el factor de la

cámara de Neubauer (104); FT es el factor de dilución del azul de tripán y #Q, el número de
cuadrantes de la cámara utilizados para el recuento.
La viabilidad se determinó por la técnica de exclusión vital, o sea, exclusión de las

células no teñidas por el azul de tripán, como anteriormente se describió.
135
La viabilidad celular se expresó como porcentaje aplicando la ecuación:
V x 100/NT EC.14
En la que, NT es el número total de células (viables y no viables) contadas en la

cámara. Con este método obtuvimos un 90% de células vivas en todos los casos.
4.2.7.2.2. Separación de PMNs de leche bovina
Se obtuvieron 150 mL de leche bovina, extraída de forma estéril, y se separaron en

alícuotas en tubos Falcon estériles de 50 mL. Se mantuvieron a 4°C hasta el momento de
realizar el procedimiento.
La leche fue filtrada a través de un filtro de nylon de 50 µm de porosidad. El filtrado

fue diluido al 50% v/v con una solución amortiguadora 0.01 M de fosfato (PBS).
La solución de leche diluida en buffer fue centrifugada durante 15 minutos a 2500

rpm, removimos la capa de crema superficial y descartamos la leche descremada,
quedándonos solo con el pellet celular, que fue suspendido en 80 mL de PBS.
Esta suspensión se llevó a una segunda centrifugación durante 15 min a 1600 rpm,
descartamos de nuevo el sobrenadante y resuspendimos el pellet en 80 mL de PBS. Este
procedimiento lo repetimos 2 veces más para realizar el lavado de las células, tras el último
lavado, el pellet celular fue resuspendido en 20mL de medio RPMI 1640.
Posteriormente, procedimos a determinar la cantidad y viabilidad celular por

observación al microscopio óptico con azul tripán. En promedio, un 60% de las células
aisladas corresponde a PMNs, y de estos aproximadamente el 60% son células viables.
Por último, realizamos la dilución requerida, para ajustar la concentración a 5 x 106

células por mL de medio RPMI 1640.
4.2.7.3. Fagocitosis
Una Alícuota de 1.9 mL del cultivo de PMNs fue vertida en cada uno de los pocillos de
la placa para cultivo celular (cada placa contiene 6 pocillos), posteriormente en cada uno de
136
los pocillos, se adicionó 0.1 mL de la suspensión bacteriana a la concentración previamente
establecida, con lo cual, en cada pocillo obtenemos un volumen final de 2 mL, con una
relación aproximada de 10 bacterias por cada leucocito PMN.
Esta suspensión fue llevada a incubación durante 90 minutos a 37ºC con 5% CO 2 y

agitación constante con la finalidad de permitir el proceso de fagocitosis.
4.2.7.3.1. Eliminación de las bacterias no fagocitadas
El contenido de cada uno de los pocillos fue colocado en tubos Falcon estériles de 15
mL, se centrifugó a 327g durante 10 minutos a 20 ºC. Se eliminó el sobrenadante
suavemente y se resuspendió el pellet celular en 5 mL de PBS suplementado con 50 µg/mL
de gentamicina, para eliminar las bacterias que pudiesen haber quedado en el fluido
extracelular.
Llevamos los tubos a incubación por 45 minutos a 37ºC con 5% CO 2 y agitación

constante, luego fueron centrifugados a 327g durante 10 minutos a 20ºC. Retiramos
suavemente el sobrenadante, y resuspendimos las células en 5 mL de PBS estéril sin
gentamicina. Se centrifugó nuevamente a 327g y a 20 ºC por 10 minutos.
Finalmente, las células fueron resuspendidas en 2mL de medio RPMI 1640.
4.2.7.3.2. Conteo del número de UFC fagocitadas.
Una alícuota de 100 µL del pellet celular resuspendido en medio RPMI 1640, se diluyó
en 100 µL de agua destilada estéril, para ocasionar la lisis celular y así permitir la liberación
de las bacterias fagocitadas. Posteriormente esta solución se agitó en vortex y 100 µL se
sembraron en placas de Petri de 10 cm con 10 mL de AMH. La evaluación del número de UFC
se realizó por conteo manual tras 24 horas de incubación a 37ºC, siendo el límite de
detección 10 UFC.
137
4.2.7.4. Exposición al Antimicrobiano
La penetración intracelular de cada uno de los diferentes antibacterianos ensayados

en este estudio (Azitromicina, Danofloxacina y Penicilina G) fue evaluada por separado. Para
ello, adicionamos, al cultivo celular en un volumen no superior a los 100 µL, el
antibacteriano a la concentración terapéutica definida para cada uno de ellos, teniendo en
cuenta sus características PK/PD:
• Danofloxacina 10µg/mL, que corresponde 10 veces la CIM a pH 7.4.

• Azitromicina 2.5µg/mL, que corresponde a 5 veces la CIM a pH 7.4.
• Penicilina G 1µg/mL, que corresponde a 4 veces la CIM a pH 7.4.
Siempre mantuvimos uno de los pocillos sin agregar antimicrobiano, solo contuvo la
mezcla cultivo celular: S aureus, es decir fue el control negativo.
La placa se incubó durante 5 horas a 37ºC con 5% CO2 en agitación constante.

Inmediatamente después de cumplido el tiempo de incubación, el contenido de cada pocillo
se pasó a un tubo cónico de polipropileno, para centrifugar la suspensión a 1600 RPM
durante 15 minutos. Se retiró suavemente el sobrenadante, el que fue analizado
posteriormente por HPLC para el caso de danofloxacina y por método microbiológico para
azitromicina y penicilina G; con el fin de cuantificar la cantidad de antimicrobiano que no
penetró al interior celular (concentración de antimicrobiano a nivel extracelular –EC-).
El pellet celular, fue resuspendido en 10 mL de PBS pH 7.4 y se centrifugó a 1600

RPM durante 15 minutos. Descartamos suavemente el sobrenadante y resuspendimos el
pellet celular en 1mL de solución salina fisiológica estéril, posteriormente todos los tubos
fueron llevados al sonicador durante 15 minutos para ocasionar la lisis de las membranas
celulares y permitir la liberación del antibacteriano intracelular. Este procedimiento nos
permitió cuantificar la concentración de antimicrobiano a nivel intracelular –IC-.
138
4.2.7.5. Evaluación de la actividad antibacteriana a nivel intracelular
Una vez puesta a punto la metodología para evaluar la fagocitosis bacteriana y la

captación celular de cada antimicrobiano por separado, procedimos a analizar la actividad
antibacteriana frente al Staphylococcus aureus a nivel intracelular.
Para lo cual repetimos los protocolos detallados en los puntos 4.2.7.3, 4.2.7.3.1 y
4.2.7.4.
Así, las células en suspensión fueron llevadas a agitación en vortex durante 5

minutos. Posteriormente procedimos a sembrar, por medio de sembradores estériles de
vidrio, 100µL en placas de Petri de 10 cm con 10 mL de AMH. La evaluación del número de
UFC, se realizó por conteo manual tras 24 horas de incubación a 37ºC.
De esta forma determinamos la eficacia del antimicrobiano a nivel intracelular frente

a la cepa de S. aureus que había sido anteriormente fagocitada.
4.2.7.8. Cuantificación intra y extracelular de las concentraciones de antimicrobianos
Tanto el sobrenadante de la primera centrifugación, como la suspensión celular,

fueron analizados para determinar las concentraciones de antimicrobiano presentes.
4.2.7.8.1. Cuantificación de Danofloxacina a nivel intracelular por HPLC
La cuantificación de Danofloxacina se realizo por HPLC con detección fluorométrica,

según se describió en el apartado 4.2.6.2.2.
El procedimiento utilizado para la extracción de las muestras fue el mismo para las
células como para el sobrenadante.
Preparación de soluciones estándares
Se preparó una solución madre de danofloxacina conteniendo 1mg/mL utilizando

como solvente ácido fosfórico 0.05M. Esta solución se mantiene estable a -20ºC durante 6
meses. A partir de la solución madre se prepararon diluciones seriadas de trabajo, utilizando
139
el mismo solvente (ácido fosfórico 0.05M), en las siguientes concentraciones: 500ng/ml,
300ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 20ng/ml, 10ng/ml.
Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las aplicadas en el apartado
4.2.6.2.2.
Nuevamente en este ensayo realizamos una revalidación de la metodología analítica.

A tal fin se determinaron especificidad, linealidad, exactitud y repetibilidad (precisión) del
método y se calculó el límite de cuantificación (LOQ) correspondiente.
4.2.7.8.2. Cuantificación de Azitromicina y Penicilina G por método microbiológico
La cuantificación intra y extracelular de Azitromicina y Penicilina G fue realizada por

método microbiológico empleando Kocuria rhizophila ATCC 9341 (Sarcina lútea) como
microorganismo testigo, técnica cilindro placa validada en nuestro laboratorio.
El método microbiológico consiste en la determinación de concentraciones

desconocidas de un antibacteriano en muestras biológicas por comparación con patrones de
concentración conocida de dicho antibacteriano. Para ello se utiliza un medio de cultivo
estándar (agar para antibióticos) en el que se inocula una cantidad fija y determinada del
microorganismo sensible al antibacteriano. Una vez homogeneizado, el medio de cultivo se
vuelca dentro de placas de vidrio de 25 x 25 cm de lado y 2.5 cm de altura. Posteriormente,
sobre la superficie del agar gelificado, se colocan cilindros dentro de los cuales se siembran
las muestras problema y los patrones. La placa es incubada durante 18 h, periodo luego del
cual se miden los halos de inhibición del crecimiento bacteriano. A partir de los halos
producidos por las concentraciones patrones se traza una línea de regresión lineal. De esta
manera, por interpolación de los diámetros de los halos producidos por las muestras
problema, se extrapolan las concentraciones correspondientes.
Las muestras problema fueron sembradas por duplicado. Se utilizó una placa de
cultivo por antimicrobiano, cada una con sus correspondientes estándares. Este
procedimiento se realizó en el mismo día, disminuyendo así la variabilidad inter-placa e
inter-día.
140
Previamente al análisis de las muestras se validó el método analítico utilizado. A tal
fin se determinaron especificidad, linealidad, exactitud y repetibilidad (precisión) del método
y se calculó el límite de cuantificación (LOQ) correspondiente.
4.2.7.8.2.1. Cuantificación de Azitromicina
Se preparó una solución stock madre de azitromicina de 1000 µg/mL en 10 mL de

metanol calidad cromatográfica. Dicha solución, almacenada a -20 °C, mantiene su potencia
durante 6 meses.
A partir de la solución madre se prepararon diluciones seriadas estándares utilizando

como diluyentes además del buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 8 estéril, solución fisiológica y
RPMI para contar con estándares preparados en las soluciones empleadas para emular el
fluido extracelular e intracelular.
Para preparar el buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 8 se mezclaron 5.3 mL de solución

estéril de fosfato monobásico de sodio 0.2 M (solución A) con 94.7 mL de solución estéril de
fosfato dibásico de sodio 0.2 M (solución B) y se llevó la mezcla a 200 mL con de agua
destilada estéril. Para preparar la solución A se diluyeron 27.8 g de fosfato monobásico de
sodio en 1000 mL de agua destilada estéril y para la solución B se diluyeron 53.65 g de
fosfato dibásico de sodio en 1000 mL de agua destilada estéril (Lucas, 2009). Después de
esterilizar el buffer en autoclave, se realizó el control del pH. El buffer se mantuvo
refrigerado y el pH fue periódicamente controlado para asegurar la estabilidad del mismo.
El rango de concentraciones incluido en la recta de calibración fue 0.0625 µg/mL,

0.125 µg/mL, 0.25 µg/mL, 0.5 µg/mL y 1 µg/mL.
4.2.7.8.2.2. Cuantificacion de Penicilina G
Se preparó una solución madre conteniendo 1000 µg/mL de Penicilina G en buffer

fosfato de sodio 0.1 M pH 6 estéril. A una temperatura de -20 ºC la solución mantuvo su
potencia durante 6 meses. A partir de la solución madre se prepararon las diluciones
seriadas estándares utilizando como diluyente buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 6 estéril,
141
solución fisiológica y RPMI para contar con estándares preparados en las soluciones
empleadas para emular el fluido extracelular e intracelular.
El buffer fosfato 0.1 M pH 6 se preparó mezclando 87.7 mL de solución de fosfato

monobásico de sodio 0.2 M (solución A) con 12.3 mL de solución de fosfato dibásico de sodio
0.2 M (solución B) y llevando a 200 mL con de agua destilada estéril. El buffer fue esterilizado
en autoclave, se controló su pH final y se mantuvo refrigerado a 4 ºC realizando controles
periódicos de pH para determinar su estabilidad (Lucas, 2009).
El rango de concentraciones incluido en la recta de calibración de Penicilina G fue de

0.0156, 0.033, 0.066, 0.125, 0.25 y 0.5 µg/mL.
Inóculo bacteriano
El microorganismo test utilizado fue Kocuria rhizophila ATCC 9341 (Sarcina lútea), el
que se mantuvo en picos de flauta de AMH e incubación a 35 ºC durante 48 h. Transcurrido
ese tiempo, a partir de los picos de flauta se realizaron repiques (con el mismo medio y
también en picos de flauta) de 24 h de incubación para la preparación del inóculo del día de
la siembra. Estos cultivos se lavaron con 1.5 mL de solución fisiológica estéril cada uno.
La solución obtenida fue diluida nuevamente con solución fisiológica estéril hasta
alcanzar un 75% de transmisión, medida por espectrofotometría a 670 nm de longitud de
onda que corresponde a una concentración de 2 – 2.6 x 107 UFC/mL, para el caso de
Azitromicina. Mientras que la suspensión bacteriana utilizada para cuantificar Penicilina G,
tuvo un 50% de transmisión a 670 nm de longitud de onda, que corresponde a una
concentración de 3 - 7 x 108 UFC/mL (Lucas, 2009).
A partir de estas suspensiones, según se ensayara Azitromicina o Penicilina G, se

tomó 1 mL para inocular el medio de cultivo para antibióticos Nº 1, cuyo volumen fue de 120
mL por placa.
Preparación de las placas
Para la preparación de las placas se utilizaron 120 mL de medio de cultivo para

antibióticos Nº 1 a una temperatura de 45-50 ºC. El mismo fue preparado el día de la
142
siembra siguiendo las instrucciones del fabricante y fue esterilizado en autoclave a 120 ºC y a
1 atmósfera de presión durante 20 min. Una vez retirado de la autoclave fue colocado en
baño de María a 50 ºC, temperatura a la cual se le adicionó 1 mL del inóculo bacteriano. Se
mezcló bien para tener una correcta distribución del inóculo en la totalidad del medio de
cultivo, con la precaución de evitar la formación de burbujas.
La placa de vidrio (previamente numerada en la cara externa de la base para poder

saber la ubicación de los cilindros) y atemperada a 35ºC, se ubicó sobre una superficie
correctamente nivelada.
El medio de cultivo inoculado fue vertido dentro de la placa de vidrio. Una vez
solidificado el agar se colocaron los 49 cilindros de acero inoxidable de acuerdo al mapa
guía, y se ejerció sobre los mismos una ligera presión para lograr una correcta coaptación
entre éstos y la superficie del medio.
Siembra de las placas
Se sembraron por cuadruplicado 200 µL de cada solución estándar (preparada con

buffer, solución fisiológica o RPMI) en cada cilindro colocando su ubicación en la planilla (Nº
de cilindro que recibió determinada muestra).
Las placas fueron incubadas en estufa a 35 ºC durante 18 h. Transcurrido el periodo

de incubación y utilizando un calibre Vernier se midieron los diámetros de los halos de
inhibición del crecimiento bacteriano.
A partir de los diámetros de los halos de inhibición se trazaron las líneas de regresión
lineal entre estos y las concentraciones antimicrobianas presentes en los estándares. A partir
de estas líneas de regresión se determinaron los correspondientes valores de intersección,
pendiente y los coeficientes de correlación (r).
Linealidad de la respuesta
La linealidad fue determinada a través de curvas de calibración de las

concentraciones calculadas del antimicrobiano (µg/mL) y las concentraciones teóricas, a
143
diferentes concentraciones de cada antimicrobiano ensayado. A partir de estas curvas
fueron calculados coeficiente de correlación lineal (r), pendiente e intercepción (Gil-Alegre,
1995).
Las rectas de calibración fueron realizadas en 3 ocasiones distintas y cada una

contenía 5 concentraciones y 4 repeticiones por cada concentración.
Especificidad de la técnica
La especificidad se evaluó sembrando en cada placa y por cuadruplicado buffer,

solución fisiológica o RPMI y cultivos celulares libres de antimicrobianos (diluyentes y
muestras control). El objetivo fue corroborar la ausencia de sustancias con actividad
inhibitoria intrínseca que pudieran interferir con la actividad inhibitoria del antimicrobiano a
ensayar (Gil-Alegre, 1995).
Exactitud de la técnica
La exactitud en la determinación de las concentraciones fue expresada como

porcentaje de recuperación y se obtuvo a partir de comparar la concentración calculada en
base a la recta de calibración (cultivo celular), con la concentración real y conocida del
estándar.
Cc100
Recuperación (%)= Ec. 15
Cr
Donde C c es la concentración calculada y C r es la concentración real. Se consideró adecuado

un valor de recuperación comprendido entre 60% y 110%.
Precisión de la técnica
Para evaluar la precisión de la técnica se determinó el grado de repetibilidad, el cual

está relacionado con la dispersión de una serie de mediciones de una misma muestra sobre
un valor promedio, el cual corresponde a la varianza de la población y es estimada por el
144
desvío estándar (DE). Para comparar la dispersión de 2 series de mediciones se utiliza el
desvío estándar relativo o coeficiente de variación (CV) que es expresado como porcentaje.
DE
CV = Ec. 16
X
Donde es el valor promedio de una serie de mediciones y el estimador de la media

poblacional (µ).
La evaluación de la precisión se realizó mediante la estimación de los CV de los halos

de inhibición obtenidos a partir de los estándares en buffer, en solución fisiológica y en
RPMI. Cada concentración fue sembrada por cuadruplicado en una misma placa y durante 3
ocasiones, a partir de lo cual se pudieron calcular los CV intra-día e inter-día. Los valores de
los CV aceptables debieron ser inferiores al 20%.
Límite de cuantificación
El límite de cuantificación (LOQ) se define como la menor concentración para la cual

la reproducibilidad de los análisis no excede un CV del 20%.
Análisis de las muestras problema
Para evitar la variabilidad inter-placa, se incluyó en cada placa sembrada con

muestras problema tres baterías de diluciones patrones, del antimicrobiano en estudio,
preparadas en buffer, solución fisiológica y RPMI.
A través de la medición de la actividad inhibitoria en los patrones, se construyeron las

rectas de regresión lineal:
y=b+ax Ec. 17
Donde y es la concentración del antimicrobiano, b es el punto de intersección con el

eje de la abscisa, a es la pendiente de la recta y x es el halo de inhibición.
Los estimadores de a y b fueron calculados de la siguiente manera:
145
∑ Xi – b ∑ Yi Ec. 18
a=
n
∑Yi Xi – (∑Yi ∑Xi)/ n Ec. 19
b=
2
∑Yi2 – (∑ Yi) / n
Donde Y i es la concentración del antimicrobiano, X i es el diámetro del halo de

inhibición y n es el número de mediciones.
El estimador del ajuste fue el coeficiente de correlación (r) que se calculó como:
n ∑ (Yi Xi) –∑Yi∑Xi)

r= Ec. 20
√[n ∑ Yi - (∑ Yi) ][n ∑ Xi - (∑ Xi) ]
2 2 2 2
Los r considerados aceptables debieron ser superiores a 0.9 en todas las placas.
La concentración del antimicrobiano en las muestras problema se expresó en µg/mL

y se calculó en función del diámetro del halo de inhibición medido utilizando la ecuación de
la recta de regresión, es decir:
“Concentración” = b + a “diámetro del halo” Ec.21
4.2.8. Cinética intracelular
En este experimento, evaluamos nuevamente la acción intracelular de cada

antimicrobiano pero en función del tiempo. Para ello, utilizamos 2 placas para cultivo celular
de 6 pocillos por cada antimicrobiano. De la misma manera que explicamos anteriormente,
sembramos 1.9 ml de medio RPMI 1640 conteniendo 5 x 106 PMNs/mL en cada pocillo,
agregamos 0.1 mL de inoculo bacteriano (5 x 107-8 ufc/mL) y lo expusimos a la concentración
terapéutica de cada antibacteriano (Danofloxacina, 10 xCIM; Azitromicina, 5xCIM y Penicilina
G, 4xCIM). Siempre se dejó uno de los pocillos de cada placa, con 1.9 mL de medio RPMI
1640 con PMNs y 0.1 mL de inóculo (control negativo).
Las placas fueron incubadas a 37ºC con 5% CO2 en agitación constante y a las 2, 4, 8,
12 y 24 horas de incubación, el contenido de 2 pocillos (uno de cada placa) fue transferido
146
cada uno a tubos cónicos de polipropileno. Se centrifugaron a 1600 RPM durante 15
minutos, luego retiramos suavemente el sobrenadante. A partir del sobrenadante
realizamos la cuantificación de antibacteriano que no penetró al interior celular mediante las
técnicas explicadas previamente.
El pellet celular fue resuspendido en 10 mL de PBS pH 7.4 y centrifugado nuevamente

a 1600 RPM durante 15 minutos, posteriormente descartamos suavemente el sobrenadante
y resuspendimos las células en 1 mL de solución salina fisiológica y lo llevamos al aquasonic
por 15 minutos para ocasionar la lisis de las membranas celulares para permitir la salida del
antibacteriano intracelular. Simultáneamente, 100 µL se sembraron en placas de Petri de 10
cm con 10 mL de AMH para proceder a la evaluación del número de UFC por conteo manual
tras 24 horas de incubación a 37ºC, siendo el límite de detección 10 UFC.
La cuantificación de cada antimicrobiano, tanto a nivel intra como extracelular se
realizó según lo detallado en el apartado 4.2.7.8.
4.2.9. Diseño y corroboración a campo de un régimen de dosificación racional
Con los resultados obtenidos se seleccionará el antimicrobiano que presente mejor

actividad bactericida a nivel intracelular. Esto significa que logre a nivel celular la
concentración y/o el tiempo de contacto adecuado para atacar al Staphylococcus aureus
según pautas farmacocinéticas/farmacodinámicas.
Se integrará toda la información obtenida con los datos farmacocinéticos disponibles

en la cátedra de farmacología. Con esta integración se podrá diseñar el régimen posológico
más adecuado.
147
5. RESULTADOS
5.1. SELECCIÓN DE LOS AISLAMIENTOS DE Staphylococcus aureus
El total de las 220 cepas de S. aureus existentes en el Laboratorio de Estudios

Farmacológicos y Toxicológicos (LEFyT) fueron nuevamente incubadas a 37°C en AMH con
5% de sangre bovina por un periodo de 24 horas. Todas dieron lugar a la formación de
colonias circulares de entre 1 y 3 mm de diámetro, de apariencia lisa, cremosa con un perfil
convexo, bordes netos y coloración blanco amarillenta. Solamente 102 cepas presentaron
hemólisis, de las cuales 32 presentaron α y β hemólisis, 51 solamente α hemólisis y 19 cepas
presentaron β hemólisis. La diferenciación del tipo de hemólisis, se hizo por observación
directa, tomando en cuenta que la α hemólisis corresponde a una lisis parcial de eritrocitos
que produce una coloración verde alrededor de las colonias (debido a la liberación de un
producto de degradación de la hemoglobina llamado bili-verdina); y la β hemólisis se expresa
como un halo de hemólisis completamente claro. En la Figura 14 se muestra la apariencia
característica de las colonias de Staphylococcus aureus crecidas en AMH con 5% de sangre
bovina y en la Figura 15 se observa la presencia de hemólisis.
Figura 14.Staphylococcus aureus cultivado en agar sangre.
148
Figura 15. Presencia de halos de hemólisis alrededor de las colonias de S. aureus en agar sangre
Mediante tinción de Gram y pruebas bioquímicas se realizó la tipificación bioquímica

de los 220 aislamientos, de los cuales 218 resultaron ser Gram positivos, cuya apariencia se
presenta en la figura 16.
Figura 16. Coloración de Gram de los aislamientos de S. aureus
Luego, al efectuar la prueba de la catalasa (Figura 17), de las 220 cepas analizadas,
173 fueron positivas. De las cuales, 18 mostraron una reacción muy débil a la prueba, por lo
que se las excluyó automáticamente del estudio. Se buscaba seleccionar aquellas cepas que
exhibiesen con mayor claridad las características propias del Staphylococcus aureus.
149
Figura 17. Comparación entre una prueba catalasa positiva y una negativa, la emisión de burbujas (B)
indica positividad en la prueba. Fuente:
http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_de_laboratorio
/Prueba_de_catalasa.html
Frente a la prueba de coagulasa (Figura 18), 79 cepas presentaron reacción positiva,

de las cuales 11, aún siendo Gram-positivas y catalasa positivas, no presentaron hemólisis
por lo cual también fueron excluidas del estudio.
Figura 18. Prueba de coagulasa en tubo, la formación del coagulo en el tubo de la izquierda
determina la positividad de la prueba. Fuente: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/cocos-
gram-positivos-piogenos-de-importancia-medica/prueba-de-coagulasa-para-staphylococcus/
150
Finalmente, un total de 68 cepas que resultaron positivas a todas las pruebas
bioquímicas y que además presentaron hemólisis, fueron seleccionadas. Se realizó el estudio
de susceptibilidad por difusión en agar método de Kirby Bauer (antibiograma). En la Tabla 10
se presentan los porcentajes de aislamientos sensibles, los que presentan sensibilidad
intermedia y los resistentes de las 68 cepas de S. aureus evaluadas.
Tabla 10. Resultados de la prueba de susceptibilidad por antibiograma efectuado frente a las 68
cepas de S.aureus.
ANTIMICROBIANO PORCENTAJE DE AISLAMIENTOS

SENSIBLES INTERMEDIOS RESISTENTES
Penicilina 66.18% - 33.82%
Amoxicilina-Ac.Clavulánico 91.16% 8.84%
Cefotaxime 91.16% 8.84%
Eritromicina 73.96% 8.40% 17.64%
Azitromicina 91.16% 8.84%
Tetraciclina 96.60% - 3.40%
Ciprofloxacina 90.36% 7.60% 2.04%
Gentamicina 99.32% 0.68%
Penicilina G fue el antimicrobiano frente al cual se encontró el mayor número de

microorganismos resistentes, un 34% del total de las muestras. Mientras que se encontró
baja resistencia a aminoglucósidos (0.68%), solo un aislamiento de los 68 analizados fue
resistente a gentamicina.
En general, de los 68 aislamientos seleccionados encontramos 27 que presentaron

resistencia a por lo menos un (1) antimicrobiano. Estas cepas quedaron excluidas del
estudio, ya que nuestro objetivo era seleccionar aquellas con alta susceptibilidad a todos los
antimicrobianos probados. Por lo tanto, solo 41 aislamientos cumplieron con esta condición,
de las cuales seleccionamos 10 cepas al azar para realizar los diversos estudios.
También mediante esta prueba de susceptibilidad por difusión (Antibiograma)

pudimos seleccionar los tres antimicrobianos a ensayar: Azitromicina, danofloxacina y
penicilina G. Estos agentes fueron elegidos como representantes de cada uno de los tres
151
grandes grupos establecidos según la clasificación basada en pautas PK/PD, y de acuerdo a lo
detallado anteriormente:
ANTIMICROBIANOS CON ACCIÓN: ANTIMICROBIANO SELECCIONADO
Tiempo- dependiente, con PAE nulo a Penicilinas (penicilina G)

moderado
Tiempo- dependiente con PAE Azálidos (azitromicina)
prolongado
Concentración dependiente con PAE Fluoroquinolonas (danofloxacina)
prolongado
5.2. PRUEBA CUANTITATIVA PARA EVALUAR LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA
Según mencionamos en el apartado Materiales y Métodos, se determinó la

Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) a través de la prueba de macrodilución en caldo
(Figura 19).
Figura 19. Resultado de la prueba de determinación de la CIM por el método de

macrodilución
Se determinó la CIM 50 y la CIM 90 analizando cada uno de los tres antimicrobianos

mencionados frente a cada uno de los 10 aislamientos a campo de S. aureus seleccionados.
152
Se evaluó la incidencia del pH en la sensibilidad de los microorganismos a los
antibacterianos, determinando la CIM a pH 7.4, 6.5 y pH 5.0. Se realizaron 3 repeticiones
para cada pH y para cada antimicrobiano.
La tabla 11 presenta los valores generales de CIM 50 y CIM 90 para los diferentes
antimicrobianos ensayados, frente a S. aureus (N= 10).
Tabla 11. CIM 50 Y CIM 90 de los diferentes antimicrobianos frente a Staphylococcus aureus a
diferentes pHs.
ANTIMICROBIANO pH CIM 50 µg/mL CIM 90 µg/mL
AZITROMICINA 7.4 1 1.5
6.5 8 12
5.0 64 95
DANOFLOXACINA 7.4 0.5 1
6.5 0.5 1
5.0 1 2
PENICILINA G 7.4 0.125 0.25
6.5 0.125 0.125
5.0 0.066 0.066
En las tablas 12, 13 y 14 se presentan los valores de CIM obtenidos frente a cada uno
de los 10 aislamientos a campo de S. aureus evaluados para los tres antibacterianos a los
distintos pHs, conjuntamente con la cepa ATCC.
Tabla 12. CIM de azitromicina (expresada en µg/mL) a pH 7.4, 6.5 y 5.0

CEPA CIM (µg/mL) pH 5.0 CIM (µg/mL) pH 6.5 CIM (µg/mL) pH 7.4
7 64 16-8 1
12 64 8 2-1
16 64 8 2-1
25 64 8 1
31 64 8 1
35 125 8 1
43 125 16-8 1
48 64 8 2-1
53 64 16-8 1
65 125 8 2-1
ATCC 64 16 2-1
153
En la Tabla 12, azitromicina muestra un aumento significativo en el valor de la CIM a
medida que se acidifica el medio, presentando un incremento de 8 veces la CIM entre el pH
7.4 y el pH 6.5; y de 64 a 125 veces la CIM entre el pH 7.4 y el pH 5.0.
Realizamos un test de anova de 1 via, a los grupos entre si, el cual arrojo diferencias
estadísticamente significativas entre las CIMs obtenidas a pH 5 vs pH 7.4 y pH 5 vs pH 6.5,
pero no entre CIMs obtenidas. El test no paramétrico (Kruskal-Wallis análisis de varianza de
una sola vía sobre rangos), arrojó diferencias estadísticamente significativas (P = < 0.001)
entre los grupos, por efecto del pH al comparar a pH 6.5 vs pH 7.4. Los resultados del análisis
se presentan en la Figura 20.
120
100
CIM azitromicina
80
Concentración (ug/mL)
60
40
20
0
pH 5 pH 6.5 pH 7.4
Figura 20. CIM de azitromicina frente a S. aureus a diferentes pHs.
Tabla 13. CIM de danofloxacina (expresada en µg/mL) a pH 7.4, 6.5 y 5.0

7 2 1 0.5
12 2-1 1 1-0.5
16 2-1 1 1-0.5
25 2-1 1-0.5 1-0.5
31 2-1 1 1-0.5
35 2-1 1-0.5 1-0.5
43 2 1-0.5 1-0.5
48 2-1 1-0.5 1-0.5
53 2-1 1-0.5 1-0.5
65 2 1-0.5 1
ATCC 2-1 1-0.5 0.5
154
Los valores de CIM de danofloxacina a pH 7.4 y 6.5 fueron similares (en el orden del
µg/mL). Se presentó un aumento de 1 vez la CIM a pH 5.0, en el cual se incrementó a 2
µg/mL.
Realizamos la estadística descriptiva, y en este caso tampoco paso el Test de

Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, por lo cual se procedió a analizar por Kruskal-Wallis,
arrojando una P = 0.004, es decir existe entre los grupos diferencia estadísticamente
significativas por efecto del pH (Figura 21).
2.0
CIM danofloxacina
1.5
1.0
0.5
0.0
pH 5 pH 6.5 pH 7.4
Figura 21. CIM de danofloxacina frente a S. aureus a diferentes pHs.
Al aplicar el Test de Bonferroni entre los grupos, se obtuvo diferencias significativas

entre las CIMs obtenidas a pH 5 vs pH 7.4 , pero no entre CIMs obtenidas pH 5 vs pH 6.5 ni a
pH 6.5 vs pH 7.4 (Figura 20).
En el caso de Penicilina G, se observó una disminución significativa en el valor de la

CIM a medida que el pH es más ácido, disminuyendo 4 veces entre pH 7.4 y 6.5; y 8 veces
entre pH 7.4 y 5.0 (Tabla 14).
155
Tabla 14. CIM de Penicilina G frente a Staphylococcus aureus a pH 7.4, 6.5 y 5.0
7 0.066 0.125 0.5-0.25
12 0.066 0.125 0.5
16 0.066 0.125-0.066 0.5-0.25
25 0.066 0.125-0.066 0.5-0.25
31 0.125-0.066 0.125 0.5-0.25
35 0.066 0.125-0.066 0.25-0.125
43 0.066 0.125-0.066 0.5-0.25
48 0.125 0.125 0.5-0.25
53 0.125-0.066 0.125 0.25-0.125
65 0.125-0.066 0.125 0.5-0.25
ATCC 0.066 0.25-0.125 0.5-0.25
Nuevamente tras realizar la estadística descriptiva, no pasó el Test de Normalidad.

Kruskal-Wallis arrojó una P = < 0.001, indicando que existen diferencias estadísticamente
significativas entre los grupos por efecto del pH (Figura 22), lo cual también coincidió con el
Test de Bonferroni.
0.30
0.25 CIM Penicilina G
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
pH 5 pH 6.5 pH 7.4
Figura 22. CIMs de penicilina G frente a S. aureus a diferentes pH.
La Tabla 15, presenta la estadística descriptiva de los datos obtenidos para los tres
antimicrobianos bajo las diferentes condiciones de pH. Puede apreciarse claramente la
existencia de cambios en los valores de CIM al modificarse las condiciones del medio de
cultivo.
156
Estos cambios en los valores de CIM, en algunas ocasiones, se traducen
estadísticamente en diferencias altamente significativas, que pueden llegar a determinar
diferencias en la eficacia de los tratamientos antibacterianos implementados.
Tabla 15. Estadística descriptiva para la concentración inhibitoria mínima (CIM) de azitromicina,
danofloxacina y penicilina G frente a S. aureus a diferentes pHs del medio de cultivo.
ANTIMICROBIANO pH N Media SD Min Max K-S (P) Bonferroni
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
a ac
AZITROMICINA 5 33 80.64 27.59 64 125 <0.001 <0.001
b ab
AZITROMICINA 6.5 33 9.46 3.58 4 16 <0.001 <0.001
c bc
AZITROMICINA 7.4 33 1. 36 0.62 0.5 2 <0.001 0.131
d df
DANOFLOXACINA 5 33 1.24 0.44 1 2 <0.001 0.008
e de
DANOFLOXACINA 6.5 33 1.11 0.41 0.5 2 <0.001 0.506
f ef
DANOFLOXACINA 7.4 33 0.94 0.35 0.5 2 <0.001 0.280
g gi
PENICILINA G 5 33 0.08 0.02 0.033 0.125 <0.001 <0.001
h gh
PENICILINA G 6,5 33 0.11 0.05 0.066 0.25 <0.001 0.017
i hi
PENICILINA G 7.4 33 0.21 0.06 0.125 0.25 <0.001 <0.001
5.3. CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA
Determinamos la Concentración Mínima Bactericida (CMB), es decir la mínima

cantidad de antibiótico capaz de destruir al 99.9% del inóculo inicial.
Utilizamos la técnica de dilución en CMH como fue previamente explicado en el

apartado 4.2.4 de Métodos. Se sembró una cantidad conocida de inóculo, de cada uno de los
tubos sin turbidez, en placas de agar. El número de colonias que creció en estos subcultivos,
fue comparado con el número de UFC/mL del cultivo original. La mínima concentración del
agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0.1 % del inóculo original se
denomina concentración bactericida mínima (CBM).
En las Tablas 16 a 18 se presenta el efecto del pH sobre las CIMs, CBMs y la relación
entre ambas para los tres antimicrobianos bajo estudio.
157
Tabla 16. Efecto del pH sobre la CIM y la CMB de Azitromicina frente a Staphylococcus aureus
CIM CMB CMB:CIM CIM CMB CMB:CIM CIM CMB CMB:CIM
CEPA (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
pH 5.0 pH 6.5 pH 7.4
7 64 250 4 16-8 64 4-8 1 16 16
12 64 250 4 8 64 8 2-1 16 8-16
16 64 250 4 8 64 8 2-1 16 8-16
25 64 250 4 8 64 8 1 16 16
31 64 250 4 8 64 8 1 16 16
35 125 250 2 8 64 8 1 16 16
43 125 250 2 16-8 64 4-8 1 16 16
48 64 250 4 8 64 8 2-1 16 8-16
53 64 250 4 16-8 64 4-8 1 16 16
65 125 250 2 8 64 8 2-1 16 8-16
ATCC 64 250 4 16 64 8 2-1 16 8-16
CIM: concentración inhibitoria mínima; CMB: concentración bactericida mínima
158
Tabla 17. Efecto del pH sobre la CIM y la CMB de Danofloxacina frente a Staphylococcus aureus
pH 5.0 pH 6.5 pH 7.4
7 2 8 4 1 2 2 0.5 0.5 1
12 2-1 8-4 4 1 2 2 1-0.5 1-0.5 1
16 2-1 8-4 4 1 2 2 1-0.5 1-0.5 1
25 2-1 8-4 4 1-0.5 2-1 2 1-0.5 1-0.5 1
31 2-1 8-4 4 1 2 2 1-0.5 1-0.5 1
35 2-1 8-4 4 1-0.5 2 2 1-0.5 1-0.5 1
43 2 8 4 1-0.5 2 2 1-0.5 1-0.5 1
48 2-1 8-4 4 1-0.5 2 2 1-0.5 1-0.5 1
53 2-1 8-4 4 1-0.5 2 2 1-0.5 1-0.5 1
65 2 8 4 1-0.5 2 2 1 1 1
ATCC 2-1 8-4 4 1-0.5 2 2 0.5 0.5 1
159
Tabla 18. Efecto del pH sobre la CIM y la CMB de Penicilina G frente a Staphylococcus aureus
pH 5 pH 6.5 pH 7.4
7 0.066 2 16 0.125 4 16 0.5-0.25 4 4-8
12 0.066 2 16 0.125 4 16 0.5 4 4
16 0.066 2 16 0.125-0.066 4 16 0.5-0.25 4 4-8
25 0.066 2 16 0.125-0.066 4 16 0.5-0.25 4 4-8
31 0.125-0.066 2 8 - 16 0.125 4 16 0.5-0.25 4 4-8
35 0.066 1 16 0.125-0.066 4 16 0.25-0.125 4 8-16
43 0.066 2 16 0.125-0.066 4 16 0.5-0.25 4 4-8
48 0.125 2 8 0.125 4 16 0.5-0.25 4 4-8
53 0.125-0.066 1 8 - 16 0.125 4 16 0.25-0.125 4 8-16
65 0.125-0.066 2 8 - 16 0.125 4 16 0.5-0.25 4 4-8
ATCC 0.066 2 16 0.25-0.125 4 8-16 0.5-0.25 4 4-8
160
5.4. CURVAS DE LETALIDAD O MUERTE BACTERIANA
Posteriormente realizamos curvas de letalidad o muerte bacteriana (CLB), método

cinético que permite evidenciar el poder bactericida del antibacteriano. Se valoró la
capacidad de matar en relación con el tiempo y con distintas concentraciones fijas de los
antimicrobianos en estudio. La curva de muerte bacteriana es un método complementario
de la CMB.
Se enfrentó un inóculo normalizado a concentraciones fijas de antimicrobiano en

caldo. Las concentraciones fueron 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM; más un control sin
antibiótico. Se realizó recuento de colonias a los siguientes tiempos: 0, 1, 2, 4, 6 8, 12 y 24
horas, los que fueron expresados en logarítmo de unidades formadoras de colonia (Log 10
UFC). El poder bactericida se determina en la caída de 3 logaritmos decimales en un tiempo
determinado.
Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética de la

muerte es casi siempre exponencial ya que el número de sobrevivientes disminuye de forma
geométrica con el tiempo. Si representamos gráficamente el logaritmo del número de
sobrevivientes frente al tiempo se obtiene una línea recta cuya pendiente negativa define la
tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos da una idea de la fracción de la población
inicial que sobrevive durante un determinado período de tratamiento. Para determinar el
número real de sobrevivientes es necesario conocer además el tamaño inicial de la
población.
Como los microorganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes

antimicrobianos, los factores que se hacen significativos son el tamaño de la población inicial
y la tasa de mortalidad de los miembros más resistentes de la población.
Las cepas N° 7, 12, 25, 35, 53 y 63 fueron seleccionadas para realizar curvas de
muerte bacteriana frente a concentraciones ascendentes de los 3 antimicrobianos en
estudio y bajo diferentes condiciones de pH (7.4, 6.5 y 5.0), como así también en presencia
de leche y de suero bovino.
161
A continuación se presentan los análisis de las curvas de muerte bacteriana realizadas
a las cepas de S. aureus (n= 6) aisladas a campo a partir de bovinos portadores de mastitis
subclínica en comparación con S.aureus ATCC 29213 (cepa de referencia), frente a cada uno
de los tres antimicrobianos en estudio.
5.4.1. AZITROMICINA
Las Figuras 22 a 51 presentan las curvas de muerte bacteriana para los aislamientos
de S. aureus obtenidos de bovinos portadores de mastitis subclínica (promedio de seis cepas
salvajes), como así también de la cepa de referencia ATCC 29213 frente a diferentes CIMs de
azitromicina en CMH a pH 7.4, 6.5 y 5.0; en leche y en CMH suplementado con 40% suero
bovino.
5.4.1.1. Azitromicina a pH 7.4
Tanto los aislamientos salvajes como la cepa de referencia tuvieron un

comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de azitromicina en CMH pH
7.4. La CIM de aztiromicina a pH 7.4 fue 1 µg/mL, obsérvese en las figuras 22 y 23 que su
actividad frente a S. aureus no se vio aumentada al aumentar las concentraciones del
antimicrobiano, prácticamente a 1, 2, 4 y 8 veces la CIM presentó similar cinética de muerte.
Este comportamiento fue luego corroborado con el modelado matemático.
En las Figuras 24 y 25 se presentan las curvas de crecimiento control para los

aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente (24 A y 25 A). Las curvas en ausencia
de azitromicina fueron analizadas por el modelo de Gompertz. En este grupo también se
incorporaron las curvas obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.125, 0.25 y 0.5 CIM de
azitromicina, ya que, como se puede observar en las gráficas, a esas concentraciones no
existió inhibición del crecimiento bacteriano, aunque sí se vio afectada la magnitud de
crecimiento.
En las Figuras 23 y 24 se presentan las curvas de muerte bacteriana para los

aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente. El modelado de las curvas de
162
letalidad bacteriana en presencia de azitromicina (1xCIM, 2xCIM, 4xCIM y 8xCIM) a pH 7.4,
fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. A las cuatro concentraciones,
tanto las cepas salvajes como la de referencia, presentaron similar cinética de muerte.
Azitromicina - S. aureus salvajes (n= 6) - pH 7.4
12
tiempo (h) vs control
x column vs y column
10 tiempo (h) vs 0.125 CIM
x column 1 vs y column 1
tiempo (h) vs 0.25 CIM
8
Log ufc/mL
tiempo (h) vs 1 CIM

6 x column 4 vs y column 4
tiempo (h) vs 2 CIM
4 tiempo (h) vs 4 CIM
tiempo (h) vs 8 CIM
2
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH a pH 7.4
Azitromicina - S. aureus ATCC - pH 7.4
12
8
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs 1 CIM

tiempo (h) vs 2 CIM
tiempo (h) vs 4 CIM
4
tiempo (h) vs 8 CIM
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
163
AZT- S. aureus salvajes (n= 6)-pH 7.4
12
12
11
A B
11
10
10
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
9
9
8
8
7 x column vs y column x column 1 vs y column 1

tiempo (h) vs control 7 tiempo (h) vs 0.125 cim
6
6
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
12 12
C D
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Log.ufc/mL
9 9
8 8
x column 2 vs y column 2 x column 3 vs y column 3

7 7
tiempo (h) vs 0.25 cim tiempo (h) vs 0.5 cim
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h) Tiempo (h)
control (sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.125 CIM de azitromicina (0.25 µg/mL), C:
curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL), D: curva de crecimiento frente a
0.5 CIM (1 µg/mL).
164
12 12
A B
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
9 9
8 8
7 tiempo (h) vs control 7 x column 1 vs y column 1
tiempo (h) vs 0.125 cim
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
12 12
C D
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Y Data
9 9
8 8

7 7
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h) X Data
(sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.125 CIM de azitromicina (0.25 µg/mL), C: curva
de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL), D: curva de crecimiento frente a 0.5
CIM (1 µg/mL).
En la Tabla 19 se presentan los parámetros obtenidos al aplicar el modelado de

Gompertz (apartado 4.2.5.4. de Métodos), cuya expresión matemática es:
Log N = a + C. exp (-exp (-b (t – m))) Ec. 6
Recordemos que Log N es el logaritmo decimal de los recuentos microbianos (Log

UFC/mL) al tiempo t (h); a es el Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece
indefinidamente (equivale aproximadamente al Log de los niveles iniciales de bacterias) (Log
165
UFC/mL); c es el Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo se incrementa
indefinidamente (es el número de ciclos Log de crecimiento) (Log UFC/mL); m es el tiempo
requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento (h); b es la velocidad de
crecimiento relativa al tiempo m (h-1). Con estos parámetros obtuvimos la velocidad
específica de crecimiento (µ = b. c / e) (Log UFC/mL*h) (e = 2.7182), la duración de la fase de
latencia (LPD = m – 1/b) (h) y la máxima densidad poblacional microbiana bajo condiciones
particulares (MPD = a + c) (Log UFC/mL).
A medida que se aumentó la concentración de azitromicina (0.125, 0.25 y 0.5 CIM),

disminuyó MPD y se mantuvo el microorganismo durante mayor tiempo en fase de latencia.
Aunque estos efectos ocasionados por la presencia de concentraciones

subinhibitorias de azitromicina fueron más evidentes al analizar los datos experimentales de
UFC/mL en función del tiempo en ausencia de azitromicina y en presencia de
concentraciones sub-CIM mediante un modelo de crecimiento exponencial:
N = N 0 . exp (Kc . T) Ec. 7
Donde la pendiente de crecimiento se hace más suave en presencia de

concentraciones sub-CIM, arrojando por lo tanto una semivida de crecimiento más lenta en
comparación a la población bacteriana en ausencia de azitromicina (Tabla 19).
166
Tabla 19. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH a pH 7.4 frente a
S. aureus aislados a campo - pH 7.4 S. aureus ATCC 29213 - pH 7.4

Parámetros Unidad control 0.125 CIM 0.25 CIM 0.5 CIM control 0.125 CIM 0.25 CIM 0.5 CIM
R 0.9907 0.9981 0.9869 0.9642 0.9999 0.9925 0.9904 0.9833
c Log ufc/mL 4.94 3.56 5.96 917 4.75 2.47 0.99 0.78
-1
b h 0.15 0.24 0.12 0.14 0.15 0.26 0.42 0.09
m h 4.06 7.61 -15.49 -55.29 4.20 6.73 2.37 -76.10
a Log ufc/mL 6.91 7.81 2.65 -908.69 7.06 7.93 7.65 -569.52
µ Log ufc/mL*h 0.28 0.31 0.27 46.35 0.27 0.24 0.15 19.09
LPD h 19.89 27.82 -132.57 -409.65 20.77 21.66 3.29 -858.60
MPD Log ufc/mL 11.84 11.37 8.61 8.24 11.81 10.40 8.64 8.41
-1
Kc h 0.2514 0.2173 0.0529 0.0354 0.2436 0.1500 0.0454 0.0438
T½c h 2.76 3.19 13.10 19.58 2.84 4.62 15.26 15.82
Modelado de Gompertz. R: Coeficiente de correlación, c: Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo se incrementa
indefinidamente, b: velocidad de crecimiento relativa al tiempo m, m: tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de
crecimiento, a: Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece indefinidamente, µ: velocidad específica de
crecimiento, LPD: duración de la fase de latencia y MPD: máxima densidad poblacional microbiana bajo condiciones particulares.
Crecimiento exponencial. Kc: constante de crecimiento de orden uno.
167
Azitromicina - S.aureus salvajes - pH 7.4
11 11
A x column 4 vs y column 4
B
10 10 x column 5 vs y column 5
tiempo (h) vs 1 cim
tiempo (h) vs 2 cim
9 9
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
8 8
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
11 11
C D
10 x column 6 vs y column 6 x column 7 vs y column 7
10
tiempo (h) vs 4 cim tiempo (h) vs 8 cim
9 9
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
8 8
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
aureus salvajes, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (2 µg/mL), B: 2x CIM de azitromicina (4
µg/mL), C: 4x CIM de azitromicina (8 µg/mL), D: 8x CIM de azitromicina (16 µg/mL).
168
2D Graph 2
11 11
A B
10 10
tiempo (h) vs 1 cim tiempo (h) vs 2 cim
9 9
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
8 8
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
11
11
C D
10
10

9 tiempo (h) vs 4 cim tiempo (h) vs 8 cim
9
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
8
8
7
7
6
6
5
5
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
En la Tabla 20 se presentan los parámetros obtenidos al ajustar los datos

experimentales de UFC/mL en función del tiempo y a diferentes concentraciones, aplicando
un modelo sigmoideo menos base:
 . �
N = N0–  Ec. 8
50�
+ �

del inóculo inicial (106 UFC/mL), N max es la población bacteriana final, T I50 es el tiempo
169
necesario para que se alcance el 50% de la inhibición bacteriana máxima, ϒ es el coeficiente
de sigmoidicidad y T es el tiempo.
También en la Tabla 20 se presentan los parámetros obtenidos tras la aplicación del

modelo de regresión lineal, cuya ecuación es:
Log N t = log N 0 + a t Ec.9
Donde: Log N t es el logaritmo decimal de los recuentos microbianos finales (Log

UFC/mL) al cabo del tiempo t, dado en horas; Log N 0 es el logaritmo decimal de los
recuentos microbianos iniciales (Log UFC/mL); a corresponde a la pendiente de la regresión
((UFC/ml)-1h-1) que es negativa cuando hay efecto bactericida.
170
Tabla 20. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH a pH 7.4 frente a diferentes
concentraciones múltiplos de la CIM de azitromicina.
S. aureus aislados a campo - pH 7.4 S. aureus ATCC - pH 7.4

Parámetros Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM
R 0.9763 0.9924 0.9989 0.9917 0.9670 0.975 0.9971 0.9809
Nmax UFC/mL 2109000 1694000 1612000 1588000 2180000 1604000 1444000 1466000
ϒ 60.54 19.76 16.46 13.01 89.67 12.84 14.47 23.66
TI50 h 5.63 4.88 4.73 4.41 5.75 4.37 4.56 5.13
N0 UFC/mL 49800000 47166667 44533333 38466667 50600000 40800000 42600000 35400000
A (UFC/mL)-1 h-1 -0.1318 -0.1386 -0.1383 -0.1328 -0.1310 -0.1349 -01410 -0.1327
T½a h 5.26 5.00 5.01 5.22 5.29 5.14 4.91 5.22
6
Modelo Sigmoidal. N 0 : concentración del inóculo inicial (10 UFC/mL), N max : población bacteriana final, T I50 : tiempo necesario para
que se alcance el 50% de la inhibición bacteriana máxima, ϒ: coeficiente de sigmoidicidad.
Modelo regresión lineal. a: pendiente de la regresión. T½a: tiempo medio de declinación
171
5.4.1.2. Azitromicina a pH 6.5
Nuevamente, como ocurrió al pH 7.4, tanto los aislamientos salvajes como la cepa de
referencia tuvieron un comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de
azitromicina. La CIM para azitiromicina a pH 6.5 fue 8 µg/mL, en las Figuras 29 y 30 se puede
corroborar su acción independiente de la concentración, ya que su actividad frente a S.
aureus no aumenta al incrementar las concentraciones. Presentó similar cinética de muerte
a 1, 2, 4 y 8 veces la CIM, de manera similar a lo que ocurrió cuando se ensayó a pH 7.4. El
aumento de la CIM demuestra la pérdida de potencia antimicrobiana a medida que el pH se
va acidificando. Este comportamiento fue corroborado con el modelado matemático.

incorporaron las curvas obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25 y 0.5 CIM de azitromicina,
ya que, como se puede observar en las gráficas, a esas concentraciones continuó el
crecimiento bacteriano, aunque de manera más lenta.

letalidad bacteriana, en presencia de azitromicina (1xCIM, 2xCIM, 4xCIM y 8xCIM) a pH 6.5,
fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. A las cuatro concentraciones
tanto las cepas salvajes como la de referencia presentaron similar cinética de muerte.
172
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) - pH 6.5
14
tiempo (h) vs CIM (8 ug/mL)
8
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs 2 CIM

tiempo (h) vs 4 CIM
tiempo (h) vs 8 CIM
4
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH a pH 6.5
14

12
10
tiempo (h) vs CIM (8ug/mL)
8
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs 2 CIM
6
tiempo (h) vs 4 cim
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
173
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) - pH 6.5
13 13
A B
12 12
11 11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 10
9 9
8 x column vs y column 8 x column 1 vs y column 1

tiempo (h) vs control tiempo (h) vs 0.25 cim
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
13
C
12
11
Log. ufc/mL
10
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
control (sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (2 µg/mL), C:
curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (4 µg/mL).
174
13 13
A B
12 12
11 11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 10
9 9
8 8 tiempo (h) vs 0.25 CIM
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
13
C
12
11
Log. ufc/mL
10
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
crecimiento control (sin azitromicina), B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (2
µg/mL), C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (4 µg/mL).

Gompertz (apartado 4.2.5.4. de Métodos).
175
Tabla 21. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH a pH 6.5 frente a
S. aureus aislados a campo - pH 6.5 S. aureus ATCC 29213 - pH 6.5
Parámetros Unidad control 0.25 CIM 0.5 CIM 1 CIM* control 0.25 CIM 0.5 CIM 1 CIM*
R 0.9990 0.9978 0.9866 0.9554 0.9998 0.9985 0.9940 0.9326
c Log ufc/mL 4.94 3.52 1.91 1.00 6.33 3.13 3.48 1.05
b h-1 0.17 0.20 0.31 -47.47 0.13 0.32 0.20 -10.29
m h 6.28 2.86 3.55 5.12 3.13 4.06 5.56 5.94
a Log ufc/mL 7.32 6.90 7.43 6.71 5.97 7.42 7.28 6.71
µ Log ufc/mL*h 0.32 0.26 0.22 -17.46 0.29 0.37 0.25 -3.99
LPD h 30.46 9.24 8.13 -0.09 17.03 9.47 23.16 -0.48
MPD Log ufc/mL 12.27 10.42 9.34 7.71 12.30 10.55 10.76 7.77
Kc h-1 0.2520 0.1415 0.0755 nc 0.2630 0.1264 0.1721 nc
T½c h 2.75 4.90 9.18 2.63 5.48 4.03
Crecimiento exponencial. Kc: constante de crecimiento de orden uno. *Se realizó el modelado de Gompertz. nc: no calculado
176
Azitromicina - S.aureus salvajes (n=6) - pH 6.5
9 9
A tiempo (h) vs cim (8 ug/mL)
B x column 4 vs y column 4
8 8 tiempo (h) vs 2 cim
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
9 9
C x column 5 vs y column 5
D x column 6 vs y column 6
8 tiempo (h) vs 4 cim tiempo (h) vs 8 cim
8
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
aureus salvajes, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (8 µg/mL), B: 2xCIM de azitromicina (16
µg/mL), C: 4xCIM de azitromicina (32 µg/mL), D: 8xCIM de azitromicina (64 µg/mL).
177
9 9
A B
8 8
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
tiempo (h) vs CIM (8ug/mL) x column 4 vs y column 4
tiempo (h) vs 2 CIM
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
9 9
C D
8 8
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
tiempo (h) vs 4 CIM tiempo (h) vs 8 CIM
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

un modelo sigmoideo menos base
178
Tabla 22. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH a pH 6.5 frente a diferentes
concentraciones múltiplos de la CIM de azitromicina.
S. aureus aislados a campo - pH 6.5 S. aureus ATCC - pH 6.5

Parámetros Unidad 2 CIM 4 CIM 8 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM
R 0.9967 0.9964 0.9795 0.9481 0.9944 0.9984
Nmax UFC/mL 4015000 2675000 2020000 3998000 2732000 2512000
ϒ 63.64 15.68 12.26 -168.84 9.63 11.95
TI50 H 5.58 4.76 4.38 4.65 4.50 4.36
N0 UFC/mL 31500000 32750000 34800000 29600000 32200000 29000000
a (UFC/mL)-1 h-1 -0.0858 -0.1044 -0.1186 -0.0834 -0.1028 -0.1019
T½a H 8.08 6.64 5.84 8.31 6.74 6.80
6
Modelo Sigmoidal. N 0 : concentración del inóculo inicial (10 UFC/mL), N max : población bacteriana final, T I50 : tiempo necesario
para que se alcance el 50% de la inhibición bacteriana máxima, ϒ: coeficiente de sigmoidicidad.
179
5.4.1.3. Azitromicina pH 5
A pH 5 se mantiene similar comportamiento entre los aislamientos salvajes y la cepa

de referencia frente a las diferentes concentraciones de azitromicina. La CIM de
azitromicina a pH 5 fue ≥ 64 µg/mL. A este pH, se presenta a grandes concentraciones (2 y 4
veces la CIM) una mayor acción de la azitromicina frente al S. aureus. Lo dicho se puede
observar en las Figuras 35 y 36. Sin embargo el aumento de la CIM demuestra una pérdida
de potencia antimicrobiana a medida que el pH se va acidificando, ya que para lograr efecto
antibacteriano se requiere de grandes concentraciones de azitromicina. Este
comportamiento fue corroborado con el modelado matemático.

incorporaron las curvas obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25 y 0.5 CIM, ya que, como se
puede observar en las gráficas, a las mismas continuó el crecimiento bacteriano, aunque
podemos notar que de manera más lenta.
Azitromicina - S.aureus salvajes (n=6) - pH 6.5
180
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) - pH 5
14
12
TIEMPO (H) vs CONTROL
TIEMPO (H) vs 0.25 CIM
10
Log. ufc/mL
TIEMPO (H) vs CIM (64 ug/mL)

6 TIEMPO (H) vs 2 CIM
TIEMPO (H) vs 4 CIM
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en CMH a pH 5.
Azitromicina - S. aureus ATCC - pH 5
14
12 TIEMPO (H) vs control

8 TIEMPO (H) vs CIM (64 ug/mL)
Log. ufc/mL
TIEMPO (H) vs 2 CIM
TIEMPO (H) vs 4 CIM
4
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Azitromicina en CMH a pH 5.
181
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) - pH 5
13 13
A B
12 12
11 11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 10
9 9

TIEMPO (h) vs CONTROL TIEMPO (h) vs 0.25 CIM
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
13
C
12
11
Log. ufc/mL
10
TIEMPO (h) vs 0.5 CIM
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
control (sin azitromicina) a pH 5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (16
µg/mL) a pH 5, C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (32 µg/mL) a pH 5.
182
Azitromicina - S.aureus ATCC - pH 5
13 13
12
A 12
B
11
11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10
10
9
9
8
x column vs y column x column 1 vs y column 1
8
TIEMPO (h) vs control 7 TIEMPO (h) vs 0.25 CIM
7 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
13
C
12
11
Log. ufc/mL
10
TIEMPO (h) vs 0.5 CIM
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
crecimiento control (sin azitromicina) a pH 5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
azitromicina (16 µg/mL) a pH 5, C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de azitromicina (32 µg/mL)
a pH 5.

183
Tabla 23. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH a pH 5 frente a concentraciones
inferiores a la CIM (64 µg/mL).
S. aureus aislados a campo - pH 5 S. aureus ATCC 29213 - pH 5
Parámetros Unidad control 0.25 CIM 0.5 CIM control 0.25 CIM 0.5 CIM
R 0.9968 0.9974 0.9977 0.9977 0.9960 0.9991
c Log ufc/mL 4.86 2.97 2.99 4.82 3.39 2.95
b h-1 0.22 0.35 0.30 0.27 0.26 0.30
m H 5.83 4.87 5.25 6.25 5.39 5.43
a Log ufc/mL 7.45 7.40 7.35 7.37 7.28 7.29
µ Log ufc/mL*h 0.40 0.38 0.33 0.48 0.32 0.33
LPD H 21.70 11.15 14.14 19.45 17.11 14.70
MPD Log ufc/mL 12.31 10.37 10.33 12.19 10.67 10.25
Kc h-1 0.1919 0.1461 0.1286 0.1843 0.1618 0.1322
T½c H 3.61 4.74 5.39 3.76 4.28 5.24
184
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) pH 5
9 9
A B
8 8
7 7 TIEMPO (h) vs 2 CIM
Log. ufc/mL
Y Data
6 TIEMPO (h) vs CIM (64 ug/mL) 6
5 5
4 4
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h) X Data
9
C
TIEMPO (h) vs 4 CIM
7
Log. ufc/mL
4
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aureus salvajes a pH 5. A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (64 µg/mL), B: 2x CIM de
azitromicina (128 µg/mL), C: 4x CIM de azitromicina (256 µg/mL).
185
Azitromicina - S. aureus ATCC - pH 5
9 9
A B
8 8
TIEMPO (h) vs 2 CIM
7 7
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6 6
5
TIEMPO (h) vs CIM (64 ug/mL)
4 4
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
9
C
8
TIEMPO (h) vs 4 CIM
7
Log. ufc/mL
4
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Figura
40. Modelado Sigmoideo realizado a las curvas de muerte bacteriana de S. aureus ATCC 29213 a pH
5, A: S. aureus frente a 1x CIM de azitromicina (64 µg/mL), B: 2x CIM de azitromicina (128 µg/mL), C:
4x CIM de azitromicina (256 µg/mL).

un modelo sigmoideo menos base.
186
Tabla 24. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH a pH 5 frente a diferentes concentraciones
(CIM -64µg/mL-, 2 y 4 veces la CIM) de azitromicina.
S. aureus aislados a campo - pH 5 S. aureus ATCC - pH 5
Parámetros Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM

R 0.9854 0.9566 1.0000 0.9745 0.9916 0.9999
Nmax UFC/mL 17000000 200000 20000 15800000 200000 20000
ϒ 29.29 1.17 4.75 23.14 2.61 5.19
TI50 H 1.94 3.16 1.11 1.93 3.92 0.88
N0 UFC/mL 39800000 36000000 33200000 37600000 20400000 21200000
a (UFC/mL)-1 h-1 -0.0355 -0.2164 -0.3090 -0.0361 -0.1927 -0.2903
T½a H 19.52 3.20 2.24 19.20 3.60 2.39
6
187
5.4.1.4. Efecto de la leche sobre la actividad de Azitromicina
Azitromicina en leche, cuyo pH se encuentra entre 6.5-6.8, comenzó a ejercer cierta

actividad frente al S. aureus a concentraciones muy bajas (0.25 CIM). Considerando que la
CIM en leche fue de 8 µg/mL, a 2 µg/mL presentó cierta inhibición sobre el crecimiento
microbiano. En las Figuras 41 y 42 se puede observar claramente este hallazgo. Si bien se
evidenció un aumento de la CIM a medida que el pH se se vuelve más ácido, la inhibición
bacteriana en leche y a grandes concentraciones fue evidente. Este comportamiento fue
corroborado con el modelado matemático.

de azitromicina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, como así también las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.125xCIM de azitromicina (1µg/mL), ya que, como se
puede observar en las gráficas, a esa concentración no se observó inhibición bacteriana ni
tampoco crecimiento, evidenciándose un estado estacionario prolongado.

letalidad bacteriana, en presencia de azitromicina (0.25xCIM, 0.5x CIM, 1xCIM, 2xCIM, 4xCIM
y 8xCIM) en leche bovina, fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. En
todas las concentraciones ensayadas, tanto las cepas salvajes como las de referencia
presentaron similar cinética de muerte.
188
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Azitromicina en leche bovina.
Azitromicina - S. aureus ATCC - Leche
14
12
8
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs cim (8ug/mL)

tiempo (h) vs 4 CIM
tiempo (h) vs 8 CIM
2
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Azitromicina en leche bovina.
189
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) - Leche
12 12
A B
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
9 9
8 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
crecimiento control (sin azitromicina) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.125 CIM de
azitromicina (1 µg/mL) en leche.
12 12
A B
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
x column vs y column tiempo (h) vs 0.125 cim
9 9
8 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
crecimiento control (sin azitromicina) en leche bovina, B: curva de crecimiento frente a 0.125 CIM de
azitromicina (1 µg/mL) en el mismo medio de cultivo que la curva control.

190
Tabla 25. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en leche bovina frente a concentraciones
inferiores a la CIM (8 µg/mL).
S. aureus aislados a campo en LECHE S. aureus ATCC 29213 en LECHE
Parámetros Unidad Control 0.125 CIM control 0.125 CIM

R 0.9921 0.9487 0.9931 0.9741
c Log ufc/mL 4.37 0.43 4.76 703.86
b h-1 0.19 0.40 0.17 0.14
m H 6.54 8.33 6.71 -50.89
a Log ufc/mL 7.34 7.51 7.27 -695.79
µ Log ufc/mL*h 0.30 0.06 0.29 35.58
LPD H 29.37 18.43 34.03 -377.68
MPD Log ufc/mL 11.71 7.95 12.03 8.07
Kc h-1 0.2675 0.0441 0.3040 0.0440
T½c H 2.59 15.71 2.28 15.75
191
Azitromicina - S.aureus salvajes (n=6) - Leche
9 9
A B
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
9
9 C D x column 5 vs y column 5
x column 4 vs y column 4 tiempo (h) vs 2 cim
tiempo (h) vs 1 cim (8ug/mL) 8
8
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7
7
6
6
5
5
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
9 9
E F
8 tiempo (h) vs 4 cim 8 tiempo (h) vs 8 cim
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
aureus salvajes en leche bovina. A: S. aureus frente a 0.25xCIM de azitromicina (2 µg/mL), B:
0.5xCIM de azitromicina (4 µg/mL), C: 1xCIM de azitromicina (8 µg/mL), D: 2xCIM de azitromicina (16
µg/mL), E: 4xCIM de azitromicina (32 µg/mL) y F: 8xCIM de azitromicina (64 µg/mL).
192
9 9
A B
8 x column 2 vs y column 2 8 x column 3 vs y column 3
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
9
9
C D
x column 4 vs y column 4 8 x column 5 vs y column 5
8
tiempo (h) vs CIM (8ug/mL) tiempo (h) vs 2 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7
7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

9 9
E F
tiempo (h) vs 8 cim
tiempo (h) vs 4 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
7 7
6 6
5 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
29213, en leche bovina. A: S. aureus frente a 0.25xCIM de azitromicina (2 µg/mL), B: 0.5xCIM de
azitromicina (4 µg/mL), C: 1xCIM de azitromicina (8 µg/mL), D: 2xCIM de azitromicina (16 µg/mL), E:
4xCIM de azitromicina (32 µg/mL) y F: 8xCIM de azitromicina (64 µg/mL).
193
194
Tabla 26. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en leche bovina frente a diferentes concentraciones
(0.25, 0.5, CIM -8µg/mL-, 2, 4 y 8 veces la CIM) de azitromicina
S. aureus aislados a campo en LECHE S. aureus ATCC en LECHE
Parám. Unidad 0.25 CIM 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 0.25 CIM 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM
R 0.9566 0.9727 0.9915 0.9896 0.9974 0.9982 0.9943 0.9849 0.9905 0.9687 0.9984 0.999
Nmax UFC/mL 8400000 9400000 5400000 4200000 600000 400000 8400000 7800000 4400000 3000000 1000000 200000
ϒ 2.98 3.60 2.76 0.95 1.02 1.09 5.80 3.99 0.87 1.59 0.71 3.63
TI50 h 3.85 3.99 3.60 1.27 1.58 1.43 6.61 3.84 1.66 1.59 1.04 1.11
N0 UFC/mL 23900000 23400000 23400000 23900000 23000000 21800000 28200000 24600000 27200000 23400000 23600000 23200000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.0476 -0.0380 -0.0611 -0.0725 -0.1520 -0.1666 -0.0505 -0.0479 -0.0759 -0.0856 -0.1317 -0.1981
T½a h 15.89 18.24 11.34 9.56 4.56 4.16 13.72 14.47 9.13 8.10 5.26 3.50
6
Modelo regresión lineal. a: pendiente de la regresión, T½a: tiempo medio de declinación.
195
5.4.1.5. Efecto del suero sobre la actividad de Azitromicina
Azitromicina en suero, cuyo pH es 7.4, comenzó a ejercer actividad frente al S. aureus

a concentraciones del orden de 0.5 CIM. La CIM de azitromicina para S. aureus cuando el
CMH fue suplementado con 40% de suero bovino fue de 2 µg/mL, pero a 1 µg/mL presentó
inhibición sobre el crecimiento microbiano. En las Figuras 47 y 48 se puede observar
claramente este hallazgo. Este comportamiento fue corroborado con el modelado
matemático.

de azitromicina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, como así también las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25xCIM de azitromicina (0.5 µg/mL), ya que, como se
puede observar en las gráficas, a 0.25 CIM continuó el crecimiento bacteriano, aunque de
manera mucho más lenta en comparación a la curva control sin azitromicina.

letalidad bacteriana, en presencia de azitromicina (0.5xCIM, 1xCIM, 2xCIM, 4xCIM, 8xCIM y
16xCIM) en CMH suplementado con 40 % de suero bovino, fue realizado aplicando un
modelo sigmoideo menos base. En todas las concentraciones ensayadas, tanto las cepas
salvajes como la de referencia presentaron similar cinética de muerte.
196
Azitromicina - S. aureus salvajes (n=6) - Suero
14
12 tiempo (h) vs control

8
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs cim

tiempo (h) vs 2 cim
6
tiempo (h) vs 4 cim
4
tiempo (h) vs 8 cim
2 tiempo (h) vs 16 cim
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
con 40% de suero bovino.
Azitromicina - S. aureus ATCC - Suero
14

8
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs CIM

tiempo (h) vs 2 CIM
tiempo (h) vs 4 CIM
tiempo (h) vs 16 CIM
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Azitromicina en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
197
13 13
A B
12 12
11 11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 x column vs y column 10 tiempo (h) vs 0.25 cim
9 9
8 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL) en CMH suplementado con suero bovino.
13 13
A B
12 12
11 11
Log. ufc/mL
Log,ufc/mL
10 10
9 9
8 tiempo (h) vs control 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
crecimiento frente a 0.25 CIM de azitromicina (0.5 µg/mL) en el mismo medio de cultivo que la curva
control.

198
Tabla 27. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH suplementado con suero bovino
frente a concentraciones inferiores a la CIM (2 µg/mL).
S. aureus aislados a campo – CMH/SUERO S. aureus ATCC 29213 – CMH/SUERO

R 0.9935 0.9915 0.9948 0.9892
c Log ufc/mL 5.17 0.71 6.13 2.14
b h-1 0.20 0.24 0.19 0.16
m h 8.09 4.73 4.10 0.50
a Log ufc/mL 7.55 7.54 6.66 6.67
µ Log ufc/mL*h 0.38 0.06 0.43 0.13
LPD h 35.22 15.48 16.13 -3.09
MPD Log ufc/mL 12.72 8.26 12.80 8.81
Kc h-1 0.3795 0.0508 0.2843 0.0832
T½c h 1.83 13.64 2.44 8.33
199
8
8
A B x column 3 vs y column 3
tiempo (h) vs 0.5 cim tiempo (h) vs cim
7
7
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6
6
5
5
4
4
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
8
8
C 7
D
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6
6
5
5
4
4
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
8 8
E F
7 7
x column 6 vs y column 6 tiempo (h) vs 16 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs 8 CIM

6 6
5 5
4 4
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
aureus salvajes en CMH suplementado con suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de
azitromicina (1 µg/mL), B: 1xCIM de azitromicina (2 µg/mL), C: 2xCIM de azitromicina (4 µg/mL), D:
(32 µg/mL).
200
8 8
A B
x column 2 vs y column 2 7 x column 3 vs y column 3

7
tiempo (h) vs 0.5 CIM tiempo (h) vs CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6 6
5 5
4 4
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8
8
C D
7
7
Log. ufc/mL

Log. ufc/mL
6 tiempo (h) vs 2 CIM tiempo (h) vs 4 CIM

6
5
5
4
4
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
8 8
E F
7 7

Log. ufc/mL
Log. ufc/mL

6 6
5 5
4 4
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
29213 en CMH suplementado con suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de azitromicina (1
µg/mL), B: 1xCIM de azitromicina (2 µg/mL), C: 2xCIM de azitromicina (4 µg/mL), D: 4xCIM de
201
202
Tabla 28. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH suplementado con suero bovino frente a
diferentes concentraciones (0.5, CIM -2 µg/mL-, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de azitromicina
S. aureus aislados a campo – CMH/SUERO S. aureus ATCC – CMH/SUERO
Parámetros Unidad 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM
R 0.9995 0.9999 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.9995 0.9995 0.9996 0.9997 0.9998 1.0000
Nmax UFC/mL 980000 480000 320000 200000 80000 20000 1020000 440000 260000 180000 100000 20000
ϒ 2.49 1.74 1.28 0.99 1.04 1.22 1.59 1.79 1.58 1.36 1.27 0.93
TI50 H 0.52 0.25 0.16 0.10 0.09 0.15 0.44 0.47 0.37 0.27 0.25 0.07
N0 UFC/mL 39200000 60800000 43200000 34800000 37800000 32800000 25800000 22400000 25200000 23600000 21200000 26600000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.1537 -0.2018 -0.2044 -0.2150 -0.2566 -0.3085 -0.1346 -0.1638 -0.1906 -0.2032 -0.2232 -0.2998
T½a h 4.51 3.43 3.39 3.22 2.70 2.25 5.15 4.23 3.64 3.41 3.10 2.31
6
Modelo Sigmoidal. N 0 : concentración del inóculo inicial (10 UFC/mL), N max : población bacteriana final, T I50 : tiempo necesario para que se alcance
el 50% de la inhibición bacteriana máxima, ϒ: coeficiente de sigmoidicidad.
203
5.4.2. DANOFLOXACINA
Las Figuras 53 a 82 presentan las curvas de muerte bacteriana obtenidas para los
aislamientos de S. aureus obtenidos de bovinos portadores de mastitis subclínica (promedio
de seis cepas salvajes), como así también de la cepa de referencia ATCC 29213 frente a
diferentes CIMs de danofloxacina en CMH pH 7.4, 6.5 y 5.0; en leche y suero bovino.
5.4.2.1. Danofloxacina a pH 7.4

comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de danofloxacina a pH 7.4,
aunque la cepa de referencia se mostró ligeramente más sensible a altas concentraciones
del antimicrobiano. La CIM de danofloxacina a pH 7.4 fue 0.5 -1 µg/mL, obsérvese en las
Figuras 53 y 54 que su actividad frente a S. aureus se vio aumentada sustancialmente al
aumentar las concentraciones, demostrando su concentración dependencia. Este

de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, como así también las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.125 CIM, ya que a esa concentración continuó un leve

letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina (0.5xCIM, 1xCIM, 2xCIM, 4xCIM, 8xCIM y
16xCIM) a pH 7.4, fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. En todos los
casos, tanto las cepas salvajes como la de referencia presentaron similar cinética de muerte,
siendo el S. aureus ATCC 29213 más sensible a altas concentraciones que las cepas salvajes.
204
Danofloxacina - S. aureus salvaje - pH 7.4
12
Tiempo (h) vs Salv-pH 7.4-Ctr
10 Tiempo (h) vs 0.25 CIM
Col 12 vs Col 13
Col 14 vs Col 15
Tiempo (h) vs 1 CIM
ufc/mL
6 Col 16 vs Col 17
Tiempo (h) vs 2 CIM
Col 18 vs Col 19
4
Tiempo (h) vs 4 CIM
Col 20 vs Col 21
2 Tiempo (h) vs 8 CIM
Col 22 vs Col 23
Tiempo (h) vs 16 CIM
0 Col 24 vs Col 25
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Danofloxacina - S.aureus ATCC 29213 - pH 7.4
12 Tiempo (h) vs ATCC-pH 7.4 Ctr

Tiempo (h) vs 0.25 CIM
10
Tiempo (h) vs 1 CIM
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 4 CIM
4
Tiempo (h) vs 8 CIM
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Danofloxacina en CMH pH 7.4.
205
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 7.4- control Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 7.4 - 0.25 CIM
12 12
A B
11 11
Log. ufc/mL
10 10
Log. ufc/mL
9 9

Tiempo (h) vs Salv-pH 7.4-Ctr Tiempo (h) vs 0.25 CIM
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 7.4 -control Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 7.4 - 0.25 CIM
12 12
A B
11 11
10 10
Log. ufc/mL
ufc/mL
9 9

Tiempo (h) vs ATCC-pH 7.4 Ctr Tiempo (h) vs 0.25 CIM
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

206
Tabla 29. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus, en CMH pH 7.4 sin danofloxacina y
frente a concentraciones inferiores a la CIM (0.25 µg/mL).
S. aureus aislados a campo – CMH pH 7.4 S. aureus ATCC 29213 – CMH pH 7.4

R 0.9898 0.9978 0.9951 0.9961
c Log ufc/mL 3.99 1.96 4.17 2.17
b h-1 0.21 0.27 0.17 0.16
m H 6.69 5.84 6.55 6.61
a Log ufc/mL 7.37 7.47 7.29 7.35
µ Log ufc/mL*h 0.31 0.19 0.26 0.13
LPD H 27.10 17.93 32.65 35.06
MPD Log ufc/mL 11.36 9.43 11.46 9.52
Kc h-1 0.2434 0.1174 0.2525 0.1492
T½c H 2.85 5.90 2.74 4.64
Crecimiento exponencial. Kc: constante de crecimiento de orden uno. T½c: tiempo medio de crecimiento.
207
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 7.4
8 A 8 B
7 7
6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5

4 4
Tiempo (h) vs 0.5 CIM Tiempo (h) vs 1 CIM
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 8
C D
7 7
6
Log. ufc/mL
6
Log. ufc/mL

Tiempo (h) vs 2 CIM Tiempo (h) vs 4 CIM
5 5
4 4
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8
8 F
E
7
7
x column 6 vs y column 6 Tiempo (h) vs 16 CIM
6
Log. ufc/mL
6
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 8 CIM
5
5
4
4
3
3
0 2 4 6 8 10 12 14
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
aureus salvajes en CMH pH 7.4. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM
de danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (4
µg/mL), E: 8xCIM de danofloxacina (8 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (16 µg/mL).
208
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 7.4
8 8
A B
7 7
6 6
Log. ufcv/mL
Log. ufc/mL
5 5

3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 8
7
C D
7
Log. ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8
8
F
E 7
7
x column 6 vs y column 6 6 Tiempo (h) vs 16 CIM
6
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 8 CIM

Log. ufc/mL
5
5
4
4
3
3
2
2
0 2 4 6 8 10 12 14
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
209
210
Tabla 30. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH pH 7.4 frente a diferentes concentraciones
(0.5, CIM -1 µg/mL-, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
S. aureus aislados a campo – CMH - pH 7.4 S. aureus ATCC – CMH – pH 7.4
Par. Unidad 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM
R 0.9984 0.9988 0.9999 0.9998 0.9991 0.9987 0.9973 0.9988 0.9998 1.0000 0.9998 0.9999
Nmax UFC/mL 2416666 126666 8666 6000 6000 0 2506666 106666 6666 1333 1333 0
ϒ 2.94 2.05 2.40 2.29 1.68 1.16 2.14 2.22 4.12 3.16 1.97 1.82
TI50 H 4.66 1.33 1.21 1.12 0.85 0.43 2.11 1.06 1.09 1.11 0.72 0.56
N0 UFC/mL 28953333 28446666 27940000 26566666 25750000 25533333 29626666 30480000 29360000 27240000 27640000 25440000
-1 -1
a (UFC/mL) h -0.1035 -0.2256 -0.3367 -0.3499 -0.3486 -0.6200 -0.1029 -0.2357 -0.3497 -0.4136 -0.4142 -0.7637
T½a H 6.70 3.07 2.06 1.98 1.99 1.12 6.73 2.94 1.98 1.68 1.67 0.91
6
Modelo Sigmoidal. N 0 : concentración del inóculo inicial (10 UFC/mL), N max : población bacteriana final, T I50 : tiempo necesario para que se alcance el 50% de la
inhibición bacteriana máxima, ϒ: coeficiente de sigmoidicidad.
211
El modelo sigmoidal demuestra que a concentraciones mayores a 0.5XCIM, el TI50 va
descendiendo, conforme aumenta la concentración, lo cual es lógico, ya que al ser un ATB,
concentración dependiente, el tiempo en que tarda en exhibir un efecto bactericida, será
menor a mayores concentraciones. A este pH, el TI50 es de 0.43 a 0.56 h a 16XCIM,
mientras que a 4XCIM es de 1.12-1.11 h. Esto mismo queda corroborado con el análisis por
regresión lineal que arroja una semivida de declinación mucho más corta a mayores
concentraciones.
5.4.2.2. Danofloxacina pH 6.5
Tanto los aislamientos salvajes como la cepa de referencia tuvieron, nuevamente, un

comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de danofloxacina, pero en
este caso a pH 6.5. La CIM en pH 6.5 fue de 0.5-1 µg/mL, en las Figuras 59 y 60 se puede
corroborar su acción dependiente de la concentración, ya que su actividad frente a S. aureus
aumenta notablemente al aumentar las concentraciones. Este comportamiento fue

aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente (Figuras 61 A y 62 A). Las curvas en
ausencia de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, conjuntamente
con las curvas obtenidas al enfrentar los inóculos salvajes a 0.25 y 0.5 CIM, debido a que,
como se observa en las gráficas, frente a esas concentraciones continuó el crecimiento
bacteriano. Sin embargo no ocurrió lo mismo con el S. aureus ATCC de referencia, ya que se
mostró más sensible y a 0.5CIM existió muerte bacteriana (Figura 62 B).

letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina a pH 6.5, fue realizado aplicando un
modelo sigmoideo menos base. A todas las concentraciones tanto las cepas salvajes como la
de referencia presentaron similar cinética de muerte.
212
12
Tiempo (h) vs control
Col 12 vs Col 13
Col 14 vs Col 15
8
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 1 CIM

Col 16 vs Col 17
Tiempo (h) vs 2 CIM
6 Col 18 vs Col 19
Tiempo (h) vs 4 CIM
Col 20 vs Col 21
Col 22 vs Col 23
2 Col 24 vs Col 25
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
12 Tiempo (h) vs CONTROL

Tiempo (h) vs 0.25
10 Col 12 vs Col 13
Col 14 vs Col 15
Log. ufc/mL
Col 16 vs Col 17
Tiempo (h) vs 2 CIM
Col 18 vs Col 19
6
Tiempo (h) vs 4 CIM
Col 20 vs Col 21
Tiempo (h) vs 8 CIM
4 Col 22 vs Col 23
Tiempo (h) vs 16 CIM-ATCC
Col 24 vs Col 25
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
frente a Danofloxacina en CMH pH 6.5.
213
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 6.5 - control Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 0.25 CIM
12 12
A 11
B
11
10 10
Log. ufc/mL
Log.ufc/mL
9 9
8 8

7 7
Tiempo (h) vs control Tiempo (h) vs 0.25 cim
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 0.5 CIM
12
c
11
Tiempo (h) vs 0.5 cim
Log. ufc/mL
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH pH 6.5, C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de
214
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 6.5 - Control Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 6.5 - 0.25 CIM
12 12
A B
11 11
10
Log. ufc/mL
10
Log. ufc/mL
9 9
x column vs y column 8 x column 1 vs y column 1

8
Tiempo (h) vs CONTROL Tiempo (h) vs 0.25
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

215
Tabla 31. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH pH 6.5 sin danofloxacina y frente
a concentraciones inferiores a la CIM.
Parámetros Unidad Control 0.25 CIM 0.5 CIM control 0.25 CIM
R 0.9986 0.9957 0.9763 0.9974 0.9947
c Log ufc/mL 3.90 1.72 0.25 3.92 1.85
b h-1 0.17 0.50 1.16 0.23 0.58
m H 5.53 5.56 1.48 7.56 5.74
a Log ufc/mL 7.13 7.51 7.44 7.42 7.56
µ Log ufc/mL*h 0.24 0.32 0.11 0.33 0.39
LPD H 26.65 9.12 0.41 28.52 8.17
MPD Log ufc/mL 11.03 9.23 7.69 11.34 9.41
Kc h-1 0.2047 0.0984 0.0187 0.2532 0.1016
T½c H 3.39 7.04 37.06 2.74 6.82
crecimiento, LPD: duración de la fase de latencia y MPD: máxima densidad poblacional microbiana bajo condiciones
particulares.
216
A B
8 8
Tiempo (h) vs 1 cim Tiempo (h) vs 2 cim
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 C 8
D x column 6 vs y column 6
x column 5 vs y column 5 Tiempo (h) vs 8 cim
Tiempo (h) vs 4 cim 7
7
6 Log.ufc/mL 6
Log.ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

8
E x column 7 vs y column 7
Tiempo (h) vs 16 cim
7
6
Log. ufc/mL
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aureus salvajes en CMH pH 6.5. A: S. aureus frente a 1xCIM de danofloxacina (1 µg/mL), B: 2xCIM de
danofloxacina (2 µg/mL), C: 4xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), D: 8xCIM de danofloxacina (8 µg/mL)
Y E: 16xCIM de danofloxacina (16 µg/mL).
217
A
8 8 B
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4

3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 C 8
D
7
7
x column 4 vs y column 4 6 Tiempo (h) vs 4 CIM
6
Tiempo (h) vs 2 CIM
ufc/mL
ufc/mL
5
5
4
4
3
3
2
2
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
8 E 8 F
Tiempo (h) vs 8 CIM 7 Tiempo (h) vs 16 CIM-ATCC
7
6
6
Log. ufc/mL
Log.ufc/ml
5
5
4
4
3
3
2
2
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
218
219
(0.5, CIM -1 µg/mL, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
Parámetro Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 0.5 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM
R 0.9909 0.9904 0.9927 0.9869 0.9938 0.9384 0.9979 0.9950 0.9973 0.9895 0.9973
Nmax UFC/mL 386666 12333 15333 4000 500 9133333 73333 5333 2667 2000 500
ϒ 2.21 3.30 1.65 1.12 0.98 33.30 2.77 3.06 0.94 1.12 1.47
TI50 H 3.75 5.20 3.39 2.31 1.50 5.76 2.17 1.51 0.65 1.95 1.48
N0 UFC/mL 30460000 27646666 25973333 28030000 26913333 26660000 28686667 31086666 26793333 22506666 24980000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.1820 -0.3215 -0.3098 -0.3690 -0.4540 -0.1406 -0.2488 -0.3613 -0.3840 -0.3888 -0.4509
T½a h 3.81 2.16 2.24 1.88 1.53 4.93 2.79 1.92 1.80 1.78 1.54
6
220
A este pH, los valores TI50 son mas elevados que los presentados a pH 7.4 y oscilan entre
3.75 y 1.50 h, para valores de 0.5 y 16 CIM.
5.4.2.3. Danofloxacina pH 5
La CIM para danofloxacina a pH 5 fue estuvo entre 1 y 2 µg/mL, en las Figuras 64 y 65

se evidencia nuevamente su acción dependiente de la concentración. Este comportamiento
fue corroborado con el modelado matemático.

ausencia de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las
curvas obtenidas al enfrentar los inóculos salvajes a 0.25, 0.5 y 1 CIM, indicando una pérdida
de su actividad bactericida a pH ácido, lo que se corroborada por el aumento de su CIM,
comportamiento demostrado también con la cepa de referencia.

letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina a pH 5, fue realizado aplicando un
modelo sigmoideo menos base. A todas las concentraciones, tanto las cepas salvajes como la
221
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5
12
10
Col 12 vs Col 13
Col 14 vs Col 15
8
Log.ufc/mL
Tiempo (h) vs 1 cim

Col 18 vs Col 19
Tiempo (h) vs 2 cim
6 Col 20 vs Col 21
Tiempo (h) vs 4 cim
Col 22 vs Col 23
4 Tiempo (h) vs 8 cim
Col 24 vs Col 25
2 Col 26 vs Col 27
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
pH 5.
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5
12
Tiempo (h) vs Control
10
Log.ufc/mL
Tiempo (h) vs 2 CIM
Tiempo (h) vs 4 CIM
Tiempo (h) vs 8 CIM
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
frente a Danofloxacina en CMH pH 5.
222
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - Control Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 0.25 CIM
12 12
A B
11 11
10
Log. ufc/mL
10
Log.ufc/mL
9 9
8 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 0.5 CIM Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 1 CIM
12 12
C D
11 11
Tiempo (h) vs 1 cim
10
Log. ufc/mL
10
Log.ufc/mL
9 9
8 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
223
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - Control Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - 0.25 CIM
12 12
A B
11 11 Tiempo (h) vs 0.25 CIM
10
Log. ufc/mL
10
Log. ufc/mL
9 9
8 x column vs y column 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - 0.5 CIM Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - 1 CIM
12 12
C D
11 Tiempo (h) vs 0.5 CIM 11
Tiempo (h) vs 1 CIM
Col 28 vs Col 29
10
Log. ufc/mL
10
Log. ufc/mL
9 9
8 8
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

224
Tabla 33. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH pH 5 sin danofloxacina y frente a
Parámetros Unidad Control 0.25 CIM 0.5 CIM 1 CIM control 0.25 CIM 0.5 CIM 1 CIM
R 0.9962 0.9918 0.9824 0.8108 0.9961 0.9837 0.9973 0.9478
c Log ufc/mL 3.73 1.48 1.24 0.30 3.77 1.54 11.84 0.51
b h
-1 0.21 0.29 1.00 11.42 0.24 0.20 0.02 24.57
m h 8.48 8.98 11.82 8.79 7.90 6.22 46.47 18.11
a Log ufc/mL 7.78 7.79 7.83 7.69 7.58 7.51 6.75 7.48
µ Log ufc/mL*h 0.29 0.16 0.46 1.26 0.33 0.11 0.09 4.61
LPD h 35.62 27.52 10.83 0.68 28.75 26.10 2273.5 0.70
MPD Log ufc/mL 11.51 9.18 9.07 7.99 11.35 9.05 18.59 7.99
-1
Kc h 0.2721 0.1248 0.1410 0.0488 0.2527 0.1127 0.1658 0.0616
T½c h 2.55 5.55 4.91 14.20 2.74 6.14 4.18 11.25
crecimiento, LPD: duración de la fase de latencia y MPD: máxima densidad poblacional microbiana bajo condiciones
particulares.
225
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 2 CIM Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 4 CIM
8 8
A B
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4
Tiempo (h) vs 2 cim 3
Tiempo (h) vs 4 cim
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 8 CIM Danofloxacina - S. aureus salvajes - pH 5 - 16 CIM
8 C 8 D
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4
3 x column 7 vs y column 7 3
Tiempo (h) vs 8 cim x column 8 vs y column 8
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
aureus salvajes en CMH pH 5. A: S. aureus frente a 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), B: 4xCIM de
µg/mL).
226
Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - 2 CIM Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - 4 CIM
8 8
A B
7 7
6 6
Log.ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4
Tiempo (h) vs 2 CIM x column 6 vs y column 6
3 3 Tiempo (h) vs 4 CIM
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Danofloxacin - S. aureus ATCC - pH 5 - 8 CIM Danofloxacina - S. aureus ATCC - pH 5 - 16 CIM
8 C 8 D
7 7
6 6 Tiempo (h) vs 16 CIM
Tiempo (h) vs 8 CIM
Log. ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
29213 en CMH pH 6.5. A: S. aureus frente a 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), B: 4xCIM de
µg/mL).

227
Tabla 34. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH pH 5 frente a diferentes concentraciones
(2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
S. aureus aislados a campo CMH pH 5.0 S. aureus ATCC CMH pH 5.0
Parámetro Unidad 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM
R 0.9967 0.9765 0.9836 0.9827 0.994 0.9986 0.9896 0.9955
Nmax UFC/mL 135333 11666 2333 500 408000 18000 1000 500
ϒ 16.92 4.03 3.57 2.63 2.20 2.87 2.18 3.05
TI50 h 6.50 5.72 5.27 4.80 3.46 2.86 2.14 2.53
N0 UFC/mL 48133333 48766667 47333333 38300000 33400000 28600000 31400000 28400000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.2448 -0.3475 -0.4133 -0.4687 -0.1836 -0.3072 -0.4315 -0.4562
T½a h 2.83 1.99 1.68 1.48 3.77 2.26 1.61 1.52
6
Modelo Sigmoidal. N 0 : concentración del inóculo inicial (10 UFC/mL), N max : población bacteriana final, T I50 : tiempo necesario para que se alcance el 50% de la inhibición
bacteriana máxima, ϒ: coeficiente de sigmoidicidad.
Modelo regresión lineal. a: pendiente de la regresión. T½a: tiempo medio de declinación.
228
A este pH, TI50 fue mas prolongado que en las condiciones de pH anteriores, esto
puede ser explicado, teniendo en cuenta que dano, es menos eficaz a este pH e incluso su
CIM, aumenta una vez con respecto a los demás pHs evaluados. En todo caso los valores
TI50 descienden a medida que aumenta la concentración.
5.4.2.4. Efecto de la leche sobre la actividad de Danofloxacina
Danofloxacina en leche, cuyo pH se encuentra entre 6.5-6.8, presentó cierta actividad

frente al S. aureus a 0.5 CIM. Considerando que la CIM en leche fue de 1 µg/mL (similar
obviamente a la CIM obtenida en CMH pH 6.5), a 0.5 µg/mL presentó cierta inhibición sobre
el crecimiento microbiano, diferenciándose en este caso con lo ocurrido en el CMH. En las
Figuras 71 y 72 se puede observar claramente este hallazgo. Este comportamiento fue

de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25xCIM de danofloxacina (0.25 µg/mL).

letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina en Tanto los aislamientos salvajes como
la cepa de referencia tuvieron un comportamiento similar frente a las diferentes
concentraciones de danofloxacina a pH 7.4, aunque la cepa de referencia se mostró
ligeramente más sensible a altas concentraciones del antimicrobiano. La CIM de
danofloxacina a pH 7.4 fue 0.5 -1 µg/mL, obsérvese en las Figuras 53 y 54 que su actividad
frente a S. aureus se vio aumentada sustancialmente al aumentar las concentraciones,
demostrando su concentración dependencia. Este comportamiento fue corroborado con el
modelado matemático.

de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, como así también las curvas
229
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.125 CIM, ya que a esa concentración continuó un leve

letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina (0.5xCIM, 1xCIM, 2xCIM, 4xCIM, 8xCIM y
siendo el S. aureus ATCC 29213 más sensible a altas concentraciones que las cepas salvajes.
El modelo sigmoidal demuestra que a concentraciones mayores a 0.5XCIM, el TI50 va
descendiendo, conforme aumenta la concentración, lo cual es lógico, ya que al ser un ATB,
concentración dependiente, el tiempo en que tarda en exhibir un efecto bactericida, será
menor a mayores concentraciones. A este pH, el TI50 es de 0.43 a 0.56 h a 16XCIM,
mientras que a 4XCIM es de 1.12-1.11 h. Esto mismo queda corroborado con el análisis por
regresión lineal que arroja una semivida de declinación mucho más corta a mayores
concentraciones.

comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de danofloxacina, pero en
este caso a pH 6.5. La CIM en pH 6.5 fue de 0.5-1 µg/mL, en las Figuras 59 y 60 se puede
corroborar su acción dependiente de la concentración, ya que su actividad frente a S. aureus
aumenta notablemente al aumentar las concentraciones. Este comportamiento fue

ausencia de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, conjuntamente
con las curvas obtenidas al enfrentar los inóculos salvajes a 0.25 y 0.5 CIM, debido a que,
como se observa en las gráficas, frente a esas concentraciones continuó el crecimiento
bacteriano. Sin embargo no ocurrió lo mismo con el S. aureus ATCC de referencia, ya que se
mostró más sensible y a 0.5CIM existió muerte bacteriana (Figura 62 B).
230
letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina a pH 6.5, fue realizado aplicando un
modelo sigmoideo menos base. A todas las concentraciones tanto las cepas salvajes como la
La CIM para danofloxacina a pH 5 fue estuvo entre 1 y 2 µg/mL, en las Figuras 64 y 65

se evidencia nuevamente su acción dependiente de la concentración. Este comportamiento
fue corroborado con el modelado matemático.

ausencia de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las
curvas obtenidas al enfrentar los inóculos salvajes a 0.25, 0.5 y 1 CIM, indicando una pérdida
de su actividad bactericida a pH ácido, lo que se corroborada por el aumento de su CIM,
comportamiento demostrado también con la cepa de referencia.

letalidad bacteriana, en presencia de danofloxacina a pH 5, fue realizado aplicando un
modelo sigmoideo menos base. A todas las concentraciones, tanto las cepas salvajes como la
Danofloxacina en leche, cuyo pH se encuentra entre 6.5-6.8, presentó cierta actividad

frente al S. aureus a 0.5 CIM. Considerando que la CIM en leche fue de 1 µg/mL (similar
obviamente a la CIM obtenida en CMH pH 6.5), a 0.5 µg/mL presentó cierta inhibición sobre
el crecimiento microbiano, diferenciándose en este caso con lo ocurrido en el CMH. En las
Figuras 71 y 72 se puede observar claramente este hallazgo. Este comportamiento leche
bovina, fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. En todas las
concentraciones ensayadas, tanto las cepas salvajes como la de referencia presentaron
similar cinética de muerte.
231
Dano - S. aureus salvajes - Leche
14
Tpo (h) vs Control

12
Tpo (h) vs 0.25 CIM
Tpo (h) vs 0.5 CIM
8 Tpo (h) vs CIM
Log. ufc/mL
Tpo (h) vs 2 CIM
Tpo (h) vs 4 CIM
4 Tpo (h) vs 8 CIM
Tpo (h) vs 16 CIM
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Danofloxacina en leche.
Dano- S. aureus ATCC-Leche
14
TPO (h) vs dano-Ctr
12 TPO (h) vs dano-0.25 CIM
TPO (h) vs dano-0.5 CIM
TPO (h) vs dano-1 CIM
8 TPO (h) vs dano-2 CIM
Log. ufc/mL
4 TPO (h) vs dano-16 CIM
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
frente a Danofloxacina en leche.
232
Danofloxacina -S. aureus salvaje - Leche - control Danofloxacina - S. aureus - salvaje - Leche 0.25 CIM
14 14
A B
13
12 12
Tpo (h) vs 0.25 CIM
Log. ufc/mL
11
Log. ufc/mL
10 10
9 x column vs y column
Tpo (h) vs Control
8 8
7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
crecimiento control (sin danofloxacina) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
danofloxacina (0.25 µg/mL) en leche.
S. aureus ATCC en leche - DANO-0.25 CIM

Curva control S. aureus ATCC en leche
14
14
A B
TPO (h) vs dano-L-0.25 CIM
12
12
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
11
10
10
x column vs y column 8
8
TPO (h) vs dano-L-Ctr
7
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
(sin danofloxacina) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de danofloxacina (0.25
µg/mL) en leche.

233
Tabla 35. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en leche sin danofloxacina y frente a
S. aureus aislados a campo – Leche S. aureus ATCC 29213 – Leche

Parámetros Unidad control 0.25 CIM control 0.25 CIM
R 0.9956 0.9864 0.9940 0.9983
c Log ufc/mL 5.99 1.49 5.78 1.40
b h-1 0.20 0.23 0.21 0.22
m h 4.39 3.26 4.64 5.89
a Log ufc/mL 6.79 7.24 6.95 7.30
µ Log ufc/mL*h 0.44 0.13 0.45 0.11
LPD h 16.95 9.83 17.33 22.23
MPD Log ufc/mL 12.78 8.73 12.73 8.70
Kc h-1 0.2843 0.0771 0.2838 0.0958
T½c h 2.44 8.99 2.44 7.23
Modelado de Gompertz. R: Coeficiente de correlación, c: Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo se
incrementa indefinidamente, b: velocidad de crecimiento relativa al tiempo m, m: tiempo requerido para
alcanzar la máxima velocidad de crecimiento, a: Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece
indefinidamente, µ: velocidad específica de crecimiento, LPD: duración de la fase de latencia y MPD: máxima
densidad poblacional microbiana bajo condiciones particulares.
Crecimiento exponencial. Kc: constante de crecimiento de orden uno. T½c:tiempo medio de crecimiento.
234
S. aureus salvajes - Leche
8 8
A 7
B
7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 Tpo (h) vs CIM
2 Tpo (h) vs 0.5 CIM
1 1
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 8
7 C 7 D
x column 4 vs y column 4 Tpo (h) vs 4 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 Tpo (h) vs 2 CIM 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 8
7 7
E F
6 6
log. ufc/mL
log. ufc/mL
5 Tpo (h) vs 8 CIM 5 Tpo (h) vs 16 CIM
4 4
3 3
2 2
1 1
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
aureus salvajes en leche. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de
235
Dano - S.aureus ATCC - leche -
8 A 8
B
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4

3
TPO (h) vs dano-L-0.5 CIM TPO (h) vs dano-L-1 CIM
2 2
1 1
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8
8
C D
7
7
6
6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
TPO (h) vs dano-L-2 CIM TPO (h) vs dano-L-4 CIM
4
4
3
3
2
2
1
1
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
8
8
E F
7
7
6
TPO (h) vs dano-L-16 CIM
Log. ufc/mL
5 TPO (h) vs dano-L-8 CIM

Log. ufc/mL
4
4
3
3
2
2
1
1
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
en leche. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de danofloxacina (1
µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), E: 8xCIM de
danofloxacina (4 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (8 µg/mL).
236
En leche, se mantuvo la misma tendencia que a pH 6.5, los valores TI50 fueron
reduciéndose a medida que aumentaba la concentración.
237
Tabla 36. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en leche frente a diferentes concentraciones (0.5,
1, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
S. aureus aislados a campo – CMH - Leche S. aureus ATCC – CMH – Leche

R 0.9990 0.9994 0.9993 0.9998 0.9999 1.0000 0.9703 0.9994 0.99990 1.0000 0.9999 1.0000
Nmax UFC/mL 1600000 700000 1100 700 200 100 9800000 2000000 1600 800 200 100
ϒ 8.89 5.81 2.55 3.78 2.65 3.29 3.06 7.22 4.46 3.84 4.26 4.78
TI50 h 3.04 2.25 1.46 1.22 1.22 1.24 2.49 1.48 1.17 1.18 1.69 1.41
N0 UFC/mL 23200000 22600000 23500000 22400000 20800000 21300000 22400000 20600000 23200000 20400000 19600000 20000000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.1114 -0.1448 -0.4155 -0.4323 -0.4814 -0.5113 -0.0344 -0.0972 -0.3993 -0.4228 -0.4790 -0.5087
T½a h 6.22 4.79 1.67 1.60 1.44 1.36 20.15 7.13 1.74 1.64 1.45 1.36
6
238
5.4.2.5. Efecto del suero sobre la actividad de Danofloxacina
Danofloxacina en suero, cuyo pH es 7.4, comenzó a ejercer actividad frente al S.

aureus a concentraciones del orden de 0.5 CIM, al igual que en leche. La CIM de
danofloxacina para S. aureus cuando el CMH fue suplementado con 40% de suero bovino fue
de 1 µg/mL, pero a 0.5 µg/mL presentó inhibición del crecimiento microbiano. En las Figuras
77 y 78 se puede observar claramente este hallazgo. Este comportamiento fue corroborado
con el modelado matemático.

de danofloxacina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25xCIM (0.25 µg/mL), debido a que continuó el
crecimiento bacteriano, aunque de manera mucho más lenta en comparación a la curva
control.

aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente. El modelado de las mismas, en
presencia de diferentes concentraciones de danofloxacina en CMH suplementado con 40 %
de suero bovino, fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. En todas las
239
Danofloxacina - S. aureus salvajes - Suero
14 Tiempo (h) vs S.aureus-salv-control

12
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 1 CIM

Tiempo (h) vs 2 CIM
6
Tiempo (h) vs 4 CIM
0 5 10 15 20 25 30 x column 7 vs y column 7
Tiempo (h)
Danofloxacina frente a S. aureus ATCC - Suero

14 Tiempo (h) vs Dano-Suero-ATCC-control
Tiempo (h) vs 1 CIM
Log. ufc/mL
8
Tiempo (h) vs 2 CIM
Tiempo (h)
ATCC 29213 frente a Danofloxacina en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
240
Danofloxacina - S. aureus salvajes - Suero -control Danofloxacina - S. aureus salvajes - suero - 0.25 CIM
14 14
13 Tiempo (h) vs S.aureus-salv-control
12 12
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
11
9
8 8
7
0 10 20 30 0 5 10 15 20 25 30
crecimiento control (sin danofloxacina) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a
0.25 CIM de danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH-40% suero bovino.
Danofloxacina - S. aureus ATCC - Suero - control Danofloxacina - S. aureus ATCC - Suero - 0.25 CIM
13 13
11 11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 10
9 9
8 Tiempo (h) vs Dano-Suero-ATCC-control 8

7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Figura 80. Modelado de Gompertz realizado a S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento control
(sin danofloxacina) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de
danofloxacina (0.25 µg/mL) en CMH-40% suero bovino.

241
Tabla 37. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH suplementado con 40% de suero
bovino sin danofloxacina y frente a concentraciones inferiores a la CIM.
S. aureus aislados a campo – 40% Suero S. aureus ATCC 29213 – 40% Suero
R 0.9962 0.9918 0.9961 0.9837
c Log ufc/mL 3.73 1.48 3.77 1.54
b h-1 0.21 0.29 0.24 0.20
m h 8.48 8.98 7.90 6.22
a Log ufc/mL 7.78 7.79 7.58 7.51
µ Log ufc/mL*h 0.29 0.16 0.33 0.12
LPD h 35.90 27.91 28.62 25.72
MPD Log ufc/mL 11.51 9.27 11.35 9.06
Kc h-1 0.4446 0.0278 0.4235 0.0454
T½c h 1.56 24.93 1.64 15.26
242
Danofloxacina - S. aureus salvajes - suero
8
A 8
B
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4
3 Tiempo (h) vs 0.5 CIM 3 Tiempo (h) vs 1 CIM
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 8
C D
7 7

Log. ufc/mL

Log. ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8
E
8 F
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4

2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 12 14
aureus salvajes en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de
danofloxacina (0.5 µg/mL), B: 1xCIM de danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (4
µg/mL), D: 4xCIM de danofloxacina (2 µg/mL), E: 8xCIM de danofloxacina (4 µg/mL) y F: 16xCIM de
danofloxacina (8 µg/mL).
243
Danofloxacina - S. aureus ATCC - Suero
8
8
A B
7
7
6
6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5
5
4
4
3 Tiempo (h) vs 0.5 CIM Tiempo (h) vs 1 CIM
3
2
2
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
8 8
C D
7 7
6 6
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
5 5
4 4

3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8
E 8
7 F
7
6
Log. ufc/mL

Log. ufc/mL
5
5
4
4
3
3
2
0 5 10 15 20 25 30 2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 0.5xCIM de danofloxacina (0.5
µg/mL), B: 1xCIM de danofloxacina (1 µg/mL), C: 2xCIM de danofloxacina (4 µg/mL), D: 4xCIM de
danofloxacina (2 µg/mL), E: 8xCIM de danofloxacina (4 µg/mL) y F: 16xCIM de danofloxacina (8
µg/mL).
244
Cuando el medio de cultivo es suplementado con suero, encontramos que no hay una
gran variación del TI50, el que se encuentra entre 1.74 a 3.44 h, lo cual contrasta con lo
encontrado en AMH a pH 7.4, donde si hubo variaciones en función de la concentración.
245
Tabla 38. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino
frente a diferentes concentraciones (0.5, CIM, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de danofloxacina
S. aureus aislados a campo – CMH – 40% Suero S. aureus ATCC – CMH – 40% Suero
R 0.9762 0.9983 0.9957 0.9989 0.9997 0.9929 0.9999 0.9998 0.9986 0.9992 0.9963 0.9864
Nmax UFC/mL 3600000 2400000 12000 6000 2000 0 800000 200000 12000 8000 2000 0
ϒ 2.03 2.07 3.11 3.19 3.06 2.28 30.28 4.75 6.29 2.29 2.76 3.25
TI50 h 3.44 1.74 1.98 2.57 2.15 1.96 1.91 1.53 1.72 1.50 2.23 1.72
N0 UFC/mL 31200000 42600000 33400000 27200000 29500000 27600000 27400000 31600000 26800000 25200000 23600000 20400000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.0899 -0.1199 -0.3305 -0.3509 -0.4000 -0.6604 -0.1473 -0.2110 -0.3214 -0.3357 -0.3907 -0.7115
T½a h 7.71 5.78 2.10 1.97 1.73 1.05 4.70 3.28 2.16 2.06 1.77 0.97
6
Modelo regresión lineal. a: pendiente de la regresión, T½a: tiempo medio de declinación
246
5.4.3. PENICILINA G
Las Figuras 83 a 112 presentan las curvas de muerte bacteriana obtenidas para los
aislamientos de Staphylococcus aureus obtenidos de bovinos portadores de mastitis
subclínica (promedio de seis cepas salvajes), como así también de la cepa de referencia ATCC
29213 frente a diferentes CIMs de pencilina G (PenG) en CMH pH 7.4, 6.5 y 5.0; en leche y en
5.4.3.1. Penicilina G a pH 7.4

comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de pencilina G (PenG) a pH
7.4, aunque la cepa de referencia se mostró ligeramente más sensible que los aislamientos
obtenidos a campo. La CIM de penicilina G a pH 7.4 fue 0.25 µg/mL, obsérvese en las Figuras
83 y 84 que su actividad frente a S. aureus no se vio aumentada al aumentar las
concentraciones de Pen G, demostrando su dependencia del tiempo de contacto. Este
comportamiento fue luego corroborado con el modelado matemático.

de penicilina fueron analizadas por el modelo de Gompertz, como así también las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25 CIM (0.066 µg/mL) y a 0.5 CIM (0.125 µg/mL), ya
que a esas concentraciones continuó un leve crecimiento bacteriano.

letalidad bacteriana, en presencia de pencilina (1xCIM, 2xCIM, 4xCIM, 8xCIM, 16xCIM y
siendo el S. aureus ATCC 29213 más sensible frente a la penicilina G.
247
Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4
14
Tiempo (h) vs 2 CIM
12 Tiempo (h)) vs CONTROL
Tiempo (h)) vs 0.25 CIM
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 4 CIM
6 Col 27 vs Col 28
Tiempo (h) vs 8 CIM
Col 31 vs Col 32
4
Col 33 vs Col 34
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Penicilina G en CMH pH 7.4.
Penicilina G - S. aureus ATCC 29213 - pH 7.4
14
12 Tiempo (h) vs 0.25 cim
Tiempo (h) vs cim
Log. ufc/mL
Tiempo (h) vs 2 cim
8
Tiempo (h) vs 4 cim
6
Tiempo (h) vs 8 cim
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Figura 84. Curvas de muerte bacteriana para Staphylococcus aureus ATCC 29213 frente a Penicilina G
en CMH pH 7.4.
248
Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 - Control Penicilina G - S.aureus salvajes - pH 7.4 - 0.25 CIM
13
12
12 A B
11
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 10
8 8
7 Tiempo (h) vs CONTROL
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 - 0.5 CIM
C
Log. ufc/mL
10
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
PenG (0.066 µg/mL); C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL).
249
Penicilina G - S. aureus ATCC 29213 - pH 7.4 -Control Penicilina G - S.aureus ATCC 29213 - pH 7.4 - 0.25 CIM
13 B
A
12 12
11 tpo (h) vs 0.25 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
10 10
8 8
7
tpo (h) vs control
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Penicilina G - S. aureus ATCC 29213 - pH 7.4 - 0.5 CIM
c
12
tpo (h) vs 0.5 CIM
Log. ufc/mL
10
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
PenG (0.066 µg/mL); C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL) en el mismo
medio de cultivo que la curva control.

250
Tabla 39. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH pH 7.4 sin penicilina G y frente a
concentraciones inferiores a la CIM (0.25 µg/mL).
Parámetros Unidad control 0.25 CIM* 0.5 CIM* control 0.25 CIM 0.5 CIM
R 0.9982 0.9895 0.8478 0.9984 0.9768 0.9026
c Log ufc/mL 7.02 6.34 0.72 5.20 1.61 0.39
b h-1 0.10 0.61 7.06 0.13 0.24 1.43
m h 3.79 175.32 3.62 7.06 5.39 7.50
a Log ufc/mL 5.96 7.55 7.49 7.42 7.79 7.80
µ Log ufc/mL*h 0.25 1.42 1.87 0.25 0.14 0.21
LPD h 29.25 285.77 0.37 46.62 18.29 4.55
MPD Log ufc/mL 12.98 13.89 8.21 11.62 9.40 8.19
Kc h-1 0.3138 0.0902 0.0401 0.3089 0.0826 0.0423
T½c h 2.21 7.68 17.28 2.24 8.39 16.38
*0.25 y 0.5 CIM aislados a campo: no se pudieron modelar por Gompertz, se aplicó un análisis sigmoidal.
251
Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 - 1CIM Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 - 2CIM
8 8
A B
7 7
Tiempo (h) vs 2 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6
5 5
Tiempo (h) vs 1 CIM
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4-4 CIM Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 - 8 CIM
8 8
C D
7
Log. ufc/mL
6
Log. ufc/mL
5 5
4 4
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 - 16 CIM Penicilina G - S. aureus salvajes - pH 7.4 -32 CIM
8 8
E F
Log. ufc/mL
6 6
Log.ufc/mL
5 5
4 4
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
(0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL), E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL)
y F: 32xCIM de PenG (8 µg/mL).
252
PenG - S. aureus ATCC -pH 7.4 - 1 CIM PenG - S. aureus ATCC - pH 7.4 - 2 CIM
8 8
A B
7 7
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6
5 5
tpo (h) vs CIM x column 12 vs y column 12
tpo (h) vs 2 CIM
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S. aureus ATCC - pH 7.4 - 4CIM PenG - S. aureus ATCC - pH 7.4 - 8 CIM
8
C 8 D
7 x column 13 vs y column 13 tpo (h) vs 8 CIM
7
tpo (h) vs 4 CIM
Log. ufc/mL
6
6
Log.ufc/mL
5
5
4
4
3
3
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
PenG - S. aureus ATCC - pH 7.4 - 16 CIM PenG - S. aureus ATCC - pH 7.4 - 32 CIM
8 8
E F
7 7
tpo (h) vs 16 CIM tpo (h) vs 32 CIM
6 6
Log. ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL), E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL) y F:
32xCIM de PenG (8 µg/mL).
253
En la Tabla 40 se puede observar que el TI50 se mantiene relativamente constante
aunque la concentración del ATB aumente, oscilando en valores entre 4.31 a 1.76 min, si
bien los tiempos son mayores que en Dano, se mantiene la tendencia a la reducción.
254
(CIM -0.25 µg/mL-, 2, 4, 8, 16 y 32 veces la CIM) de pencilina G
Parámetros Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 32 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 32 CIM
R 0.9510 0.9960 0.9961 0.9841 0.9918 0.9645 0.9597 0.9958 0.9926 0.9989 0.9967 0.9787
Nmax UFC/mL 600000 3000 5333 4333 4000 4000 666666 21333 2666 8666 1333 667
ϒ 8.26 11.39 10.40 6.97 9.21 1.37 7.55 9.86 4.28 3.49 2.47 1.15
TI50 H 4.49 4.49 4.47 4.21 4.26 2.75 4.32 4.20 3.60 3.02 2.73 1.77
N0 UFC/mL 35800000 32200000 27266666 34566667 26700000 26633333 47333333 51866667 46666666 44800000 37600000 41733333
-1 -1
a (UFC/mL) h -0.1704 -0.3868 -0.3559 -0.3744 -0.3670 -0.3669 -0.1776 -0.3249 -0.4072 -0.3563 -0.4270 -0.4603
T½a H 4.07 1.79 1.95 1.85 1.89 1.89 3.90 2.15 1.70 1.94 1.62 1.51
6
255
5.4.3.2. PENICILINA G pH 6.5

comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de PenG, pero en este caso
a pH 6.5. La CIM en pH 6.5 también fue de 0.25 µg/mL, en las Figuras 89 y 90 se puede
corroborar su acción dependiente del tiempo. Sin embargo a pH 6.5 pareciera que la PenG
presenta mayor acción bactericida, pues a 2, 4, 8 y 16 veces su CIM presenta una acción
bactericida fuerte, aunque no muy diferente entre las mayores concentraciones. Este

ausencia de PenG fueron analizadas por el modelo de Gompertz, conjuntamente con las
curvas obtenidas al enfrentar los inóculos salvajes a 0.25 y 0.5 CIM, debido a que frente a
esas concentraciones no se evidenció una gran inhibición del crecimiento bacteriano.

letalidad bacteriana, en presencia de PenG a pH 6.5, fue realizado aplicando un modelo
sigmoideo menos base. A todas las concentraciones tanto las cepas salvajes como la de
referencia presentaron similar cinética de muerte.
256
PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5
12
10 tiempo (h) vs 0.25 cim
8
tiempo (h) vs 1 cim
Log.ufc/mL
6
tiempo (h) vs 2 cim
tiempo (h) vs 8 cim
tiempo (h) vs 16 cim
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a PenG en CMH pH 6.5.
PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5
12
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs 1 cim

tiempo (h) vs 2 cim
tiempo (h) vs 4 cim
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
frente a PenG en CMH pH 6.5.
257
PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5 -control PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 0.25 CIM
12 A 12 B
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
9 9
8 8

7 7
tiempo (h) vs control tiempo (h) vs 0.25 CIM
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30
PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 0.5 CIM

12 C
11
Log. ufc/mL
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
(0.066 µg/mL) en CMH pH 6.5, C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL) en
CMH pH 6.5.
258
PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5 - control PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5 - 0.25 CIM
12 12
A B
11 11
10 10
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
9 9
8 8

7 7
tiempo (h) vs control tiempo (h) vs 0.25 CIM
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5 - 0.5 CIM

12
C
11
10
Log. ufc/mL
6
0 10 20 30
Tiempo (h)
Figur
a 92. Modelado de Gompertz realizado a Staphylococcus aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento
control (sin PenG) en CMH pH 6.5, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG (0.066 µg/mL)
y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL) en el mismo medio de cultivo que
la curva control.

259
Tabla 41. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH pH 6.5 sin PenG y frente a
Parámetros Unidad control 0.25 CIM* 0.5 CIM control 0.25 CIM 0.5 CIM*
R 0.9989 0.8515 0.9978 0.9922
c Log ufc/mL 3.50 0.43 4.24 5.84
b h-1 0.25 1.88 0.17 0.09
m h 5.06 1.24 3.93 -6.34
a Log ufc/mL 7.63 7.68 7.05 4.38
µ Log ufc/mL*h 0.32 0.30 0.26 0.19
LPD h 16.13 0.13 17.67 -83.79
MPD Log ufc/mL 11.13 8.11 11.29 10.22
Kc h-1 0.1520 0.1362 0.0387 0.1759 0.1418 0.0419
T½c h 4.56 5.09 17.91 3.94 4.89 16.54
*0.25CIM (a campo) y 0.5CIM (ATCC): no se pudieron modelar por Gompertz
260
PenG - S. aureus salvajes -pH 6.5 -1 CIM
PenG - s. aureus salvajes - pH 6.5 -2 CIM
10
A x column 4 vs y column 4
10 B
tiempo (h) vs 1 CIM x column 5 vs y column 5
tiempo (h) vs 2 CIM
8 8
Log.ufc/mL
Log. ufc/mL
6 6
4 4
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 4 CIM PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 8 CIM
10 10
C D
8 8
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
4 4
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S. aureus salvajes - pH 6.5 - 16 CIM

10
E x column 8 vs y column 8
Log. ufc/mL
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
(0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y E: 16xCIM de PenG (4
µg/mL).
261
PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5 - 1 CIM
PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5 - 2 CIM
10
10
A B
tiempo (h) vs 2 CIM
8
8
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6
6
tiempo (h) vs 1 CIM 4
2
2
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
PenG - S. aureus ATCC - pH 6.5 - 4 CIM PenG - s. aureus ATCC - pH 6.5 - 8 CIM
10 C 10
D
8 tiempo (h) vs 4 CIM 8 tiempo (h) vs 8 CIM
Log. ufc/mL
Log. ufc/mL
6 6
4 4
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

PenG - S.aureus ATCC - pH 6.5 - 16 CIM
10
E
8
Log. ufc/mL
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL).
262
un modelo sigmoideo menos base. A pH 6.5 el TI50 se encontró por arriba de las 3 h, no
variando mucho con el aumento de las concentraciones de penG.
263
(CIM -0.25 µg/mL-, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de penicilina G.
Parámetros Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM
R 0.9532 0.9807 0.9972 0.9851 0.9905 0.9434 0.9774 0.9881 0.9753 0.9726
Nmax UFC/mL 400000 2000 4500 1000 500 600000 1000 4000 2000 1000
ϒ 11.31 26.38 6.45 2.49 2.49 9.89 28.17 8.53 2.09 2.62
TI50 h 3.92 3.81 3.83 3.39 2.56 3.78 3.79 3.98 3.30 3.61
N0 UFC/mL 41900000 44550000 42600000 37100000 40100000 49600000 36000000 33200000 41600000 37200000
-1 -1
a (UFC/mL) h -0.1939 -0.4172 -0.3815 -0.4385 -0.4706 -0.1840 -0.4372 -0.3761 -0.4144 -0.4386
T½a h 3.77 1.66 1.82 1.58 1.47 3.77 1.59 1.84 1.67 1.58
6
264
5.4.3.3. PENICILINA G pH 5
La CIM para PenG a pH 5 fue 0.125 µg/mL, en las Figuras 94 y 95 se evidencia

nuevamente su acción dependiente del tiempo de contacto, pero además a este pH
aumentó notablemente su actividad frente al Staphylococcus aureus, ya que la CIM fue
varias veces inferior a lo observado a los pH 7.4 y 6.5. Nótese que a partir de 0.5 CIM la PenG
presenta actividad frente al S. aureus, tornándose más evidente a mayores concentraciones,
para a partir de 4 veces la CIM no mostrar mayor eficacia. Este comportamiento fue

aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente. Las curvas en ausencia de PenG
fueron analizadas por el modelo de Gompertz.
letalidad bacteriana, en presencia de PenG a pH 5, fue realizado aplicando un modelo
sigmoideo menos base. A todas las concentraciones, tanto las cepas salvajes como la de
referencia presentaron similar cinética de muerte.
265
PenG - s. aureus salvajes - pH 5
14
tiempo (h) vs 1 CIM
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs 4 CIM
6
tiempo (h) vs 8 CIM
4
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a PenicilinaG en CMH pH 5.
PenG - S. aureus ATCC 29213 - pH 5
12

10 x column vs y column
Log. ufc/mL
tiempo (h) vs cim
6
tiempo (h) vs 2 cim
tiempo (h) vs 4 cim
tiempo (h) vs 8 cim
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
frente a Penicilina G en CMH pH 5.
266
PenG - S. aureus salvaje - pH 5 - control
12
11
10
Log. ufc/mL
9
8
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Figura 99. Modelado de Gompertz realizado a los aislamientos salvajes de S. aureus: curva de
crecimiento control (sin PenG) en CMH pH 5
PenG - S. aureus ATCC 29213 - pH 5 - Control
12
11
10
Log.ufc/mL
8
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Figura 100. Modelado de Gompertz realizado a Staphylococcus aureus ATCC 29213: curva de
crecimiento control (sin PenG) en CMH pH 5.

267
Tabla 43. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH pH 5 sin Penicilina G.
S. aureus salvajes – CMH pH 5 S. aureus ATCC 29213 – CMH pH 5

Parámetros Unidad control control
R 0,9936 0,9936
c Log ufc/mL 4.73 4.71
b h-1 0.20 0.18
m h 4.87 3.14
a Log ufc/mL 6.98 6.60
µ Log ufc/mL*h 0.35 0.31
LPD h 19.35 11.89
MPD Log ufc/mL 11.71 11.31
Kc h-1 0.2518 0.2076
T½c h 2.75 3.38
Crecimiento exponencial. Kc: constante de crecimiento de orden uno
268
PenG - S. aureus salvajes - pH 5 - 0.25CIM PenG - S. aureus salvajes - pH 5 - 0.5CIM
8 8
7 7
B
6 6
A
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
tiempo (h) vs 0.25 CIM tiempo (h) vs 0.5 CIM
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S. aureus salvajes - pH 5 - 1CIM PenG - S. aureus salvajes - pH 5 - 2CIM

8 8
tiempo (h) vs 2 CIM
tiempo (h) vs 1 CIM
6 6
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
4 4
3 C 3 D
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

PenG - S.aureus salvajes - pH 5 - 4CIM PenG - S.aureus salvajes - pH5 -8 CIM
8 8
7 7
6 6
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
E F
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG- S.aureus salvajes - pH 5- 16CIM

8
7
6
Log.ufc/mL
5 G
4
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
S. aureus salvajes en CMH pH 5. A: 0.25xCIM; B: 0.5XCIM; C: 1XCIM (0.125 µg/mL); D: 2xCIM; E:
269
PenG - S. aureus ATCC - pH 5 - 0.25CIM PenG - S. aureus ATCC - pH - 0.5CIM
8 8
7 7
B
6 A 6
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
4 4
tiempo (h) vs 0.25 CIM tiempo (h) vs 0.5 CIM
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S. aureus ATCC - pH 5 - CIM PenG - S.aureus ATCC - pH 5 - 2CIM

8 8
7 7
C D
6 6
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
4 4
tiempo (h) vs CIM
3 3 tiempo (h) vs 2 CIM
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus ATCC - pH 5 - 4CIM PenG - S.aureus ATCC - pH 5 - 8CIM
8 8
7 7
6 6 tiempo (h) vs 8 CIM
E
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
5 5
F
4 4
tiempo (h) vs 4 CIM
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
8 PenG - S.aureus ATCC - pH 5 -16CIM
6
Log.ufc/mL
3 G
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
S. aureus ATCC 29213 en CMH pH 5. A: 0.25xCIM; B: 0.5XCIM; C: 1XCIM (0.125 µg/mL); D: 2xCIM; E:
270
un modelo sigmoideo menos base. A este pH, los valores TI50 se mantienen estables a partir
de la CIM.
271
Tabla 44. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH pH 5 frente a diferentes concentraciones
(0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 16 veces la CIM) de Penicilina G
S. aureus aislados a campo – CMH - pH 5 S. aureus ATCC – CMH – pH 5

Parámet. Unidad 0.25CIM 0.5CIM 1CIM 2CIM 4CIM 8CIM 16CIM 0.25CIM 0.5CIM 1CIM 2CIM 4CIM 8CIM 16CIM
R 0.9159 0.9960 0.9982 0.9953 0.9934 0.9997 0.9999 0.7979 0.9975 0.9953 0.9998 0.9990 0,9991 0.9963
Nmax UFC/mL 12000000 400000 100000 11000 2000 1000 2000 20400000 400000 200000 32000 8000 2000 2000
ϒ 2.74 3.35 4.34 2.55 3.71 5.83 4.15 1.57 3.28 3.90 4.13 5.24 4.52 5.22
TI50 h 4.80 3.56 2.73 2.53 3.60 3.57 2.54 5.01 2.89 2.53 2.62 2.53 2.26 2.73
N0 UFC/mL 26000000 27000000 29200000 28000000 25400000 24400000 25200000 26400000 31200000 28400000 33200000 30800000 26400000 29600000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.0322 -0.1755 -0.2366 -0.3268 -0.3938 -0.4210 -0.3935 -0.0107 -0.1816 -0.2065 -0.2894 -0.3441 -0.3954 -0.4002
T½a h 21.52 3.95 2.93 2.12 1.76 1.65 1.76 64.77 3.82 3.36 2.39 2.01 1.75 1.73
6
272
5.4.3.4. Efecto de la leche sobre la actividad de Pencilina G
Penicilina G en leche, cuyo pH se encuentra entre 6.5-6.8, presentó cierta actividad

frente al S. aureus a 0.5 CIM enlenteciendo su crecimiento. A partir de la CIM en leche (0.25
µg/mL) comenzó a ejercer inhibición sobre el crecimiento microbiano. En las Figuras 103 y
104 se puede observar claramente lo mencionado, comportamiento fue corroborado con el
modelado matemático.
aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente (105 A y 106 A). Puede verse que el
crecimiento del S. aureus en leche se ve alterado. Las curvas en ausencia de PenG fueron
analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las curvas obtenidas al enfrentar los
inóculos a 0.25xCIM y 0.5xCIM de PenG (0.125 µg/mL).
letalidad bacteriana, en presencia de PenG en leche bovina, fue realizado aplicando un
modelo sigmoideo menos base. En todas las concentraciones ensayadas, tanto las cepas
salvajes como la de referencia presentaron similar cinética de muerte.
273
PenG - S.aureus salvajes - Leche
14
Tiempo (h) vs CONTROL
Tiempo (h) vs 1 CIM
Log.ufc/mL
Col 18 vs Col 19
Col 20 vs Col 21
Tiempo (h) vs 4 CIM
6
Col 22 vs Col 23
Tiempo (h) vs 8 CIM
Col 24 vs Col 25
4
Col 26 vs Col 27
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Staphylococcus aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a Pencilina
G en leche.
PenG - S.aureus ATCC - Leche
14
Tiempo (h) vs 1 CIM
Log.ufc/mL
Tiempo (h) vs 4 CIM
Tiempo (h) vs 8 CIM
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
frente a Penicilina G en leche.
274
PenG - S.aureus salvajes - Leche - Control PenG - S. aureus salvajes - Leche - 0.25CIM
14
14
A B
13
12 12
11
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
10 10
8 8
Tiempo (h) vs CONTROL Tiempo (h) vs 0.25 CIM
7
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus salvajes - Leche - 0.5CIM

14
C
12
Log.ufc/mL
10
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
crecimiento control (sin PenG) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG (0.066
µg/mL) en leche y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL).
275
PenG - S.aureus ATCC - Leche -Control PenG - S.aureus ATCC - Leche -0.25CIM
14 14
A B
12 12 Tiempo (h) vs 0.25 CIM
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
10 10
8 8
6 6
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus ATCC - Leche - 0.5CIM

14
C
12
Log.ufc/mL
10
6
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Figura 104. Modelado de Gompertz realizado al S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento
control (sin PenG) en leche, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG (0.066 µg/mL) en
leche y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de PenG (0.125 µg/mL).

276
Tabla 45. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en leche sin PenG y frente a
S. aureus aislados a campo – Leche S. aureus ATCC 29213 – Leche

Parámetros Unidad control 0.25 CIM 0.5 CIM Control* 0.25 CIM 0.5 CIM
R 0.9468 0.9962 0.9622 0.9779 0.9955 0.9695
c Log ufc/mL 3.65 2.33 0.48 2.84 1.10
b h-1 2.06 0.27 3.25 0.26 2.26
m h 12.07 0.51 1.66 -1.48 6.28
a Log ufc/mL 8.30 6.82 7.63 6.25 7.95
µ Log ufc/mL*h 2.76 0.23 0.58 0.26 0.91
LPD h 5.39 0.05 1.98 -0.14 5.22
MPD Log ufc/mL 11.99 1.29 4.65 -3.40 18.39
Kc h-1 0.4739 0.0654 0.0268 0.4961 0.0617 0.0670
T½c h 1.46 10.59 25.86 1.40 11.23 10.34
incrementa indefinidamente, b: velocidad de crecimiento relativa al tiempo m, m: tiempo requerido para alcanzar la
máxima velocidad de crecimiento, a: Log de los recuentos asintóticos cuando el tiempo decrece indefinidamente, µ:
velocidad específica de crecimiento, LPD: duración de la fase de latencia y MPD: máxima densidad poblacional
microbiana bajo condiciones particulares.
*S.aureus ATCC en leche sin penicilina (control) no pudo ser modelado por Gompertz
277
PenG - S. aureus salvajes - Leche - 1CIM PenG - S.aureus salvajes - Leche - 2CIM
9 9
A B
8 x column 4 vs y column 4 8 Tiempo (h) vs 2 CIM
Tiempo (h) vs 1 CIM
7 7
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
5 5
4 4
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus salvajes - Leche - 4CIM PenG - S.aureus salvajes - Leche -8CIM
9 9
C D
7 Tiempo (h) vs 4 CIM 7
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
5 5
4 4
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus salvajes - Leche -16CIM
9
E
8
7
Log.ufc/mL
3
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
S. aureus salvajes en leche. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5
µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y, E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL).
278
PenG - S.aureus ATCC - Leche - 1CIM PenG - S.aureus ATCC - Leche - 2CIM
9
A 9 B
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
5 5
4 4
3 3
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus ATCC - Leche - 4CIM PenG - S.aureus ATCC - Leche - 8CIM
9
C 8 D
8
Tiempo (h) vs 8 CIM
7
x column 11 vs y column 11 6
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
Tiempo (h) vs 4 CIM

6
5
5
4
4
3
3
2
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
PenG - S.aureus ATCC - Leche - 16CIM
8
E
7
6
Log.ufc/mL
2
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
29213 en leche. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5 µg/mL), C:
4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL) y, E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL).
279
un modelo sigmoideo menos base. En este caso TI50 osciló alrededor de las 4 h, excepto a
16 CIM, donde se necesitó un menor tiempo para inhibir el 50% del inóculo bacteriano
(entre 2.6-2.8 h).
280
Tabla 46. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en leche frente a diferentes concentraciones (1, 2,
4, 8 y 16 veces la CIM) de Penicilina G.
S. aureus aislados a campo – CMH - Leche S. aureus ATCC – CMH – Leche

Parámetros Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM
R 0.8774 0.9567 0.9857 0.9943 0.9841 0.9862 0.9666 0.9979 0.9832 0.9849
Nmax Log UFC/mL 400000 20000 8000 4000 8000 200000 4000 4000 2000 0
ϒ 18.27 32.54 14.35 3.59 2.25 -11.02 21.20 8.43 9.43 2.23
TI50 h 3.74 3.76 4.22 3.48 2.82 4.29 3.74 4.02 4.47 2.57
N0 Log UFC/mL 46400000 42800000 34000000 37200000 33600000 40400000 45200000 43200000 32800000 37600000
-1 -1
a (UFC/mL) h -0.1981 -0.3196 -0.3482 -0.3808 -0.3477 -0.2212 -0.3889 -0.3870 -0.4044 -0.5049
T½a h 3.50 2.17 1.99 1.82 1.99 3.13 1.78 1.79 1.71 1.37
6
Modelo regresión lineal. a: pendiente de la regresión, T½a: tiempo medio de declinación
281
5.4.3.5. Efecto del suero sobre la actividad de Penicilina G
La CIM de PenG para S. aureus cuando el CMH fue suplementado con 40% de suero
bovino fue igual que la CIM obtenida en CMH a pH 7.4 (0.5 µg/mL). En las Figuras 107 y 108
se presentan las curvas de crecimiento y de letalidad bacteriana para las cepas aisladas a
campo y para la cepa de referencia, respectivamente.
aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente (109 A y 110 A). Las curvas en
ausencia de PenG fueron analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.25xCIM y 0.5xCIM, debido a que continuó el
crecimiento bacteriano, aunque de manera mucho más lenta en comparación a la curva
control.
aislamientos salvajes y de referencia, respectivamente. El modelado de las mismas, en
presencia de diferentes concentraciones de PenG en CMH suplementado con 40 % de suero
bovino, fue realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. En todas las
282
PenG - S.aureus salvajes -40% Suero
14
12
10
Tiempo (h) vs CIM
Log.ufc/mL
Tiempo (h) vs 2 CIM
Tiempo (h) vs 8 CIM
Tiempo (h)
Staphylococcus aureus (n=6) aisladas de bovinos portadores de mastitis subclìnica frente a PenG en
PenG - S. aureus ATCC - 40% Suero
14
Tiempo (h) vs 1 CIM
Log.ufc/mL
Tiempo (h) vs 4 CIM
Tiempo (h) vs 8 CIM
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
ATCC 29213 frente a PenG en CMH suplementado con 40% de suero bovino.
283
PenG - S-aureus salvajes - 40% Suero - Control PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero - 0.25CIM
12 12
A B
11 11
10 10
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
9 9

Tiempo (h) vs Control Tiempo (h) vs 0.25 CIM
7 7
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero - 0.5CIM
12
C
11
10
Log.ufc/mL
9
7
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
crecimiento control (sin PenG) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM
de PenG (0.066 µg/mL) en CMH-40% suero bovino y C: curva de crecimiento frente a 0.5 CIM de
PenG (0.125 µg/mL) en CMH-40% suero bovino.
284
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - Control
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - Control
14
A 14
B
13
12
Log.ufc/mL 12
11
Log.ufc/mL
10
10
9
8
x column vs y column 8
Tiempo (h) vs Control x column 2 vs y column 2
6
6
0 5 10 15 20 25 30
0 10 20 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - 0.5CIM
14
C
12
Log.ufc/mL

10
6
0 10 20 30
Tiempo (h)
Figura 110. Modelado de Gompertz realizado a S. aureus ATCC 29213, A: curva de crecimiento
control (sin PenG) en CMH-40% suero bovino, B: curva de crecimiento frente a 0.25 CIM de PenG
(0.066 µg/mL) en CMH-40% suero bovino y C: curva de crecimiento frente a 0. 5 CIM de PenG (0.125
µg/mL) en CMH-40% suero bovino.

285
Tabla 47. Aplicación del modelo de Gompertz y de crecimiento exponencial al desarrollo de Staphylococcus aureus en CMH suplementado con 40% de suero
bovino sin PenG y frente a concentraciones inferiores a la CIM.
S. aureus aislados a campo – Suero S. aureus ATCC 29213 – Suero

Parámetros Unidad control 0.25 CIM 0.5 CIM* control 0.25 CIM* 0.5 CIM*
R 0.9892 0.9955 0.9931
c Log ufc/mL 4.23 4.56 4.39
b h-1 0.16 0.13 0.20
m h 7.47 7.89 8.85
a Log ufc/mL 7.60 7.24 7.94
µ Log ufc/mL*h 0.25 0.22 0.32
LPD h 40.44 53.00 39.25
MPD Log ufc/mL 11.83 11.80 12.33
Kc h-1 0.2387 0.3027 0.0467 0.2902 0.4837 0.0358
T½c h 2.90 2.29 14.84 2.39 1.43 19.36
*no se pudieron modelar por Gompertz, solo se analizó el crecimiento exponencial.
286
PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero - CIM PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero - 2CIM
A B
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6
4 4
Tiempo (h) vs CIM
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus salvajes -40% Suero - 4CIM PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero - 8CIM
9 9
C D
8 8
7 7
Log.ufc/mL
6
Log.ufc/mL
6
5 5
4 4
3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero - 16CIM PenG - S.aureus salvajes - 40% Suero -32CIM
9
E F x column 8 vs y column 8
8 8
7
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
4 4
Tiempo (h) vs 16 CIM 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
S. aureus salvajes en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 1xCIM de
PenG (0.25 µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2
µg/mL), E: 16xCIM de PenG (4 µg/mL) y F: 16xCIM de PenG (8 µg/mL).
287
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - CIM PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - CIM
9 A 9 B
8 Tiempo (h) vs 1 CIM 8 Tiempo (h) vs 2 CIM
7 7
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - 4CIM
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - 8CIM
9
C 9
D
8
7
7
Log.ufc/mL
6
Log.ufc/mL
6
5
5
4
4
3
3
2
2
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - 16CIM PenG - S.aureus ATCC - 40% Suero - 32 CIM
9 9
E F x column 10 vs y column 10
8 8
Log.ufc/mL
Log.ufc/mL
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
29213 en CMH suplementado con 40% de suero bovino. A: S. aureus frente a 1xCIM de PenG (0.25
µg/mL), B: 2xCIM de PenG (0.5 µg/mL), C: 4xCIM de PenG (1 µg/mL), D: 8xCIM de PenG (2 µg/mL), E:
16xCIM de PenG (4 µg/mL) y F: 16xCIM de PenG (8 µg/mL).
288
un modelo sigmoideo menos base. Se mantien relativamente constante el TI50 frente a las
diferentes concentraciones de penG, esto podría ser explicado ya que al ser un ATB acción
bactericida tiempo dependiente, la variable que determina la eficacia del producto no es la
concentración, sino, el tiempo de contacto.
En las Tablas 49 a 51 se presentan resumidamente los efectos del pH, de la leche y

del suero sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus.
289
Tabla 48. Aplicación del modelo Sigmoidal para evaluar la cinética de muerte del Staphylococcus aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino
frente a diferentes concentraciones (1, 2, 4, 8, 16 y 32 veces la CIM) de Penicilina G.
S. aureus aislados a campo – CMH – Suero S. aureus ATCC – CMH – Suero

Parámetros Unidad 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 32 CIM 1 CIM 2 CIM 4 CIM 8 CIM 16 CIM 32 CIM
R 0.9406 0.9394 0.9395 0.9893 0.9744 0.9648 0.9399 0.9709 0.9605 0.9855 0.9613 0.9404
Nmax Log UFC/mL 82000 22000 6000 4000 8000 2000 110000 20000 6000 8000 4000 2000
ϒ 4.16 6.19 5.70 4.28 3.64 1.27 12.12 9.95 11.04 8.17 6.81 5.61
TI50 H 4.60 3.90 4.10 4.25 3.75 3.08 3.63 3.61 3.69 3.59 4.05 5.07
N0 Log UFC/mL 27200000 33600000 25200000 30800000 23600000 22400000 44000000 52800000 44800000 43200000 34400000 40000000
-1 -1
A (UFC/mL) h -0.2419 -0.3055 -0.3477 -0.3729 -0.3329 -0.3886 -0.2497 -0.3283 -0.3717 -0.3582 -0.3775 -0.4187
T½a H 2.86 2.27 1.99 1.86 2.08 1.78 2.78 2.11 1.86 1.93 1.84 1.86
6
Modelo Sigmoidal. N 0 : concentración del inóculo inicial (10 UFC/mL), N max : población bacteriana final, T I50 : tiempo
necesario para que se alcance el 50% de la inhibición bacteriana máxima, ϒ: coeficiente de sigmoidicidad.
290
de azitromicina
Caldo-pH CIM µg/mL µ LPD MPD Kc T½c

CMH-7.4 0 0 0.28 19.89 11.84 0.2514 2.27
0.125 0.25 0.31 27.82 11.37 0.2173 3.19
0.25 0.5 0.27 -132.57 8.61 0.0529 13.1
0.5 1 46.32 -409.65 8.24 0.0354 19.58
CMH-6.5 0 0 0.32 30.46 12.27 0.2520 2.75
0.25 2 0.26 9.24 10.42 0.1415 4.9
0.5 4 0.22 8.13 9.34 0.0755 9.18
1 8 -17.46 -0.09 7.71 nc nc
CMH-5 0 0 0.40 21.7 12.31 0.1919 3.61
0.25 16 0.38 11.15 10.37 0.1461 4.74
0.5 32 0.33 14.14 10.33 0.1286 5.39
LECHE 0 0 0.30 29.37 11.71 0.2675 2.59
0.125 1 0.06 18.43 7.95 0.0441 15.71
CMH-40%Suero 0 0 0.38 35.22 12.72 0.3795 1.83
0.25 0.5 0.06 15.48 8.26 0.0508 13.64
de danofloxacina

CMH-7.4 0 0 0.31 27.10 11.36 0.2434 2.85
0.25 0.25 0.19 17.93 9.43 0.1174 5.90
CMH-6.5 0 0 0.24 26.65 11.03 0.2047 3.39
0.25 0.25 0.32 9.12 9.23 0.0984 7.04
0.5 0.5 0.11 7.69 7.69 0.0187 37.06
CMH-5 0 0 0.29 35.62 11.51 0.2721 2.55
0.25 0.5 0.16 27.52 9.18 0.1248 5.55
0.5 1 0.46 10.83 0.07 0.1410 4.91
1 2 1.26 0.68 7.99 0.0488 14.20
LECHE 0 0 0.44 16.95 12.78 0.2843 2.44
0.25 0.25 0.13 9.83 8.73 0.0771 8.99
CMH-40%Suero 0 0 0.29 35.90 11.51 0.4446 1.56
0.25 0.25 0.16 27.91 9.27 0.0278 24.93
291
de penG

CMH-7.4 0 0 0.25 29.25 12.98 0.3138 2.21
0.25 0.0625 1.42 285.77 13.89 0.0902 7.68
0.5 0.125 1.87 0.37 8.21 0.0401 17.28
CMH-6.5 0 0 0.32 16.13 11.13 0.1520 4.56
0.25 0.0625 --- --- --- 0.1362 5.09
0.5 0.125 0.30 0.13 8.11 0.0387 17.91
CMH-5 0 0 0.35 19.35 11.71 0.2518 2.75
LECHE 0 0 2.76 5.39 11.99 0.4739 1.46
0.25 0.0625 0.23 0.05 1.29 0.0654 10.59
0.5 0.125 0.58 1.98 4.65 0.0268 25.86
CMH-40%Suero 0 0 0.25 40.44 11.83 0.2387 2.90
0.25 0.0625 0.22 53.00 11.80 0.3027 2.27
0.5 0.125 --- --- --- 0.0467 14.84
5.5. ÍNDICE DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
El índice de actividad antibacteriana (E), se cuantificó como la diferencia entre los

valores Log 10 del número de bacterias viables (UFC/mL) al inicio (n t-0 ) y al final del ensayo
(n t-24 ) según la siguiente ecuación:
E = n t-24 - n t-0 Ec. 10
Para evaluar E, aplicamos tres puntos de corte teóricos: a) Efecto bacteriostático: E =

0; no hay cambios en valor de n t-0 : b) Efecto bactericida: E = -3; hay reducción de ≥ 3 log 10 de
n t-0 por eliminación del 99.9% de las bacterias iniciales y c): Efecto de erradicación virtual de
bacterias: E = -4; hay reducción de ≥ 4 Log 10 (eliminación del 99.99%) respecto del Log de n t-
0.
Basándonos en estos puntos de corte establecidos para eficacia antibacteriana,

podemos decir que la actividad de las diferentes concentraciones de un antibiótico puede
ser valorada considerando dos bandas en las cuales se situaría el recuento de bacterias al
292
final del ensayo. La primer banda se corresponde con la reducción del número de bacterias
entre -3 log 10 (99.9%) y -4 log 10 (99.99%) respecto del log 10 de n t-0 (efecto bactericida) y que
podría ser compatible con la cura clínica. La segunda banda se corresponde con la
erradicación virtual de bacterias logrando una reducción ≥ -4 log 10 (>99.99%) del log 10 de nt-
0, pudiendo esta banda ser compatible con la cura bacteriológica.
5.5.1. AZITROMICINA
Las Tablas 52 a 56 presentan el índice de la actividad antibacteriana (E) obtenido para

azitromicina (8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 xCIM) en las diferentes condiciones de cultivo
ensayadas (pH 7.4, pH 6.5, pH 5, leche y suero). Mientras que en las Figuras 113 a 117, se
grafican las relaciones entre las concentraciones logarítmicas de azitromicina y la diferencia
entre los valores del log 10 del conteo de bacterias viables (ufc/mL) de S. aureus salvajes y
ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en CMH pH 7.4, 6.5, 5,
en leche y en suero. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos
mencionados anteriormente.
En CMH-pH 7.4 solamente se obtuvo un efecto bacteriostático (E=0), es decir

prácticamente no hubo cambios en el valor de n t-0 , o bien que tras 24 h de contacto con
concentraciones entre la CIM (2 µg/mL) y 8 veces la CIM (16 µg/mL) no pasó de efecto
bacteriostático a bactericida (Figura 113).
supra-CIM) frente a S.aureus en CMH-pH 7.4
AZT- CMH - pH 7.4 S.aureus Salv. S.aureus ATCC
µg/mL Log Cc ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
8xCIM 16 1.204 -1.38 -1.38
4xCIM 8 0.903 -1.44 -1.47
2xCIM 4 0.602 -1.44 -1.41
CIM 2 0.301 -1.37 -1.37
0.5xCIM 1 0.000 0.52 0.60
0.25xCIM 0.5 -0.301 0.78 0.95
0.125xCIM 0.25 -0.602 3.60 2.57
Control 0 3.94 3.82
293
4 AZT- pH 7.4
3 S. aureus salvajes
S.aureus ATCC
∆ log ufc 24-0 h

2
-1
-2
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Log. Concentración
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en CMH-pH
7.4. La línea punteada representa el punto de corte teórico de la eficacia de AZT: efecto
bacteriostático.
En CMH-pH 6.5 (Tabla 53) ocurre exactamente lo mismo pero a una concentración 4
veces mayor, ya que la CIM de azitromicina a pH 6.5 fue 8 µg/mL. Solamente se obtuvo
efecto bacteriostático (E=0), y tras 24 h de contacto con concentraciones en entre la CIM (8
µg/mL) y 8 veces la CIM (64 µg/mL) tampoco pasó a tener un efecto bactericida (Figura 113).
Queda claramente demostrado que la azitromicina a medida que el pH se acidifica pierde
potencia, necesitando concentraciones mayores para lograr el mismo efecto que a pH 7.4
(ambientes extracelulares). Aunque a este pH, a mayores concentraciones de azitromicina se
comienza a evidenciar pequeños aumentos en su actividad.
AZT - CMH - pH 6.5 S.aureus Salv. S.aureus ATCC
8xCIM 64 1.806 -1.24 -1.06
4xCIM 32 1.505 -1.09 -1.07
2xCIM 16 1.204 -0.89 -0.87
CIM 8 0.903 -0.72 -0.78
0.5xCIM 4 0.602 1.79 3.24
0.25xCIM 2 0.301 2.83 3.11
Control 0 4.47 4.46
294
4 AZT - pH 6.5
3 S.aureus salvajes
S.aureus ATCC
2
∆ log ufc 24-0 h

1
-1
-2
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Log. Concentración
6.5. La línea punteada representa el punto de corte teórico de la eficacia de AZT: efecto
bacteriostático.
En CMH-pH 5 (Tabla 54) azitromicina logra efecto bactericida (E ≥ -3 log 10 ), pero a

concentraciones muy altas, en el orden de 4 veces la CIM, que a este pH es 8 veces superior
(64 µg/mL) a su CIM a pH 6.5. Frente a concentraciones equivalentes a la CIM y 2xCIM
solamente se obtuvo efecto bacteriostático (E=0) (Figura 114). Como mencionamos para el
caso del CMH-pH 6.5, la azitromicina a medida que el pH desciende va perdiendo potencia,
por lo que requiere de concentraciones mayores para lograr el mismo efecto. Sin embargo a
este pH se vio un efecto bactericida compatible con la cura clínica, a pesar de ser un
antimicrobiano que por su mecanismo de acción (inhibición de la síntesis proteica a nivel
bacteriano) se destaca por presentar efecto de tipo bacteriostático.
supra-CIM) frente a S.aureus en CMH-pH 5
AZT – CMH - pH 5.0 S.aureus salv. S.aureus ATCC
4xCIM 250 2.398 -3.22 -3.03
2xCIM 125 2.097 -2.26 -2.01
CIM 64 1.806 -0.37 -0.38
0.5xCIM 32 1.505 2.98 2.95
0.25xCIM 16 1.204 3.02 3.29
Control 0 4.66 4.79
295
AZT - pH 5.0
4
3
S.aureus salvajes
2
S.aureus ATCC
∆ log ufc 24-0 h

1
0
-1
-2
-3
-4
0,0 1,0 2,0 3,0
Log. Concentración
5. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de AZT: efecto
bacteriostático (E=0) y efecto bactericida (E≥ -3 log 10 ).
Cuando empleamos como caldo de cultivo leche bovina, para emular lo acontecido
en la glándula mamaria (Tabla 55), azitromicina se comporta de manera similar a lo
observado en CMH-pH 6.5, es decir logra solo efecto bacteriostático. La CIM en este medio
de cultivo fue 8 µg/mL, igual a la CIM obtenida en CMH-pH 6.5 (Figura 115). Como
mencionamos para el caso del CMH-pH 6.5, la azitromicina a medida que el pH desciende va
perdiendo potencia, por lo que requiere de concentraciones mayores para lograr el mismo
efecto.
supra-CIM) frente a S.aureus en leche bovina empleada como caldo de cultivo
AZT - Leche S. aureus salv. S.aureus ATCC
Cc µg/mL Log Cc ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
8xCIM 64 1.806 -1.74 -2.06
4xCIM 32 1.505 -1.58 -1.37
2xCIM 16 1.204 -0.76 -0.89
CIM 8 0.903 -0.64 -0.79
0.5xCIM 4 0.602 -0.40 -0.50
0.25xCIM 2 0.301 -0.45 -0.53
0.125xCIM 1 0.000 0.55 0.65
Control 0 4.12 4.31
296
AZT- leche
1
S.aureus salvajes
S.aureus ATCC
0
∆ log ufc 24-0 h

-1
-2
-3
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Log. Concentración
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en leche
bovina. La línea punteada representa el punto de corte teórico de la eficacia de AZT: efecto
bacteriostático.
En CMH suplementado con 40% de suero bovino (Tabla 56), azitromicina se comporta
de manera similar a lo observado en CMH-pH 7.4, es decir logra solo efecto bacteriostático.
La CIM en este medio de cultivo fue 8 µg/mL, igual a la CIM obtenida en CMH-pH 6.5
(Figura 115). Sin embargo a 16 veces la CIM se observa efecto bactericida, con valores de E ≥
-3 (-3.21).
supra-CIM) frente a S.aureus en CMH suplementado con 40% de suero bovino
AZT - suero S.aureus salv. S.aureus ATCC
16xCIM 32 1.505 -3.21 -3.12
8xCIM 16 1.204 -2.67 -2.33
4xCIM 8 0.903 -2.24 -2.12
2xCIM 4 0.602 -2.13 -1.99
CIM 2 0.301 -2.10 -1.71
0.5xCIM 1 0.000 -1.60 -1.40
0.25xCIM 0.5 -0.301 0.66 1.33
Control 0 4.93 5.39
297
1 AZT - suero
∆ log ufc 24-0 h

S.aureus salvajes
-1 S.aureus ATCC
-2
-3
-4
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Log. Concentración
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en CMH
suplementado con 40% de suero bovino. Las líneas punteadas representan los puntos de corte
teóricos de la eficacia de AZT: efecto bacteriostático (E= 0) y efecto bactericida (E= ≥ -3 log 10 ).
En las Tablas 57 a 61 se presentan los índices de la actividad antibacteriana (E)

obtenidos para danofloxacina (8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 xCIM) en las diferentes
condiciones de cultivo ensayadas (pH 7.4, pH 6.5, pH 5, leche y suero). Mientras que en las
Figuras 118 a 122, se grafican las relaciones entre las concentraciones logarítmicas de
danofloxacina y la diferencia entre los valores del log 10 del conteo de bacterias viables
(ufc/mL) de S. aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte
construidas en CMH pH 7.4, 6.5, 5, en leche y en suero. Las líneas punteadas representan los
puntos de corte teóricos mencionados anteriormente.
Danofloxacina es un antimicrobiano acción bactericida concentración dependiente,

por esa razón ya en CMH-pH 7.4 se obtuvo efecto bactericida (E≥ -3 log 10 ) a partir de las
concentraciones correspondientes a 2xCIM (Tabla 57 y Figura 118). Las cepas aisladas a
campo mostraron mayor sensibilidad que la cepa de referencia ATCC 25923, pues a
concentraciones superiores presentaron efecto de erradicación virtual de bacterias (E ≥ -4
Log 10 ) con eliminación del 99.99% respecto del Log de n t-0 .
298
S.aureus Salv. S.aureus ATCC
CMH - pH 7.4 ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc DANO pH 7.4 DANO pH 7.4
16xCIM 16 1.204
8xCIM 8 0.903 -4.32 -3.63
4xCIM 4 0.602 -4.31 -3.65
2XCIM 2 0.301 -3.64 -3.51
1xCIM 1 0.000 -2.46 -2.35
0.5xCIM 0.5 -0.301 -1.07 -1.08
0.25xCIM 0.25 -0.602 1.93 1.98
Control 0 0.000 3.84 3.85
Dano pH 7.4 S.aureus salvaj

3 S.aureus ATCC
2
1
∆ log ufc 24-0h
0
-1
-2
-3
-4
-5
-4,0 -2,0 0,0 2,0
Log Concent
7.4. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de danofloxacina.
En CMH-pH 6.5 (Tabla 58) también a partir de 2xCIM (2 µg/mL) se visualiza el efecto
bactericida (E ≥ -3 log 10 ), pero a partir de 4xCIM se da el efecto de erradicación virtual (E ≥ -4
log 10 ) (Figura 119), siendo bien categórico a partir de 8xCIM. Es importante remarcar que a
concentraciones inferiores a 2xCIM muestra claramente un efecto bacteriostático, situación
que puede ejercer presión de selección sobre las subpoblaciones son susceptibilidad a
danofloxacina disminuída.
299
CMH - pH 6.5 ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc DANO pH 6.5 DANO pH 6.5
16xCIM 16 1.204 -4.70 -4.71
8xCIM 8 0.903 -4.05 -4.59
4xCIM 4 0.602 -4.00 -4.00
2XCIM 2 0.301 -3.77 -3.51
1xCIM 1 0.000 -2.59 -2.35
0.5xCIM 0.5 -0.301 -1.47 -1.08
0.25xCIM 0.25 -0.602 2.03 1.98
Control 0 0.000 3.88 3.42
S.aureus salvajes
Dano pH 6.5 S.aureus ATCC
3
2
1
0
∆ log ufc 24-0h
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-4,0 -2,0 0,0 2,0
Log Concent
6.5. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de danofloxacina.
En CMH-pH 5 (Tabla 59) danofloxacina pierde potencia, su CIM sube a 2 µg/mL

presentando efecto bacteriostático (E= 0), recién a partir de 4xCIM se da el efecto
bactericida (E ≥ -3 log 10 ) compatible con cura clínica (Figura 120), y a 8xCIM presenta efecto
de erradicación virtual que es compatible con cura bacteriológica. A este pH concentraciones
inferiores a 4xCIM arrojan un efecto bacteriostático.
300
supra-CIM) frente a S.aureus en CMH-pH 5
CMH - pH 5 ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc DANO pH 5 DANO pH 5
16xCIM 32 1.505 -4.88 -4.75
8xCIM 16 1.204 -4.31 -4.5
4xCIM 8 0.903 -3.62 -3.2
2XCIM 4 0.602 -2.55 -1.84
1xCIM 2 0.301 0.43 0.49
0.5xCIM 1 0.000 1.37 1.55
0.25xCIM 0.5 -0.301 1.55 1.47
Control 0 0.000 3.66 3.76
S.aureus salvajes
Dano pH 5
S.aureus ATCC
2
1
0
∆ log ufc 24-0h
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-4,0 -2,0 0,0 2,0
Log Concent
5. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de danofloxacina.
El comportamiento de danofloxacina en leche, presentado en la Tabla 60, muestra

efecto bacteriotático a concentraciones de 1xCIM, pero, a partir de 2xCIM (2 µg/mL) se
visualiza un cambio drástico, presentándose un efecto de erradicación virtual (E ≥ -4 log 10 ),
el cual como se ha comentado, es compatible con el concepto de cura bacteriológica, siendo
un poco más marcado en la cepa ATCC que en las cepas de campo.
301
supra-CIM) frente a S.aureus en leche.
S.aureus ATCC S.aureus salvajes
CMH – LECHE ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc DANO LECHE DANO LECHE
16xCIM 16 1.204 -5.3 -5.33
8xCIM 8 0.903 -4.99 -5.02
4xCIM 4 0.602 -4.41 -4.51
2XCIM 2 0.301 -4.16 -4.33
1xCIM 1 0.000 -1.01 -1.51
0.5xCIM 0.5 -0.301 -0.36 -1.16
0.25xCIM 0.25 -0.602 1.35 1.29
Control 0 0.000
2 Dano leche S.aureus ATCC

1 S.aureus salvajes
0
∆ log ufc 24-0 h
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Log. Concent
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en leche. Las
líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de danofloxacina.
En CMH suplementado con 40% de suero bovino (Tabla 61) danofloxacina presenta
efecto bacteriostático a la concentración de 1 xCIM, luego a 2 y 4 veces la CIM demuestra
efecto bactericida compatible con cura clínica (E ≥ -3 log 10 ). El efecto de erradicación virtual,
compatible con cura bacteriológica se a concentraciones de 8xCIM.
302
supra-CIM) frente a S.aureus en suero bovino.
CMH – SUERO ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc DANO SUERO DANO SUERO
16xCIM 16 1.204
8xCIM 8 0.903 -4.07 -4.17
4xCIM 4 0.602 -3.50 -3.66
2XCIM 2 0.301 -3.35 -3.44
1xCIM 1 0.000 -2.20 -1.25
0.5xCIM 0.5 -0.301 -1.53 -0.94
0.25xCIM 0.25 -0.602 0.51 0.33
Control 0 0.000
1 Dano suero S.aureus ATCC

S.aureus salvajes
0
∆ log ufc 24-0 h
-1
-2
-3
-4
-5
-1,0 0,0 1,0 2,0
Log. Concent
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en suero
bovino. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de
danofloxacina.
5.5.3. PENICILINA G
En las Tablas 62 a 66 se presentan los índices de la actividad antibacteriana (E)

obtenidos para penG (16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 xCIM) en las diferentes condiciones de
cultivo ensayadas (pH 7.4, pH 6.5, pH 5, leche y suero). Mientras que en las Figuras 123 a
127, se grafican las relaciones entre las concentraciones logarítmicas de penG y la diferencia
entre los valores del log 10 del conteo de bacterias viables (ufc/mL) de S. aureus salvajes y
ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en CMH pH 7.4, 6.5, 5,
303
en leche y en suero. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos
mencionados anteriormente.
PenicilinaG, antimicrobiano acción bactericida tiempo dependiente, en CMH-pH 7.4,

tal como se observa en la Tabla 62, a la concentración equivalente a 1xCIM presenta efecto
bacteriostático (E= 0). El efecto bactericida se visualiza a 2xCIM y el efecto de erradicación
virtual compatible con cura bacteriológica a 4xCIM (E≥ -4 log 10 ). Podemos observar que a la
concentración de 8xCIM se presenta un efecto paradójico, descripto con antelación, donde
el efecto vuelve a ser bactericida, para luego a 16 veces la CIM recobrar el efecto de cura
bacteriológica.

supra-CIM) frente a S.aureus en CMH pH 7.4
CMH - pH 7.4 ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc PenG pH 7.4 PenG pH 7.4
32xCIM 8 0.903 -4.797 -4.124
16xCIM 4 0.602 -4.450 -4.125
8xCIM 2 0.301 -3.713 -3.902
4XCIM 1 0.000 -4.243 -3.709
2xCIM 0.5 -0.301 -3.386 -4.031
1xCIM 0.25 -0.602 -1.851 -2.173
0.5xCIM 0.125 -0.903 0.568 -1.079
0.25xCIM 0.066 0.000 1.603 -0.878
Control 0 0 4.433 4.497
304
2 PenG-pH 7.4 S.aureus ATCC
1 S.aureus salvajes
∆ log ufc 24-0 h

-1
-2
-3
-4
-5
-6
-2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0
Log. Concent
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en CMH a pH
7.4. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de PenG.
La CIM de penicilina en CMH- pH 6.5, tal como se muestra en la Tabla 63, continúa
siendo de 0.25 µg/mL, a este pH continúa ejerciendo efecto bacteriostático (E= 0) a la
concentración de 1xCIM, como se observó en CMH-pH 7.4. A 2xCIM, cambia drásticamente
el efecto y produce efecto de erradicacion virtual (E= ≥ -4 log 10 ), observándose nuevamente
el efecto paradójico a 4 veces la CIM (E= ≥ -3 log 10 ). Para finalmente a concentraciones
equivalentes a 8 y 16xCIM recuperar el efecto de erradicación virtual, compatible con la cura
bacteriológica (Figura 124).

CMH - pH 6.5 ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc PenG pH 6.5 PenG pH 6.5
16xCIM 4 0.602 -4.904 -4.571
8xCIM 2 0.301 -4.569 -4.318
4XCIM 1 0.000 -3.976 -3.919
2xCIM 0.5 -0.301 -4.348 -4.556
1xCIM 0.25 -0.602 -2.020 -1.917
0.5xCIM 0.125 -0.903 0.623 -1.602
0.25xCIM 0.066 -1.180 2.003 2.154
Control 0 0.000 3.418 3.472
305
3 PenG-pH 6.5 S.aureus ATCC
2 S.aureus salvajes
1
∆ log ufc 24-0 h

0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Log. Concent
Penicilina G, en CMH- pH 5.0, tal como se muestra en la tabla 64, aumenta su eficacia
reduciendo su CIM a la mitad siendo de 0.125 µg/mL; a este pH, se presenta el efecto
bacteriostático a valores de 1xCIM, continuando con efecto bactericida (E= ≥ -3log 10 ) a 2 y 4
veces la CIM. A este pH no observamos efecto paradójico como cuando se cultivó a pH 7.4 y
6.5. El efecto compatible con la cura bacteriológica se vio a concentraciones de 8 y 16 veces
la CIM.

CMH - pH 5 ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc PenG pH 5 PenG pH 5
16xCIM 2 0.301 -4.170 -4.100
8xCIM 1 0.000 -4.121 -4.387
4XCIM 0.5 -0.301 -3.585 -4.104
2xCIM 0.25 -0.602 -3.016 -3.406
1xCIM 0.125 -0.903 -2.152 -2.465
0.5xCIM 0.066 -1.180 -1.892 -1.829
0.25xCIM 0.033 -1.481 -0.112 -0.336
Control 0 0.000 3.805 4.255
306
PenG-pH 5
0,0
-0,5
-1,0 S.aureus ATCC
-1,5 S.aureus salvajes
∆ log ufc 24-0 h

-2,0
-2,5
-3,0
-3,5
-4,0
-4,5
-5,0
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5
Log. Concent
PenicilinaG en leche tiene una CIM de 0.25 µg/mL, cuando realizamos las curvas de
muerte bacteriana en esta matrix, se observó a 1xCIM efecto bacteriostático (E= 0). A de
2xCIM hasta 8xCIM, presentó efecto bactericida, no alcanzándose el efecto de erradicación
virtual, compatible con cura bacteriologica en ninguna de las concentraciones estudiadas
frente a los aislamientos salvajes, sin embargo frente a la cepa de referencia se evidenció
efecto de erradicación virtual a partir de2xCIM.
supra-CIM) frente a S.aureus en Leche.
S.aureus salvajes S.aureus ATCC
LECHE ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc PenG LECHE PenG LECHE
16xCIM 4 0.602 -3.620
8xCIM 2 0.301 -3.970 -4.210
4XCIM 1 0.000 -3.630 -4.030
2xCIM 0.5 -0.301 -3.330 -4.050
1xCIM 0.25 -0.602 -2.060 -2.310
0.5xCIM 0.125 -0.903 0.460 1.400
0.25xCIM 0.066 -1.180 1.560 1.370
Control 0 0.000 4.320 4.140
307
PenG-LECHE
2
S.aureus salvajes
1
S.aureus ATCC
0
∆ log ufc 24-0 h

-1
-2
-3
-4
-5
-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Log. Concent
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en leche. Las
líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de PenG.
Penicilina en CMH suplementado con 40% de suero bovino, repite el patrón de

comportamiento evidenciado en las condiciones de los medios de cultivos anteriormente
expestos. Presenta efecto bacteriostático (Tabla 66) a 1xCIM. Desde 2 hasta 16 veces la CIM,
presenta efecto bactericida y a 32xCIM efecto de erradicación virtual, compatible con cura
bacteriológica. No se observaron grandes diferencias entre las cepas de campo y la cepa
ATCC (Figura 127).
supra-CIM) frente a S.aureus en suero bovino.
S.aureus salvajes S.aureus ATCC
SUERO ∆ ufc24-0h ∆ ufc24-0h
µg/mL Log Cc PenG SUERO PenG SUERO
32XCIM 8 0.903 -4.050 -4.300
16xCIM 4 0.602 -3.470 -3.930
8xCIM 2 0.301 -3.890 -3.730
4XCIM 1 0.000 -3.620 -3.870
2xCIM 0.5 -0.301 -3.180 -3.420
1xCIM 0.25 -0.602 -2.520 -2.600
0.5xCIM 0.125 -0.903 0.800 0.530
0.25xCIM 0.066 -1.180 3.820 4.290
Control 0 0.000 4.100 4.460
308
PenG-SUERO
5
S.aureus salvajes
4
S.aureus ATCC
3
2
∆ log ufc 24-0 h

1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0
Log. Concent
aureus salvajes y ATCC 25923 al final y al comienzo de las curvas de muerte construidas en suero
bovino. Las líneas punteadas representan los puntos de corte teóricos de la eficacia de penicilina G.
5.6 EFECTO POSTANTIBIOTICO
El efecto postantibiótico (PAE) se define como la supresión de crecimiento bacteriano

que persiste tras una limitada exposición de los microorganismos a un antimicrobiano (Mc.
Donnald et al., 1997). Esta definición llama la atención sobre el hecho de que el PAE es
debido a una acción previa del antimicrobiano y no a concentraciones subinhibitorias de
éste.
El mecanismo por el cual los antimicrobianos inducen PAE en los microorganismos es
en parte desconocido, ya que las diferencias en la duración de este efecto en las distintas
combinaciones antimicrobiano-microorganismo, sugieren que deben existir varios
mecanismos implicados. La explicación más acertada es que el PAE es debido a los daños no
letales producidos por los antimicrobianos y/o a la persistente unión de éstos en
determinados lugares bacterianos, lo que se traduce en un retraso en el crecimiento normal
de la bacteria.
Los antimicrobianos que actúan a nivel del ribosoma (por ejemplo, aminoglucósidos,
y macrólidos), inhiben la síntesis de proteínas. Así, el PAE podría significar un período de
resíntesis de estas proteínas necesarias para el metabolismo o el crecimiento bacteriano y si
la unión del antimicrobiano es irreversible la actividad persiste aunque éste haya sido
309
retirado (Preston et al., 1998). En el caso de los betalactámicos, se unen específicamente a
proteínas fijadoras de penicilinas (PBP), enzimas implicadas en la síntesis de peptidoglicano.
Una posible explicación es que el PAE sería el tiempo requerido por la célula para sintetizar
nuevamente estas proteínas (Vogelman & Craig, 1985).
Las diferencias observadas en el PAE para las distintas combinaciones de
microorganismo-antimicrobiano, se deberían posiblemente a otros muchos factores además
del propio mecanismo de acción del antibiótico:
• Diferente afinidad del antibiótico por su diana,
• Distinta capacidad de penetración a través de la membrana en bacterias Gram-

positivas y Gram-negativas.
• Empleo de diferentes técnicas en la evaluación del PAE.
• Utilización de distintas cepas bacterianas, etc.
En el desarrollo de esta tesis realizamos la determinación del efecto postantibiótico

in-vitro a 2 cepas de S. aureus, una la cepa de referencia ATCC 29213 y la otra una cepa
salvaje aislada de un cuarto mamario de una vaca portadora de mastitis subclínica. Este
ensayo se llevó a cabo tanto en CMH como en leche, para simular las condiciones
medioambientales imperantes en infecciones a nivel de la glándula mamaria.
5.6.1. EFECTO POSTANTIBIOTICO IN-VITRO.
5.6.1.1. AZITROMICINA
5.6.1.1.1. AZITROMICINA EN CMH
En la Figura 128 se presenta el comportamiento de las cepas de S. aureus ATCC 29213
(A) y aisladas a campo (n= 2) (B), control y tratadas con azitromicina en función del tiempo.
310
En ambos casos, la gráfica describe el comportamiento desde -2h, cultivo inicial,
pasando por la hora 0, momento en el cual el antimicrobiano fue retirado por el método de
dilución, hasta las 6 horas posteriores, según lo descrito en el apartado de metodología.
Cabe destacar, que la concentración de antibacteriano a la cual fue expuesto el

cultivo tratado corresponde a la concentración terapéutica, la cual fue establecida teniendo
en cuenta los predictores de eficacia definidos por las características farmacocinéticas/
farmacodinámicas (PK/PD) de los diferentes antimicrobianos tal como se documentó en el
apartado 4.2.6.1., que en el caso de azitromicina fue 5 µg/mL y que corresponde a 5 veces la
CIM de este antimicrobiano sobre S. aureus a pH 7.4.
En la gráfica, se puede observar la representación semilogarítmica de la evolución de

la población bacteriana en función del tiempo para S. aureus ATCC 29213 (A) y cepas salvajes
(n = 2) (B) en el ensayo de PAE. El PAE (horas) se estableció como la diferencia de tiempo en
el que los inóculos expuestos a azitromicina incrementaron el número de bacterias viables
en 1 log 10 respecto de los controles.
9 Control 9
Control
8 ATB 8 ATB
7 7
6 6
Log ufc/mL
Log ufc/mL
5 5
4 4
3 EPA 3 EPA
2 1.87 h 2.30 h
2
1 1
0 0
-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8
Horas Horas
Figura 128. Estimación del EPA (horas) como la diferencia de tiempo en el que los inóculos de S.
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin azitromicina) en CMH.
En la tabla 67, se resumen los resultados de la estimación del PAE para las cepas
salvajes y de referencia. Se presentan las bacterias viables expresadas como log 10 de las
ufc/mL observadas al momento de la dilución (T1) de los inóculos control y expuestos a 5
µg/mL de azitromicina (5xCIM) durante 2 horas. T2 es el momento en que se incrementa el
número de bacterias viables en un 1 log 10 .
311
Tabla 67. PAE presentado por azitromicina frente a S. aureus cepa ATCC 29213 y cepas aisladas a
campo en CMH-pH 7.4.
ATCC 29213
T1 (h) Log ufc/mL T2 (h) Log ufc/mL PAE
Control 0 4.68 2.38 5.68
ATB 0 4.39 4.25 5.39 1.87
CEPAS SALVAJES (n=2)
Control 0 4.62 2.41 4.62
ATB 0 4.34 4.71 5.34 2.30
En las cepas salvajes, el tiempo en el cual se presentó un aumento de 1 log 10 en el

cultivo control, a partir del tiempo 0 fue de 2.41 horas y el cultivo tratado aumentó 1 log 10
luego de 4.71 h después de la retirada del antimicrobiano, con lo cual la diferencia entre
estos 2 valores nos representa el tiempo durante el cual azitromicina presentó PAE, que en
este caso fue de 2.30 horas. Frente a la cepa ATCC 29213, el tiempo en el cual aumentó 1
log 10 el cultivo control, a partir del tiempo 0 fue 2.38 h y el cultivo tratado aumentó 1 Log 10
luego de 4.25 h tras la retirada del antimicrobiano, arrojando un PAE de 1.87 h. Azitromicina
frente a los aislamientos a campo presentó un efecto ligeramente más prolongado que
frente a S. aureus ATCC 29213.
5.6.1.1.2. AZITROMICINA EN LECHE
Cuando evaluamos la existencia de PAE de azitromicina en leche, cuyo pH en

condiciones de mastitis subclínica es 6.5 – 6.8, y que, según demostramos en los ensayos
anteriores, azitromicina pierde potencia a medida que el pH disminuye; encontramos
también una menor persistencia de este efecto con respecto al estimado para CMH 7.4
(Figura 129 y Tabla 68). En este medio, la concentración de azitromicina a la cual fue
expuesto el cultivo tratado, fue 40 µg/mL (5 veces la CIM –8 µg/mL- de azitromicina
obtenida a pH 6.5).
312
9 9
8
Control A Control B
ATB 8
ATB
7 7
Log ufc/mL 6 6
Log ufc/mL
5 5
4 4
PAE PAE
3 3
1.94 h 1.80 h
2 2
1 1
0 0
-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8
Horas Horas
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin azitromicina) en leche.

cultivo control, a partir del tiempo 0 fue de 3.01 horas y el cultivo tratado aumento 1 log 10
estos 2 valores nos representa el valor de PAE, que en este caso fue de 1.80 horas. En el caso
de la cepa ATCC 25932, el tiempo en el cual aumentó 1 log 10 el cultivo control, a partir del
tiempo 0 fue 2.88 h y el cultivo tratado aumentó 1 Log 10 luego de 4.82 h tras la retirada del
antimicrobiano, arrojando un PAE de 1.94 h (Tabla 68). Es decir en leche azitromicina
mantiene su PAE alrededor de la s 2 horas, pero necesita como hemos demostrado una
concentración varias veces por arriba a la plasmática.
Tabla 68. PAE presentado por azitromicina en leche frente a S. aureus ATCC 29213 y cepas aisladas
ATCC 29213
Control 0 4.79 2.88 5.79
TRAT-ATB 0 4.22 4.82 5.22 1.94
Control 0 4.84 3.01 5.84
TRAT-ATB 0 4.24 4.81 5.24 1.80
313
5.6.1.2. DANOFLOXACINA
5.6.1.2.1. DANOFLOXACINA EN CMH
(A) y de cepas aisladas a campo (n= 2) (B), control y tratadas con danofloxacina en función
del tiempo. La concentración de antibacteriano a la cual fue expuesto el cultivo tratado y
tratándose de un antimicrobiano cuya acción es concentración dependiente (ver apartado
4.2.6.1.), fue 10 µg/mL (10xCIM en CMH-pH 7.4).
dilución, hasta las 6 horas posteriores, según lo descripto en el apartado de metodología.
En la gráfica, se puede observar la representación semilogarítmica de la evolución de

la población bacteriana en función del tiempo para S. aureus ATCC 29213 (A) y cepas salvajes
(n = 2) (B) en el ensayo de PAE. El PAE (horas) se estableció como la diferencia de tiempo en
el que los inóculos expuestos a danofloxacina incrementaron el número de bacterias viables
en 1 log 10 respecto de los controles.
9 9
8 Control 8 Control
7 ATB 7 ATB
6 6
Log ufc/mL
Log ufc/mL
5 5
4 4
EPA EPA
3 3
2.11 h 0.97
2 2 h
1 1
0 0
-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8
Horas Horas
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin danofloxacina) en CMH.
En la tabla 69, se resumen los resultados de la estimación del PAE para las cepas
salvajes y de referencia. Se presentan las bacterias viables expresadas como log 10 de las
ufc/mL observadas al momento de la dilución (T1) de los inóculos control y expuestos a 10
µg/mL de danofloxacina (10xCIM) durante 2 horas. T2 es el momento en que se incrementa
314
el número de bacterias viables en un 1 log 10 . Notése que frente a las cepas salvajes
danofloxacina demostró un PAE la mitad más breve.
Tabla 69. PAE de danofloxacina en CMH frente S. aureus ATCC 29213 y cepas asiladas de animales
portadores de mastitis subclínica
ATCC 29213
Control 0 4.73 3.42 5.73
ATB 0 4.18 5.53 5.18 2.11
Control 0 4.86 3.80 5.86
ATB 0 4.34 4.77 5.34 0.97

luego de 4.77 h después de la retirada del antimicrobiano, de manera que la diferencia entre
ambos valores nos arroja un PAE de 0.97 horas. Frente a la cepa ATCC de referencia, el
tiempo en el cual aumentó 1 log 10 el cultivo control, a partir del tiempo 0 fue 3.42 h,
mientras que el cultivo tratado aumentó 1 Log 10 luego de 5.53 h tras la retirada del
antimicrobiano dando un PAE de 2.11 h. Danofloxacina frente a los aislamientos a campo
presentó un efecto post antibiótico más de la mitad menos persistente que frente a la cepa
de referencia (0.97 vs 2.11 h).
5.6.1.2.2. DANOFLOXACINA EN LECHE
Cuando evaluamos la existencia de PAE de la danofloxacina en leche (pH 6.5 – 6.8)

encontramos una menor persistencia de este efecto con respecto al estimado para CMH 7.4
(Figura 131 y Tabla 70). En leche, la concentración de danofloxacina a la cual fue expuesto el
cultivo tratado, fue la misma que en CMH, 10 µg/mL (10 veces la CIM –1 µg/mL- de
deanofloxacina obtenida a pH 6.5).
315
9 9
Control Control
8 8
7 ATB 7 ATB
Log ufc/mL 6 6
Log ufc/mL
5 5
4 4
3 PAE 3 PAE
1.14 0.97
2 2
h h
1 1
0 0
-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8
Horas Horas
el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin danofloxacina) en leche.

estos 2 valores nos representa el valor de PAE, que en este caso fueron escasas 0.97 horas.
Frente a la cepa de referencia, el tiempo en el cual aumentó 1 log 10 el cultivo control, a
partir del tiempo 0 fue 2.93 h y el cultivo tratado aumentó 1 Log 10 luego de 4.07 h tras la
retirada del antimicrobiano, arrojando un PAE de 1.14 h (Tabla 70). En leche, frente a las
cepas aisladas a campo, danofloxacina se comportó de manera similar que en CMH,
presentando igual extensión su PAE.
ATCC 29213
Control 0 4.79 2.93 5.79
ATB 0 4.13 4.07 5.13 1.14
Control 0 4.77 3.11 5.77
ATB 0 4.2 4.08 5.2 0.97
316
5.6.1.3. PENICILINA G
5.6.1.3.1. PENICILINA G EN CMH

(A) y de cepas aisladas a campo (n= 2) (B), control y tratadas con penicilina G en función del
tiempo. La concentración de antibacteriano a la cual fue expuesto el cultivo tratado
correspondió a 4 veces la CIM (1 µg/mL) obtenida en CMH-pH 7.4 (CIM 0.25 µg/mL), según
los predictores de eficacia definidos por las características farmacocinéticas y
farmacodinámicas (PK/PD) para penG, considerada un antimicrobiano cuya acción
bactericida es dependiente del tiempo de contacto (T>CIM) (ver apartado 4.2.6.1.). El PAE
(horas) se estableció como la diferencia de tiempo en el que los inóculos expuestos a penG
incrementaron el número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de los controles.
dilución, hasta las 6 horas posteriores, según lo descripto en el apartado de metodología.
9 Control 9 Control
8 ATB 8 ATB
7 7
6 6
Log UFC/mL
Log UFC/mL
5 5
4 PAE 4
0.42
PAE
3 3 1.27 h
h
2 2
1 1
0 0
-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8
Horas Horas
número de bacterias viables en 1 log 10 respecto de controles (sin penicilina G) en CMH
En la cepa de referencia ATCC, el tiempo en el cual se presentó un aumento de 1

log 10 en el cultivo control, a partir del tiempo 0 fue de 3.58 horas y el cultivo tratado
aumentó 1 log 10 luego de 3.99 h después de la retirada del antimicrobiano, con lo cual la
diferencia entre estos 2 valores nos representa el valor de PAE, que en este caso fueron
escasas 0.42 horas. Frente a las cepas salvajes, el tiempo en el cual aumentó 1 log 10 el
317
cultivo control, a partir del tiempo 0 fue 3.58 h y el cultivo tratado aumentó 1 Log 10 luego de
4.86 h tras la retirada del antimicrobiano, arrojando un PAE de 1.27 h (Tabla 71).
ATCC 29213
Control 0 4.74 3.58 5.74
ATB 0 4.37 3.99 5.37 0.42
Control 0 4.76 3.58 5.76
ATB 0 4.17 4.86 5.18 1.27
5.6.1.3.2. PENICILINA G EN LECHE.
Cuando evaluamos la existencia de PAE para penG en leche (pH 6.5 – 6.8)
encontramos un aumento en la persistencia de este efecto con respecto al estimado para
CMH 7.4 (Figura 132 y Tabla 71). En leche, la concentración de penicilina G a la cual fue
expuesto el cultivo tratado, fue la misma que en CMH, 1µg/mL (4 veces la CIM –0.25 µg/mL-
de penicilina G obtenida a pH 6.5).
9 Control 9 Control
8 ATB 8 ATB
7 7
6 6
Log UFC/mL
Log UFC/mL
5 5
4 4
PAE
3 PAE 3 1.02h
1.54h
2 2
1 1
0 0
-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8
Horas Horas
número de bacterias viables en 1 log10 respecto de controles (sin penicilina G) en leche.
En la cepa ATCC 29213, el tiempo en el cual se presentó un aumento de 1 log 10 en el

cultivo control, a partir del tiempo 0 fue de 3 horas y el cultivo tratado aumento 1 log 10
318
estos 2 valores nos representa el valor de PAE, que en este caso fueron 1.54 horas. Frente a
las cepas salvajes, el tiempo en el cual aumentó 1 log 10 el cultivo control, a partir del tiempo
0 fue 3.14 h y el cultivo tratado aumentó 1 Log 10 luego de 4.16 h tras la retirada del
antimicrobiano, arrojando un PAE de 1.02 h (Tabla 72).
ATCC 29213
T1 (h) Log ufc/mL T2 (h) Log ufc/mL EPA
Control 0 4.72 3.00 5.75
ATB 0 4.51 4.54 5.52 1.54
Control 0 4.78 3.14 5.78
ATB 0 4.34 4.16 5.34 1.02
5.6.1. EFECTO POSTANTIBIOTICO IN-VIVO
El efecto postantibiótico (PAE) es uno de los parámetros más ampliamente

estudiados, obteniéndose gran cantidad de información en estudios tanto in vitro como in
vivo.
El PAE In vivo es generalmente definido de acuerdo a la fórmula: PAE = T-C, donde T
es el tiempo requerido para que el número de UFC en los animales tratados se incremente 1
Log 10 a partir del tiempo en que los niveles plasmáticos de antibacteriano descienden de la
CIM y, C es el tiempo requerido para que el número de UFC en animales control incremente
1 Log 10 a partir del momento 0 (Craig y Gudmundsson, 1996).
La determinación del PAE in vivo de danofloxacina frente a S. aureus, utilizando la
metodología descrita por Craig en 1996, mostró una duración de 2.26 ± 0.48 horas, es decir
presentó un efecto post antibiótico ligeramente más prolongado que el obtenido en los
ensayos in vitro, tanto en CMH como en leche.
319
En la Tabla 73, se presentan los datos que nos permitieron determinar el PAE in vivo
para danofloxacina frente a S. aureus ATCC 29213 en un modelo de infección en muslo de
ratón neutropénico.
Tabla 73. Determinación del PAE in vivo para danofloxacina mediante un modelo de infección en
muslo de ratón neutropénico (Promedio ± DE).
Log 10 ufc/mL Log 10 ufc/mL Concentración Concentración
Tiempo Tratados Control muscular sérica
Horas Promedio T DE Promedio C DE µg/g DE µg/mL DE
-2 6.48 0.26 6.03 0.44 0 0 0 0
0 6.55 0.07 6.31 0.49 0 0 0 0
1 6.82 0.10 6.98 0.02 6.51 1.94 1.95 0.41
2 6.44 0.36 7.07 0.01 7.81 6.09 2.21 0.50
3 6.42 0.11 7.36 0.09 7.02 1.17 1.46 0.31
4 6.58 0.12 7.54 0.08 2.04 0.62 0.69 0.09
5 6.38 0.25 8.01 0.01 1.78 0.60 0.49 0.03
6 6.37 0.18 8.38 0.07 1.71 0.38 0.40 0.02
7 6.77 0.15 8.64 0.15 1.41 0.35 0.30 0.03
8 6.99 0.30 9.07 0.09 1.05 0.23 0.24 0.04
9 7.29 0.39 9.49 0.14 0.77 0.18 0.19 0.03
10 7.99 0.23 9.89 0.14 0.64 0.09 0.12 0.03
Donde:
Promedios T: Log 10 de las ufc/mL obtenidas a partir de los animales tratados (n = 4) a los
diferentes tiempos de muestreo.
Promedios C: Log 10 ufc/mL obtenidas de los animales control (n = 2) a los diferentes
tiempos de muestreo.
Concentración sérica de danofloxacina: concentraciones promedio ± DE de
danofloxacina obtenidas en los animales del grupo tratado, expresadas en µg/mL. Se debe
considerar el tiempo en el cual las concentraciones (en cada uno de los 4 animales tratados)
caen por debajo de los valores de CIM, en nuestro caso se dio a las 4 horas en todos los
animales (se identifica en la Tabla 73 en color rojo).
Al tiempo en que las ufc/mL en los cultivos tratados aumentan 1 log, a partir de la hora 4
(T1) y que en promedio corresponde a 9.16 ± 0.48 h, lo denominamos T1b, por lo tanto
definimos T2 como T1b – T1
320
A su vez, el cultivo control tarda 2.90 horas en incrementar 1 log 10 su número de ufc/mL
a partir del tiempo 0 = C
En la Tabla 74 se presentan los cálculos efectuados para determinar el PAE de
danofloxacina en cada uno de los animales experimentales utilizados.
Tabla 74. PAEs de danofloxacina obtenidos in vivo aplicando un modelo de infección por
Staphylococcus aureus en muslo de ratón
1b 2
(h) Log 10 ufc/mL T (h) T (h) Pr.C (h) Log 10 ufc/mL PAE (h) Pr.(h) DE(h)
1
ATB 1 T =4 6.41 9.38 5.38 7.41 2.48
1
ATB 2 T =4 6.61 9.20 5.2 7.61 2.30
1 2.26 0.48
ATB 3 T =4 6.69 8.48 4.48 7.69 1.58
1
ATB 4 T =4 6.61 9.58 5.58 7.61 2.68
Control 1 C=0 6.66 3.83 7.66
2.90
Control 2 C=0 5.96 1.97 6.96
De esta manera definimos el PAE como T2- C:

PAE 1 = 5.38 – 2.90 = 2.48 h;
PAE 2 = 5.20 – 2.90 = 2.30 h;
PAE 3 = 4.48 – 2.90 = 1.58 h;
PAE 4 = 5.58 – 2.90 = 2.68 h
En la Figura 134 se presenta la evolución de las UFC de S. aureus ATCC 29213/mL de

homogenato en función del tiempo en cada uno de los animales control (n = 2) y en cada
uno de los animales tratados con danofloxacina (n = 4) tras realizar la infección en el muslo.
321
11 Animal T1 Animal T2
10 Animal T3 Animal T4
Animal C1 Animal C2
9
8
7
Log ufc/mL
6
5
4
3
2
1
0
-2 0 2 4 6 8 10 12
Tpo en que la Csérica cae debajo
Horas
de la CIM
Figura 134. Evolución de las ufc/mL de Staphylococcus aureus en un modelo de infección en

muslo de ratones para evaluar la duración del PAE in vivo.
5.6.1.1. Cuantificación de danofloxacina
La cuantificación de danofloxacina en suero y en homogenato de músculo de ratón,

fue realizada por cromatografía líquida de alta presión con detección por fluorescencia tras
su extracción en fase líquida, siguiendo una metodología analítica validada en el Laboratorio
de Estudios Farmacológicos y Toxicológicos (LEFyT) (Mestorino. et al., 2009).
Bajo las condiciones analíticas empleadas se determinó que el tiempo de retención

de danofloxacina fue 6.6 ± 0.2 min.
Se preparó una solución estándar de danofloxacina conteniendo 0.100 µg/mL

(100 ng/mL) y se determinó la precisión del sistema cromatográfico mediante la colocación
de veinte (20) inyecciones. De esta manera se evaluó la eficiencia de la columna y del
sistema, a través del conocimiento del coeficiente de variación existente, obteniéndose
luego de veinte inyecciones un coeficiente de variación (CV) de 5.23 %. No existió con la
técnica utilizada interferencias en los tiempos de retención correspondientes a los picos de
danofloxacina, comprobando así la especificidad de la misma.
322
En cuanto a la linealidad, se preparó por duplicado una batería de 6 diluciones stock
del analito en el rango de concentraciones mencionadas. Las cuales fueron inyectadas en el
HPLC a los efectos de obtener curvas de calibración en las que se pudo evaluar: coeficiente
de variación, coeficiente de correlación, medias y desviación estándar de cada
concentración. Las rectas de calibración de los estándares en ácido, suero y músculo pueden
observarse en la Figura 135 (A, B y C, respectivamente).
4500000 Correlación estándar DAN 4500000 Correlación DAN en suero

4000000 4000000
Experimental Experimetal
3500000 3500000 Teórica
Área cromatográfica
Teórica
Area cromatográfica
3000000 3000000
B
2500000 A 2500000
2000000 2000000
1500000 y = 7185x + 144851
1500000
y = 7258,9x - 106539 R² = 0,9952
1000000 1000000
R² = 0,9918
500000 500000
0 0
0 100 200 300 400 500 600 0 200 400 600
Concentración (ng/ml) Concentración (ng/mL)
3500000 Correlación DAN en músculo

3000000
Experim.
2500000
Área cromatográfica
Teórica
C
2000000
1500000
y = 6429,9x - 73623
1000000 R² = 0,9992
500000
0
0 200 400 600
Concentración (ng/g)
Figura 135. Rectas de calibración mediante ajuste lineal del área de pico cromatográfico de
estándares de danofloxacina en ácido fosfórico 0.05 M (A), en suero (B) y en músculo (C) en un
rango de concentración 10 a 500 ng/0.2 mL.
El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) de danofloxacina en

suero fueron 0.005 y 0.010 µg/mL y en músculo 0.006 y 0.010 µg/g respectivamente.
323
En la Tabla 75 se presentan los parámetros de la re-validación de la técnica analítica
en suero y en músculo intra-día e inter-día (% de recuperación, % de exactitud (RSD) y % de
precisión (CV).
Tabla 75. Resultados de la re-validación de danofloxacina en suero y en músculo de ratón
Intra-día Inter-día (n=3)

Matriz r µg/mL Rec. (%), Exactitud Precisión Rec. (%) Exactitud Precisión
n=6 (%), n=6 (%), n=6 (%) (%)
0.9959 0.100 96.38 -3.62 7.85 98.15 -1.50 1.63
(0.1-0.5 0.300 103.81 3.81 1.53 98.72 2.23 2.60
Suero µg/mL) 0.500 98.89 -1.11 2.99 97.42 -1.87 2.19
0.010 128.94 28.94 0.38 129.29 29.29 0.91

0.9996 0.020 109.11 9.11 3.00 106.80 6.80 3.40
(0.01- 0.050 95.24 -4.76 5.54 91.51 -8.49 3.30
Músculo
0.5 0.100 100.24 0.24 0.01 100.23 0.23 1.02
µg/mL) 0.300 98.05 -1.95 1.84 96.77 -3.23 2.27
0.500 100.65 0.65 2.31 99.01 -0.99 2.15
5.6.1.2. Concentraciones de danofloxacina en suero y en músculo

Las concentraciones individuales y promedio ± desvío estándar (DE) de danofloxacina
en suero y en músculo obtenidas tras la administración de 10 mg/kg de DAN
intramuscularmente a los ratones utilizados en el ensayo de PAE in vivo se presentan en las
Tablas 76 y 77 respectivamente. Mientras que en la Figura 134 se integran las
concentraciones de danofloxacina en muslo y en suero con la evolución de las ufc/mL
obtenidas tras la infección experimental ocasionada tanto en los animales tratados como en
el grupo control.
En la grafica se puede apreciar que a partir de las 3 h post tratmiento, las

concentraciones de danofloxacina comienzan a descender tanto en suero como en el muslo
para caer en suero por debajo de la CIM de danofloxacina frente a S. aureus a las 4 horas.
Recordemos que 4 h, es el momento T1 en suero de los animales tratados. A partir de este
momento, aproximadamente a las 2.26 h se evidencia el recrecimiento del S. aureus en los
animales tratados.
324
Es interesante observar que coincidiendo con la concentración máxima alcanzada
(C max ) tanto en suero como en músculo, las ufc/mL, en el grupo tratado, sufren un descenso.
Tabla 76. Concentraciones séricas individuales y promedio ± DE obtenidas tras la administración de

10 mg/kg de DAN por la vía intramuscular
Concentraciones séricas de DAN
Tiempo 1 2 3 4 Promedio DE
(h) µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
-2 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
1 1.38 2.33 1.93 2.16 1.95 0.41
2 2.78 2.24 1.80 2.02 2.21 0.42
3 1.16 1.59 1.59 1.50 1.46 0.20
4 0.75 0.68 0.65 0.69 0.69 0.04
5 0.48 0.50 0.46 0.50 0.49 0.02
6 0.38 0.42 0.37 0.42 0.40 0.03
7 0.31 0.28 0.30 0.30 0.30 0.01
8 0.22 0.26 0.23 0.23 0.24 0.02
9 0.18 0.18 0.20 0.19 0.19 0.01
10 0.14 0.13 0.11 0.11 0.12 0.02
Tabla 77. Concentraciones musculares individuales y promedio ± DE en músculo de ratones tras la

administración de 10 mg/kg de DAN por la vía intramuscular
Concentraciones musculares de DAN
Tiempo 1 2 3 4 Promedio DE
(h) µg/g µg/g µg/g µg/g µg/g
-2 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
1 6.33 4.00 8.67 7.05 6.51 1.94
2 12.49 2.69 13.64 2.42 7.81 6.09
3 5.30 7.90 7.51 7.36 7.02 1.17
4 2.75 1.51 1.54 2.37 2.04 0.62
5 1.92 2.51 1.62 1.07 1.78 0.60
6 2.15 1.22 1.68 1.79 1.71 0.38
7 1.11 1.10 1.74 1.69 1.41 0.35
8 0.97 0.83 1.01 1.37 1.05 0.23
9 0.79 0.51 0.92 0.87 0.77 0.18
10 0.61 0.63 0.56 0.77 0.64 0.09
325
Cc en muslos Cc en Suero
9 11
Log ufc/mL Tratados Log ufc/mL Control
8 10
Concentración (µg/mL) 7 9
6 8
5 7
Log UFC/mL
4 6
3 5
2 4
CIM
1 3
0 2
-1 1
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo (horas)
INFECCIÓN TRAT. CONCENTRACIÓN
SÉRICA POR DEBAJO
CIM
Figura 136. Perfil de las concentraciones séricas y tisulares seguido por DAN tras su
administración intramuscular en ratones. Integración con la evolución de las ufc/mL de
Staphylococcus aureus ATCC control y tratadas con DAN obtenidas luego de realizar la infección
en los ratones para evaluar el PAE de la danofloxacina in vivo.
A partir de las concentraciones obtenidas en suero y en músculo tras la

administración intramuscular de DAN a razón de 10 mg/kg se realizó un análisis
farmacocinético aplicando un modelo no compartimental en ambos casos, mediante el
paquete informático WinNonlin Professional versión 6.4 (Pharsight Corp. 2012). Para el
cálculo del área bajo la curva concentración plasmática en función del tiempo (ABC) se utilizó
la regla trapezoidal lineal.
Entre los parámetros de relevancia clínica se encuentran la concentración máxima
alcanzada en suero y en músculo (C max , µg/mL o µg/g); el tiempo máximo que corresponde
al tiempo en que se alcanza la Cmax (T max , h), la constante de eliminación (λ, h-1), la semivida
de eliminación (T½λ, h); el área bajo la curva concentración sérica o tisular en función del
tiempo desde el tiempo 0 hasta el tiempo final (ABC 0-10h , µg.h/mL o µg.h/g), el área bajo la
curva concentración sérica o tisular extrapolada al infinito (ABC 0-∞ , µg.h/mL o µg.h/g) y el
tiempo medio de residencia (TMR, h) que también puede ser hasta el último momento
analizado o extrapolado al infinito y se refiere al promedio del tiempo que permanece una
partícula en el sistema. Los parámetros farmacocinéticos mencionados se presentan en la
Tabla 78.
326
Los parámetros necesarios para llevar a cabo la integración PK/PD y establecer los
parámetros predictores de eficacia son C máx , % de tiempo en que las concentraciones se
ubican por encima de la CIM durante el intervalo de dosis y el ABC 0-24h .
Tabla 78. Parámetros farmacocinéticos individuales y promedio ± DE en suero y en músculo

obtenidos por análisis no compartimental tras la administración intramuscular de danofloxacina a
ratones neutrópenicos en el ensayo de PAE in vivo
Parámetro Unidad 1 2 3 4 Promedio DE
Suero
C max µg/mL 2.78 2.33 1.93 2.16 2.30 0.36
T max h 2 1 1 1 1.25 0.50
λ h-1 0.25 0.35 0.27 0.29 0.29 0.04
T½λ h 2.77 2.00 2.60 2.41 2.45 0.33
ABC 0-10h µg.h/mL 7.56 8.45 7.50 7.98 7.87 0.44
ABC 0-∞ µg.h/mL 8.12 8.82 7.91 8.37 8.31 0.39
ABMC 0-10h µg.h.h/mL 24.35 25.64 23.67 24.70 24.59 0.82
ABMC 0-∞ µg.h.h/mL 32.20 30.47 29.34 29.87 30.47 1.24
TMR 0-10h h 3.22 3.03 3.16 3.09 3.13 0.08
TMR 0-∞ h h 3.96 3.45 3.71 3.57 3.67 0.22
Músculo
C max µg/g 12.49 7.9 13.64 7.36 10.35 3.18
T max h 2 3 2 3 2.50 0.58
λ h-1 0.23 0.28 0.35 0.28 0.29 0.05
T½λ h 2.99 2.47 1.98 2.46 2.48 0.41
ABC 0-10h µg.h/g 33.38 21.60 37.50 25.77 29.56 7.20
ABC 0-∞ µg.h/g 36.01 23.85 39.10 28.51 31.87 6.95
ABMC 0-10h µg.h.h/g 106.07 78.56 112.56 92.74 97.48 15.07
ABMC 0-∞ µg.h.h/g 143.71 109.05 133.17 129.85 128.95 14.52
TMR 0-10h h 3.18 3.64 3.00 3.60 3.35 0.31
TMR 0-∞ h h 3.99 4.57 3.41 4.55 4.13 0.55
327
5.7. CAPTACION Y ACTIVIDAD INTRACELULAR DE LOS ANTIBACTERIANOS
La relacion existente entre los antibacterianos y los neutrófilos PMNs, genera una
sinergia que posibilita y hace mas eficaz la acción antibacteriana por parte de estos últimos;
de hecho, los diferentes mecanismos de acción de los agentes antimicrobianos hacen a las
bacterias más susceptibles a la muerte por acción de los neutrófilos, incluso a
concentraciones subinhibitorias (Mandell y Coleman, 2001).
De la misma manera y como lo hemos comentado con antelación, en la lucha contra
las bacterias de vida intracelular, obligatoria o facultativa, como es el caso del S. aureus,
necesitamos conocer cuales aquellos antibacterianos que mejor penetran, se concentran y
actuán en el interior celular, a fin de diseñar planes terapéuticos más eficaces.
Para determinar la penetración y actividad antibacteriana de azitromicina,
danofloxacina y penicilina G, diseñamos un ensayo que constó de las siguientes etapas:
1. Separación celular de PMNs de sangre y leche bovina.

2. Exposición de los PMNs a cada antibacteriano.
3. Evaluación de la captación Intracelular de cada antimicrobiano.
Todos estos procedimientos están documentados y explicados en el apartado 4.2.7.

de materiales y métodos.
5.7.1. CAPTACIÓN CELULAR DE LOS ANTIMICROBIANOS
5.7.1.1. Cuantificación intra y extracelular de azitromicina y penicilina G
La cuantificación intra y extracelular de Azitromicina y Penicilina G fue realizada por

método microbiológico empleando Kocuria rhizophila ATCC 9341 (Sarcina lútea) como
microorganismo testigo, técnica cilindro placa validada en nuestro laboratorio, según
detallamos en el apartado de materiales y métodos (punto 4.2.7.8.2.).
Las rectas de calibración de los estándares de azitromicina y de penicilina G en buffer

fosfato, solución fisiológica y RPMI pueden observarse en las Figura 137 y 138 (A, B y C,
328
respectivamente). Mientras que en las Tablas 79 y 80 se presentan los coeficientes de
correlación, intersección y pendiente para azitromicina y para penicilina G en Buffer,
solución fisiológica y RPMI, respectivamente.
Correlación AZT en Sol.Fisiol.

3 3
Correlación AZT en Buffer
2,5 2,5
Diametro de Halo
Diametro de Halo
2 2
1,5 1,5
Experimental
Experimental
1 Teórico 1 Teórica
y = 0,8309x + 2,3463
0,5 R² = 0,979 0,5 y = 0,8515x + 2,174
R² = 0,9755
0 0
-1,20 -0,70 -0,20 0,30 -1,20 -0,70 -0,20 0,30
Log. concentración (µg/ml) Log. concentración (µg/ml)
3
Correlación AZT en RPMI
2,5
Diametro de Halo
1,5 Experimental
Teórico
1
y = 0,803x + 2,297
0,5 R² = 0,9534
0
-1,20 -0,70 -0,20 0,30
Log. concentración (µg/ml)
Figura 137. Rectas de calibración mediante ajuste lineal del diámetro del halo de inhibición de
estándares de azitromicina en Buffer fosfato de Na 0.1M pH 8 (A), en solución fisiológica (B) y en
RPMI (C) en un rango de concentración 0.0625 a 1 µg/mL (expresadas en logaritmo).
Tabla 79. Coeficientes de correlación, intersección y pendientes obtenidos para azitromicina

en buffer fosfato pH 8, solución fisiológica y RMPI
AZT (0.625 - 1) µg/mL r Intersección Pendiente
Buffer fosfato pH 8 0.98944 -2.78 1.18
Sol. Fisiológica 0.98765 -2.51 1.15
RMPI 0.97642 -2.75 1.19
329
3 Correlación PenG en Buffer 3
Correlación PenG en Sol.Fisiol.
Diametro del Halo 2,5 2,5
Diametro del Halo

2 2
1,5 1,5
Experimental
Experimental
1 1 Teórico
Teórico
y = 0,9887x + 2,7939
0,5 y = 0,8999x + 2,6698 0,5 R² = 1
R² = 0,9467
0 0
-1,810 -1,410 -1,010 -0,610 -1,810 -1,410 -1,010 -0,610
Log. concentración (µg/ml) Log. concentración (µg/ml)
Correlación PenG en RPMI

3
2,5
Diametro del Halo
1,5 Experimental
Teórico
1
y = 1,055x + 2,8014
0,5 R² = 0,989
0
-1,500 -1,000 -0,500 0,000
Log. concentración (µg/m)l
estándares de Penicilina G en Buffer fosfato de Na 0.1M pH 6 (A), en solución fisiológica (B) y en
RPMI (C) en un rango de concentración 0.0156 a 0.25 µg/mL (expresadas en logaritmo).
Tabla 80. Coeficientes de correlación, intersección y pendientes obtenidos para penicilina G

en buffer fosfato pH 6, solución fisiológica y RMPI
PenG (0.0156 - 0.25) µg/mL r Intersección Pendiente
Buffer fosfato pH 6 0.97299 -2.87 1.05
Sol. Fisiológica 0.98860 -2.82 1.01
RMPI 0.99449 -2.63 0.94
5.7.1.2. Cuantificación de danofloxacina
La cuantificación intra y extracelular de danofloxacina fue realizada por

cromatografía líquida de alta presión con detección por fluorescencia tras su extracción en
fase líquida, siguiendo una metodología analítica validada en el Laboratorio de Estudios
330
Farmacológicos y Toxicológicos (LEFyT) (Mestorino. et al., 2009), según se detalló en el
apartado 4.2.6.2.2. de materiales y métodos y cuyos resultados de validación se presentaron
en 5.6.1.1.
Las rectas de calibración de los estándares de danofloxacina en ácido fosfórico,

solución fisiológica y RPMI pueden observarse en las Figura 139 (A, B y C, respectivamente).
Mientras que en la Tablas 81 se presentan los coeficientes de correlación, intersección y
pendiente respectivamente.
4000000 Correlación Dano en ác. fosfórico 4000000 Correlación Dano en Sol. Fisiol.
3500000
3500000
3000000
3000000
2500000
Area Pico
2500000
Area Pico
2000000
Experimental 2000000
Experimental
1500000 Teórico 1500000
Teórico
1000000 1000000
y = 7612,6x - 115739 y = 7513,9x - 165019
500000 R² = 0,9985 500000 R² = 0,995
0 0
0 200 400 600 0 100 200 300 400 500 600
Concentración (ng/ml) Concentración (ng/ml)
4000000 Correlación Dano en RPMI

3500000
3000000
Area Pico
2500000
2000000 Experimental
1500000 Teórico
1000000
y = 7173,1x - 127554
500000 R² = 0,9923
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentración (ng/ml)
estándares de Danofloxacina en ácido fosfórico 0.05 M (A), en solución fisiológica (B) y en RPMI
(C) en un rango de concentración 10 a 500 ng/mL.
Tabla 81. Coeficientes de correlación, intersección y pendientes obtenidos para

danofloxacina en ácido fosfórico 0.05 M, solución fisiológica y RMPI
Dano (10 - 500 ng/mL) r Intersección Pendiente
Ác. Fosfórico 0.05M 0.99923 15.43 0.0001
Sol. Fisiológica 0.99751 22.66 0.0001
RMPI 0.99612 18.91 0.0001
331
A partir de las curvas de calibración obtenidas para cada antimicrobiano ensayado se
obtuvieron las concentraciones en los fluidos extracelulares y en el contenido de PMN
(previa lisis celular), siempre corrigiendo por el volumen celular como se explicó en
materiales y métodos.
En la siguiente Tabla 82 se presentan los resultados de la captación intracelular de

cada uno de los antimicrobianos por parte de los PMNs (IC), su concentración equivalente a
nivel del fluido extracelular (EC) y la relación entre ambos (R IC/EC). Para calcular las
concetraciones intracelulares de cada antimicrobiano se consideró un volumen celular
medio de 2.5 µL para 1 x 106 PMN.
Tabla 82. Concentración intracelular, extracelular y relación IC/EC para azitromicina,

danofloxacina y penicilinaG
ANTIMICROBIANO IC (µg/mL) EC (µg/mL) R IC/EC

Azitromicina 387.75 0.84 462/1
Danofloxacina 18.03 2.87 6.28/1
Penicilina G 1 2.26 0.44/1
5.7.2. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ANTIMICROBIANOS A NIVEL INTRACELULAR
Una vez comprobada la capacidad de penetración intracelular de los antimicrobianos

objeto de este estudio, procedimos a analizar la actividad antibacteriana de cada uno de
ellos frente a Staphylococcus aureus a nivel intracelular. Para lo cual, diseñamos un desafío
en el cual PMNs suspendidos en medio RPMI 1640 con cantidades conocidas de UFC de S.
aureus fagocitadas, se expusieron a concentraciones terapéuticas de cada uno de los
antimicrobianos en estudio durante un periodo de 5 horas a 37°C en estufa de cultivo.
Luego, mediante siembra directa del contenido celular, evaluamos el efecto de cada
antimicrobiano frente al S. aureus a nivel intracelular.
332
5.7.2.1. Acción de AZITROMICINA frente a Staphylococcus aureus internalizados en
PMNs extraidos de sangre y de leche de vacas
Como vimos en los ensayos anteriores, azitromicina tiene una excelente capacidad de
penetración a nivel celular, 462 veces con respecto al medio extracelular y a medida que el
pH se torna más ácido aumenta notablemente su CIM 50 (de 1 µg/mL pH 7.4 –EC- aumenta a
≥ 64 µg/mL a pH 5.0 –IC-). Recordemos que azitromicina según pautas PK/PD, es un
antimicrobiano acción tiempo dependiente con prolongada persistencia, aunque frente a S.
aureus mostró un EPA moderado.
Tras 90 min de exposición, se produjo una adecuada internalización del S. aureus, ya

que, 5.23 y 5.32 log 10 ufc/mL fueron fagocitados por los PMNs sanguíneos y obtenidos de
leche bovina (Figura 140, A y B, respectivamente). Cuando los cultivos celulares (PMN + S.
aureus) no fueron tratados con antimicrobiano, al cabo de 5 horas, no observamos
incremento en el número de ufc/mL. Una explicación, es que los S aureus no se reprodujeron
en el interior celular, es decir disminuyeron su metabolismo, a lo que llamamos sueño
bacteriano (Figura 140 A-B, Tabla 83).
Los S aureus intracelulares tratados con una dosis terapéutica de azitromicina

(5xCIM) por espacio de 5 horas, sufrieron una reducción de 1.77 Log 10 (Tabla 83) con
relación al número inicial de bacterias fagocitadas en los PMNs sanguíneos, y un efecto
menor en los PMNs de orginen mamario (-1.66). Esto demuestra que azitromicina presentó
un efecto bacteriostático solamente, un índice de actividad antibacteriana de -1.77 / -1.66
no alcanza para considerar efecto bactericida (Efecto bacteriostático: E = 0 y Efecto
bactericida: E = -3; cuando la reducción es de ≥ 3 log 10 de n t-0 por eliminación del 99.9% de
las bacterias iniciales). Aquí obtuvimos una eliminación del 98.03 y 97.44% en ambos
cultivos (Tabla 83).
333
Tabla 83. Efecto de la azitromicina sobre S. aureus localizados a nivel subcelular en PMN obtenidos
de sangre y de leche de vacas Holando Argentino (n = 3 ensayos), % de eficacia e Indice
antibacteriano (E)
PMNs sanguíneos Log ufc/mL DE Prom ufc/mL % %Eficacia E (Δ Log ufc 5-0h )
UFC inicial (EC) 7.62 0.05 41950000
S.aureus IC (90 min-T 1control )s/AZT 5.23 0.05 169000 100
S.aureus IC (5 h-T 2control ) s/AZT 5.22 0.04 165000 97.63 -0.01
S.aureus IC (5 h-T 2ATB ) c/AZT 3.46 0.28 3333 1.97 98.03 -1.77
PMN s/S.aureus (control neg.) 0 0 --- --- --- ---
PMNs de leche
UFC inicial (EC) 7.7 0.08 49950000
S.aureus IC (90 min-T 1control )s/AZT 5.32 0.04 208000 100
S.aureus IC (5 h-T 2control ) s/AZT 5.59 0.06 388000 186.54 0.27
S.aureus IC (5 h-T 2ATB ) c/AZT 3.66 0.32 5333 2.56 97.44 -1.66
B
A
Figura 140. Representación gráfica promedio del efecto ejercido por azitromicina sobre S. aureus a
nivel IC en PMNs obtenidos de sangre (A) y de leche (B) de vacas Holando Argentino.
5.7.2.2. Acción de DANOFLOXACINA frente a Staphylococcus aureus internalizados en

Danofloxacina también presentó penetración a nivel celular, pero solo 6 veces con
respecto al medio extracelular y a medida que el pH se torna más ácido, su CIM 50 se
modifica ligeramente (de 0.5 µg/mL pH 7.4 –EC- aumenta a 1-2 µg/mL a pH 5.0 –IC). Según
pautas PK/PD, es un antimicrobiano bactericida acción dependiente de la concentración, que
frente a S. aureus mostró un EPA moderado, de 2.26 ± 0.48 h.
334
que, 5.26 y 5.46 log 10 ufc/mL fueron fagocitados por los PMNs sanguíneos y de leche (Figura
141, A y B, respectivamente). Cuando los cultivos celulares (PMN + S. aureus) no fueron
tratados con antimicrobiano, al cabo de 5 horas, no observamos incremento en el número
de ufc/mL, en ninguno de los cultivos celulares. Corroborando lo observado con el ensayo de
azitromicina en cuanto a que S aureus disminuye su metabolismo a nivel intracelular (Figura
141 A-B, Tabla 84).
Los S aureus intracelulares tratados con danofloxacina a razón de 10 veces la CIM por
espacio de 5 horas, sufrieron una reducción de 1.72 Log 10 (Tabla 84) con relación al número
inicial de bacterias fagocitadas en los PMNs sanguíneos, y un efecto menor en los PMNs de
orginen mamario (-1.12). Es interesante el menor efecto observado en los PMNs extraidos
de la leche. A pesar de ser un antimicrobiano de acción bactericida, en este ensayo solo
logró un efecto bacteriostático, presentó un índice de actividad antibacteriana a nivel IC
frente a S. aureus de -1.72 / -1.12 y un % de eficacia de 97.80 y 87.91 % en los PMNs
extraidos de sangre y de leche, respectivamente (Tabla 84).
Tabla 84. Efecto de danofloxacina sobre S. aureus localizados a nivel subcelular en PMN obtenidos de
sangre y de leche de vacas Holando Argentino (n = 3 ensayos), % de eficacia e Indice antibacteriano
(E)
PMNs sanguíneos Log.ufc/mL DE Prom ufc/mL % %Eficacia Δ Log ufc 5-0h
UFC inicial (EC) 7.71 0.03 51400000
S.aureus IC (90 min-T 1control )s/Dano 5.26 0.03 182000 100
S.aureus IC (5 h-T 2control ) s/DANO 5.5 0.1 320500 176.10 0.24
S.aureus IC (5 h-T 2ATB ) c/DANO 3.54 0.34 4000 2.20 97.80 -1.72
PMNs de leche
UFC inicial (EC) 7.68 0.06 48550000
S.aureus IC (90 min-T 1control )s/Dano 5.46 0.09 289000 100
S.aureus IC (5 h-T 2control ) s/DANO 5.2 0.07 161500 88.74 -0.26
S.aureus IC (5 h-T 2ATB ) c/DANO 4.34 0.11 22000 12.09 87.91 -1.12
335
B
A
Figura 141. Representación gráfica promedio del efecto ejercido por danofloxacina sobre S. aureus a
5.7.2.3. Acción de PENICILINA G frente a Staphylococcus aureus internalizados en

PenicilinaG, por sus características físico-químicas, lógicamente presentó una R IC/EC

muy baja (0.44/1). A pH ácido, su CIM 50 disminuye notablemente (de 0.125 µg/mL pH 7.4 –
EC- disminuye a 0.066 µg/mL a pH 5.0 –IC-). Según pautas PK/PD, es un antimicrobiano
bactericida acción dependiente del tiempo de contacto con escaso EPA.

que, 5.19 y 5.22 log 10 ufc/mL fueron fagocitados por los PMNs sanguíneos y de leche (Figura
142, A y B, respectivamente). Cuando los cultivos celulares (PMN + S. aureus) no fueron
tratados con antimicrobiano, al cabo de 5 horas, no observamos modificación en la cinética
de crecimiento del microorganismo, ya que la diferencia fue solo de 0.18 (diferencia de log 10
entre tiempo T 2control -T 1control ). Corroborando lo observado anteriormente (Figura 142 A-B,
Tabla 85).
Los S aureus intracelulares tratados con penicilina G a razón de 4 veces la CIM por
espacio de 5 horas, sufrieron una reducción de 1.63 - / -1.62 Log 10 (Tabla 85) con relación al
número inicial de bacterias fagocitadas en los PMNs sanguíneos y de leche, respectivamente.
A pesar de ser un antimicrobiano de acción bactericida, en este ensayo solo logró un efecto
bacteriostático a nivel IC, presentó un índice de actividad antibacteriana a nivel IC frente a S.
336
aureus de -1.63 / -1.62 y un % de eficacia de 97.44 y 97.12 % en los PMNs extraidos de
sangre y de leche, respectivamente (Tabla 85).
Tabla 85. Efecto de penicilina G sobre S. aureus localizados a nivel subcelular en PMN obtenidos de
sangre y de leche de vacas Holando Argentino (n = 3 ensayos), % de eficacia e Indice antibacteriano
(E)
PMNs sanguíneos Log ufc/mL DE Prom ufc/mL % %Eficacia Δ Log ufc 5-0h
UFC inicial (EC) 7.76 0.06 58200000
S.aureus IC (90 min-T 1control )s/PenG 5.19 0.02 156000 100
S.aureus IC (5 h-T 2control ) s/PenG 5.37 0.09 240000 153.85 0.18
S.aureus IC (5 h-T 2ATB ) c/PenG 3.56 0.34 4000 2.56 97.44 -1.63
PMN s/S.aureus (control neg.) 0 0
PMNs de leche
UFC inicial (EC) 7.77 0.04 58850000
S.aureus IC (90 min)s/PenG 5.22 0.02 167000 100
S.aureus IC (5 h) s/PenG 5.39 0.06 249500 159.94 0.17
S.aureus IC (5 h) c/PenG 3.60 0.17 4500 2.88 97.12 -1.62
PMN s/S.aureus (control neg.) 0 0
A B
Figura 142. Representación gráfica promedio del efecto ejercido por penicilinaG sobre S. aureus a
337
5.8. CINETICA INTRACELULAR DE LOS ANTIBACTERIANOS Y ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA.
5.8.1. AZITROMICINA
A continuación se presentan los resultados obtenidos en los ensayos orientados a

determinar la cinetica de penetración y eflujo de azitromicina al interior de leucocitos PMNs,
extraidos de sangre bovina y la relación de este evento con la eficacia antibacteriana, frente
a S. aureus, previamente fagocitados por dichas células.
Azitromicina fue ampliamente captada por los PMNs, sin sufrir saturación durante las
primeras 6 h de incubación en donde la relación IC/EC tras los diferentes tiempos de
incubación se fue incrementando. A partir de las 8 h, los niveles intracelulares del
antimicrobiano comenzaron a descender, evidenciando un lento eflujo del antimicrobiano
(Tabla 86).
Tabla 86. Concentraciones individuales y promedio ± DE (µg/mL) a nivel intracelular y

extracelular en función del tiempo de incubación, relación IC/EC.
Concentración equivalente AZT-IC Concetración AZT-EC

Tpo (h) IC-1 IC-2 Prom DE EC-1 EC-2 Prom DE RIC/EC
2 209.28 221.84 215.56 8.88 0.78 0.83 0.80 0.03 267.95
4 243.82 253.24 248.53 6.66 0.63 0.69 0.66 0.04 375.94
6 272.07 265.79 268.93 4.44 0.60 0.63 0.61 0.03 437.60
8 265.79 262.65 264.22 2.22 0.69 0.66 0.67 0.02 392.78
12 218.70 206.14 212.42 8.88 0.58 0.60 0.59 0.01 361.61
24 181.02 181.02 181.02 0.00 0.60 0.56 0.58 0.03 314.39
Simultáneamente evaluamos la actividad de la AZT IC frente a S. aureus, recordemos

que la CIM de AZT a pH 5 (fagolisosoma) aumentaba considerablemente, ≥ 64µg/mL. Se
lograron concentraciones intracelulares por arriba de la CIM durante un periodo sostenido
(Figura 143), pero no se observó un efecto bactericida a este nivel. A partir de las 6 h se
evidenció un recrecimiento del inoculo bacteriano.
338
CIM
Figura 143. Representación gráfica de los niveles de AZT alcanzados IC en relación a los niveles EC y
su acción sobre S.aureus (Log ufc/mL) en función del tiempo en comparación a la curva control (sin
AZT).
La evolución del Log 10 ufc/mL frente a azitromicina intracelular en función del tiempo
se presenta en la Tabla 87, donde podemos observar que el índice de actividad
antibacteriana (E) máximo alcanzado fue -1.70, nunca se alcanzó una reducción de ≥ -3 Log 10
de las ufc/mL para considerar un efecto antibacteriano bactericida.
Tabla 87. Log ufc/mL en presencia de AZT -IC (N= 2) versus control sin AZT (n = 2) , relación
IC/EC e índice de actividad antibacteriana para los distintos R IC/EC a los tiempos de incubación del
ensayo.
Tpo (h) Log. ufc/mL ATB Log.ufc/mL control R IC/EC Δ log Tn-T0 E-Tratado Control
0 5.45 5.46
2 4.19 5.78 267.95 Δ log 2h-0h -1.26 0.31
4 3.75 5.87 375.94 Δ log 4h-0h -1.70 0.41
6 4.17 5.99 437.60 Δ log 6h-0h -1.29 0.53
8 4.48 6.13 392.78 Δ log 8h-0h -0.97 0.67
12 5.06 6.58 361.61 Δ log 12h-0h -0.40 1.12
24 5.95 7.87 314.39 Δ log 24h-0h 0.50 2.40
339
Realizamos un análisis no compartimental de los datos de concentración equivalente
a nivel intracelular (Tabla 88). Calculamos el predictor de eficacia ABC 0-24h /CIM, el cual no
fue sufiente para lograr la erradicación del S. aureus a nivel intracelular.
Tabla 88. Análisis no compartimental de las concentraciones IC de azitromicina en función

del tiempo. Predictor de eficacia PK/PD
Parámetro Unidad Placa 1 Placa 2 Promedio DE
-1
λ h 0.0221 0.0204 0.0212 0.001
T½λ h 31.36 33.99 32.67 1.86
T max h 6.00 6.00 6.00 0.00
C max µg/mL 272.07 265.79 268.93 4.44
ABC 0-24h h*µg/mL 5083.43 5004.93 5044.18 55.51
ABC 0-∞ h*µg/mL 13273.38 13881.09 13577.24 429.72
MRT 0-24h h 11.70 11.64 11.67 0.04
MRT 0-∞ h 47.21 50.90 49.05 2.61
AUC 0-24h /CIM h 79.43 78.20 78.82 0.87
Danofloxacina, presentó una acumulación a nivel intracelular entre 6 y 8 veces con

respecto al medio extracelular. Hacia las 6 h de incubación la relación IC/EC se incrementó
ligeramente, pero a partir de ese momento comenzó a predominar el eflujo. Los niveles
intracelulares estuvieron en el orden de más de 10 veces la CIM calculada para S. aureus a
este nivel (1-2 µg/mL)(Tabla 89).

Concentración equivalente DAN-IC Concetración DAN-EC
2 19.04 19.08 19.06 0.03 2.88 2.86 2.87 0.01 6.64
4 19.99 20.04 20.02 0.04 2.54 2.61 2.58 0.05 7.77
6 19.44 19.20 19.32 0.17 2.41 2.37 2.39 0.03 8.08
8 16.01 15.96 15.99 0.04 2.28 2.20 2.24 0.06 7.14
12 13.82 13.43 13.63 0.28 2.36 2.20 2.28 0.11 5.98
24 11.14 10.84 10.99 0.21 2.28 2.36 2.32 0.06 4.74
340
Evaluamos la actividad de danofloxacina a nivel IC frente a Staphylococcus aureus
(Figura 144). A pesar de ser un antimicrobiano acción bactericida concentración
dependiente, no se logró este efecto en el ambiente intracelular, ya que el Log ufc/mL cayó
1.98, y se evidenció recrecimiento del inoculo bacteriano.
CIM-IC
Figura 144. Representación gráfica de los niveles de DANO alcanzados IC en relación a los niveles EC
y su acción sobre S.aureus (Log ufc/mL) en función del tiempo en comparación a la curva control (sin
DANO).
La evolución del Log 10 ufc/mL frente a danofloxacina a nivel intracelular en función

del tiempo se presenta en la Tabla 90, donde podemos observar que el índice de actividad

a nivel intracelular (Tabla 91). Calculamos los predictores de eficacia Cmax/CIM y ABC 0-
24h /CIM, si bien los mismos fueron alcanzados (Cmax/CIM ≥ 10 y ABC 0-24h /CIM ≥ 125) no
fueron suficientes para lograr la erradicación del S. aureus a nivel intracelular. Este resultado
nos deja claro que la acumulación a nivel intracelular no es predictivo de actividad a nivel
intracelular.
341
Tabla 90. Log ufc/mL en presencia de DANO -IC (N= 2) versus control sin DANO (n = 2) ,
relación IC/EC e índice de actividad antibacteriana para los distintos R IC/EC a los tiempos de
incubación del ensayo.
Tpo (h) Log ufc/mL ATB Log ufc/mL Control R IC/EC Δ log T n -T 0 E-Tratado Control
0 5.43 5.43
2 4.27 5.57 6.64 Δ log 2h-0h -1.16 0.14
4 3.45 5.77 7.77 Δ log 4h-0h -1.98 0.35
8 4.44 5.99 7.14 Δ log 8h-0h -0.99 0.56
12 4.73 6.46 5.98 Δ log 12h-0h -0.71 1.03
24 5.29 7.44 4.74 Δ log 24h-0h -0.14 2.01
Tabla 91. Análisis no compartimental de las concentraciones IC de danofloxacina en función

del tiempo. Predictores de eficacia PK/PD
-1
λ h 0.0216 0.0227 0.0222 0.0008
T½λ h 32.12 30.51 31.31 1.14
T max h 4.00 4.00 4.00 0.00
C max µg/mL 19.99 20.04 20.015 0.04
ABC 0-24h h*µg/mL 342.37 337.00 339.69 3.80
ABC 0-∞ h*µg/mL 858.55 814.15 836.35 31.39
MRT 0-24h h 11.05 10.98 11.02 0.05
MRT 0-∞ h 46.70 44.41 45.55 1.62
AUC 0-24h /CIM h 171.19 168.50 169.84 1.90
C max /CIM 10.00 10.02 10.01 0.02
5.8.3. PENICILINA G
Nuestro tercer antibacteriano probado, fue penicilina G, la que presentó una escasa
acumulación a nivel intracelular, menor a 1 con respecto al medio extracelular. Hacia las 4 h
de incubación la relación IC/EC se incrementó ligeramente, pero a partir de ese momento
comenzó a predominar el eflujo. Los niveles intracelulares sin embargo se mantuvieron
varias veces por arriba de la CIM calculada para S. aureus a este nivel (0.066 µg/mL)(Tabla
92).
342
Concentración equivalente PenG-IC Concetración AZT-EC
2 0.390 0.450 0.420 0.042 1.070 0.996 1.033 0.052 0.41
4 0.420 0.600 0.510 0.127 1.090 0.920 1.005 0.120 0.51
6 0.420 0.480 0.450 0.042 1.120 1.080 1.100 0.028 0.41
8 0.300 0.320 0.310 0.014 1.050 1.020 1.035 0.021 0.30
12 0.250 0.240 0.245 0.007 0.850 0.730 0.790 0.085 0.31
24 0.150 0.150 0.150 0.000 0.670 0.750 0.710 0.057 0.21
Evaluamos la actividad de pencilina G a nivel IC frente a Staphylococcus aureus

(Figura 145). A pesar de ser un antimicrobiano acción bactericida tiempo dependiente, no se
logró este efecto en el ambiente intracelular, ya que el Log ufc/mL cayó solamente 0.87
veces, evidenciándose recrecimiento del inoculo bacteriano.
CIM
Figura 145. Representación gráfica de los niveles de PenG alcanzados IC en relación a los niveles EC y
su acción sobre S.aureus (Log ufc/mL) en función del tiempo en comparación a la curva control (sin
PenG).
La evolución del Log 10 ufc/mL frente a penicilina G a nivel intracelular en función del
tiempo se presenta en la Tabla 93, donde podemos observar que el índice de actividad
343

a nivel intracelular (Tabla 94). Calculamos el predictor de eficacia para beta lactámicos,
T≥CIM. En este ensayo in vitro durante las 24 h de incubación, las concentraciones
intracelulares se mantuvieron por arriba de la CIM calculada para el pH 5 (fagolisosoma),
pero evidentemente no es suficiente para lograr la erradicación del S. aureus a nivel
intracelular. Este resultado nos deja claro que la acumulación a nivel intracelular no es
predictivo de actividad a nivel intracelular.
Tabla 93. Log ufc/mL en presencia de Pen G -IC (N= 2) versus control sin Pen G (n = 2),
relación IC/EC e índice de actividad antibacteriana para los distintos R IC/EC a los tiempos de
incubación del ensayo.
Tpo (h) Log. ufc/mL ATB Log.ufc/mL control R IC/EC Δ log Tn-T0 Δ log Tn-T0 (Ctr)
0 5.34 5.37
2 4.66 5.67 0.41 Δ log 2h-0h -0.68 0.30
4 4.47 5.80 0.51 Δ log 4h-0h -0.87 0.44
6 4.79 5.95 0.41 Δ log 6h-0h -0.55 0.58
8 5.04 6.10 0.30 Δ log 8h-0h -0.30 0.73
12 5.34 6.45 0.31 Δ log 12h-0h 0.00 1.08
24 5.84 7.74 0.21 Δ log 24h-0h 0.50 2.37
Tabla 94. Análisis no compartimental de las concentraciones IC de penicilina G en función del

tiempo. Predictor de eficacia PK/PD
-1
λ h 0.0431 0.0455 0.0443 0.0016
T½λ h 16.06 15.25 15.65 0.58
T max h 4.00 4.00 4.00 0.00
C max µg/mL 0.42 0.60 0.51 0.13
ABC 0-24h h*µg/mL 6.26 6.84 6.55 0.41
ABC 0-∞ h*µg/mL 9.74 10.14 9.94 0.28
MRT 0-24h h 10.03 9.46 9.74 0.40
MRT 0-∞ h 23.29 21.35 22.32 1.38
T≥CIM % 33.00 33.00 33.00 0.00
344
5.9. DISEÑO DE UN RÉGIMEN DE DOSIFICACIÓN RACIONAL
A partir de los resultados obtenidos en los ensayos previos no es posible diseñar un

régimen de dosificación para el tratamiento de la mastitis subclínica por Staphylococcus
aureus empleando los antimicrobianos seleccionados por pruebas de susceptibilidad in vitro.
Esto significa que ninguno de los antimicrobianos ensayados es capaz de lograr a

nivel celular la concentración y/o el tiempo de contacto adecuado para atacar al
Staphylococcus aureus según pautas farmacocinéticas/farmacodinámicas y en caso de
alcanzar los predictores de eficacia necesarios, su actividad antibacteriana se ve seriamente
afectada.
345
6. DISCUSION
6.1. ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD POR ANTIBIOGRAMA
La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitro se puede determinar por

varios métodos. Nosotros realizamos la técnica estándar de difusión en agar para bacterias
de crecimiento aeróbico, debido a que el objetivo era contar con un procedimiento
adecuado para seleccionar cepas sensibles a tres antimicrobianos elegidos como modelo de
estudio por sus perfiles farmacocinéticos/farmacodinámicos.
El antibiograma es una técnica In vitro relativamente sencilla, donde un

microorganismo es expuesto a un antimicrobiano bajo determinadas condiciones
estandarizadas. El objetivo de esta técnica es categorizar a los microorganismos en sensibles
o resistentes a un determinado antimicrobiano.
Los resultados obtenidos pueden variar de manera considerable dependiendo de las

condiciones experimentales, las que generalmente se encuentran muy alejadas de las
existentes in vivo, en el propio foco infeccioso (Soriano, 2002; Mestorino y Errecalde, 2012).
En una prueba de laboratorio, el microorganismo es colocado en condiciones de crecimiento
óptimo, con el mejor pH, con la temperatura ideal, los nutrientes necesarios, en un medio
apacible para él, como es la placa de Petri (esto a los efectos de obtener un rápido
crecimiento, aunque lo aleje de las condiciones a las que se enfrentará en el organismo).
Comparemos lo que ocurre, por ejemplo, a un estafilococo (motivo de este estudio) en
condiciones de laboratorio, con lo que ocurre con el mismo microorganismo dentro de un
fagolisosoma en un macrófago, donde, luego de ser fagocitado, se encuentra en condiciones
de pH y ataque enzimático que no tienen nada que ver con las anteriores, al punto que su
metabolismo como mecanismo de defensa, baja hasta alzanzar un estado de “sueño
bacteriano” y su reproducción se encuentra inhibida.
Consideremos que una bacteria que está en pleno proceso reproductivo es muy
susceptible a agentes bactericidas como los beta-lactámicos y que una bacteria “dormida”,
definitivamente no lo es a las concentraciones y tiempos de contacto habituales logrados en
346
tratamientos convencionales. Esto pone a las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en
un lugar difícil.
Es evidente, entonces, que una prueba de susceptibilidad por sí misma no es

suficiente, y que estas pruebas deben combinarse con parámetros farmacocinéticos y
farmacodinámicos para, de acuerdo con el estado actual del conocimiento, obtener los
mejores resultados posibles.
No obstante, el antibiograma ofrece, por lo general, una información útil, acumulable

y fácilmente comparable con datos históricos o con los obtenidos en otros laboratorios
(Soriano García, 2010).
La interpretación de los resultados del antibiograma es un poco más compleja que

señalar solamente la sensibilidad de un microorganismo, en parte debido entre otros
factores al incremento de la resistencia bacteriana (Coyle, 2005). De manera tal que se debe
realizar una lectura interpretada de los resultados del antibiograma, la cual está
fundamentada en el conocimiento molecular de los mecanismos de resistencia y en la
interpretación terapéutica de las pruebas de susceptibilidad in vitro (Coyle, 2005).
Los criterios de interpretación utilizados por mucho tiempo han sido establecidos en
base a concentraciones de antimicrobianos determinadas en plasma de seres humanos, por
lo que la veracidad de los resultados al aplicar dichos criterios para la terapia antimicrobiana
de la mastitis bovina, resulta inescrutablemente cuestionable (MacGowan et al., 2001;
Constable y Morin, 2003; Lucas, 2009). En el interior de la glándula mamaria existen distintas
variables que deberían tenerse en cuenta, tales como pH, composición electrolítica,
concentración de grasas, de proteínas y de leucocitos que difieren entre la leche bovina y el
plasma humano (Constable y Morin, 2003). Si bien contamos con documentos armonizados
y validados por la CLSI que dirigen los estándares de los ejercicios de susceptibilidad para
microorganismos aislados de animales, los mismos no contemplan los nichos específicos de
los diferentes patógenos, por tanto los valores arrojados por dichas pruebas deben ser
interpretados a la luz del caso clínico y el abordaje terapéutico, teniendo en cuenta las
características físico químicas y los predictores PK/PD de eficacia establecidos para cada
antibacteriano.
347
El avance de los criterios de interpretación de resultados derivados de pruebas de
susceptibilidad con agentes antimicrobianos de uso en medicina veterinaria ha permitido un
manejo más racional de los mismos (EMEA 2000, Constable y Morin, 2003; Lucas, 2009). El
efecto directo de la información que brindan las pruebas de susceptibilidad correctamente
interpretadas es el punto de partida para la selección criteriosa de un protocolo terapéutico
antimastítico.
En infecciones producidas por Staphylococcus spp., Streptococcus uberis,

Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, y en el caso de mastitis recientes
causadas por S. aureus, los antibiogramas han demostrado ser buenos pronosticadores de
eficacia antimicrobiana, pero aún así, no podemos considerarlos garantía de eficacia cuando
se trata de infecciones crónicas producidas por S. aureus (Owens, 1997; Constable y Morin,
2003; Lucas, 2009).
Actualmente existen métodos estandarizados para la realización de los antibiogramas

disco-placa en medicina veterinaria (CLSI, 2008). Sin embargo, en diferentes ensayos las
técnicas microbiológicas aplicadas no siempre son las mismas (Erskine et al., 2002; Lucas,
2009). Por lo cual la comparación de los patrones de susceptibilidad debe realizarse con
cautela, teniendo en cuenta que los métodos aplicados para la determinación podrían ser
diferentes. Existen otros varios factores de variabilidad, como la metodología de selección
de las vacas, las técnicas utilizadas para la recolección de las muestras, el procedimiento
utilizado para el aislamiento e identificación de los microorganismos y las diferencias entre
las poblaciones bacterianas de diferentes zonas geográficas y momentos históricos (Erskine
et al., 2002). Además, se debe tener en cuenta la importancia del tamaño de la muestra, es
decir la cantidad de vacas y de establecimientos incluidos en la toma de muestras. Por
consiguiente, es comprensible que la comparación de los perfiles de susceptibilidad de
aislamientos realizados a partir de muestras de secreción láctea en nuestro país arroje
resultados dispares (Calvinho et al., 1990; 2002; Gentillini et al., 2000; Lucas, 2009).
Cepas de S. aureus, aisladas de vacas con mastitis en varias regiones de Argentina,

mostraron resistencia frente a eritromicina, estreptomicina, gentamicina, ampicilina-
sulbactam, rifampicina y oxacilina; destacándose casos de multirresistencia (Pellegrino et al.,
2011; Russi, 2008). En Chile se reportó resistencia a penicilina G y a ampicilina mediante la
348
producción de diferentes tipos de beta-lactamasas; sin embargo, hubo sensibilidad frente a
cloxacilina, enrofloxacina y neomicina (Betancourt et al., 2003). Otro estudio previo, también
realizado en Chile, en las regiones Chilenas V y X, informó sobre la existencia de resistencia
frente a amoxicilina, ampicilina, estreptomicina y lincomicina en S. aureus, así como, a
ceftiofur, cloxacilina, enrofloxacina, gentamicina, oxitetraciclina, sulfadiazina-trimetropina,
en otras bacterias (San Martín et al., 2002). Por su parte, en Paraguay los reportes indican
que 77% de los Staphylococcus coagulasa negativos (SCN) son resistentes a la neomicina,
47% a la ampicilina, 41% a la nitrofurantoína y un menor porcentaje a sulfa-trimetropina,
tetraciclina, kanamicina, estreptomicina y gentamicina. En Brasil se halló una alta resistencia
en SCN a penicilina (93.5 %) y a sulfonamidas (88.9 %) (Machado et al., 2008). En los últimos
años se ha incrementado el número de SCN productores de β-lactamasas y resistentes a
meticilina, portadores del gen MecA resistente a todos los grupos de antibióticos β-
lactámicos (Bochniarz et al., 2013). Lo cual complica bastante la situación, ya que los SCN
actúan como reservorios de genes de resistencia para S. aureus (Tulinski et al., 2012).
De lo expresado de manera muy resumida, se pone en evidencia el claro avance de

Staphylococcus aureus resistentes y multirresistentes, como consecuencia, entre otras
causas, del uso indiscriminado de antimicrobianos en explotaciones lácteas en el intento de
combatir a este microorganismo de tan difícil resolución. Por esta razón nos propusimos a
través de una selección de cepas de S. aureus sensibles evaluar algunas de la razones del
porqué de la falla terapéutica en el caso de utilizar el antimicrobiano elegido por pruebas de
laboratorio. Y, fundamentalmente, a partir de la identificación de la problemática sentar las
bases para futuros desarrollos terapéuticos más racionales para el control de la mastitis
bovina subclínica por Staphylococcus aureus.
En nuestro estudio un 33.82% de los aislamientos evaluados presentaron resistencia

a penicilina G, ergo, frente a las penicilinas β- lactamasas sensibles (ampicilina y amoxicilina).
Este porcentaje fue algo menor, comparado con estudios previos realizados en otras zonas
del país, donde los hallazgos de resistencia variaron entre 40% y 77.5% (Calvinho et al., 1990,
Gentillini. et al., 2000, Calvinho et al., 2002). En Uruguay se halló un 47.6% de S. aureus
resistentes, aislados de muestras lácteas obtenidas a partir de casos clínicos y subclínicos de
mastitis bovinas (Gianneechini et al., 2002). En un estudio más reciente, también realizado
349
por Gianneechini et al. (2014), informaron que un 39.1% de aislamientos de S. aureus
obtenidos de casos subclínicos y un 36% de casos clínicos fueron resistentes a la penicilina, y
en Staphylococcus coagulasa negativos el 29.4% y 33.3%, respectivamente. Es decir, hubo
un incremento notable en la resistencia a penicilina. Mientras que en Chile el nivel de
resistencia de S. aureus aislados de mastitis clínicas fue algo menor, 32.43% (San Martín et
al., 1992), en Brasil se reportó 96.99% de Staphylococcus spp resistentes a penicilina, aunque
los aislamientos evaluados no fueron exclusivamente S. aureus, el nivel de resistencia fue
sumamente elevado (Costa et al., 2001). Otros estudios realizados en ese mismo país
arrojaron porcentajes dispares de S. aureus resistentes a penicilina, desde un 2.6% (Menezes
Ferreira et al., 2006) hasta un 76.29% (Andrade et al., 2000).
Con la finalidad de evaluar la resistencia de los aislamientos de S. aureus frente a la

asociación penicilina sensible a las β- lactamasas (amoxicilina) – inhibidor de enzimas β-
lactamasas (ácido clavulánico), utilizamos discos de amoxicilina ácido clavulánico. Si bien las
formulaciones utilizadas en medicina veterinaria suelen estar elaboradas en una proporción
de amoxicilina-ácido clavulánico en relación 4:1, los discos de antibiograma que se
comercializan contienen una combinación antimicrobiana en relación 2:1. Por lo tanto, para
estudiar la susceptibilidad in vitro de amoxicilina-ácido clavulánico se utilizaron discos que
contenían 20 µg de amoxicilina y 10 µg de ácido clavulánico.
El porcentaje de aislamientos sensibles fue de 91.16%, hallándose solo un 8.84% de

cepas resistentes entre todos los aislamientos incluidos en el ensayo. Resultados similares o
ligeramente inferiores a los encontrados por nosotros fueron reportados en estudios previos
realizados en otros países, tales como 3% en Inglaterra (Teagle y David, 1999) y 5.7% en la
República Eslovaca (Vasil et al., 2005).
Como representante de la familia de las fluoroquinolonas, utilizamos discos de

ciprofloxacina. El 2.4% de los aislamientos fueron resistentes, mientras que el 7.3% presentó
susceptibilidad intermedia y el 90.3% fueron sensibles. Este antimicrobiano fue seleccionado
como patrón de comparación con otras fluoroquinolonas tales como enrofloxacina,
norfloxacina y danofloxacina, siguiendo la recomendación del CLSI 2010.
350
Nuestros resultados son coincidentes con los reportados por Gianneechini et al.
(2014) en Uruguay (Sensibles 98.4%, intermedios 1.6%, resistentes 0.0%). En Brasil los
estudios de susceptibilidad de S. aureus aislados de muestras de leche bovina arrojaron
valores similares frente a fluoroquinolonas con un 89.4% de aislamientos sensibles a
enrofloxacina, un 3.4% con sensibilidad intermedia y un 7.2% resistentes (Andrade et al.,
2000). En los Estados Unidos, sin embargo obtuvieron un menor porcentaje de sensibilidad,
80%, (Owens et al., 1997). Si bien, la susceptibilidad de los aislamientos de S. aureus
obtenidos a partir de muestras de leche de vacas mastíticas frente a fluoroquinolonas fue
relativamente alta, es importante tener en cuenta el hallazgo de cepas resistentes. Ya que, el
aumento de la resistencia de cepas aisladas a partir de muestras de origen animal y sus
derivados destinados al consumo humano, es un factor controversial en lo que hace al uso
de las fluoroquinolonas en medicina veterinaria (Sáraközy, 2001).
Agentes antimicrobianos tales como los macrólidos y lincosamidas son utilizados

comúnmente como tratamiento para la infección por estafilococos, dentro de estos grupos
eritromicina, tilmicosina, espiramicina, y clindamicina se utilizan con frecuencia para el
tratamiento de la mastitis bovina (Dingwell et al., 2003; Wang et al., 2008). Como
representante de la familia de los macrólidos, utilizamos azitromicina y eritromicina. En el
caso de azitromicina, se evidenció un alto nivel de susceptibilidad (91.16%) con un bajo nivel
de resistencia (8.84%) entre los aislamientos evaluados. Para el caso de eritromicina, los
resultados fueron muy disímiles a su homóloga, encontrando un menor porcentaje de
susceptibilidad (73.96%), mientras que un 8.4% de las cepas mostraron susceptibilidad
intermedia y un 17.64% fueron resistentes. Normalmente, en los estudios de susceptibilidad
se utiliza como representante de los macrólidos a la eritromicina, sin embargo, cuando se
desea evaluar la susceptibilidad frente a espiramicina, no se la recomienda dado que se ha
comprobado que las proteínas que participan en la interacción macrólido-ribosoma son
diferentes. El sitio de fijación de eritromicina es la proteína L22 y el de espiramicina es la L27
(Giner Almaraz et al., 1995). Además, se debe tener en cuenta que la poca sensibilidad in
vitro frente espiramicina no tiene correlación con la eficacia in vivo pues es posible obtener
buena respuesta terapéutica frente a cepas teóricamente resistentes. Esto es sumamente
importante ya que el antibiograma no reflejaría la probabilidad exacta de su utilización con
351
éxito (Bergoglio, 1993). Mundialmente, se han reportado niveles variables de resistencia
frente a eritromicina, en nuestro país, en un estudio realizado sobre un total de 206
aislamientos de S. aureus de muestras lácteas de vacas con mastitis clínica y subclínica, se
halló un 11.6% de aislamientos resistentes a la eritromicina (utilizando discos de 15 µg)
(Gentillini et al., 2000). En otros países los niveles de resistencia frente a eritromicina van
desde el 13% en Brasil (Menezes Ferreira et al., 2006), 3% en Uruguay (Gianneechini et al.,
2000) y 1.9% en la República Eslovaca (Vasil´ et al., 2002). En Uruguay se mantienen los
niveles los niveles de sensibilidad después de 14 años, ya que Gianneechini et al. (2014)
volvieron a encontrar un alto porcentaje de aislamientos sensibles a eritromicina (89.5%)
con un 7.9% de intermedios y un bajo nivel de resistencia (2.6%). En otros países, como por
ej China, no ocurrió lo mismo, pues se reportaron altos niveles de resistencia a diferentes
miembros de los macrólidos y lincosamidas, como eritromicina, azitromicina, lincomicina,
espiramicina, tilosina, clindamicina y tilmicosina (93.1%; 93.1%; 45.8%; 41.7%; 40.3%; 36.1%
y 27.8%, respectivamente) (Wang et al., 2008).
Los resultados de la prueba de susceptibilidad a tetraciclina, presentaron niveles de

resistencia bastante bajos, siendo de 3.4%, con un 96.6% de los aislamientos susceptibles.
Existe una gran variedad de trabajos que incluyen el estudio de susceptibilidad de S. aureus
frente a tetraciclina con resultados variables. En Estados Unidos se reportó un 100% de
aislamientos sensibles, mientras que en la República Eslovaca se halló un 4.3% de
aislamientos resistentes (Vasil´ et al., 2002), siendo similar al hallado en Inglaterra (5%). En
Uruguay y en Polonia los porcentajes de S. aureus resistentes aislados de mastitis bovina
fueron algo superiores, alcanzando el 13.4 % (Gianneechini et al., 2002) y el 26% (Malinowski
et al., 2002) respectivamente. En Uruguay se vislumbra un mejor manejo de los
antimicrobianos utilizados en bovinos de leche, pues los niveles de resistencia a tetraciclinas
han bajado a 3.2% en los últimos años (Gianneechini et al., 2014).
En el caso de la gentamicina, como representante de la familia de los

aminoglucósidos, obtuvimos resultados de alta sensibilidad al antimicrobiano (99.32%).
En general, los antimicrobianos evaluados mostraron buena actividad in vitro frente a

los S. aureus aislados de mastitis subclínica bovina. En este estudio se incluyeron
aislamientos obtenidos de dos establecimientos ubicados en la Provincia de Buenos Aires.
352
Uno de la cuenca lechera Mar y Sierras (A) y el otro de la cuenca Abasto de la Provincia de
Buenos Aires (B).
Los hallazgos reflejan una situación específica, limitada a un sitio geográfico

particular y a un momento puntual. El establecimiento A trabajaba desde tiempo atrás con
protocolos de terapia antibacteriana de mastitis clínica en lactancia y terapia de secado fijos.
El antimicrobiano utilizado en todos los casos era cloxacilina, en una formulación de
administración IMM en lactancia o en secado. No se realizaban cultivos bacteriológicos de
rutina ni antibiogramas para evaluar la susceptibilidad de las cepas de campo.
El establecimiento B utilizaba al momento del muestreo una terapia antimicrobiana

similar al establecimiento A, aunque realizaban cambios periódicos en los productos
antimastíticos. Sin embargo, tampoco se realizaban cultivos bacteriológicos ni antibiogramas
para la selección de los antibióticos a utilizar.
El estudio de susceptibilidad realizado en el marco de esta Tesis Doctoral no

pretendió analizar epidemiológicamente la situación actual en Argentina, sólo fue un
instrumento utilizado para seleccionar cepas sensibles a tres antimicrobianos elegidos como
modelo de estudio por sus perfiles farmacocinéticos/farmacodinámicos.
De manera que a partir de este ensayo seleccionamos como referentes de cada uno
de los tres grupos de antimicrobianos según sus perfiles PK/PD a azitromicina, danofloxacina
y penicilinaG.
353
6.2. DETERMINACION DE LAS CONCENTRACIONES MINIMAS INHIBITORIAS
6.2.1 Azitromicina
Azitromicina es un antimicrobiano macrólido de 15 miembros perteneciente a una

subfamilia de compuestos semisintéticos denominados azálidos. Los azálidos fueron
obtenidos a partir de la eritromicina por adición de un átomo de nitrógeno endocíclico en
posición 9 (Mulazimoglu et al., 2005). In vitro es levemente menos activa que eritromicina
contra microorganismos Grampositivos, aunque esto es de dudosa significancia clínica ya
que azitromicina alcanza concentraciones tisulares e intracelulares mayores. Es activa contra
aislamientos de S. aureus, incluso productores de β-lactamasas, aunque menos que
claritromicina y roxitromicina, también es activa frente a Staphylococcus epidermidis y otros
Staphylococcus coagulasa negativos. Sin embargo contra especies de Staphylococcus
resistentes a macrólidos, azitromicina también es inactiva (Wang et al., 2008; Lucas, 2009;
Turic, 2010). Los azálidos en general son más activos contra patógenos Gramnegativos y
también son resistentes a la acción de sus enzimas β- lactamasas (Van Bambeke, 2014).
Los macrólidos son agentes bacteriostáticos, aunque en determinados casos pueden

tener acción bactericida. Se unen en forma reversible al sitio P (peptídico), que se encuentra
cerca del dominio V del componente 23S de la subunidad 50S (Lucas, 2009; Turic, 2010; Van
Bambeke, 2014) y del centro que contiene a la enzima peptidil-transferasa en el ribosoma
bacteriano. Actúan inhibiendo la translocación durante la síntesis proteica bacteriana (Lucas,
2009; Turic, 2010; Van Bambeke, 2014).
En cuanto a su comportamiento farmacocinético, se caracteriza por una rápida y

extensiva captación desde la circulación hacia compartimientos intracelulares, seguida de
una lenta fase de eliminación (Lucas, 2009; Turic, 2010), se distribuye ampliamente por todo
el organismo, alcanzando altas concentraciones en pulmón, tonsilas, próstata, hígado,
linfonódulos, fluidos tisulares y en diferentes tipos de células (Turic, 2010). Los reportes
sobre su volumen de distribución arrojan valores del orden de los 23 a 30 L/kg, aunque las
concentraciones en grasa y músculo son relativamente bajas (Lucas, 2009; Turic, 2010; Van
354
Bambeke, 2014). La fijación a proteínas plasmáticas es del 50% cuando la concentración
plasmática es 0.002 – 0.05 µg/mL y se reduce al 7 % cuando la concentración es 1 µg/mL. Los
porcentajes de fijación a proteínas plasmáticas de otros macrólidos, como eritromicina o
roxitromicina, son más altos, por lo que comparativamente hay mayor cantidad de
azitromicina libre y disponible para su distribución hacia los sitios de infección (Lucas, 2009;
Turic, 2010; Van Bambeke, 2014).
Desde el punto de vista farmacodinámico, los macrólidos se caracterizan por no

pertenecer a una sola categoría (Andes y Craig, 1998). Se considera que su actividad
bacteriológica es tiempo-dependiente y que el éxito terapéutico está estrechamente ligado
al parámetro T>CIM (Andes y Craig, 1998; Jacobs, 2004; Van Bambeke, 2014). Sin embargo,
azitromicina tiene un perfil PK/PD particular y a diferencia de los macrólidos tradicionales,
posee un marcado PAE in vivo (Andes y Craig, 1998). Estudios experimentales han
demostrado que para alcanzar la eficacia clínica de azitromicina, se debe tener en cuenta
tanto el T>CIM como el ABC 0-24h /CIM (Andes y Craig, 1998; Novelli et al., 2002; Ambrose et
al., 2004; Van Bambeke, 2014). Incluso, algunos autores han postulado que, azitromicina,
tiene una actividad bacteriológica concentración-dependiente y que el parámetro C máx /CIM
es el que mejor predice su comportamiento (Mazzei y Novelli, 1999).
Las propiedades mencionadas permiten suponer que azitromicina puede ser una
alternativa viable e interesante para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por
bacterias Grampositivas aeróbicas con capacidad de sobrevivir en el interior de los
fagolisosomas.
Cuando realizamos la determinación de la concentración inhibitoria mínima,

azitromicina se comportó de manera diferente frente a S. aureus a medida que acidificamos
el pH del medio de cultivo; se observó una sustancial pérdida de potencia, lo cual se hizo
evidente por el aumento de hasta 8 veces su CIM a pH 6.5 y de más de 64 veces su CIM a pH
5.0 en comparación a cuando las mismas cepas fueron analizadas al pH fisiológico de 7.4; lo
cual concuerda con lo reportado por (Fuchs et al., 1997).
355
Modificamos el pH del medio de cultivo con el fin de emular las condiciones
subcelulares a las cuales se encuentra asociado el S. aureus de vida intracelular, asumiendo
que el cambio de pH, pudiera ser un factor limitante en la acción del antimicrobiano.
La comparación estadística aplicada a estos resultados determinó que existen

diferencias significativas entre las CIMs obtenidas a pH 5 vs pH 7.4 y pH 5 vs pH 6.5, de la
misma forma que las hubo entre el pH 6.5 y 7.4 con una (P = < 0.001), lo cual prueba que las
variaciones en el efecto antibacteriano de azitromicina, reflejado en los cambios del valor de
la CIM en efecto son producto del cambio de pH del medio y no producto del azar.
Practicamente no existen estudios de susceptibilidad de S. aureus aislados de mastitis

bovina a azitromicina, ya que no es un antimicrobiano aprobado para su indicación en
bovinos de leche. Sin embargo Wang et al. (2008) reportaron altos niveles de resistencia a
macrólidos, incluida la azitromicina en aislamientos de S. aureus obtenidos de vacas
portadoras de mastitis subclínica en China, con una CIM 50 y CIM 90 ≥ 128 µg/mL.
Por otro lado, Ferrara et al., en 1996 en un estudio encaminado a comparar la

actividad antibacteriana de azitromicina, claritromicina y roxitromicina frente a varios
patógenos de las vías respiratorias, donde se incluía S. aureus, reportaron que azitromicina
fue mucho menos activa frente a S. aureus que frente a patógenos como Haemophilus
influenzae y Moraxella catarrhalis, presentándose una relación entre la CIM y la CMB mayor
a 16. La CIM determinada de azitromicina fue 3.1 µg/mL, siendo de 4 a 8 veces mayor que la
CIM de claritromicina determinada frente al mismo patógeno.
En 2003, Seral et al, en un análisis de la actividad antibacteriana intracelular de 5

tipos de antibacterianos, incluida azitromicina, frente a S. aureus, encontraron valores de
CIM de azitromicina en caldo a pH 7.3 de 0.5 µg/mL y una CMB de 8 µg/mL, lo cual
concuerda con lo reportado por Ferrata et al., 1996 y por nosotros. De la misma forma la
CIM de azitromicina reportada por Seral et al. (2003), a pH 6 fue de 32 µg/mL y a pH 5 fue
512 µg/mL, coincidiendo con lo hallado en nuestro estudio. Claramente los macrólidos y en
particular azitromicina, pierden potencia antibacteriana en medios ácidos.
En otras especies también encontramos reportes de la susceptibilidad de S. aureus a

azitromicina, así, Poiata y Tuchilis en un estudio publicado en Italia en 2010, reportaron una
356
CIM 90 para azitromicina de 8 µg/mL frente a cepas de S. aureus aisladas del tracto
respiratorio superior de pacientes humanos sanos. En otro estudio de similares
características, publicado en 2009 por Dubois y Fernandez en Canadá, reportaron una CIM 90
≥ a 32 para azitromicina frente también a cepas de S. aureus aisladas del tracto respiratorio
superior en la misma especie.
En potros se ha determinado la CIM 90 de azitromicina, frente a Rhodococcus equi,

patógeno intracelular facultativo Gram-positivo, con características similares a S. aureus,
encontrando una CIM 90 < 1.5 μg/ml, hallazgo similar a lo reportado por nosotros en cepas
de S. aureus (Ribeiro et al., 2006).
A modo informativo es interesante conocer cuales son las CIMs de otros macrólidos
utilizados habitualmente frente a S. aureus aislados de mastitis bovinas a pH 7.4.
En un trabajo realizado en 11 países (Alemania, Dinamarca, Estados Unidos,

Finlandia, Inglaterra, Irlanda, Islandia, Noruega, Suecia, Suiza, y Zimbabwe) sobre
susceptibilidad de S. aureus a eritromicina, se demostró que en la mayoría de ellos, la CIM 90
de eritromicina frente a S. aureus aislados de mastitis bovinas fue 0.5 µg/mL, excepto en
Irlanda, Suiza y Estados Unidos, donde fue 1 µg/mL, al igual que en nuestro ensayo frente a
azitromicina (De Oliveira et al., 2000). Cabe destacar que en ese mismo estudio y en la
mayoría de los países, la CIM 50 también fue 0.5 µg/mL, excepto en Dinamarca que fue 0.25
µg/mL.
En un estudio llevado a cabo en Argentina, la CIM 90 reportada para eritromicina

alcanzó los 0.75 µg/mL (Gentillini et al., 2000). De manera similar, en Japón se reportó que la
CIM 50 determinada para eritromicina fue 0.39 µg/mL y la CIM 90 0.78 µg/mL (Yoshimura et
al., 2002). Estos datos nos permiten apreciar el rango de concentraciones en el cual pueden
hallarse las CIMs de otros macrólidos. Se observó que, en general, eritromicina y
azitromicina tienen valores de CIM similares. Cabe resaltar que los resultados arrojados por
nuestro trabajo, son coincidentes con los valores de referencia aportados por la CLSI (2010),
los cuales fueron de 0.5 a 2µg/mL para azitromicina frente a S. aureus.
357
6.2.2. Danofloxacina
Danofloxacina es un antibacteriano perteneciente a la familia de las

fluoroquinolonas, el cual posee una rápida actividad bactericida, contra una amplia gama de
patógenos responsables de enfermedades de importancia económica en la cría comercial de
ganado (Sarazola et al., 2002; Mestorino et al., 2009, Mestorino y Errecalde, 2012). Desde su
introducción a finales de 1980, las fluoroquinolonas han demostrado presentar actividad
antibacteriana dependiente de la concentración, por lo que el efecto óptimo se consigue
mediante la administración de dosis altas durante un período corto (Sarazola et al., 2002;
Mestorino et al., 2009, Mestorino y Errecalde, 2012).
El desarrollo que tuvieron las quinolonas en la década del ochenta con la

introducción de un átomo de flúor en el núcleo básico de la molécula, en posición C6 y un
sustituyente piperazínico o pirrolidínico en posición C7, dieron paso a las fluoroquinolonas,
como la norfloxacina (la primera fluoroquinolona aprobada para uso clínico) y la
danofloxacina, las cuales mostraron un aumento en su actividad antibacteriana contra
bacterias Gramnegativas y Grampositivas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa y
Estafilococos (Martínez et al., 2006), al igual que contra patógenos de vida intracelular
(Lecoeur Bitchatchi y Kolf Clauw, 1998) y frente a algunos micoplasmas (Vancutsem et al.,
1990; Brown, 1996).
De la misma forma en que fue mejorada su acción antibacteriana, las características

farmacocinéticas de las nuevas fluoroquinolonas también mejoraron, obteniéndose un
aumento en la tasa de absorción oral y distribución tisular con estas nuevas moléculas (Ball,
2000). La primera fluoroquinolona que fue aprobada para uso en Medicina Veterinaria fue
enrofloxacina, en la década de 1980 (Martínez et al., 2006).
Las quinolonas actúan en el interior de la bacteria, penetrando a través del canal

acuoso de las porinas. Son los únicos agentes antibacterianos que ejercen su actividad
bactericida uniéndose a topoisomerasas bacterianas e inhibiéndolas; aunque éste no sería el
único mecanismo de acción (Lecoeur Bitchatchi y Kolf Clauw, 1998). Las topoisomerasas son
enzimas que controlan el superenrollamiento y desenrollamiento del ADN bacteriano. El
358
superenrollamiento permite a la larga molécula de ADN empaquetarse dentro de la célula
bacteriana. Esta estructura debe ser desenrollada para permitir diferentes funciones como
replicación, transcripción y reparación del ADN. La inhibición de la actividad de estas
enzimas impide a la célula bacteriana producir las proteínas necesarias para su reparación,
crecimiento y reproducción. Una inhibición prolongada conduciría así a la muerte de la
célula (Hooper, 1998; Otero et al., 2001 a y b).
Existen 4 tipos de topoisomerasas. Las quinolonas actuarían a nivel de ADN-girasa

(también llamada topoisomerasa tipo II) y de la topoisomerasa tipo IV. No actúan a nivel de
las topoisomerasas I y III, la compleja interacción con las topoisomerasas, es la base del
diferente espectro antibacteriano de las quinolonas y también de la selección de cepas
resistentes. La actividad de las quinolonas contra las bacterias Grampositivas se debe a su
acción "blanco" en las topoisomerasas IV, en cambio la actividad contra las bacterias
Gramnegativas es por su acción "blanco" en las topoisomerasa II o ADN-girasa (Otero et al.,
2001 a y b; Guthrie y col, 2004).
En general, las fluoroquinolonas se caracterizan por presentar altos volúmenes de

distribución y excelente biodisponibilidad (Kaartinen et al., 1995, McKellar et al,. 1999; Otero
et al., 2001 a y b; Mestorino et al., 2009, Mestorino y Errecalde, 2012). En el ganado vacuno,
danoflaxacina tiene un volumen relativamente grande de distribución en estado estacionario
(2.5 litros / kg) y es 100 % biodisponible cuando se administra por vía intramuscular
(Sarasola et al., 2002).
En un estudio realizado sobre 21 vacas en producción lechera, publicado en 2009,

Mestorino et al, reportaron que tras la administración por la vía subcutánea de una sola
dosis de mesilato de danofloxacina al 18% a razón de 6 mg/kg, la absorción de esta fue
bastante rápida, encontrándose en plasma una concentración de 0.53 ± 0.13 µg/mL (C max ) a
las 2.17 ± 0.98 (T max ) horas de su administración; de la misma forma se evidenció que este
fármaco presenta un perfil lento de eliminación, con una semivida de eliminación promedio
(T½ß) de 12.53 ± 1.47 horas.
Las concentaciones en leche, reportadas en el mismo estudio, sugieren una rápida

penetración desde el plasma a la leche, alcanzando concentraciones superiores con respecto
359
a las medidas en plasma, con valores de C max de 1.37 ± 0.7 µg/mL a las 8.67 ± 2.07 (T max )
horas tras la administración del fármaco (R C maxL /C maxPl de 2.68), y una semivida de
penetración del plasma a la leche de 2.27 ± 0.48 horas.
Lo interesante, fue la elevada biodisponibilidad láctea alcanzada (F L = 1.62), ya que el

ABC en leche fue de 15.46 ± 5.42 µg.mL/h, mientras que en plasma fue de 9.69 ± 1.41
µg.mL/h. Si consideramos la CIM obtenida para danofloxacina en nuestro estudio (0.5 – 1
µg/mL), los resultados anteriores arrojarían una R C max /CIM de 2.74-1.37 y una R ABC/CIM
de 30.92 – 15.46 h. Es decir, a la dosis recomendada (6 mg/kg), al menos en el
compartimento blanco no se alcanzarían los valores de corte establecidos para los
predictores de eficacia considerados para erradicar al S. aureus de la glándula mamaria. Sin
embargo, dadas las características mencionadas para danofloxacina, decidimos continuar
con el estudio a los fines de evaluar su comportamiento a nivel intracelular.
Sarasola et al en 2002, informó que tras la administración de un bolo intravenoso de

danofloxacina en terneros, se alcanzó una alta relación C max /CIM frente a Pasteurella
haemolytica a los 15 minutos, siendo esta de 14.5 con una relativamente corta T≥CIM de 9.1
horas. En contraste, cuando danofloxacina, fue administrada en infusión continua, durante
un periodo de 36 horas, solo se logró una relación C max /CIM de 2.3, manteniéndose las
concentraciones plasmáticas por encima de la CIM durante un período prolongado, lo que
resultó en una T> CIM de 33.3 h.
En el mismo estudio, los valores del predictor ABC/CIM tanto para la infusión
constante, como para la administración de un único bolo, fueron uniformes y se
mantuvieron en el rango de 43 y 49.1 h respectivamente.
La CIM determinada en nuestro estudio a pH 7.4 para danofloxacina frente a S.

aureus, fue coincidente con la hallada anteriormente por Lucas en el año 2008 (1 µg/mL).
En un estudio realizado en Brasil por Cruz, et al., (1998), donde evaluaron la actividad
in vitro frente a cepas de S. aureus obtenidas de cuartos mamarios de vacas portadoras de
mastitis encontraron una CIM 90 para danofloxacina de 0.20 µg/mL y una CMB de 0.40
µg/mL, donde se aprecia una relación CIM – CMB de 1:2, lo cual corrobora la acción
bactericida de danofloxacina.
360
En otro estudio realizado en Colombia por Ruiz, et al. (2001) se evaluó la sensibilidad
a un grupo de antibacterianos de 37 cepas de microorganismos aislados de glándulas
mamarias bovinas durante el año 1999. Las bacterias correspondían en un 64.9% a
Streptococcus agalactiae, un 18.9% a S.aureus y un 16.2% a Staphylococcus coagulasa
negativo. Dentro de los antibacterianos ensayados, utilizaron ciprofloxacina, la cual presentó
una CIM para S. aureus de 0.5 µg/mL por el método de microdilucion.
Diversos autores han reportado CIM 90 de marbofloxacina frente a S. aureus, Shem-

Tov et al. (1997) reportaron valores de 0.3 µg/mL, Schneider et al. (2004) de 0.22 µg/mL,
Gániere et al. (2004) 0.25 – 0.5 µg/mL y Meunier et al. en un estudio publicado en 2004
sobre cepas colectadas en 8 países europeos, reportaron que entre 1994 y 2001, la CIM 90 de
marbofloxacina frente a este patógeno osciló entre 0.12 y 1 µg/ml. De lo expuesto, se
desprende que marobofloxacina es ligeramente más potente que danofloxacina frente a S.
aureus.
Para la clínica veterinaria práctica, datos de susceptibilidad recientes para los

patógenos comunes, reportados a nivel regional, son de gran valor en la selección de
agentes antimicrobianos específicos (Pengov y Ceru, 2003), de manera que los datos
aportados por el presente estudio pueden considerarse de relevancia.
Diversos autores han reportado muy buena actividad in vitro de distintas

fluoroquinolonas frente a cepas de S. aureus aisladas de glándulas mamarias mastíticas en
bovinos. Es así como Cruz et al., en 1998 en Brasil, reportaron para danofloxacina valores de
CIM 90 de 0.18 µg/mL, en otro estudio realizado también en Brasil, publicado en el año 2000
por De Oliveira et al., reportaron para enrofloxacina niveles de CIM 90 de 0.06 a 0.31 µg/mL,
y para ciprofloxacina se menciona un rango de CIM 90 de 0.12 a 0.5 µg/mL.
En nuestros resultados podemos observar que la CIM 90 de danofloxacina a pH 5.0 fue

2µg/mL, el doble de la CIM determinada para los pH 7.4 y 6.5, sin embargo considerando su
buena penetrabilidad y capacidad de acumulación a nivel subcelular, decidimos continuar el
estudio a los fines de evaluar su actividad a nivel subcelular.
La relación entre la farmacocinética y actividad antimicrobiana (farmacodinamia)

debe ser considerada para determinar dosis e intervalo posológico, a los fines de maximizar
361
la eficacia antibacteriana. Desde esta perspectiva, las fluoroquinolonas han sido asociadas
con una actividad bactercida concentración-dependiente (Zhanel, 2001).
Los parámetros predictores de eficacia relacionados con dicha actividad incluyen la

relación del área bajo la curva concentración en función del tiempo (ABC) frente a la CIM
calculada para el patógeno aislado, ABC/CIM, y la relación entre la concentración máxima
(C max ) y la CIM, o Cmax/CIM. Ambos parámetros están estrechamente relacionados, y son
importantes para asegurar eficacia antimicrobiana (Martínez et al., 2006).
Es sabido que para este tipo de antimicrobianos con actividad concentración-

dependiente, es necesario alcanzar adecuados niveles en el sitio de infección, los cuales
deben destruir la población bacteriana existente o, al menos, reducir significativamente el
número de microorganismos, de tal manera que los mecanismos de defensa del hospedador
puedan encargarse de controlar o eliminar los patógenos remanentes (Martínez et al.,
2006).
Debido a las propiedades PK/PD, así como a su mecanismo de acción, nos permite
suponer que danofloxacina puede ser una alternativa viable e interesante para el
tratamiento de infecciones bacterianas causadas por bacterias Grampositivas aeróbicas con
capacidad de sobrevivir en el interior de los fagolisosomas tal como es el caso del S. aureus.
Al igual que en azitromicina, analizamos estadísticamente las CIMs obtenidas a

diferentes pHs mediante el test de Bonferroni, el cual nos arrojó diferencias
estadísticamente significativas entre las CIMs obtenidas a pH 5 vs pH 7.4, pero no entre CIMs
obtenidas a pH 5 vs pH 6.5 ni a pH 6.5 vs pH 7.4. Es decir, la pérdida de susceptibilidad del S.
aureus a danofloxacina a pH 5.0 vs pH 7.4, obedece definitivamente a una consecuencia
producida por el cambio de pH y no al azar. Lo hallado se opone a lo propuesto por Brown
en 1996, quien manifiestó, que el pH ácido del medio, no produce cambios en la actividad
antibacteriana de las fluoroquinolonas frente a patógenos Grampositivos, pero concuerda
con la apreciación de Wetzstein y De Jong (1996), quienes demostraron que en pH
ligeramente ácido (característico de tejidos inflamados, abscesos o fagocitos) se reduce la
tasa de muerte de algunas bacterias en presencia de enrofloxacina (Otero et al., 2001 a y b).
362
6.2.3. Penicilina G
Las penicilinas, son un grupo de antimicrobianos de origen natural, semisintético y

sintético, que contienen un núcleo de ácido 6-aminopenicilánico, consistente en un anillo
beta-lactámico unido a un anillo tiazolidínico. Los compuestos de origen natural son
producidos por diferentes especies de Penicillum spp. Las penicilinas difieren unas de otras
por sustituciones en la posición 6 del anillo, donde pequeños cambios en la cadena lateral
pueden inducir modificaciones en la actividad antibacteriana y en las propiedades
farmacocinéticas (Mandell y Petri, 2001).
De acuerdo a su origen y espectro de acción pueden clasificarse en: penicilinas

naturales y semisintéticas (G y V, respectivamente), penicilinas resistentes a las penicilinasas
estafilocócicas (oxacilina, meticilina, cloxacilina, dicloxacilina), aminopenicilinas (ampicilina,
amoxicilina), carboxipenicilinas (carbenicilina, ticarcilina), ureidopenicilinas (piperacilina). El
espectro antimicrobiano de la penicilina G abarca cocos Grampositivos, cocos
Gramnegativos (Neisseria meningitidis) y bacilos Grampositivos, tanto facultativos como
anaerobios, así como espiroquetas y algunos bacilos Gramnegativos anaerobios (Taponen et
al., 2003).
El efecto que ejercen las penicilinas es básicamente bactericida, sin embargo a bajas
concentraciones pueden actuar como bacteriostáticas. Con respecto a su mecanismo de
acción, en términos generales se puede afirmar que las penicilinas interfieren con etapas
enzimáticas, especialmente reacciones de transpeptidación que alteran la síntesis de los
compuestos necesarios para la formación de la pared microbiana. Debido a que el efecto
bactericida de las penicilinas se ejerce sobre sustancias químicas propias de los
microorganismos (ácido N acetilmurámico que no son constituyentes de las células de los
mamíferos superiores), se le atribuye a estas moléculas un amplio margen de seguridad
terapéutica. Las penicilinas al interferir con la 'construcción' de esta muralla facilitan la lisis
del microorganismo, este hecho ha sido comprobado en numerosos géneros de gérmenes
Grampositivos y en algunos Gramnegativos (Gomez, 2013).
363
Las penicilinas son ácidos orgánicos en general disponibles como sal sódica o potásica
del ácido libre. Con la excepción de las isoxazolilpenicilinas (cloxacilina, oxacilina,
dicloxacilina) y penicilina V, la hidrólisis ácida limita la disponibilidad sistémica de la mayoría
de las penicilinas de las preparaciones orales. Las penicilinas (pKa 2.7) básicamente están
ionizadas en plasma, tienen volúmenes de distribución aparentes relativamente pequeños
(0.2 a 0.3 L / kg) y semividas de eliminación cortas (0.5 -1.2 horas) en todas las especies de
animales domésticos (Bhavsar y Thaker, 2012).
Después de la absorción, tienen amplia distribución en los líquidos extracelulares,

pero apenas atraviesan membranas biológicas por estar ionizadas y por su escasa
liposolubilidad. La entrada a través de las barreras hematoencefálica, placentaria, mamaria o
prostática, solo se ve favorecida en procesos inflamatorios, de modo que las
concentraciones inhibitorias pueden ser alcanzadas en tales situaciones.
Las penicilinas son eliminadas casi por completo por los riñones (por filtración
glomerular y secreción tubular activa), lo cual ocasiona niveles muy altos en orina; la
nafcilina es una excepción, porque se excreta principalmente por bilis (Bhavsar y Thaker
2012).
La vía mamaria es también una ruta de eliminación de las penicilinas, encontrándose

en pequeñas cantidades en la leche, las que pueden persistir durante 90 horas, dependiendo
de la formulación administrada y del estado de la ubre. De la misma forma, se han detectado
residuos de penicilina en leche después de la infusión intrauterina (Sarvaiya et al., 2006).
En términos generales, todos los betalactámicos poseen características semejantes;

luego de su administración parenteral, ya sea por vía intramuscular o subcutánea, se
absorben en forma completa muy rápidamente; debido a su hidrosolubilidad, se distribuyen
principalmente por el líquido extracelular, donde alcanzan concentraciones terapéuticas, si
bien su ingreso al interior celular no es un proceso complejo, si lo es su acumulación, ya que
es expulsado rápidamente del interior celular. Lo cual es lógico, dado que el interior celular
es un pH más bajo que el del fluido extracelular, por lo cual no se establece secuestro de
moléculas ácidas como lo es la penicilina.
364
La eficacia antibacteriana óptima de los β-láctamicos depende del tiempo por el cual
las concentraciones se mantienen por encima de la CIM de los microorganismos patógenos y
no de las concentraciones alcanzadas (Vogelman. 1988, Craig 1998, Carrillo et al., 2013).
Desde principios de los años 70s, tenemos las primeras descripciones del efecto del
pH, sobre el aumento de la sensibilidad de varios microorganismos a la penicilinaG (Sabath
et al., 1972). En el presente estudio, evaluamos ese efecto, por lo cual obtuvimos las CIMs de
penicilina G frente a S. aureus a pH 7.4, 6.5 y 5.0; las fueron: 0.25, 0.125 y 0.066 µg/mL,
respectivamente. Observamos una marcada reducción de la concentración inhibitoria
minima de PenicilinaG a pH 5.0, que al analizar estadísticamente arrojó una diferencia
altamente significativa (P = < 0.001). Estas diferencias estadísticamente significativas entre
las medias de las CIMs obtenidas a diferentes pHs, nos permiten suponer un
restablecimento de la susceptibilidad del S. aureus a penicilina G en medio ácido.
La restauración de la susceptibilidad a las penicilinas del S. aureus en medio ácido, ya

se había descrito con anterioridad, pero en ese momento no se consideró de importancia
clínica. De hecho, vieron este efecto de una manera reproducible sólo a valores de pH
inferiores a 5.5 (mediante el uso de métodos de dilución en agar) y no fueron conscientes de
que este grado de acidez, se presenta con frecuencia en focos infectados y más aún en
estructuras intracelulares a las cuales se encuentran normalmente asociados los patógenos
(Sandrine et al., 2007).
En el presente estudio confirmamos esta observación original y entendemos que este
hecho tiene en sí un significado terapéutico mucho más amplio, mostrando que, la
restauración de la susceptibilidad de patógenos en principio resistentes se puede obtener de
manera reproducible a un pH de 5.5 o inferior cuando los ensayos se realizan en caldos con
pH ajustado y que las estructuras intracelulares en las que S. aureus sobrevive y prospera en
los macrófagos, representan focos de infección con un grado de acidez suficiente para
causar una restauración de la actividad.
Doce años después de su descubrimiento, la restauración de la susceptibilidad de

MRSA en pH ácido frente a β-lactámicos fue atribuida a la ausencia de expresión de PBP 2ª
(Hartman y Tomasz, 1984), esta presunción se basaba en su falta de detección con
bencilpenicilina marcada con 3H, incluso a altas concentraciones (Hartman y Tomasz, 1984).
365
En un estudio publicado por Sandrine et al., en 2007, demostraron que el crecimiento
de bacterias a un pH de 5.5 en lugar de pH 7.4, no altera el nivel de expresión del gen que
codifica a PBP 2a (mecA), o de sus genes reguladores cuando la expresión es examinada por
RT -PCR (un resultado similar fue obtenido para la cepa de MRSA COL mediante el uso de
análisis de microarrays) y no modifica el contenido bacteriano en PBP 2a inmunodetectable.
La observación de Hartman y Tomasz debe, por lo tanto ser reinterpretada, puesto

que no se indica realmente la ausencia de PBP 2a, pero si, la incapacidad de PBP 2a de ligar
la penicilina cuando se expresa en las bacterias que crecen en un pH ácido (Sandrine et al.,
2007).
Una interpretación tentativa de estos datos puede ser, que el pH ácido hace a la PBP
2a incapaz de unirse a β-lactámicos, pero mejora la unión de la penicilina a otros objetivos
(que explica la disminución de la CIM para MSSA a pH ácido) y que también hace a la PBP 2a
incapaz de compensar la inactivación de la otra PBP, resultando en las susceptibilidades
similares de MRSA a β-lactámicos.
Por lo tanto, la PBP 2a expuesta a pH ácido puede ser en realidad una enzima
inactiva; a pH 7.4, PBP 2a muestra ya muy débil unión y una baja tasa de acilación cuando se
expone a la oxacilina pero mantiene eficiente actividad de síntesis de peptidoglicano.
Algunos cambios conformacionales sustanciales en la PBP 2a se presentan, pero sin
embargo, para que estas reacciones se produzcan, se requiere del pH ácido (Fuda et al.,
2004).
La expresión completa de resistencia a la meticilina requiere que la función de

transglicosilasa de la PBP 2 se mantenga, junto con la función de transpeptidasa de la PBP 2a
y la capacidad de la PBP 2a para localizar correctamente los otros componentes necesarios
para la síntesis de la pared celular, incluyendo PBP 2, en el sitio de división de S. aureus
(Pinho y Errington, 2005).
Teniendo en cuenta lo anterior, es posible que el pH ácido impida que la PBP 2

funcione en conjunción con PBP 2a y/o perturbe su reclutamiento. Estas hipótesis no
mutuamente excluyentes ahora pueden necesitar ser examinadas por el uso de métodos
bioquímicos y morfológicos adecuados (Sandrine et al., 2007).
366
Nuestras observaciones pueden inducir el diseño y ejecución de más estudios in vitro
y aún in vivo, para promover el interés terapéutico de incluir β-lactámicos en el tratamiento
de infecciones por SARM y/o en situaciones en las cuales la ubicación en organelas
intracelulares desempeñe un papel importante en la persistencia intracelular de S. aureus,
causando recaídas y recidivas. Aunque no es seguro que intracelularmente el S. aureus
siempre esté ubicado dentro de fagolisosomas ácidos, la restauración de la susceptibilidad
de MRSA a β-lactámicos también podrían tener lugar en otros entornos, tal como la
superficie de la piel (Dikstein y Zlotogorski, 1994), la vagina, o las vías urinarias, que son los
hábitats donde el pH puede llegar a un valor suficientemente bajo.
En general, podemos afirmar que el medio ácido tiene una incidencia directa sobre el
comportamiento de los ATBs probados, en casos como azitromicina y danofloxacina, este
efecto es negativo, incidiendo de manera directa en la acción antibacteriana, en contraste
pudimos observar que penicilina G, tuvo un importante aumento en su capacidad
antibateriana a pH ácido.
6.3 CURVAS DE LETALIDAD BACTERIANA.
El desarrollo de los diversos modelos predictivos del comportamiento microbiano,

empleados en microbiología, descansan sobre bases matemáticas preestablecidas con
anterioridad, sin importar si se trata de modelos probabilísticos, cinéticos, mecanísticos etc.
En el año 1949, Jacques Monod, publicó en el Annual Review of Microbiology un

estudio titulado: THE GROWTH OF BACTERIAL CULTURES. En el cual, desarrolló un modelo
matemático mediante el cual era posible estimar la población de una bacteria, metabolito o
sustrato en función del tiempo. Este modelo fue inicialmente adoptado en la industria de la
fermentación, posteriormente se fueron desarrollando técnicas para representar por medio
de expresiones matemáticas la relación existente entre el número de bacterias finales en
función del tiempo y como puede variar este número por acción de algún agente externo
que influya sobre su crecimiento o superviviencia.
367
En nuestro caso particular, realizamos curvas de muerte bacteriana exponiendo
nuestras cepas de campo y la cepa de referencia de S. aureus ATCC 29213 a concentraciones
sub CIM, CIM y varias veces la CIM, de: azitromicina, danofloxacina y penicilinaG, a pH 7.4,
6.5 y 5.0 comúnmente asociados a estructuras subcelulares donde habitan y se desarrollan
eventualmente los S. aureus, como así también evaluamos la incidencia de la leche y del
suero. Con la finalidad de evaluar, por un lado el efecto limitante que tienen los
antibacterianos sobre el crecimiento y desarrollo de los microorganismos y por otro lado el
efecto que pudiera inducir el cambio de pH en dicho resultado.
6.3.1. Azitromicina
Tal como lo indican nuestros resultados, tanto los aislamientos salvajes como la cepa
de referencia tuvieron un comportamiento similar frente a las diferentes concentraciones de
azitromicina en CMH pH 7.4, donde la CIM se situó en 1 µg/mL, la actividad antibacteriana,
no se vió alterada al incrementar las concentraciones del antimicrobiano, es así que
prácticamente a 1, 2, 4 y 8 veces la CIM presentó similar cinética de muerte. El análisis de las
curvas, para estas concentraciones, se realizó aplicando un modelo sigmoideo menos base.
Sin embargo al aumentar la concentración de azitromicina en el caldo (8xCIM) el T I50 fue más
breve.
Por otro lado, las curvas de crecimiento control para los aislamientos salvajes y de
referencia, fueron analizadas por el modelo de Gompertz, de igual manera que las curvas
obtenidas al enfrentar los inóculos a 0.125, 0.25 y 0.5 CIM de azitromicina, ya que, como se
pudo observar en los resultados, a esas concentraciones no se inhibió el crecimiento
bacteriano, aunque sí se vió afectada la magnitud del mismo. Estudios realizados por Seral
et al. (2003) indican una baja actividad antibacteriana de azitromicina a diferentes
concentraciones en caldo (0.5 a 10 µg/mL), las que no redujeron la concentración del inoculo
bacteriano en comparación con otros antibióticos, es decir azitromicina en caldo se mostró
esencialmente bacteriostática.
368
Con los parámetros derivados del modelo de Gompertz, obtuvimos la velocidad
específica de crecimiento (µ = b. c / e) (Log UFC/mL*h) (e = 2.7182), la duración de la fase de
latencia (LPD = m – 1/b) (h) y la máxima densidad poblacional microbiana bajo condiciones
particulares (MPD = a + c) (Log UFC/mL).
A medida que se aumentó la concentración de azitromicina en el caldo (0.125, 0.25 y

0.5 CIM) disminuyó la MPD y la población bacteriana se mantuvo mayor tiempo en fase de
latencia. Efecto, ocasionado por la presencia de concentraciones subinhibitorias de
azitromicina.
A pH 6.5, donde la CIM para azitromicina fue 8 µg/mL, los aislamientos salvajes como
la cepa de referencia tuvieron un comportamiento similar frente a las diferentes
concentraciones de azitromicina, nuevamente su actividad frente a S. aureus no aumenta al
incrementar las concentraciones, aunque sí a este pH disminuyó su potencia antibacteriana.
Datos que concuerdan con los estudios del modelo de simulación de actividad extracelular a
pH de 7.3 a concentraciones de 0.5 µg/mL de azitromicina (Barcia-Macay et al., 2006).
Es así que el S. aureus, presentó similar cinética de muerte a 1, 2, 4 y 8 veces la CIM,

de manera similar a lo que ocurrió cuando se ensayó a pH 7.4. Aunque el aumento de la CIM
demuestra la pérdida de potencia antimicrobiana a medida que el pH se va acidificando.
Al igual que lo ocurrido a pH 7.4, al enfrentar los inóculos a concentraciones subCIM,

0.25 y 0.5xCIM de azitromicina, continuó el crecimiento bacteriano, aunque de manera más
lenta.
Cuando el CMH se llevó a pH 5, la CIM de azitromicina fue ≥ 64 µg/mL. A este pH, se

obtuvo acción antibacteriana de la azitromicina cuando se ensayó a concentraciones más
altas (2 y 4 veces la CIM) frente al S. aureus. El aumento de la CIM demuestra bajo estas
condiciones una pérdida de potencia antimicrobiana a medida que el pH se va acidificando,
ya que para lograr efecto antibacteriano se requiere de grandes concentraciones de
azitromicina.
La cinética de crecimiento para los cultivos control y las concentraciones subCIM, fue
muy similar para los anteriores casos descriptos, permaneciendo por un espacio de tiempo
mayor en fase de latencia los cultivos expuestos a concentraciones subCIM.
369
En leche, cuyo pH se encuentra entre 6.5-6.8, azitromicina comenzó a ejercer cierta
actividad frente al S. aureus a concentraciones muy bajas (0.25xCIM), a diferencia de lo que
ocurrió en CMH a igual pH. Si bien se evidenció un aumento de la CIM a medida que el pH se
vuelve más ácido, la inhibición bacteriana en leche a grandes concentraciones fue mejor que
en caldo.
Este efecto lo hemos analizado en todas las pruebas de susceptibilidad realizadas en

leche, donde en comparación a las realizadas en iguales condiciones en CMH, siempre
encontramos mejor respuesta antibacteriana en la leche, probablemente debido a que los
factores inmunitarios específicos e inespecíficos presentes en las misma coadyuvan con el
antimicrobiano y a las inmejorables condiciones de crecimiento que ofrece el caldo de
cultivo vs la leche.
En suero bovino, cuyo pH es 7.4, azitromicina comenzó a ejercer actividad frente al S.

aureus a concentraciones del orden de 0.5xCIM. En nuestro caso, la CIM de azitromicina
para S. aureus cuando el CMH fue suplementado con 40% de suero bovino fue de 2 µg/mL,
pero a 1 µg/mL presentó inhibición sobre el crecimiento microbiano.
6.3.2. Danofloxacina
A pH 7.4, danofloxacina, presentó, tanto frente a los aislamientos salvajes como a la

cepa de referencia, un comportamiento similar a las diferentes concentraciones ensayadas.
A través del modelo sigmoidal, observamos que a concentraciones mayores a 0.5 veces la
CIM, el T I50 fue descendiendo, conforme aumenta la concentración, lo cual es lógico, ya que
al ser un ATB acción bactericida dependiente de la concentración, el tiempo en que tarda en
exhibir un efecto bactericida, será menor a concentraciones mayores. A este pH, el T I50 fue
de 0.43 a 0.56 h a 16 veces la CIM, mientras que a 4XCIM fue de 1.12-1.11 h.
Cuando el CMH fue suplementado con suero, danofloxacina evidenció actividad

frente al S. aureus a concentraciones a partir de 0.5xCIM. En todas las concentraciones
370
ensayadas, tanto las cepas salvajes como la de referencia presentaron similar cinética de
muerte que en CMH a pH 7.4.
En un estudio publicado por Baroni et al en 2014, encaminado a determinar la

actividad antibacteriana in vitro de ciprofloxacina sobre Escherichia coli, realizaron curvas de
muerte bacteriana en diferentes condiciones y encontraron al igual que nosotros que, en
CMH solamente se obtuvo un efecto bactericida (E = 3) con concentraciones de (16 x CIM) y
superiores, a las 2 y 3 horas de iniciado el ensayo, pero, en contraste con nuestros hallazgos,
donde encontramos este mismo efecto hasta las 24 horas de iniciado el ensayo, ellos
reportaron que ninguna concentración de ciprofloxacina logró un efecto bactericida,
presentando valores de E entre -2,005 (99,01%) y -2,882 (99,87%) después de 5 horas.
En el mismo estudio, Baroni et al. (2014) encontraron que en las curvas realizadas en
CMH, suplementado con suero bovino, el número de bacterias viables se redujo de manera
proporcional al incremento de los niveles de ciprofloxacina y obtuvieron efecto bactericida a
concentraciones de (4 x CIM) y (32 x CIM), lo cual concuerda con nuestros resultados, donde
a pesar que la CIM para esta matrix es de 1 µg/ml, empezamos a observar efecto inhibitorio
a 0.5 veces la CIM y se presentó efecto bactericida a concentraciones de 2 y 4 veces la CIM y
efecto de erradicación virtual a la concentración de 16 veces la CIM.
A pH 6.5, al igual que el caso anterior, danofloxacina nuevamente se comportó de

manera similar a las diferentes concentraciones frente a los aislamientos salvajes y de
referencia. Es decir, su actividad aumentó notablemente al aumentar las concentraciones; a
través del modelo sigmoidal, observamos que el tiempo en que tarda en exhibir un efecto
bactericida, fue menor a concentraciones mayores. A este pH, el T I50 fue de 1.50 h a
16XCIM, mientras que a 4XCIM fue de 3.39h. Las curvas en ausencia de danofloxacina en
conjunto con las curvas obtenidas a concentraciones de 0.25 y 0.5 CIM de las cepas salvajes,
fueron analizadas por el modelo de Gompertz, debido a que, frente a esas concentraciones
continuó el crecimiento bacteriano. Sin embargo no ocurrió lo mismo con el S. aureus ATCC
de referencia, ya que se mostró más sensible y a 0.5CIM se evidenció inhibición bacteriana.
La CIM para danofloxacina a pH 5, como se comentó anteriormente aumentó

ligeramente, situándose entre 1 y 2 µg/mL, de igual forma se evidencia nuevamente su
371
acción dependiente de la concentración. Las curvas en ausencia de danofloxacina fueron
analizadas por el modelo de Gompertz, al igual que las curvas obtenidas al enfrentar los
inóculos salvajes a 0.25, 0.5 y 1xCIM, indicando pérdida de su actividad bactericida a pH más
ácido, lo que se corrobora por el aumento de su CIM, comportamiento demostrado también
con la cepa de referencia.
En un estudio diseñado para evaluar la farmacodinamia intracelular de algunos

antibacterianos frente a S. aureus utilizando un modelo de macrogafos THP 1, Barcia-Macay
et al. (2006), determinaron CIMs para levofloxacina, moxifloxacina, garenoxacina y
moxifloxacina a pH 5.0 en 1, 1, 1.25 y 0.25 respectivamente, lo cual corresponde a valores de
entre 6 a 8 veces mayores que las CIM reportadas para estos mismos ATBs a pH 7.3; lo cual
se correlaciona con nuestros resultados, confirmando la perdida de actividad antibacteriana
de las fluoroquinolonas a pH ácido.
En leche, danofloxacina presentó una CIM de 1 µg/mL, similar a la CIM obtenida en

CMH pH 6.5; en esta matriz, 0.5xCIM, presentó cierta inhibición sobre el crecimiento
microbiano, diferenciándose en este caso con lo ocurrido en el CMH a pH 6.5.
Teniendo en cuenta que la leche no es un medio tan enrriquecido para el crecimiento

bacteriano como el CMH, y que además hay factores inmunitarios específicos e inespecíficos
que inhibirían el crecimiento bacteriano, esperaríamos una mayor actividad antibacteriana
de danofloxacina en este medio, pero, la actividad de las quinolonas, en la leche, se ve
disminuida debido a la presencia de sales de calcio. Marshall y Piddock (1994), reportaron
que las CIM de 18 quinolonas para las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
aumentaron en presencia de leche.
Con relación al efecto que ejerce la leche sobre la acción antibacteriana de las
quinolonas, diversos autores han determinado que dicha actividad puede verse reducida en
presencia de cationes bivalentes como calcio y magnesio, considerando que las
concentraciones de estos iones son elevadas en leche (1.25 y 0.12 g/L, respectivamente).
Gániere et al. (2004) estudiaron el efecto del medio de cultivo (caldo Mueller Hinton o leche
semidescremada), sobre los valores de CIM y CMB de diversos antimicrobianos frente a
patógenos mamarios aislados de bovinos. En el caso de marbofloxacina, hubo un incremento
372
de entre 2 a 4 veces en los valores de estas concentraciones cuando fueron medidos en
leche.
En el caso concreto de S. aureus, la CIM determinada en AMH se incrementó al doble

cuando fue medida en leche, resultados similares, fueron reportados por Fang y Pyorala
(1996), quienes demostraron que la leche reduce aproximadamente a la mitad la actividad
bactericida de enrofloxacina frente a E. coli.
6.3.3. Penicilina G
La actividad antibacteriana de penicilina G a pH 7.4, presentó un comportamiento

similar frente a las diferentes concentraciones, revelando claramente que su actividad frente
a S. aureus no se vió aumentada al aumentar las concentraciones de PenG, demostrando su
dependencia del tiempo de contacto, tal como lo reporta la literatura (Craig 1998, Carrillo et
al., 2013.). En todos los casos, tanto las cepas salvajes como la de referencia presentaron
Un estudio llevado a cabo por Betriu et al. (1994), encaminado a determinar la

tolerancia a penicilina G de cepas de β Streptococcos (GBS) mostró por medio de curvas de
muerte bacteriana a una concentración de 10 veces la CIM, que penicilina provocó una
rápida muerte de GBS sensibles, con una disminución – 3 Log ufc/mL durante las primeras 8
horas, siguiendo con la ausencia de recuentos viables a las 24 horas, en contraste con cepas
tolerantes que solo disminuyeron entre 2 y 3 log en las primeras 8 horas y después de 24 h,
no se presentó efecto bactericida. La utilización de una única concentración en este estudio,
no permite vislumbrar cual es la real concentración que pudiera tener efecto bactericida o
de erradicación virtual en la cepas sensibles. En contraste nuestro trabajo nos provee de
gran información al tener la posibilidad de evaluar la actividad de penicilina a un rango
amplio de concentracionnos tanto subCIM como sobre CIM, nuestros resultados son
compatibles con lo reportado por Knudsen et al. (1995). Quienes indicaron que el efecto de
la penicilina In vitro es independiente de la concentración, tal como lo reporta la literatura y
373
lo confirman nuestros ensayos, con un efecto máximo a dos a cuatro veces la CIM para
microorganismos penicilino-susceptibles.
La CIM de PenG, a pH 6.5, fue la misma que a pH 7.4, sin embargo a este pH pareciera
que la Pen G presenta mayor acción bactericida, pues a 2, 4, 8 y 16 veces su CIM presenta
una fuerte acción bactericida, aunque no muy diferente entre las mayores concentraciones,
lo cual de nuevo corrobora, su acción dependiente del tiempo y no del aumento de la
concentración.
La CIM para PenG a pH 5 fue 0.066 µg/mL, a este pH aumentó notablemente su

actividad frente al S. aureus, ya que la CIM fue varias veces inferior a lo observado en los pH
7.4 y 6.5; observamos que a partir de 0.5xCIM este antimicrobiano presenta actividad frente
al S. aureus, efecto que fue más evidente hasta 4 veces la CIM, de ahí en adelante, las
concentraciones mayores no mostraron mayor eficacia.
En leche, Pen G, presentó un comportamiento similar al observado a pH 6.5 en CMH.

El modelado de las curvas de letalidad bacteriana, en presencia de PenG en leche bovina, fue
realizado aplicando un modelo sigmoideo menos base. En todas las concentraciones
ensayadas, tanto las cepas salvajes como la de referencia presentaron similar cinética de
muerte.
Como se mencionó con antelación, penicilina G, presenta un evidente aumento en la
sensibilidad al disminuir el pH del medio frente a S. aureus, lo cual coincide con lo reportado
por Sandrine et al. (2007), para otros ß-lactámicos como meropemen y cloxacilina.
Sandrine et al. (2007) interpretan dicho evento como la incapacidad de la PBP 2ª para
unirse a los β-lactámicos en condiciones de pH ácido, lo cual mejora la unión de la penicilina
a otros objetivos, y también que el pH ácido, hace PBP 2a incapaz de compensar la
inactivación de la otra PBPs, resultando en las susceptibilidades similares de S. aureus
meticilino resistente y S. aureus meticilino sensible a β-lactámicos.
Estos datos, nos muestran quizás lo que pudiera ser una alternativa que nos
permitiría recrear las condiciones intracelulares, donde el pH ácido favorecería la acción de
los β-lactámicos y explicaría porque a pesar de no centrarse en cantidades suficientes a nivel
intracelular, serían una buena opción en el tratamiento de infecciones intracelulares por S.
374
aureus, pero aún es muy complejo obtener una visión completa de su potencial terapéutico,
ya que esta susceptibilidad no puede simplemente ser deducida de su eficacia, sino que se
deben tener en cuenta factores como la acumulación y disposición de estas moléculas a
nivel intracelular.
La CIM de Pen G frente a S. aureus cuando el CMH fue suplementado con 40% de
suero bovino fue igual que la CIM obtenida en CMH a pH 7.4 (0.5 µg/mL), al igual que su
cinética de muerte en esta matrix.
6.3.4. ÍNDICE DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
Como se indicó en el apartado resultados, definimos el índice de actividad

antibacteriana (E), como la diferencia entre los valores Log 10 del número de bacterias viables
(UFC/mL) al inicio (n t-0 ) y al final del ensayo (n t-24 ).
Con la finalidad de evaluar E, aplicamos tres puntos de corte teóricos: a) Efecto

bacteriostático: E = 0; no hay cambios en valor de n t-0 : b) Efecto bactericida: E = -3; hay
reducción de ≥ 3 log 10 de n t-0 por eliminación del 99.9% de las bacterias iniciales y c): Efecto
de erradicación virtual de bacterias: E = -4; hay reducción de ≥ 4 Log 10 (eliminación del
99.99%) respecto del Log de n t-0 .
Con base en esta premisa, encontramos que, para azitromicina en CMH-pH 7.4
solamente se obtuvo un efecto bacteriostático (E=0), tras 24 h de contacto con
concentraciones entre la CIM (2 µg/mL) y 8 veces la CIM (16 µg/mL), corroborando lo
observado al analizar las curvas de muerte bacteriana.
Luego en CMH-pH 6.5, ocurrió exactamente lo mismo que en el caso anterior, pero a
una concentración 4 veces mayor, ya que la CIM de azitromicina a pH 6.5 fue 8 µg/mL. Aquí,
queda de nuevo manifiesto que la azitromicina a medida que el pH se acidifica pierde
375
eficacia antibacteriana, necesitando concentraciones mayores para lograr el mismo efecto
que a pH 7.4.
En CMH-pH 5, azitromicina logró efecto bactericida compatible con la cura clínica, a

pesar de ser un antimicrobiano que por su mecanismo de acción (inhibición de la síntesis
proteica a nivel bacteriano) se destaca por presentar efecto de tipo bacteriostático. Este
efecto se logró solo a concentraciones en el orden de 4 veces la CIM, que a este pH fue 8
veces superior (64 µg/mL) a la CIM presentada a pH 6.5. En las concentraciones
equivalentes a la CIM y 2xCIM solamente se obtuvo efecto bacteriostático.
Empleando leche bovina como caldo de cultivo, para emular lo acontecido en la

glándula mamaria, azitromicina se comportó de manera similar a lo observado en CMH-pH
6.5, es decir logró solo efecto bacteriostático.
En CMH suplementado con 40% de suero bovino (Tabla 56), azitromicina se

comportó de manera similar a lo observado en CMH-pH 7.4, es decir logró solo efecto
bacteriostático. Es decir no observamos potenciación alguna por la presencia del suero.
Analizando los resultados de este ensayo y teniendo en cuenta las características

farmacodinámicas de este antibacteriano, podemos determinar que azitromicina, tiene la
particularidad de no pertenecer a una sola categoría, es decir que aunque clásicamente se
determina como un antibacteriano tiempo dependiente, algunos autores consideran que
presenta acción dependiente de la concentración y que Cmax/CIM es el parámetro que
mejor predice su comportamiento (Mazzei y Novelli, 1999).
Por otro lado, estudios experimentales han demostrado que la eficacia clínica de
claritromicina y azitromicina, no solo depende de la relación T>CIM, sino que se debe
considerar también la relación ABC 24hs /CIM (Van Bambeke, 2001; Novelli, 2002), parámetro
directamente gobernado por la dosis diaria total administrada (Novelli, 2002). De la misma
forma, se sabe que los macrólidos actúan como bacteriostáticos, sin embargo, pueden
actuar como bactericidas dependiendo de su concentración, de la densidad microbiana a la
que se enfrentan, de la fase de proliferación y de la susceptibilidad de la cepa involucrada
(Mulazimoglu et al., 2005). Lo anterior soporta, lo reportado en este estudio, donde
hallamos efecto bactericida a pH 5.0 a concentraciones superiores a 4 veces la CIM.
376
En general, para los tratamientos con azitromicina al poseer un perfil farmacocinético
particular y un prolongado efecto persistente, su actividad se correlaciona mejor con la
relación ABC 24hs /CIM que con el T>CIM.
Los macrólidos tienen la capacidad de concentrarse a nivel intracelular,

principalmente dentro de macrófagos y leucocitos polimorfonucleares (Gómez-Lus et al.,
2005). En el interior de estas células se ubican en los lisosomas, dentro de los cuales se
concentran por atrapamiento iónico y, si tenemos en cuenta que solo la forma no ionizada
es la única que posee actividad antibacteriana (Shryock et al., 1998), podemos inferir que la
alta concentración de azitromicina a nivel intralisosomal no es garantía de actividad
antibacteriana, aunque se cree que el acúmulo de macrólidos dentro de leucocitos puede
incrementar el rendimiento de los mecanismos asociados a la inmunidad celular.
Por su condición de antibacteriano acción dependiente de la concentración,

danofloxacina en CMH-pH 7.4 presentó efecto bactericida (E≥ -3 log 10 ) a partir de 2xCIM. Y
efecto de erradicación virtual de bacterias (E ≥ -4 Log 10 ) con eliminación del 99.99% respecto
del Log al tiempo de inicio a concentraciones superiores a 2 veces la CIM.
Este mismo comportamiento fue observado en CMH-pH 6.5, a este pH en

concentraciones inferiores a 2xCIM muestra claramente un efecto bacteriostático, situación
que puede ejercer presión de selección sobre las subpoblaciones son susceptibilidad a
danofloxacina disminuída.
Danofloxacina, a pH ácido, pierde potencia, ya que su CIM en CMH-pH 5, se ubica en

2 µg/mL presentando efecto bacteriostático (E= 0), recién a partir de 4xCIM se da el efecto
bactericida (E ≥ -3 log 10 ) y, a partir de concentraciones por encima de 8xCIM presenta efecto
de erradicación virtual.
En los estudios realizados en leche, danofloxacina, presento efectó bacteriostático a

concentraciones de 1xCIM, pero, a partir de 2xCIM (2 µg/mL) se visualiza un cambio drástico,
presentándose un efecto de erradicación virtual (E ≥ -4 log 10 ). El comportamiento de este
377
mismo antibacteriano en CMH suplementado con 40% de suero bovino, fue similar al
observado en CMH pH 7.4, donde obtuvimos efecto bacteriostático a la concentración
equivalente a 1xCIM, pero a concentraciones de 2 y 4 veces la CIM demuestró efecto
bactericida compatible con cura clínica (E ≥ -3 log 10 ).
La actividad antibacteriana de las fluoroquinolonas, al igual que las quinolonas de

primera generación, está determinada por su acción sobre la ADN girasa en organismos
Gram negativos y sobre la topoisomerasa IV en organismos Gram positivos tal como el S.
aureus. (Hooper, 2001). Ambas enzimas son esenciales para la replicación y transcripción del
ADN, de ahí que la inhibición de estas funciones conduzca a la muerte celular.
Nuestros resultados corroboran que el mecanismo de acción de danofloxacina induce

muy buena actividad bactericida In Vitro frente a las cepas de campo de S. aureus, aisladas
de cuartos mamarios de vacas portadoras de mastitis subclínica. Dicha observación nos
permite inferir que In Vivo, contando con el efecto potenciador de la acción antibacteriana
que nos brinda el sistema inmune, a través de los factores específicos e inespecíficos que
facilitan y potencializan la acción de los antibacterianos (Meglia y Matta, 2001), podríamos
sugerir que danofloxacina es una mejor alternativa que azitromicina para el tratamiento de
mastitis subclínica producida por S. aureus.
Las características PK/PD de Penicilina G, determinan que su acción bactericida, sea

en mayor parte dependiente del tiempo de contacto, en las pruebas realizadas en CMH-pH
7.4, a la concentración equivalente a 1xCIM presentó efecto bacteriostático (E= 0). El efecto
bactericida se hizo evidente a 2xCIM y el efecto de erradicación virtual compatible con cura
bacteriológica a 4xCIM. A la concentración de 8xCIM se presentó el efecto paradójico clásico
de penicilina G previamente descripto, observándose un efecto bactericida, para luego a 16
veces la CIM recobrar el efecto de cura bacteriológica.
La CIM de penicilina a pH 6.5, continúa siendo 0.25 µg/mL igual que a PH 7.4, pero se
observa un aumento en su actividad antibacteriana, ya que a la concentración de 2xCIM,
produce un drástico efecto de erradicacion virtual (E= ≥ -4 log 10 ), observamos a este pH,
378
nuevamente el efecto paradójico a 4 veces la CIM (E= ≥ -3 log 10 ). Para finalmente a
concentraciones equivalentes a 8 y 16xCIM recuperar el efecto de erradicación virtual,
compatible con la cura bacteriológica.
A pH 5.0 penicilina G, aumenta su eficacia antibacteriana, lo cual se ve claramente

evidenciado en la reducción en la CIM, la cual fue de 0.125 µg/mL; a este pH, se presenta el
efecto bacteriostático a valores de 1xCIM, y efecto bactericida a concentraciones superiores
a 2 veces la CIM. A este pH no observamos efecto paradójico como cuando se cultivó a pH
7.4 y 6.5.
En leche al igual que a pH 6.5, la CIM de penicilina G, fue 0.25 µg/mL, en esta matriz,
observamos a 1xCIM efecto bacteriostático y a concentraciones mayores a 2xCIM,
encontramos efecto bactericida, pero en contraste con lo observado en CMH a pH 6.5 no se
observó efecto de erradicación virtual (E= ≥ -4 log 10 ) en las cepas salvajes.
Penicilina en CMH suplementado con 40% de suero bovino, repitió el patrón de

comportamiento evidenciado en las pruebas realizadas en CMH pH 7.4.
El mecanismo de acción de la penicilina G, produce un efecto bactericida en bacterias

en fase de crecimiento, tal como se evidencia en nuestros resultados; esta característica,
unida al hecho que las bacterias recobran sensibilidad a la penicilina a pH ácido, nos indican
que este antimicrobiano podría ser una buena elección terapéutica, de hecho,
tradicionalmente se ha considerado que el paso de un fármaco de la sangre a la leche refleja
razonablemente bien la concentración del fármaco en el tejido mamario, pero no siempre es
así; algunas veces una distribución no tan sorprendente del fármaco a la leche puede reflejar
una mejor concentración en el tejido mamario. Características como acción bactericida, CIM
bajas y baja toxicidad pueden ser considerados como factores ventajosos para un
antibacteriano dado, este es el caso de las penicilinas, las cuales, siguen siendo de primera
elección para el tratamiento de la mastitis por microorganismos Gram-positivos.
Dicho de otra forma, los ß-lactámicos que generalmente no exceden la concentración

en leche por arriba del 20% de la concentración plasmática correspondiente y debido a su
rápida eliminación, su concentración residual es baja, son tradicionalmente considerados
como muy efectivos en el tratamiento de la mastitis (Soback et al., 1995).
379
6.4. EFECTO POSTANTIBIOTICO (PAE)
El PAE hace referencia a la supresión del crecimiento de un microorganismo después

de la exposición a un agente antimicrobiano (Mac Donald et al., 1997), y es de interés clínico
importante, ya que una vez hallado este tiempo para cada antimicrobiano frente a un
determinado agente patógeno, podríamos indicar intervalos de dosificación más largos, lo
cual contribuye a reducir la toxicidad y los costos del tratamiento sin pérdida de eficacia.
El PAE, ha sido un parámetro farmacodinámico que ha despertado gran interés

especialmente en la última década tal como se comentó en su análisis bibliográfico. En el
desarrollo de esta tesis doctoral, realizamos una relación de modelos experimentales tanto
“in vitro” como “in vivo”, para la determinación del PAE de nuestros antibacterianos frente a
las cepas problema y ATCC 29213 de S. aureus.
Dado que la comparación de datos depende en gran medida del modelo utilizado, la
discusión sobre el PAE se centrará en primer lugar en la evaluación de los modelos
experimentales utilizados para su determinación, ya que este fenómeno requiere una
metodología más complicada que el estudio de los demás parámetros.
6.4.1. EVALUACION DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES
6.4.1.1. Modelo “In Vitro”
El método de dilución utilizado para eliminar el antimicrobiano es uno de los más

utilizados en la determinación del PAE “in vitro” (Craigy Gudmundsson, 1999). Su uso es
amplio debido a su facilidad, rapidez y mejor comparación con los datos obtenidos con otros
autores. El único problema reside en la posible pérdida de UFC cuando el antimicrobiano es
muy bactericida.
En nuestros experimentos, el PAE fue determinado mediante el seguimiento del

número de UFC/mL utilizando el recuento de las UFC viables en placa. Este método ha sido y
es ampliamente utilizado por su relativa facilidad y rapidez (Isaksson et al., 1993). Sin
embargo, es posible que en este método de evaluación, se presenten posibles
380
subestimaciones en el PAE al asumir que hay una correspondencia entre una bacteria y una
UFC. Algunos antimicrobianos (sobre todo los β-lactámicos) producen filamentación, con lo
cual es probable, tomar un filamento (de 2 a 20 células) como una UFC; al dividirse el
filamento rápidamente en células independientes crearía un virtual rápido crecimiento que
aparentemente reduciría el PAE (Mc. Donnald et al., 1981).
En el caso de los antimicrobianos probados en este estudio, esto sólo podría ocurrir
con penicilina G. Otros métodos para la determinación del PAE, como el de
espectrofotometría o el de medida de impedancia son incapaces de medir concentraciones
por debajo de 10UFC/mL.
El método de bioluminiscencia del ATP intracelular está solo basado en que el

contenido de ATP es siempre igual en la célula. Este último y el método de cambios en la
morfología han dado PAEs más prolongados que el de recuento en placa (Mc. Donnald et al.,
1981).
4.4.1.2. Modelo “In Vivo”
Para estudiar este fenómeno in vivo, se han utilizado varios modelos en animales
(Hesen et al., 1988; Odenholt, Holm y Cars, 1990; Odenholt-Tornqvist et al., 1995).
El modelo de infección en el muslo de ratón neutropénico (Gudmundssonet al., 1986)

es uno de los modelos más empleados porque es más rápido y menos laborioso que otros.
En la literatura se reportan PAEs largos hallados para quinolonas y aminoglucósidos
mediante el uso de este modelo (Minguezet al., 1992), aunque para meropenem no se
encontraron valores significativos (Fuenteset al., 1995). Otros autores también han
informado un significativo PAE in vivo con macrólidos y aminoglucósidos mediante el uso de
este modelo (Minguezet al., 1992; Hesenet al., 1988).
El modelo de infección en muslo de ratón neutropénico utilizado en este trabajo es

tal vez el más usado en la determinación del PAE “in vivo” (Vogelmanet al., 1998). Sus
ventajas más importantes son:
- fácil manejo de los animales.
381
- facilidad en la extracción del muslo para la obtención del número de UFC.
-La inmunodepresión permite ver aisladamente la relación bacteria-antimicrobiano.
- las curvas de control de las concentraciones subinhibitorias comprueban que el PAE

no se debe a la acción del antimicrobiano residual.
Se ha demostrado que en modelos animales con una relación AS/V=60, donde AS =

(área de superficie de contacto entre los capilares y el compartimento que se estudia) y V =
(volumen de líquido que contiene), los niveles de antimicrobiano en suero son muy
parecidos a los encontrados en tejidos (Ryanet al., 1986). El modelo de infección en muslo, al
igual que los que utilizan compartimentos naturales, tienen una relación AS/V alta; por
tanto, los niveles de antimicrobiano (y sus metabolitos activos) en suero estimarían
relativamente bien las concentraciones en el fluido intersticial del músculo del muslo
(Renneberg y Walder, 1988).
Buscando cuantificar la virulencia relativa in vivo de diferentes cepas de

Staphylococcus spp., Acred (1986) diseñó un modelo que consistía en la inoculación
intramuscular profunda de 200 µL de un cultivo bacteriano líquido en el muslo izquierdo de
un ratón inmunocompetente, dejando el muslo derecho del animal como control. Por medio
de un calibrador se medía el edema originado en el miembro infectado y se comparaba con
el sano. Luego, demostró la utilidad de su modelo en ratón para evaluar la efectividad de la
penicilina sódica y penicilina procaínica en el tratamiento de infecciones por Staphyloccocus
(Selbie, 1954). El tratamiento lo inició 2 a 3 horas pos infección, porque el iniciar más
rápidamente la administración del fármaco impedía que se expresara completamente la
lesión (edema) en los ratones. Aunque la eficacia (disminución del edema) de las
preparaciones de penicilina evaluadas no fue estadísticamente diferente, fue posible
observar que la duración del efecto curativo del antibiótico dependía del tiempo total que el
medicamento permanecía en la sangre a concentraciones efectivas y de la respuesta inmune
del hospedero a la infección.
En la década de los 70s, Hunter et al., (1978), Superaron la subjetividad de la

medición del diámetro del muslo mediante el recuento de bacterias viables en el mismo
después del tratamiento. De esta manera fue posible demostrar diferencias significativas en
382
la actividad bactericida entre la amoxicilina y la ampicilina contra Escherichia coli y Proteus
mirabilis, a pesar de la similitud de ambos medicamentos en sus concentraciones séricas y
en su CIM.
Estos hallazgos demostraron que los datos in vitro no reflejaban el comportamiento

in vivo, e impulsaron el modelo animal como una herramienta indispensable dentro del
estudio de compuestos farmacológicos nuevos (Kunin, 1981).
6.4.2. EVALUACION DE RESULTADOS DE PAE “IN VITRO”
Este antimicrobiano mostró valores de PAE de 1.87 y 2.30 horas para la cepa ATCC
29213 y cepas problema respectivamente, en CMH, lo cual concuerda plenamente, con lo
reportado por Ferrara et al. (1996), quienes en su estudio comparativo de las expresiones de
PAE de diferentes macrólidos y azálidos, reportaron un PAE de azitromicina frente a S.
aureus, de 2.3 horas.
Otros trabajos como el presentado por Fuursted et al., en 1997, donde se realizó un
estudio comparativo entre 6 diferentes macrólidos frente a Streptococcus pneumoniae
reporta un PAE para azitromicina de 2.83 horas, siendo el más bajo de todos los macrólidos
probados entre los cuales se contaba: roxitromicina, claritromicina, espiramicina,
eritromicina y diritromcina.
En nuestro estudio comparativo entre azitromicina, danofloxacina y penicilina G,

azitromicina, fue el antibacteriano que expresó el más largo PAE frente a S. aureus.
En leche, el PAE determinado para azitromicina, fue de 1.94 y 1.80 horas para la cepa
ATCC 29213 y las cepas problema respectivamente; al igual que en los estudios de
susceptibilidad por curva de muerte bacteriana, y en ausencia de estudios comparativos en
esta matriz, observamos que no hay cambios significativos entre el PAE de azitromicina en
CMH y el PAE en leche.
383
Estudios acerca del PAE inducido por fluoroquinolonas, se han publicado varios, entre
ellos destacamos los resultados reportados por Carbone et al., (2001), Pastor et al., (1993),
Gottfredsson et al. (1991), McGrathet al. (1995). Los valores más representativos obtenidos
por estos autores, están en el rango de los presentados por nosotros en este trabajo. Ya que
reportaron para S. aureus, un PAE de entre 1.2 a 2.1 horas dependiendo de la concentración,
lo que es similar a las 0.97 horas de nuestros resultados de las cepas problema en CMH y
2.11 horas para la cepa ATCC 25923 en la misma matriz.
El PAE de danofloxacina frente a S. aureus en leche fue de 0.97 y 1.14 horas para las
cepas problema y ATCC 25923 respectivamente, al igual que para azitromicina, no hay
estudios previos en leche, pero tal como lo muestran los resultados, no hay diferencias
marcadas entre los valores obtenidos en esta matriz y los obtenidos en CMH; y en general
concuerdan con lo reportado en la literatura (Carbone et al., (2001), Pastor et al., (1993),
Gottfredsson et al. (1991), McGrathet al. (1995).
Los β-lactámicos son generalmente inductores de PAE en Gram-positivos. En este

caso penicilina G, presentó un PAE in vitro de 1.27 y 0.42 horas para las cepas problema y
ATCC 25923 respectivamente. Estos datos contrastan con lo reportado por Fuursted et al.
(1997), en un estudio comparativo del efecto bactericida y PAE de penicilina G versus 6
macrolidos frente a Streptococcus pneumoniae. Ellos hallaron un PAE para penicilina de 2.33
horas, utilizando el método de dilución de la suspensión bacteriana 1/1000 para la retirada
del antibacteriano, el cual también fue utilizado en nuestro estudio. Esta diferencia esta
determinada básicamente porque a pesar de haber sido utlizados por más de 60 años para el
control de procesos infecciosos bacterianos, las penicilinas siguen siendo muy efectivas para
el tratamiento de Streptococcos spp.
La literatura reporta que penicilina V o amoxicilina, siguen siendo el tratamiento de

elección para erradicar el Streptococo, los macrólidos solo se recomiendan en caso de
alergia a los antibióticos beta- lactámicos (Altamimi 2009).
384
No contamos en la actualidad con estudios que determinen el PAE de penicilina G
frente a S. aureus, que nos permitan establecer comparaciones discutibles con nuestros
resultados, pero en un estudio publicado en 2015 por Ahmad Ijaz et al., en el que
determinaron el PAE de cefquinoma frente a cepas de S. aureus causantes de septicemia en
bovinos, encontraron un PAE de 0.6 horas luego de una exposición al antibacteriano por
espacio de 2 horas a una concentración de 4 veces la CIM. Este estudio es el que más
coincide con el nuestro en cuanto a concentración, tiempo de exposición y resultado
obtenido.
6.4.3. EVALUACION DE RESULTADOS DE PAE “In Vivo”
6.4.3.1 DANOFLOXACINA
Este ensayo solo lo realizamos con danofloxacina, considerando que pertenece al

grupo de antimicrobianos concentración dependientes con prolongada persistencia, a los
efectos de corroborar lo hallado in vitro.
La determinación del PAE In vivo de danofloxacina frente a S. aureus, utilizando la
metodología descrita por Craig en 1996, mostró una duración de 2.26 ± 0.48 horas, es decir
presentó un efecto post antibiótico ligeramente más prolongado que el obtenido en los
ensayos In vitro, tanto en CMH como en leche.
El tiempo en el cual las ufc/mL en los cultivos tratados aumentaron 1 log, a partir de
la hora 4, hora en la cual las concentraciones séricas de danofloxacina descendieron por
debajo de la CIM (T1), correspondió a 9.16 ± 0.48 h, lo cual fue denominado T1b, por lo tanto
definimos T2 como T1b – T1, a su vez, el cultivo control tardó 2.90 horas en incrementar 1
log 10 su número de ufc/mL a partir del tiempo 0 = C.
Algunos autores han reportado diferentes valores para PAE in vivo de
fluoroquinolonas frente S. aureus, es así como Spreng et al. (1995), reportaron un PAE de
0.7 y 1.1 horas de marbofloxacina a 2xCIM y 4xCIM respectivamente frente a S. aureus
aislados de felinos, lo cual difiere con nuestros resultados, debido básicamente a que en
nuestro ensayo la concentración del antimicrobiano fue 10 veces la CIM y se ha reportado
385
que altas concentraciones del antimicrobiano con respecto a la CIM, contribuyen a aumentar
el PAE (Deziel et al., 2001).
Por otra parte, Fuentes (1994), reportó un PAE In vivo de ciprofloxacina frente a S.
aureus en 3.5 horas en un modelo de muslo de ratón neutropénico tal como en nuestro caso
y además obtuveron un PAE in vitro de 2.88 horas, lo que igualmente confirma que en
general los resultados In vivo son más prolongados que los encontrados In vitro.
La determinación del PAE In vivo, difiere de los resultados hallados In vitro, de hecho,
el encontrar un prolongado PAE In vitro no asegura que este mismo efecto se vaya a
presentar In vivo (Craig y Gudmundsson 1996). Por otro lado, generalmente el PAE In vivo es
mucho más prolongado que el mismo efecto obtenido in Vitro. Se han reportado PAEs
prolongados In vitro, pero no In vivo para penicilinas y cefalosporinas, frente a Streptococcos
(Craig y Gudmundsson, 1996; Craig, 1993; Craig, 1998).
La importancia clínica del PAE, no se ha establecido claramente, pero en general, el
tratamiento con un antibiótico puede beneficiarse de un largo PAE. De hecho, este último
puede permitir que la concentración del antimicrobiano, pueda descender a valores por
debajo de la CIM, por largos periodos de tiempo sin presentarse recrecimiento del
microorganismo.
Es bien sabido que las quinolonas impiden la síntesis de ADN bacteriano mediante la
inhibición de la ADN girasa, de ahí que el PAE inducido por estos antimicrobianos puede
representar el tiempo requerido para que las fluoroquinolonas se puedan disociar de los
sitios de unión del receptor y puedan difundirse fuera de la bacteria (Prescott y Walker,
2000).
La duración del PAE In vivo tiende a ser modificada por varios factores, como por
ejemplo la concentración de antimicrobiano alcanzada en el sitio de infección, el tiempo de
exposición al antimicrobiano, pH, tamaño del inóculo, y el medio en el cual se encuentra el
antimicrobiano.
Las fluoroquinolonas presentan un gran efecto inhibidor postantibiotico tanto In vitro

como In vivo, este prolongado efecto postantibiótico, lo ejercen tanto frente a bacterias
Gram negativas como frente a algunas Gram positivas, lo cual permite la instauración de
intervalos posológicos prolongados (Ingerman et al., 1986; Vogelman y Craig, 1986). En un
386
estudio publicado en 2012 por Díaz, quién evaluó el comportamiento farmacocinético de la
marbofloxacina en bovinos de diferentes edades y su relación PK-PD frente a mastitis
estafilocócicas, comparó el efecto postantibiótico de fluoroquinolonas y aminoglucósidos,
encontrando que las fluoroquinolonas expresan mayores valores de tiempo sobre la CIM y
mayores reducciones en el crecimiento, que los aminoglucósidos, pero sin embargo los PAE
presentados por fluoroquinolonas son sensiblemente menores.
Una explicación para este menor PAE y mayor efecto inhibitorio puede ser el
probable cambio en la morfología de los microorganismos en su exposición a la
fluoroquinolona. Lorian et al. (1985), demostró que bacterias expuestas a betalactámicos o
quinolonas cambian su peso y morfología, los bacilos se convierten en filamentos y los cocos
aumentan de tamaño, así mismo se ha comprobado que estas bacterias alteradas en su
morfología son más susceptibles a los mecanismos bactericidas de los PMNs (Lorian et al.,
1985).
Por otra parte, durante la fase de PAE, se presenta una disminución de la actividad
bactericida tras una nueva dosis de antimicrobiano (efecto refractario), esto debido a que
durante la fase de PAE, los microorganismos son menos susceptibles a la actividad
bactericida de ciertos antimicrobianos (Vogelman et al., 1983). Con base en estos reportes,
el grado de inhibición parece ser dependiente del microorganismo (más en bacilos Gram-
negativos que en S. aureus) y del antimicrobiano (betalactámicos y trimetoprim más que
aminoglucósidos). Aunque se necesitan más datos tanto de experimentos “In vitro” como “In
vivo” que demuestren más eficazmente este efecto en los antimicrobianos estudiados, estas
observaciones podrían tener su importancia en la dosificación de la terapia combinada.
Los resultados reportados en el presente estudio muestran un PAE significativo de

danofloxacina contra S. aureus. Este efecto reviste gran importancia clínica para el uso de
esta fluoroquinolona, puesto que podría ser administrada a intervalos ligeramente más
largos sin perder eficacia en infecciónes por S. aureus.
387
6.5 CAPTACION Y ACTIVIDAD DEL ANTIBACTERIANO A NIVEL INTRACELULAR
En general, el tratamiento de las infecciones por S. aureus puede presentar

complicaciones debido a las características físicas propias del patógeno, así como por las
características del lugar de la infección y la ubicación del patógeno en el tejido, es decir si se
encuentra a nivel intra o extra celular. Varios factores pueden ayudar a explicar la capacidad
del S. aureus para evitar las acciones de los antibióticos. La formación de biopelículas podría
ser la razón principal para el fracaso terapéutico, al igual que la presencia del patógeno a
nivel intracelular, lo cual es una situación muy frecuente y teniendo en cuenta la
imposibilidad y/o dificultad de algunas moléculas antimicrobianas para penetrar al interior
celular, esta situación podría explicar fácilmente el fracaso terapéutico observado a lo largo
de los tratamientos.
La capacidad de respuesta de los antimicrobianos también puede cambiar a nivel

intracelular; en un estudio publicado en 2006, por Bambeke et al., mencionan que la
actividad antimicrobiana de algunas moléculas es a menudo mucho menor en comparación
con la actividad a nivel extracelular.
Los primeros estudios usaron técnicas indirectas para valorar la penetración a nivel
subcelular, si la reducción del número de microorganismos viables en el interior de las
células era mayor en presencia de antibiótico que en su ausencia, deducían la penetración
del antimicrobiano (Klempner, 1982; Petersonet al., 1984). Este método es poco sensible, ya
que la supervivencia de las bacterias no se correlaciona necesariamente con que el
antibiótico no haya penetrado. Puede ocurrir que el antimicrobiano sea inactivado por el
entorno intracelular, puede ser bacteriostático o bien puede que esté localizado en un
orgánulo diferente a donde se alojan las bacterias. También la interpretación se complica
por las posibles interacciones del antibiótico y el sistema bactericida celular, o puede que la
muerte bacteriana sea independiente de la actividad antibiótica (Van der Auwera et al.,
1988; Barcia-Macay et al., 2006).
Basados en esta evidencia y en la necesidad de plantear nuevos protocolos

terapéuticos que tengan mayor eficacia en el control del S. aureus a nivel intracelular,
388
evaluamos la penetración, acumulación y actividad intracelular de azitromicina,
danofloxacina y penicilina G en polimorfonucleares bovinos extraídos de sangre y leche.
6.5.1. Técnicas para determinar la penetración de los antibióticos en el interior celular
En los estudios de penetración intracelular se han utilizado diferentes métodos

experimentales, es así como se han ido introduciendo técnicas capaces de cuantificar la
cantidad de antibiótico que pasa al interior de las células mediante métodos
microbiológicos, marcado radiactivo del antimicrobiano, fluorimetría o cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC).
La cuantificación del antimicrobiano intracelular presenta los mismos inconvenientes

con todos los métodos utilizados, ya que miden la cantidad total de antimicrobiano asociado
a la célula, tanto a la fracción lipídica como a la proteica, sin diferenciar el antibiótico
intracelular del unido a la superficie externa de la célula (Leca´Roz et al., 2006). La duración
de los procesos de lavado y centrifugado de las células, realizados para eliminar el
antimicrobiano extracelular, tiene importancia para aquellas moléculas que penetran
mediante un proceso de difusión, ya que parte del antibiótico intracelular puede salir al
exterior (Brown y Percival 1978; Klempner, 1984).
El ensayo microbiológico, utilizado en nuestro caso para la cuantificación de

azitromicina y penicilina G, mide el halo de inhibición del crecimiento bacteriano producido
por la suspensión de PMNs. Una vez que los PMNs han sido incubados con el antibiótico
durante un cierto tiempo, son separados del líquido extracelular por centrifugación y lavado,
y finalmente son lisados para liberar el antibiótico de su interior (Pemán et al., 1991).
La técnica cromatográfica (HPLC), al principio requería de grandes volúmenes de

células y altas concentraciones de antibiótico, por lo que pocas veces simulaba las
concentraciones fisiológicas alcanzadas en el plasma (Koga., 1987). Sin embargo hoy en día
con la sofisticación de los equipos analíticos y con la ayuda de metodologías de extracción
líquido/líquido, o en fase sólida (Solid Phase Extraction –SPE-) acopladas a métodos de
389
concentración de las muestras, se ha transformado en la técnica de elección por su alta
especificidad y sensibilidad (Yazar et al., 2006).
6.5.1.1 AZITROMICINA
En el estudio encaminado a determinar las concentracioens intracelulares de

azitromicina realizado por método microbiológico, técnica cilindro placa validada en nuestro
laboratorio, obtuvimos para azitromicina, una concentración IC equivalente de
378.75µg/mL, luego de 5 horas de exposición de los PMNs al antimicrobiano. Esta
concentración, corresponde a 461 veces la concentración EC, lo cual es compatible con lo
reportado por Mandell y Coleman en 2001, quienes realizaron un estudio en similares
condiciones a las nuestras y encontraron una acumulación IC de 517 veces con respecto a la
concentración EC.
En otro estudio, Bosnar et al. (2005), evaluaron cinco diferentes antibióticos

macrólidos (azitromicina, eritromicina, claritromicina, telitromicina y cetromicina) y
compararon entre ellos la cinética de absorción y liberación en PMNs en tres líneas celulares
diferentes. LLegaron a la conclusión, que azitromicina se concentró dentro de todas las
células de la prueba, sin saturación durante un periodo de incubación de 3 h, con una mayor
acumulación en líneas de células fagocíticas que en líneas celulares no fagociticas.
Esta observación también se relaciona muy bien con los hallazgos publicados por
Pascual et al. (1997), quienes compararon la absorción de azitromicina en PMNs humanos,
macrófagos peritoneales, y dos líneas celulares no fagociticas; hallando que los fagocitos
maduros PMNs y las células RAW264.7 acumularon más azitromicina que las células no
diferenciadas.
Hallazgos similares fueron reportados por Munic et al. (2002), con azitromicina en
PMNs, sus precursores no diferenciados (HL-60 línea celular), y células HL-60 diferenciados
hacia granulocitos.
El interés por el conocimiento de la localización subcelular del antibiótico está basado

en la razón fundamental que los microorganismos intracelulares se localizan en diferentes
390
organelas (lisosoma, fagosoma, fagolisosoma o citosol). Si el antibacteriano no alcanza la
misma estructura celular que la bacteria, nunca entrará en contacto con ella, y por lo tanto
no la podrá atacar.
Azitromicina, como la mayoría de los macrólidos, tiene la capacidad de penetrar en

los polimorfonucleares (PMN), monocitos, linfocitos y macrófagos alveolares, sitios en donde
alcanza altas concentraciones (Lucas et al., 2007).
De la misma forma, conocer la localización intracelular del antibiótico ayuda a

explicar fenómenos como la acumulación (se sabe que la azitromicina se concentra en el
interior de los lisosomas por atrapamiento iónico), de ahí que aunque su CIM a pH ácido
aumente varias veces, ésta seguirá siendo teóricamente activa por las altas concentraciones
que alcanza a nivel lisosomal (Orero et al., 1998).
Del arsenal terapéutico antibacteriano actual, las fluoroquinolonas son una

importante herramienta, debido a su amplio espectro, la actividad altamente bactericida, y
las propiedades farmacocinéticas favorables. Su buena distribución tisular les permite en
general, alcanzar concentraciones terapéuticas en zonas de difícil acceso para otros
antibacterianos.
Las fluoroquinolonas, como familia antibacteriana poseen en general, una gran

capacidad de penetrar, acumularse y ser activas en el interior de los PMNs (Canton., et al.
1992). Siendo ésta una de las razones por las que son consideradas tratamiento de elección
en infecciones que involucren patógenos de vida intracelular. El grado de penetración de las
fluoroquinolonas depende de factores fisicoquímicos como la lipofilia, el pH o la energía de
activación de la molécula, como así también de la presencia, en el medio, de sustancias que
pudieran competir por los transportadores de membrana.
En el presente estudio evaluamos la penetración de danofloxacina en PMNs extraidos

de sangre bovina. La cuantificación, fue realizada por cromatografía líquida de alta presión
con detección por fluorescencia tras su extracción en fase líquida, siguiendo una
391
metodología analítica validada en el Laboratorio de Estudios Farmacológicos y Toxicológicos
(LEFyT) (Mestorino et al., 2009). La penetración del antimicrobiano, alcanzó una relación
IC/EC de 6.26 tras las primeras 5 horas de incubación, lo cual concuerda con lo reportado por
Coralie et al., (2011) para ciprofloxacina en PMNs humanos. No existen trabajos en donde se
evalue la capacidad de penetración intracelular de danofloxacina.
Valores similares de captación intracelular, también se han descrito para otras

quinolonas, como el ofloxacino que presentó un cociente IC/EC máximo de 7.69 ± 0.88,
mientras que el de grepafloxacino alcanza un valor de 61.27 ± 3.04. Así pues, estas
quinolonas, presentan la misma cinética de penetración, pero las concentraciones
intracelulares de grepafloxacino son diez veces superiores a las de ofloxacino (Orero et al.,
2002).
Esta diferencia en la magnitud de penetración entre las dos quinolonas puede

deberse, en parte, a una serie de parámetros fisicoquímicos, ya que por ejemplo, la lipofilia
de grepafloxacino es mayor que la de ofloxacino, lo cual le permite difundir más fácilmente a
través de la membrana plasmática. Así mismo, también hay diferencias en las constantes de
disociación, ya que las de grepafloxacino tienen un valor muy cercano, mientras que las de
ofloxacino están más distanciadas. A pH 7.4 ambas quinolonas se encuentran
mayoritariamente en forma de iones híbridos (zwitterion), que es como en mayor
proporción atraviesan la membrana plasmática, ya que su carga neta es nula (Furet et al.,
1992).
En macrófagos alveolares humanos, se han determinado concentraciones de

ciprofloxacino, moxifloxacino, y gemifloxacina, las cuales presentan cocientes IC/EC de 5.2,
20, y 90 Respectivamente (Al Nawas y Shah, 1998).
Cuando evaluamos la penetración IC de penicilina G al interior de los PMNs extraidos

de sangre bovina, pudimos determinar una concentración equivalente de 1µg/mL a nivel IC
versus 2.26 µg/mL que fueron determinados a nivel EC, lo cual nos da una relación de
0.42/1, indicando una pobre penetración a nivel intracelular, comparado con los otros
392
antibacterianos objeto de este experimento, ya que azitromicina presentó una relación de
461/1 y danofloxacina 6.26/1.
Como documentamos en nuestra revisión bibliográfica, la literatura reporta que los

β-lactámicos, tanto penicilinas como cefalosporinas, se acumulan de manera escasa en el
interior de los fagocitos, esto básicamente porque aunque son plenamente capaces de
atravesar la membrana plasmática, son incapaces de quedar retenidos en el interior celular
(Jonson et al., 1980; Turnidge, 1998).
Estructuralmente los betalactámicos poseen un grupo carboxílico libre, y por lo tanto

se pueden considerar ácidos orgánicos. El pKa de este grupo se encuentra entre 3 y 5, de ahí
que estas moléculas, si bien tienen la capacidad de penetrar al interior citoplasmático, son
excluidas rápidamente del mismo, al ser éste más ácido que el medio extracelular (Delcour,
2009).
Nuestros resultados coinciden con lo reportado por Mandell y Coleman, quienes en

2001 desarrollaron un experimento con varios antibacterianos, incluyendo penicilina G, para
evaluar la captación de los mismos en PMNs humanos. Ellos encontraron, al igual que
nosotros y acorde al antecedente bibiografico, una pobre acumulación de penicilina G en el
interior celular, con una relación IC/EC de 0.16 versus una elevada concentración IC de
azitromicina en la cual reportaron una relación IC/EC de 517.
6.6. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ANTIMICROBIANOS A NIVEL INTRACELULAR
6.6.1. Acción de AZITROMICINA frente a Staphylococcus aureus internalizados en PMNs

extraidos de sangre y leche bovina
Como bien pudimos apreciar, azitromicna presenta una muy buena capacidad de
penetración a nivel intracelular, que para nuestro caso reportó valores de 462 veces más con
respecto al medio extracelular, también, durante el desarrollo del proyecto pudimos
observar que a medida que el pH se torna más ácido disminuye notablemente su eficacia,
siendo 64 veces mayor su CIM a pH 5.0 que a al pH fisiológico 7.4.
393
Cuando expusimos los S. aureus fagocitados por PMNs con una dosis terapéutica de
azitromicina, la cual por sus características PK/PD, se determinó en 5xCIM por espacio de 5
horas, los mismos sufrieron una reducción de 1.77 Log 10. Reducción que representa un
efecto bacteriostático solamente, debido a que como vimos con anterioridad, un índice de
actividad antibacteriana de -1.77 / -1.66 no logra el efecto bactericida deseado.
Estudios realizados por Seral et al., 2003, encaminados a la cuantificación y

evaluación de la actividad antibacteriana frente a cepas de S. aureus ATCC 25923, a nivel
intracelular de 6 antibacterianos, incluido azitromicina, mostraron que azitromicina tuvo
esencialmente un efecto bacteriostático a nivel intracelular, con una máxima disminución en
el recuento de bacterias de aproximadamente 0.6 log a concentraciones de 10 veces su CIM
o superiores.
Nuestros resultados concuerdan con lo reportado por Seral et al., 2003 y corroboran
la información que indica la acción bacteriostática de los macrólidos, ya que a la
cancentracion terapéutica y aún teniendo en cuenta su alta concentración a nivel
intracelular, no obtuvimos efecto bactericida tras 5 horas de exposición. En este caso
deberían repetirse ensayos contemplando aumentar el tiempo de exposición y comparar
diferentes concentraciones del agente antibacteriano. La evidencia de los estudios realizados
en las curvas de letalidad a concentraciones varias veces por encima de la CIM, nos indican
que azitromicina puede actuar como un agente bactericida dependiendo de su
concentración, pero como ya se ha documentado, azitromicina a nivel intracelular, se ubica
principalmente en los lisosomas, dentro de los cuales se concentran por atrapamiento iónico
y teniendo en cuenta que solo la forma no ionizada es la única que posee actividad
antibacteriana (Shryock et al., 1998). Podemos inferir que las altas concentraciones de
azitromicina a nivel intralisosomal no son garantía de actividad antibacteriana.
394
6.6.2. Acción de DANOFLOXACINA frente a Staphylococcus aureus internalizados en PMNs
extraidos de sangre y de leche de vacas
La concentracion de danofloxacina a nivel intracelular fue de 6 a 8 veces superior con

respecto al medio extracelular; y a medida que el pH se torna más ácido, pierde eficacia
antibacteriana, modificando su CIM 50 de 0.5 µg/mL a pH 7.4 a 1-2 µg/mL a pH 5.0. Según
pautas PK/PD, es un antimicrobiano bactericida acción dependiente de la concentración, que
frente a S. aureus mostró un PAE moderado, de 2.26 ± 0.48 h.
A pesar de ser un agente acción bactericida, tras una exposicion de 5 horas a

concentraciones de 10xCIM, los S. aureus intracelulares tratados con danofloxacina solo
sufrieron una reducción de 1.72 Log 10 con relación al número inicial de bacterias fagocitadas,
lo cual solo representa un efecto bacteriostático, presentando un índice de actividad
antibacteriana a nivel IC frente a S. aureus de -1.72 / -1.12 log 10 y un % de eficacia de 97.80
y 87.91 % en los PMNs extraidos de sangre y de leche, respectivamente.
Durante décadas se alimentó la teoría que sugería que la acumulación intracelular de

los antibacterianos, era un indicativo directamente proporcional a la actividad antibacteriana
intracelular (Broek, 1991). Sin embargo, varios autores han ofrecido evidencia experimental
comprobando que no existe una simple correlación directa entre la acumulación y la
actividad de los antimicrobianos, tal como ocurre con las fluoroquinolonas (Paillard et al.,
2002; Nielsen et al., 1997). Esta falta o disminución de la expresión en la actividad
antibacteriana en el medio intracelular es probablemente multifactorial, derivada de la
concentración alcanzada a nivel intracelular, la tasa de absorción y localización subcelular, el
pH del medio intracelular. Si bien la actividad de las fluoroquinolonas es menos afectada por
el pH ácido, sí observamos una clara disminución en su eficacia antibacteriana cuando esta
fue evaluada en condiciones de pH 5.0.
Los parámetros relacionados con los microorganismos también pueden ser críticos,
de hecho pueden ser directamente responsables de la disminución en la acción intracelular
de los antibacterianos, ya que la modulación del metabolismo bacteriano, que deriva en una
tasa de multiplicación más lenta de bacterias intracelulares desempeña un papel importante
395
en la disminución de la actividad antibacteriana de los agentes bactericidas como las
fluoroquinolonas (Eng et al., 1991).
En nuestro caso particular pudimos observar una gran disminución de la actividad

antibacterina de danofloxacina frente a las mismas cepas de S. aureus cuando éstas se
encontraban a nivel intracelular, en las cuales a pesar de haberse concentrado el
antibacteriano 6 veces más que el medio extracelular solo se consiguió un efecto
bacteriostático. Mientras que en las pruebas de sensiblidad realizadas en bacterias libres,
encontramos efecto bactericida a concentraciones por encima de 2 veces la CIM,
confirmando el efecto bactericida de las fluoroquinolonas, su actividad dependiente de la
concentración y también las limitantes de este antibacteriano en tratamientos de patógenos
de vida intracelular.
6.6.3. Acción de PENICILINA G frente a Staphylococcus aureus internalizados en PMNs

extraidos de sangre y de leche de vacas
Las características físico-químicas de la penicilina G conllevan a una muy baja tasa de

absorción celular, que para nuestro caso presentó una relación IC/EC escasa (0.44/1). Si bien
a pH ácido, aumenta su eficacia, lo cual se ve reflejado en una sustancial reducción de su
CIM 50 , pasando de 0.125 µg/mL a pH 7.4, que sería el medio EC, a 0.066 µg/mL a pH 5.0 lo
que coincidiría con el pH del medio IC de los fagolisosomas, donde habitualmente están
alojados los S. aureus. Teniendo en cuenta las pautas PK/PD, penicilina G es un
antimicrobiano bactericida acción dependiente del tiempo de contacto con escaso PAE.
Penicilina G a la dosis terapéutica, definida como 4 veces la CIM frente a los S. aureus
intracelulares, solo produjo una reducción de 1.63 Log 10 con relación al número inicial de
bacterias fagocitadas en los PMNs sanguíneos, y un efecto menor en los PMNs de origen
mamario (-1.12 log 10 ). A pesar de ser un antimicrobiano de acción bactericida, en este
ensayo solo logró un efecto bacteriostático, presentando un índice de actividad
antibacteriana de -1.63 / -1.12 en los PMNs extraidos de sangre y leche respectivamente; lo
396
que concuerda con el efecto logrado a nivel extracelular, donde a pH 5.0 presentó efecto
bacteriostático a concentraciones 1 x CIM y efecto bacericida solo a concentraciones
superiores a 2 veces la CIM.
Los estudios hasta ahora publicados, han reportado una aparente concentración
intracelular más baja que en el medio extracelular en equilibrio para todos los β-lactámicos,
ya sea en células fagocíticas o células no fagocíticas (Carryn et al., 2002). En general, se sabe
que este tipo de moléculas difunden razonablemente bien a través membranas biológicas,
pero los estudios de distribución de transmembrana de ácidos débiles muestran que la
concentración total de tales sustancias es siempre más bajo en medio ácido que en
compartimentos con características básicas o neutras (Wilkinson, 2001).
Teniendo en cuenta que las estructuras subcelulares son más ácidas que el medio
extracelular, los β-lactámicos no se pueden acumular en el interior celular, aún cuando
pueden pasar a través de membranas.
En concordancia con nuestros resultados, donde se muestra una pobre acumulación

de penicilina G a nivel subcelular y una baja actividad antibacteriana, Chanteux et al., (2003)
obtuvieron una pobre actividad antibacteriana, con una reducción de solamente 0.5 log 10
de UFC frente a cepas de L. monocytogenes internalizadas en macrogafos J774, utilizando
ampicilina y pivampicilina a dosis de 1.25 µg/mL de ampicilina y 1.83 µg/mL para
pivampicilina, correspondiente en ambos casos a 10 veces la CIM determinada en el mismo
estudio por un espacio de 5 horas. Sin embargo, resultados publicados por Carryn et al., en
2003, muestran un resultado paradójico, puesto que a pesar que los β- lactámicos
(ampicilina y meropemen) penetran en las células, pero no acumulan, es decir, su
concentración celular es más baja que la extracelular son esencialmente bacteriostáticos
contra L. monocytogenes en caldo, pero se convierten en bactericidas a nivel intracelular
después de 24 horas de exposición.
En general, los β-lactámicos, tienen un mecanismo de acción predominantemente
tiempo-dependiente, tal como quedo de manifiesto en los resultados de nuestros ensayos,
lo cual significa que su actividad bactericida es máxima a concentraciones 4 veces sobre la
CIM, no aumentando su eficacia a concentraciones mayores. Con lo cual la máxima eficacia
de estas moléculas está asociada a la obtención de tiempos prolongados de contacto.
397
Dicho de otra forma, el objetivo farmacodinámico al utilizar estas familias de
antimicrobianos es por lo tanto lograr tiempos sobre la CIM (T > CIM) prolongados, lo que
también se asocia a mayores AUC/CIM (Onyeji et al., 1994). En general, con este tipo de
moléculas, se recomienda y esta justificado el uso de dosis fraccionadas ajustadas a la vida
media de cada antibacteriano, con el fin de mantener en el tiempo, las concentraciones
terapéuticas.
6.7. CINETICA INTRACELULAR DE LOS ANTIBACTERIANOS Y ACTIVIDAD

ANTIBACTERIANA
6.7.1. AZITROMICINA
Azitromicina al igual que la mayoría de los macrólidos, posee debido a sus

características físico químicas la capacidad de penetrar y acumularse en el interior de
diferentes tipos celulares, especialmente en células del sistema fagocítico, donde alcanzan
concentraciones varias veces superiores a las concentraciones extracelulares (Gómez-Lus. et
al., 2005). En nuestro caso, fue ampliamente captada por los PMNs, sin sufrir saturación
durante las primeras 5 horas de incubación en donde la relación IC/EC fue de 467. La mayor
parte del antibacteriano se acumula en los fagolisosomas probablemente porque en medio
ácido, la azitromicina y en general los macrólidos por su carácter básico sufren una
protonación, debido a lo cual, la azitromicina, no posee buena difusión a través de la
membrana lipídica y queda atrapada en el fagolisosoma.
Si bien azitromicina posee una muy buena capacidad de penetración y acumulación

intracelular, cabe resaltar que la actividad intracelular de la mayoría de los macrólidos es
escasa (Carryn et al., 2003; Van Bambeke, 2014). Esta condición parece estar asociada a
varios factores entre los que se encuentran, la inactivación debida al pH ácido del
fagolisosoma donde se concentran en mayor medida los macrolidos (Pemán et al., 1991),
esta condición ha sido evidente en nuestro trabajo al reportar aumento en 64 veces o más el
valor de la CIM de azitromicina a pH 5.0 con relacion al pH 7.4.
398
Por otro lado, Mtairag et al., (1995), reportaron para roxitromicina, la posible
capacidad de inhibir la producción de superóxido y peróxido de hidrógeno en los PMNs, lo
cual altera considerablemente la actividad antibacteriana. Sin embargo, estudios más
recientes (Carryn et al., 2003; Van Bambeke, 2014), aseguran que los nuevos macrólidos
como la azitromicina sí presentan actividad intracelular in vivo frente a S. aureus. Lo cual
contrasta con nuestros resultados al observar la pobre actividad intracelular de azitromicina,
donde el índice de actividad antibacteriana (E) máximo alcanzado fue -1.70, a las 4 horas de
contacto, no lográndose en ningun caso, una reducción de ≥ -3 Log 10 de las ufc/mL lo cual
consideraríamos como efecto antibacteriano bactericida.
En las CLB, realizadas en CMH-pH 5, azitromicina logró efecto bactericida solo a
concentraciones que se situan en el orden de 4 veces la CIM, lo cual no ocurrió a nivel
intracelular aún cuando las concentraciones fueron mucho mas elevadas con respecto al
medio EC, lo que nos indica que factores intracelulares anteriomente descritos como la
concentración y grado de ionizacion, la densidad microbiana, la fase de proliferación y la
susceptibilidad de la cepa involucrada, influyen claramente en la actividad intraceluar de
azitromicina (Mulazimoglu. et al 2005).
Si bien la familia de los macrólidos se caracteriza por ser antimicrobianos tiempo

dependientes, la azitromicina posee un perfil farmacocinético particular y un prolongado
efecto de segunda exposición (Biskri y Mazel, 2003). Su actividad se correlaciona mejor con
la relación ABC 24hs /CIM que con el T>CIM, ya que a diferencia de los otros macrólidos
presenta un marcado PAE in vivo (Van Bambeke y Tulkens, 2001).
Por ello, realizamos un análisis no compartimental de los datos de concentración

equivalente a nivel intracelular en el cual calculamos el predictor de eficacia ABC 0-24h /CIM,
encontrando que los valores de este parámetro no fueron lo suficientemente altos para
lograr la erradicación del S. aureus a nivel intracelular, llegando solo a 78.82 con un DE de
0.87, cuando la relación adecuada compatible con una respuesta clínica y microbiológica
adecuada debería ser mayor a 125.
399
De las fluoroquinolonas se sabe que tienen buena capacidad de penetración celular y

se acumulan en las células eucariotas a concentraciones en promedio 10 veces más con
respecto al medio extracelular (García et al., 2000). Acerca del mecanismo de acumulación
de este tipo de moléculas aún no hay una explicación clara, se ha identificado una vía de
transporte específica en PMNs para ciprofloxacinA, junto con un transportador de
aminoácidos activado por el acetato de forbol miristato, ésta demanda también podría ser
regulada por la activación de la proteína quinasa C (Carryn et al., 2003).
Las fluoroquinolonas a nivel intracelular se localizan generalmente en el citosol, pero

probablemente sean capaces de difundir en menor medida a los diferentes compartimentos
subcelulares como lo hacen a través de los diversos órganos del cuerpo (Carryn et al., 2003).
En nuestros estudios a nivel intracelular encontramos que danofloxacina se acumuló

entre 6 y 8 veces con respecto al medio extracelular, lo cual concuerda con la observación de
García et al. (2000). Hacia las 6 h de incubación la relación IC/EC presentó su mayor nivel,
llegando a valores de 8.08, pero a partir de ese momento, predomina el eflujo de la
molécula.
Si bien los niveles IC de danofloxacina se ubicaron en valores de más de 10 veces la

CIM calculada en esta tesis para S. aureus, no se logró efecto bactericida en el ambiente
intracelular, alcanzando solo una disminución de 1.98 log 10 de las UFC/mL, observándose
recrecimiento bacteriano a partir de las 6 horas de incubación.
La evidente disminución de la expresión en la actividad antibacteriana en el medio

intracelular encontrada en este estudio, vs las pruebas de sensiblidad realizadas en bacterias
libres, donde hubo un evidente efecto bactericida a concentraciones por encima de 2 veces
la CIM, es probablemente como se comentó con antelación de caracter multifactorial;
derivada en especial por la tasa de absorción, la localización subcelular (generalmente a
nivel citosólico), el pH del medio intracelular, por lo cual observamos una clara disminución
en su eficacia antibacteriana.
400
Igualmente las condiciones que se relacionan directamente con el microorganismo,
son también limitantes en la actividad antibacteriana a nivel intracelular y, pueden estar
directamente relacionadas con la disminución de la actividad intracelular de los
antibacterianos y el posible fracaso terapéutico, entre ellos, podemos destacar, la
modulación del metabolismo bacteriano, que deriva en una tasa de multiplicación menor y
por tanto en una disminución de la actividad antibacterina de los agentes bactericidas como
las fluoroquinolonas (Eng., et al 1991).
Habiendo confirmado el efecto bactericida de las fluoroquinolonas a nivel

extracelular, su actividad dependiente de la concentración, así como también las limitantes
de este antibacteriano en tratamientos de patógenos de vida intracelular, realizamos un
análisis no compartimental de los datos de concentración equivalente a nivel intracelular
donde calculamos los predictores de eficacia Cmax/CIM y ABC 0-24h /CIM.
El predictor de eficacia Cmax/CIM, es el indicado para valorar la eficacia de

antibacterianos acción dependiente de la concentración, como es el caso de las
fluoroquinolonas (Craig 1998). Con base en este parámetro, tasas superiores o iguales a 10
se han correlacionado con eficacia en el tratamiento de bacteriemia por P. aeruginosa
tratada con tobramicina (Zelenitsky et al., 2003); de la misma forma, se ha obtenido buena
correlación en el tratamiento de bacteriemia por P. aeruginosa tratada con ciprofloxacino
cuando la tasa Cmax/CIM alcanzada era superior o igual a 8 (Soriano y Ponte 2009).
Un modelo In vivo en ratones infectados experimentalmente con Estreptococo

pneumoniae y tratados con ciprofloxacina, reportado por Sullivan et al. (1993), indicó que la
relación de la concentración Cmax/CIM tenía que alcanzar un valor de 10,6 para alcanzar una
optima actividad bactericida.
El Cociente del ABC/CIM también se correlaciona con la actividad bactericida de

antibacterianos concentración dependiente (Craig 1998). Existen datos clínicos que sugieren
la necesidad de obtener cocientes del ABC/CIM superiores o iguales a 125.
Estudios in vitro en animales de experimentación, sugieren que las tasas ABC/CIM de

100–120 parecen asociarse a una disminución en el riesgo de selección de mutantes
resistentes a las fluoroquinolonas (Ambrose y Grasela, 2000). La obtención de cocientes
401
óptimos no sólo se correlaciona con eficacia terapéutica, sino con un menor riesgo de
selección de mutantes resistentes y disminución de la toxicidad (Drusano et al 2007).
Si bien en nuestro experimento los predictores de eficacia, fueron alcazados,

(Cmax/CIM ≥ 10 y ABC 0-24h /CIM ≥ 125), estos valores no fueron suficientes para lograr la
erradicación del S. aureus a nivel intracelular, con lo cual nos queda claro que la
acumulación a nivel intracelular de los antibacterianos no es predictivo de actividad a nivel
intracelular.
6.7.3. PENICILINA G
La evaluación de la acumulación de penicilina G, demostró que ésta molécula

presentó una escasa acumulación a nivel intracelular (0.51) con respecto al medio
extracelular. Se ha documentado que tanto las penicilinas como las cefalosporinas, se
acumulan de manera escasa en el interior de los fagocitos, aunque ello no significa que sean
incapaces de atravesar la membrana plasmática (muchos compuestos tienen lipofilia
suficiente para difundir a través de la bicapa lipídica) sino que son incapaces de quedar
retenidos en el interior celular debido a su PKa (Jonson et al., 1980; Turnidge, 1998).
A las 4 horas de incubación la relación IC/EC fue la mayor, siendo ésta de 0.51, pero a
partir de ese momento comenzó a predominar el eflujo, no obstante, los niveles
intracelulares de penicilina G se mantuvieron varias veces por arriba de la CIM calculada en
esta tesis para S. aureus a este nivel (0.066 µg/mL).
Mandell y Coleman, en 2001, encontraron al igual que nosotros y acorde al

antecedente bibiográfico, una pobre acumulación de penicilina G en el interior celular con
una relación IC/EC de 0.16, en un estudio realizado en PMNs humanos. Del mismo modo,
Hugues et al., en 2003 en un estudio encaminado a evaluar la acumulación y actividad
intracelular de ampicilina y pivampicilina frente a L. monocytogenes en macrófagos J774,
encontrarron una pobre acumulación de ampicilina libre obteniéndose una relación IC/EC
menor a 1.
402
Al evaluar la actividad de pencilina G a nivel IC frente a S. aureus, encontramos que a
pesar de ser un antimicrobiano acción bactericida, no se logró este efecto en el ambiente
intracelular, ya que el Log ufc/mL cayó solamente 0.87 veces, evidenciándose recrecimiento
del inóculo bacteriano.
Del mismo modo Barcia et al., (2006) reportaron una pobre actividad intracelular de
penicilina V frente a S. aureus en un modelo de macrófagos J774, encontrando una
disminución de menos 1 log 10 en el conteo de UFC/mL, vs el medio extracelular donde se
evidenció efecto bactericida, tal como ocurrió en nuestros estudios de CLB, donde hallamos
efecto bactericida a pH 5.0 en las concentraciones por arriba de 2 veces la CIM.
Paradójicamente Carryn et al., en 2003, reportaron que a pesar que los β- lactámicos
(ampicilina y meropemen) penetran en las células, pero no acumulan, se convierten en
bactericidas a nivel intracelular después de 24 horas de exposición contra L. monocytogenes,
de igual forma Van den Broek et al., (1986) reportaron que en monocitos humanos penicilina
G fue de dos a siete veces más potente sobre S. aureus intracelulares, que el efecto sobre los
microorganismos no fagocitados.
Los antimicrobianos que actúan sobre la pared celular como ß-lactámicos, poseen un
mecanismo de acción predominantemente tiempo-dependiente, es decir la actividad
bactericida se presenta con una Cmax 4 veces sobre la CIM y no aumenta con
concentraciones mayores, lo cual pudimos hacer evidente en nuestras CLB, de ahí que la
máxima eficacia se asocia a la obtención de tiempos prolongados de concentración del
antibacteriano 4 veces sobre la CIM. El objetivo farmacodinámico al utilizar estas familias de
antimicrobianos es por lo tanto lograr tiempos sobre la CIM (T > CIM) prolongados.
Tras el análisis no compartimental de los perfiles intracelulares, encontramos que

durante las 24 h de incubación, las concentraciones intracelulares se mantuvieron por arriba
de la CIM calculada en esta tesis para el pH 5, pero evidentemente no fue suficiente para
lograr la erradicación del S. aureus a nivel intracelular.
Probablemente el fracaso en la actividad antibacteriana a nivel IC de penicilina G, se

deba a que el principio general (4 veces sobre la CIM) para antibacterianos activos sobre la
pared celular aplica cuando se trata de bacterias muy sensibles y/o de inóculos bacterianos
403
bajos; sin embargo, frente a inóculos altos, la C max adquiere importancia y la actividad
bactericida máxima puede no alcanzarse aún con C máx /CIM de 128 veces (Onyeji et al.,
1994).
Lo anterior pone nuevamente de manifiesto, que penicilina G al igual que para los
antibacterianos anteriormente evaluados, la acumulación a nivel intracelular y cumplir con
las condiciones estimadas en su predictor de eficacia, no es garantía de actividad a nivel
intracelular, debido básicamente a que la actividad antibacteriana no está sujeta a una sola
condición, sino que es el resultado de una serie de características que incluyen: las
características PK/PD de la molécula, las características propias del microroganismo y el
medio en el cual se reúnen estos elementos.
404
7. CONCLUSIONES
El uso irracional de los antimicrobianos se puede combatir mediante la

implementación de esquemas terapéuticos racionales basado en los siguientes aspectos:
1. Perfil microbiológico de la mastitis. El diagnóstico clínico y de laboratorio

(aislamiento, tipificación y antibiograma) es uno de los pilares fundamentales del uso
racional de los agentes antimicrobianos, pero no el único como hemos demostrado en esta
tesis.
2. Farmacocinética/Farmacodinamia de antibióticos en animales productores de

leche portadores de mastitis. La compresión de la relación de los parámetros
farmacocinéticos con los parámetros farmacodinámicos, PK/PD, en estos animales
redundará en un aumento de la eficacia antimicrobiana y en una disminución de la selección
de cepas resistentes, aspectos fundamentales que hacen al éxito de la terapia. Y
fundamentalmente nos permitirá seleccionar aquellos agentes antimicrobianos capaces de
alcanzar al agente causal en un sistema biológico tan complejo como la glándula mamaria en
general y el sistema subcelular en particular.
3. Diseño de formulaciones y de regímenes terapéuticos más eficaces y seguros. El

desarrollo de nuevos medicamentos debe involucrar más que el descubrimiento de una
nueva sustancia, el aprovechamiento integral de sus efectos sobre el organismo, se debe
considerar como se transporta la molécula al sitio apropiado, y una vez allí lograr que esté
disponible para su uso y sea eficaz.
El S. aureus es un patógeno extremadamente complejo que posee variados factores

de virulencia, los cuales dificultan enormemente la acción de los antimicrobianos, por tanto
y teniendo en cuenta la importancia epidemiológica y económica a nivel mundial de las
infecciónes intramamarias causadas por este patógeno, pensamos que será más eficaz el
control sanitario, derivado del adecuado manejo consuetudinario en los tambos lecheros,
buenas practicas de ordeño, alocación y alimentación más que tratamientos antibacterianos
realizados sin fundamento microbiológico.
405
La terapia de la mastitis bovina, debe plantearse y ralizarse, teniendo en cuenta, la
interacción PK/PD de los antimicrobianos de acuerdo a las características de la glándula
mamaria (pH, composición electrolítica, concentración de grasas, de proteínas y de
leucocitos) entre otros y no solamente teniendo en cuenta los criterios de interpretación de
las pruebas de susceptiblidad, que por demás, generalmente han sido establecidos con base
en las concentraciones de antimicrobianos determinadas en plasma.
El S. aureus en el interior de la glándula mamaria y más aún en el interior de los

PMNs, sufre grandes cambios anatomofisiológicos, que a su vez modifican su relación con
los antimicrobianos, por tanto no podemos tomar los resultados de los antibiogramas, como
garantía de eficacia para los tratamientos de mastitis.
El efecto que surte el pH acido del medio intracelular, en el caso de azitromicina, es

netamente deletéreo de la actividad antibacteriana, por otro lado, esta molécula posee la
capacidad de penetrar en los polimorfonucleares (PMN), monocitos, linfocitos y macrófagos
alveolares, concentrándose varios cientos de veces dentro de los mismos, lo cual nos llevaría
a pensar que podría perfilarse como una buena alternativa terapéutica en casos de mastitis
bovina causada por patógenos de vida intracelular, pero debido a que solo la fracción de la
droga libre es activa y la acumulación de azitromicina se produce por atrapamiento ionico,
las grandes cantidades del ATB retenido, no necesariamente tienen actividad.
La restauración de la susceptibilidad del S. aureus a la peniclina en medio ácido, nos

pone de manifiesto nuevamente a esta molécula, como una alternativa interesante en el
tratramiento en infeciones bacterianas de localizacion intracelular, siempre que podamos
desarrollar la tecnología necesaria para retener inalterado el ATB en el interior celular.
Aunque las pruebas de susceptibilidad realizadas en bacterias libres, muestran que

danofloxacina posee efecto bactericida a concentraciones por encima de 2 veces la CIM, a
nivel intracelular no pudimos corroborar este efecto, debido en parte al efecto negativo que
tiene el pH ácido en la actividad de las fluoroquinolonas.
Ninguno de los antimicrobianos ensayados fue capaz de lograr a nivel intracelular la

concentración y/o el tiempo de contacto adecuado para atacar con la suficiente eficacia al S.
aureus según pautas farmacocinéticas/farmacodinámicas establecidas para ellos, lo cual
406
significaría que si se continúan utilizando estos antimicrobianos para el tratamiento de las
mastitis subclínicas por S. aureus sin considerar los aspectos enunciados en este trabajo,
solamente estaremos favoreciendo la cronicidad de la enfermedad, la selección de cepas
resistentes y su eventual diseminación al medio ambiente, al hombre y a otras especies
animales; y fundamentalmente malgastando valiosas herramientas terapéuticas.
407
8. BIBLIOGRAFIA
1. Abdelghaffar, H., Vazifeh, D., Labro, M.T. Cellular uptake of two fluoroketolides, HMR 3562
and HMR 3787, by human polymorphonuclear neutrophils in vitro. Antimicrob Agents
Chemother 2001; 45: 2798-2806.
2. Acred P., The Selbie or thigh lesion test. En: Zak O, Sande MA, editors. Experimental models
in antimicrobial chemotherapy, lsted. London: Academic Press; 1986. p. 109-20.
3. Aeschlimann JR, Hershberg E, Rybak MJ. Análisis of vancomycin population susceptibility
profiles, killing activity, and postantibiotic effect against vancomycin-intermediate
Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:1914-1918.
4. Ahmad I, Hao H, Huang L, Sanders P, Wang X, Chen D, Tao Y, Xie S, Xiuhua K, Li J, Dan W and
Yuan Z. Integration of PK/PD for dose optimization of Cefquinome against Staphylococcus
aureus causing septicemia in cattle. Front. Microbiol. 2015. 6:588. doi:
10.3389/fmicb.2015.00588
5. Akaike, h. An Information Criterion (AIC). Mathematical Science. (1976). 14, 5-9.
6. Altamimi, S., A. Khalil, et al. (2009). «Short versus standard duration antibiotic therapy for
acute streptococcal pharyngitis in children». Cochrane Database Syst Rev (1): CD004872.
7. Ambrose PG, Grasela DM. The use of Monte Carlo simulation to examine pharmacodynamic
variance of drugs: Fluoroquinolone pharmacodynamycs against Streptococcus pneumoniae.
Diagn Microbiol Infect Dis. 2000; 38:151–7.
8. Ambrose, P., Bhavnani, S., Rubino, C., Lovie, A., Gumbo, T., Forrest, A. and Drusano, G.
Pharmacokinetic-Pharmacodynamic of antimicrobial therapy: Its not just for mice anymore.
Clin Infect Dis 2004; 44:79-86
9. Anderson, R., Joone, G., Van Rensburg, C.E.J. An in-vitro investigation of the intracellular
bioactivity of amoxicillin, clindamycin and erythromycin for Staphylococcus aureus. J Infect
Dis 1986; 153: 593-600.
10. Andes D, Craig W. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of outpatient intravenous
antimicrobial therapy. Infect Dis Clin N Am 1998; 112:849-860.
11. Anon, G. (1980) Progress in mastitis control (1977) in 23 countries. Bulletin of the
International Dairy Federation, Document 121.
12. Andrade. M.A, Dias. F, F.C.; Mesquista. A.J, Rocha. P.T. 2000. Sensibilidade “in vitro” de
Staphylococcus aureus isolados de amostras de leite de vacas com mastite subclínica. Ciência
Animal Brasileira, v.1, n.1, p.53-57.
13. Ariznabarreta, A., Gonzalo, C., San Primitivo, F. Microbiological Quality and Somatic Cell
Count of Ewe Milk with Special Reference to Staphylococci. J. Dairy Sci. 2012. 85:1370-1375.
14. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition.
15. Azul tripán (C.I. 23850) para microscopia. Hoja informativa sobre el producto
comercial. Merck.
16. Baggot, JD. Principios de Farmacología Clínica Veterinaria. Ed. Acribia. Zaragoza. España.
1977.
408
17. Barcia Macay, Maritza; Seral, Cristina; Mingeot-Leclercq, Marie-Paule; Tulkens, Paul M.; Van
Bambeke, Françoise. Pharmacodynamic evaluation of the intracellular activities of antibiotics
against Staphylococcus aureus in a model of THP-1 macrophages. In: Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, Vol. 50, no. 3, p. 841-851 (2006).
18. Bauer AA, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by standardized
single disk method. Am J Clin Pathol 1966; 45:493-496.
19. Barragry, T.B. Veterinary Drug Therapy. Philadelphia (PA): Lea & Febiger, 1994.
20. Bean, R.C., Shepherd, W.C., Chan, H. Permeability of lipid bilayer membranes to organic
solutes. J Gen Physiol 1968; 52: 495-508.
21. Benet LZ, Kroetz DL, Sheiner LB. Pharmacokinetics: the dynamics of drug absorption,
distribution and elimination. En: Hardman JG, Limbird LE, Molinoff PF, Ruddon RW, editores.
Goodman & Gilman´s The pharmacological basis of therapeutics. 9 ed. USA: McGraw-Hill;
1996. p. 3-28.
22. Betancourt, O, Scarpa, C. y Villagran, K. 2003. Estudio de resistencia de cepas de
Staphylococcus aureus aisladas de mastitis subclínica bovina frente a cinco antibióticos en
tres sectores de la IX región de Chile. Revista Científica FCV-LUZ 13 (5): 413-417.
23. Betriu. Carmen, Gomez Maria, Sanchez Ana, Cruceyra Antonio, Romero Jose and Picazo Juan.
1994. Resistance and Penicillin Tolerance in Clinical Isolates of Group B Streptococci.
Antimicrob Agents and Chemother p. 2183-2186 Vol. 38, No. 9 0066-4804/94/$04.00+0
Copyright X 1994, American Society for Microbiology Antibiotic
24. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath. Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology 1994. (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-
7.
25. Bhavsar, S. K. and A. M. Thaker (2012). Pharmacokinetics of Antimicrobials in Food Producing
Animals, Readings in Advanced Pharmacokinetics - Theory, Methods and Applications, Dr.
Ayman Noreddin (Ed.), InTech, DOI: 10.5772/33787. Available from:
http://www.intechopen.com/books/readings-in-advanced-pharmacokinetics-theory-
methods-and-applications/pharmacokinetics-of-antimicrobials-in-food-producing-animals
26. Blackwell Prokesch, R.C., Hand, W.L. Antibiotic entry into human polymorphonuclear
leukocytes. Antimicrob Agents Chemother 1982; 21: 373-380.
27. Biesenkamp-Uhe, C. Li., Hehnen, H. R., Sachse, K. y Kaltenboeck, B., Therapeutic
Chlamydophila abortus and C. pecoum. Vaccination Transiently Reduces Bovine Mastitis
Associated with Chlamydophila Infection. Infection and Imnunity: 2007. 75 (2), 870-877.
28. Bigger, J.W. The bactericidal action of penicillin on Staphylococcus pyogenes. Ir J Med Sci
1944; 227: 533-568.
29. Bochniarz M, Wawron W, Szczubial M. Resistance to methicillin of coagulase-negative
staphylococci (CNS) isolated from bovine mastitis. Pol J Vet Sci. 2013;16 (4):687-92.
30. Bonventre, P.F., Imhoff, J.G. Uptake of 3H-dihydrostreptomycin by macrophages in culture.
Infect Immun 1970; 2: 86-93.
31. Boothe D.M. The analgesic-antiinflammatory drugs. In: Adams H.R. editor. Veterinary
Pharmacology and Therapeutics. 7th ed. Ames (IO): Iowa State University Press, 1995: 432-
449.
409
32. Boswell FJ, Andrews JM, Wise R, Dalhoff A. Bactericidal properties of moxifloxacin and post-
antibiotic effect. J Antimicrob Chemother 1999; 43:43-49.
33. Baroni, E. Russi, N. Rubio, M; Picco, E. Formentini, E. 2014. Actividad antibacteriana in vitro
de ciprofloxacina sobre Escherichia coli. InVet, 16 (1): 7-14. ISSN 1514-6634 (impreso) ISSN
1668-3498 (en línea).
34. Bramley. A.J. and Dodd, F.H. Reviews of the progress of dairy science: Mastitis control -
progress and prospects. J. Dairy Res. 1984; 51:481-512.
35. Brown, K.N., Percival, A. Penetration of antimicrobials into tissue culture cells and leucocytes.
Scand J Infect Dis 1978; 14 (Suppl.): S251-S260.
36. Brown SA. Fluorquinolones in animal health. Journal of Veterinary Pharmacology and
Therapeutics. 1996; 19: 1-14.
37. Bundtzen, R.W., Gerber, A.U., Cohn, D.L., Craig, W.A. Postantibiotic suppresion of bacterial
growth. Rev Infect Dis 1981; 3 (1): 28-37.
38. Calvinho, L. F. y L. Tirante. Prevalencia de microorganismos patógenos de mastitis bovina y
evolución del estado de salud de la glándula mamaria en Argentina en los últimos 25 años.
Rev. FAVE Sección Cs. Vet. 2005; 4:29-40.
39. Calvinho, L. F. 2004 Jornada Internacional de Calidad de Leche y Mastitis. Organizada por
APROCAL. Facultad de Ciencias Veterinarias, “Mastitis en Argentina: evolución en los últimos
diez años y perspectivas futuras”.
40. Calvinho, L. F. "Mastitis bovina”. En: Curso de postgrado de Especialistas en Producción
Lechera. Facultad de Agronomía, Universidad Nacional del Litoral. 2012 Pp. 25.
41. Cantón R. Lectura interpretada del antibiograma: ¿necesidad clínica o ejercicio intelectual?
Enf Infec Microbiol Clin, 20 (2002), pp. 176-86.
42. Cao, C.X., Silverstein, S.C., Neu, H.C., Steinberg, T.H. J774 macrophages secrete antibiotics via
organic anion transporters. J Infect Dis 1992; 165: 322-328.
43. Carlier, M.B., Scorneaux, B., Tulkens, P.M. Uptake and subcellular localization of sparfloxacin
(AT-4140, RP-64206;S) in phagocytic cells. 30th Interscience Conference of Antimicrob Agents
and Chemother, Atlanta 1990; Abstr. 1243.
44. Carlier, M.B., Scorneaux, B., Zenebergh, A., Desnottes, J.F., Tulkens, P.M. Cellular uptake,
localization and activity of fluoroquinolones in uninfected and infected macrophages. J
Antimicrob Chemother 1990; 26 (Suppl. B): S27-S39.
45. Carlier, M.B., Zenebergh, A., Tulkens, P.M. Cellular uptake and subcellular distribution of
roxithromycin and erythromycin in phagocytic cells. J Antimicrob Chemother 1987; 20 (Suppl.
B): S47-S56.
46. Carrillo Raúl Esper, Miriam Zavaleta Bustos, Haidee Álvarez Alcántara, Dulce María Carrillo
Córdova, Carlos Alberto Carrillo Córdova. 2013. The importance of pharmacokinetic and
pharmacodynamic parameters in antibiotic prescription. Rev. Fac. Med.
(Méx.) vol.56 no.3 México may./jun.
47. Carryn S, Van Bambeke F, Mingeot-Leclercq MP, Tulkens PM. Comparative intracellular (THP-
1 macrophage) and extracellular activities of beta-lactams, azithromycin, gentamicin, and
fluoroquinolones against Listeria monocytogenes at clinically relevant concentrations.
Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:2095–103.
410
48. Chavez, C. Javier. Curso: Sistemas de Produccion Lechera de ARGENTINA Y CUBA. Calidad de
leche y mastitis bovina 2009. Facultad de ciencias Veterinarias UBA.
49. Chokr A, Watier D, Eleaume H, Pangon B, Ghnassia JC, Mack D, Jabbouri S. Correlation
between biofilm formation and production of polysaccharide intercelular adhesin in clinical
isolates of coagulase-negative staphylococci. Int. J. Med. Microbiol. 2006; 296: 381-388.
50. Clarke SR; Foster SJ. Surface adhesins of Staphylococcus aureus. Adv. Microb. Physiol. 2006;
51: 187-225.
51. Coetzer, J.A.W.; Thomson, G.R.; Tustin, R.C. Infectious diseases of livestock. 1994; vol 2:1564-
1595.
52. Corbellini, C.N. Actualización de la patogenia y diagnóstico de mastitis. Memorias del
Congreso Nacional de Calidad de Leche y Mastitis. Río Cuarto. 1996; p. 37-48.
53. Cordero, L. Mastitis bovina como factor negativo de la productividad [en línea]. Universidad
Nacional de Costa Rica (1999).
54. Corvaisier, S., Mairie, P.H., Bouvier d’Yvoire, M.Y., Barbaut, X., Bleyzac, N. and Jelliffe, R.W.
Comparisons Between Antimicrobial Pharmacodynamic Indices and Bacterial Killing as
Described by Using the Zhi Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. July, 1998; 1731-
1737.
55. Costa, E.O. et al. Mastite subclínica: prejuízos causados e os custos de prevenção em
propriedades leiteiras.Rev Napgama. v.2, p.16-20, 1999.
56. Cowan, S.T. & Steel, K.J. Manual for the Identification of Medical Bacteria. Cambridge,
University Press. 1965.
57. Craig WA. Does the dose matter? Clin Infect Dis 2001; 33:S233-S237.
58. Craig WA, Gudmundsson S. Postantibiotic effect. In: Lorian V, ed. Antibiotics in laboratory
medicine. 4th ed. Baltimore: Williams and Wilkins, infected with H. influenzae was only 15%–
20% [41]. These 1996:296–329.
59. Craig WA. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing
of mice and men. Clin Infect Dis 1998; 26:1-12.
60. Craig, N. L. 2002. “Tn7,” in Mobile DNA II, eds. N. Craig, R. Craigie, M. Gellet, and A. M.
Lambowitz (Washington: ASM Press), 432–456
61. Craven, N. Efficacy and financial value of antibiotic treatment of bovine clinical mastitis
during lactation. A review. Br. Vet. J., 1997; 143:410-422.
62. Cucarella C, Solano C, Valle J, Amorena B, Lasa I, Penades JR. Bap, a Staphylococcus aureus
surface protein involved in biofilm formation. J. Bacteriol. 2001; 183: 2888-2896.
63. Cucarella CM, Tormo A, Ubeda C, Trotonda MP, Monzon M, Peris C, Amorena B, Lasa I,
Penades JR. Role of biofilm-associated protein bap in the pathogenesis of bovine
Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 2004; 72: 2177-2185.
64. D’Argenio & Schumitzky (2003) ADAPT II, Software, Biomedical Simulations Resource (BMSR).
65. David, N.A. The pharmacology of dimethyl sulfoxide. Ann. Rev. Pharmacol., 1972; 12:353-
374.
66. De Boer, A.J. Socio-economic aspects of dairying in developing countries. Journal of Dairy
Science. 1981; 64:2453-2463.
411
67. Delcour AH. 2009. Outer membrane permeability and antibiotic resistance. Biochim Biophys
Acta. May; 1794(5):808-16.
68. Díaz D. Diego Carlos. 2012. Comportamiento farmacocinético de la marbofloxacina en
bovinos de diferentes edades y relación PK-PD frente a mastitis estafilocócicas. Universidad
Complutense de Madrid. Facultad de Veterinaria. Departamento de toxicologia y
farmacología.
69. Dingwell, R.T., Leslie, K.E., Duffield, T.F., Schukken, Y.H., Des-Coteaux, L., Keefe, G.P., Kelton,
D.F., Lissemore, K.D., Shewfelt, W., Dick, P., Bagg, R., 2003. Efficacy of intramammary
tilmicosin and risk factors for cure of Staphylococcus aureus infection in the dry period. J.
Dairy Sci. 86, 159–168.
70. Djabri, B., Barielle, N., Beaudeau, F., Seegers, H. Quarter milk somatic cell count in infected
dairy cows: a meta analysis. Vet. Res. 2002; 33:335-357.
71. Dobbins, C.N. Mastitis losses. Journal of the American Veterinary Medical Association. 1977;
170:1129-1132.
72. Dodd, F.H.; Griffin, T.K. & Kingwill, R.G. Proceeding of the IDF Seminar on Mastitis Control
1975. Bulletin of the International Dairy Federation, 1975; Document 85.
73. Dodd, F.H. Mastitis Therapy. The role of therapy in mastitis control. In: International Mastitis
Symposium, MacDonald College, Ste Anne de Bellevue Quebec, Canada, 1987 pp 161-175.
74. Drugeon, H. B., Le Gallou, F. & Caillon, J. 1990. Methodes d'etude de l'activite bactericide. In
Bactiricidie, Aspects Theoriques et Therapeutiques pp. 113-26. Maloine, Paris.
75. Drusano GL, Ambrose PG, Bhavnani SM, Bertino JS, Nafziger AN, Louie A. Back to the future:
Using aminoglycosides again and how to dose them optimally. Clin Infect Dis. 2007;45:753–
60.
76. Du Preez, J.H. Antibioteseresidue in melk. Veterinary Clinical. August 1980; 9-10.
77. Dubois. J, Fernandes. P. In Vitro Activity of CEM-101 Against Resistant Strains of
Staphylococcus aureus. Cempra Pharmaceuticals Inc., Chapel Hill, NC Revised Abstract
Objective Discussion ICAAC 2009.
78. EMEA Committee for Veterinary Medicinal Products: Note for guidance for the
determination of withdrawal periods for milk. 1998; EMEA/CVMP/473/98.
79. Eng, R. H., F. T. Padberg, S. M. Smith, E. N. Tan, and C. E. Cherubin. Bactericidal effects of
antibiotics on slowly growing and nongrowing bacteria. Antimicrob. Agents Chemother.
1991. 35:1824–1828.
80. Errecalde J. El uso racional de los antimicrobianos en explotaciones lecheras. Jornadas de
Actualización en Lechería. Lincoln, Buenos Aires, Argentina. (1994b).
81. Errecalde J. El control de puntos críticos en el tambo: Una alternativa viable en nuestro
medio? Segundo Curso de Actualización Profesional Fisiopatología de la Lactancia y Calidad
de Leche. Universidad Nacional de La Plata, INTA y CREA. (2000a). Pp 99-105.
82. Errecalde J. La elección del medicamento de calidad. Libro de resúmenes de las XIV Jornadas
Ganaderas de Pergamino, Buenos Aires. Argentina. (2003). Pp. 72-76.
83. Errecalde, J.O. Antimicrobianos en leche. Su importancia en salud pública. Boletín Técnico
presentado por Boehringer Ingelheim S.A. (1996).
84. Erskine, R.J. Empleo de Fármacos antimicrobianos en la mastitis bovina. Terapéutica. (2002).
412
85. Erskine RJ, Walker RD, Bolin CA, Bartlett PC, White DG. Trends in Antibacterial Susceptibility
of Mastitis Pathogens during a Seven-Year Period. J Dairy Sci 2002; 85:1111-1118.
86. Fang, W. and Vikerpur, M. 1995. Potency of antibacterial drug in milk as analyze by
BGlocoronidase- Based Fluorometry, J. Vet. Pharmacol. Ter., Vol 18 (6) 422- 428.
87. Ferraro, L.; Scaramelli, A.M. y Troya, H.R. Prevalencia de la mastitis subclínica bovina en
Venezuela y evaluación de la prueba de California para mastitis. Memorias del Congreso
Panamericano de Control de la Mastitis y Calidad de la Leche. Mérida, Yucatán, México.
1998. p. 46.
88. Foulds, G., R. M. Shepard, and R. B. Johnson. 1990. The pharmacokinetics of azithromycin in
human serum and tissues. J. Antimicrob. Chemother. 25 (Suppl. A):73-82. [PubMed].
89. Fuentes, F., M. M. Martin, J. Izquierdo, M. L. Gomez-Lus, and J. Prieto. In vivo and in vitro
pharmacodynamic effects of meropenem. Scand. J. Infect. Dis. 1995; 27:469–474.
90. Fuentes Martinez Fernando. Estudio “in vitro” e “in vivo” de diversos parámetros
farmacodinámicos de meropenem y ciprofloxacino con S. aureus, E. coli y P. aeruginosa
1994. Universidad Complutense de Madrid Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de
Microbiología III BIBLIOTECA UCM
91. Furet, Y.X. Deshusses, J., Pechère, J.C. Transport of pefloxacin across the bacterial
cytoplasmic membrane in quinolone-susceptible Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents
Chemother 1992; 36: 2506-2511.
92. Fustes, E.; Avila, C. y Ortega, L. Mastitis Bovina: Efecto sobre la producción lechera y la
economía agropecuaria en Cuba. Rev. Salud Anim. 1985; 7:91-100.
93. García Rodríguez, J.A., Cantón, R., García Sánchez, J.E., Gómez-Lus, M.L., Martínez Martínez,
L., Rodríguez-Avial, C. y Vila, J. Métodos Especiales para el Estudio de la Sensibilidad a los
Antimicrobianos. En Juan J. Picazo Editor. 2001.
94. García Rodríguez JA, Cantón R, García Sánches JE, Gómez-Lus ML, Martínez Martínez L,
Rodríguez-Avial C, Vila J. (2000) Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los
antimicrobianos.
95. Gasque, R. y Blanco, M.A. Mastitis bovina [cd-room]. En su: Zootecnia en bovinos
productores de leche [Ciudad México]: UNAM. 2001. p. 155-171.
96. Gianneechini, R, Concha C, Delucci I , Gil J , Salvarrey L, Rivero R. (2014). Bovine mastitis,
distribution of pathogens and antimicrobial resistance in the Southern Dairy Basin of
Uruguay. Revista de la Sociedad de medicina Veterinaria de Uruguay, vol 50 (196): 4-32
97. Gieseck H.W. The definition of bovine mastitis and the diagnosis of its subclinical types during
normal lactation. Proceedings of the IDF seminar of mastitis control. Reading University
collage of state management Reading England 1975.
98. Giesecke, W.D. Bovine mastitis. Dept. Agric. Tech. Serv. Rep. S. Africa, Technical Comunic.
1979; 51:1-37.
99. Giesecke, W.H. Bovine mastitis. Science Bulletin, Nº401. Pretoria: Department of Agriculture.
1983.
100. Giesecke, W.H. The diagnosis and control of bovine mastitis as a means of improving the
quality of milk. South African Journal of Dairy Technology, 1985; 17:3-21.
413
101. Gilson, W. Interpreting and using mastitis screening test [en línea]. University of Georgia
College of Agricultural & Environmental Sciences. Bulletin 913 (1995).
102. Gómez-Lus ML, Calvo A, Bouza E, Prieto J. (2005) Quimioterapia antiinfecciosa y antitumoral:
Antibióticos y quimioterápicos. Generalidades. En: Leza Cerro JC, Lizasoaín Hernández I,
Lorenzo Fernández P, Moreno González A, Moro Sánchez MA (eds): Velásquez Farmacología
básica y clínica (20ª Ed) Buenos Aires, Ed. Panamericana, p. 825-839.
103. Gómez J, Bonillo C, Ruiz J. 2013. Bases para optimizar el uso de antibióticos en la Clínica
Práctica. En (Gómez J, Gobernado M. Eds) Enfoque Clínico de los Grandes Síndromes
Infecciosos. Madrid. Ergón Ed. 5ª edición 2013: 689-702.
104. Gottfredsson, M., Erlendsdottir, H., Gudmundsson, S. Quantitation of postantibiotic effect by
measuring CO2 generation of bacteria with the BACTEC blood culture-system. Antimicrob
Agents Chemother 1991; 35 (12): 2658-2661.
105. Gudmundsson, S., B. Vogelman, and W. A. Craig. The in vivo postantibiotic effect of
imipenem and other new antimicrobials. J. Antimicrob. Chemother. 1986; 18(Suppl. E):67–
73.
106. Gottfredsson, M., Erlendsdottir, H., Gudmundsson, A., Gudmundsson, S. Ultrastructural
alterations of P. aeruginosa and S. aureus during the postantibiotic effect (PAE) phase. ICAAC
1991; Abstr. 934.
107. Gould, I.M., Jason, A.C., Milne, K. Use of the Malthus Microbial Growth Analyser to study the
postantibiotic effect of antibiotics. J Antimicrob Chemother 1989; 24: 523-531.
108. Gutman, G., E. Guiguet y J. Rebolini. Los ciclos en el complejo làcteo argentino. Análisis de
políticas lecheras en países seleccionados. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y
Alimentos. Programa Calidad de los Alimentos Argentinos. 2003.
www.alimentosargentinos.gov.ar/programa_calidad/Estudio_lacteo.pdf Pp. 267.
109. Gregoriadis, G. Engineering liposomes for drug delivery: Progress and problems, Trends in
Biotechnology, 1995, 13: 527-537.
110. Gruet, P., P. Maincent, X. Berthelot, and V. Kaltsatos. 2001. Bovine mastitis and
intramammary drug delivery: Review and perspectives. Adv. Drug Deliv. Rev. 50:245–259.
111. Halasa, T., K. Huijps and H. Hogeveen. Bovine mastitis, a review. Vet Q. 2007. 29: 18-31.
112. Halasa, T., Huijps, K., Osteras, O. y Hogeveen, H. Economics effects of bovine mastitis and
mastitis management: A review. Veterinary Quaterly. 2007; 29 (1): 18-31.
113. Hanberger, H., Nilsson, L.E., Kihlstrom, E., Maller, R. Postantibiotic effect of b-lactam
antibiotics on Escherichia coli evaluated by bioluminescence assay of bacterial ATP.
Antimicrob Agents Chemother 1990; 33 (1): 102-106.
114. Hand, W.L. Antibiotics and phagocytic cells. Antimicrob Newletter 1988; 5: 53-60.
115. Hand, W.L., Boozer, R.M., King-Thompson, N.L. Antibiotic uptake by alveolar macrophages of
smokers. Antimicrob Agents Chemother 1985; 27: 42-45.
116. Hand, W.L., King-Thompson, N.L. Contrast between phagocyte antibiotic uptake and
subsequent intracellular bactericidal activity. Antimicrob Agents Chemother 1986; 29: 135-
140.
117. Hans Andresen S. Mastitis: prevención y control. Revista de Investigaciones Veterinarias del
Perú, 2001.
414
118. Hartman. B. J. and Tomasz J. 1984. Low-affinity penicillin-binding protein associated with
beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus. Bacteriol. May; 158(2): 513–516. PMCID:
PMC215458
119. Hebert, A.; Sayasith, K.; Senechal, S.; Dubreuil, P. and Lagace, J. Demostration of intracellular
Staphylococcus aureus in bovine mastitis alveolar cells and macrophages isolated from
naturally infected cow milk. FEMS Microbiol. Lett. 2000; 193(1):57-62.
120. Heeschen, W.; Suhren, G. & Hahn, G. Mastitis: Significance for processing of milk and public
health aspects. Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte, 1985; 37:233-243.
121. Hooper. D.C. Clin. Infect. Dis. 2001, 32, S9-S15
122. Hesen, M. T., P. G. Pitsakis, and M. E. Levison. Absence of postantibiotic effect in
experimental Pseudomonas endocarditis treated with imipenem, with or without gentamicin.
J. Infect. 1988; Dis. 158:542–548.
123. Hunter PA, Rolinson GN, Witting DA. Comparative activity of amoxicillin and ampicillin in an
experimental bacterial infection in mice. Antimicrob Agents Chemother 1973; 4:285-93.
124. Hugues Chanteux1, Marie-Paule, Mingeot-Leclercq, Etienne Sonveaux, Françoise Van
Bambeke and Paul M. Tulkens. Intracellular accumulation and activity of ampicillin used as
free drug and as its phthalimidomethyl or pivaloyloxymethyl ester (pivampicillin) against
Listeria monocytogenes in J774 macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 2003. 52, 610–
615.
125. Hyatt, J.M., McKinnon, P.S., Zimmer, G.S. and Schentag, J.J. The importance of
pharmacokinetic/pharmacodynamic surrogate markers to outcome. Clinical Pharmacokinetic
Concepts, 1995; 28, 143-160.
126. Illini DairyNet. University of Illinois (2000). Urbana-Champaingn.
127. Isaksson B., Nilsson L., Maller R., Sorén L. Postantibiotic effect of aminoglycoside on Gram-
negative bacteria evaluated by a new method. J. Antimicrob. Chemother., 1988; 22: 23-33.
128. Iskandar I, Walters JD. 2011. Clarithromycin accumulation by phagocytes and its effect on
killing of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. J Periodontol; 82:497–504.
129. Izak, E., and S. Ackermann. Prevalence and incidence of clinical mastitis at early lactation in
dairy farms with low bulk tank somatic cell count in Argentina. Proc. 49th Annual Meeting of
the National Mastitis Council, 2010; pp 266-267.
130. Jacobs MR. Building in efficacy: developing solutions to combat drug-resistant S.
pneumoniae. Clin Microbiol Infect 2004; 10:18-27.
131. Johnson, J D., Hand, W. L., Francis, J.B., King-Thompson, N., Corwin, R.W. Antibiotic uptake by
alveolar macrophages. J Lab Clin Med 1980; 35: 429-439.
132. Kapusnik-Uner JE, Sande MA, Chambers, HF. 1996 Fármacos antimicrobianos: Tetraciclinas,
cloranfenicol, eritromicina y diversos antibacterianos. En: Hardman JG, Limbird LE, Molinoff
PB, Ruddon RW, Goodman Gilman A (eds): Las bases farmacológicas de la terapéutica. Vol II
(9ª Ed) México, Ed. McGraw-Hill Interamericana, p. 1205-1211.
133. Khan, IU, Hassan, A A., Abdulmawjood, A., Lämmler, C., Wolter, W., Zschöck, M.
Identification and epidemiological characterization of Streptococcus uberis isolated from
bovine mastitis using conventional and molecular methods. Journal of Veterinary Science.
2003; 4(3): 213-24.
415
134. Keith D. DeDonder, Ronette Gehring, Ronald E. Baynes, Lisa A. Tell, Thomas W. Vickroy,
Michael D. Apley, and Jim E. Riviere. 2013. Effects of new sampling protocols on procaine
penicillin G withdrawal intervals for cattle. Journal of the American Veterinary Medical
Association, November 15, 2013, Vol. 243, No. 10, Pages 1408-1412. (doi:
10.2460/javma.243.10.1408).
135. Kerr, D. E., Plaut, K., Bramley, A. J., Williamson, C. M., Lax, A. J., Moore, K. Lysostaphin
expresion in mammary glands confers protection against staphylococal infection in
transgenic mice. Nature Biotechnology. 2001; 19:66-70.
136. Klempner, M.S. Antibiotic penetration into phagocytes. A determinant of therapeutic
efficacy? Drug Ther 1982; 12: 44-53.
137. Klempner, M.S. White cells. En: Ristuccia, A.M., Cunha, B.A. (Eds.). Antimicrobial therapy.
Raven Press, New York 1984; 513-517.
138. Klostermann, K, Crispie, F. Flynn, J., Meaney, W., Ross, R. Paul and Hill, C. Efficacy of a teat
dip containing the bacteriocin lacticin 3147 to eliminate Gram-positive pathogens associated
with bovine mastitis. Journal of Dairy Research, 2010; 77, pp 231-238.
139. Knudsen JD, Frimodt-Møller N, Espersen F. 1995. Experimental Streptococcus pneumoniae
infection in mice for studying correlation of in vitro and in vivo activities of penicillin against
pneumococci with various susceptibilities to penicillin. Antimicrob Agents
Chemother 39:1253–1258.
140. Koga, H. High-performance liquid chromatography measurement of antimicrobial
concentrations in polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob Agents Chemother 1987; 31:
1904-1908.
141. Kunin CM. Dosage schedules of antimicrobial agents: a historical review. Rev Infect Dis 1981;
3:4-11.
142. Kurt Fuursted, Jenny Dahlknudsen, Mette Barendorff Petersen, Rikke Lykke Poulsen, and
Dorte Rehm. Comparative Study of Bactericidal Activities, Postantibiotic Effects, and Effects
on Bacterial Virulence of Penicillin G and Six Macrolides against Streptococcus pneumoniae.
Antimicrobial Agents and chemoteraphy, Apr. 1997, p. 781–784.
143. Labro, M.T., Babin-Chevaye, C., Hakim, J. Influence of subinhibitory concentrations of
ceftriaxone on opsonization and killing of Pseudomonas aeruginosa by human neutrophils. J
Antimicrob Chemother 1988; 22: 341-352.
144. Larriestra. Alejandro. Claudina Vissio. 2012. Producir XXI, Bs. As., 20(249):28-32. Proyecto
PICTO 30368/05. Grupo Responsable: Liliana Odierno, Cristina Bogni, Jose Giraudo, Alejandro
Larriestra. FCEFQyN y FAV, UNRC. 0358-4676508.
145. Laufen, H., Wildfeuer, A. Ketics of the uptake of antimicrobials agents by human
polymorphonuclear leucocytes. Arzneim Forsch 1989; 39: 233-235.
146. Larrea, D. Caracterizacion y eficiencia de la producción lechera en el noreste de la pampa
Argentina. (2011) Tesis presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de
Córdoba (España).
147. Lebreton, J.D. & Miller, C. Modèles Dynamiques Dèterministes en Biologie. Masson, Paris,
1982; 54-56.
416
148. Lees P. and May S.A. Inflammation and antiinflammatory drugs. In: Andrews A.H. Blowey,
R.W. and Boyd H. Bovine Medicine. Diseases and Husbandry of Cattle. Oxford (UK) Blackwell
Scientific Pub. 1992: 843-863.
149. Lizarraga M.I. y Sumano L.H. Farmacología clínica de los antihistamínicos en medicina
veterinaria. Veterinaria México 29 (4) 369- 383 (1998).
150. Loo, K.C., Cario, A.C., Zhang, F., Walters, J.D. Regulation of ciprofloxacin uptake in human
promyelocytic leukemia cells and polymorphonuclear leukocytes. J Leukocyte Biol 1997; 61:
619-623.
151. Loor, J.J.; Jones, G.M. y Bailey, T.L. Aspectos básicos sobre el desarrollo de mastitis (1999).
[enlínea]. Instituto y Universidad Politécnica de Virginia. Blacksburg.
152. Lopez-Benavides, MG., Williamson, JH., Pullinger, GD., Lacy-Hulbert, SJ., Cursons, RT., Leigh,
JA. Field observations on the variation of Streptococcus uberis populations in a pasture-based
dairy farm. Journal of Dairy Science 2007; 90(12): 5558-66.
153. Lorian 14 1985. Low concentration of antibiotics. J. Antimicrob. Chemother. I5 (Supp. A): 15-
26.
154. Lorian E, Tosch IV, Joyce D. 1985. Weight ami morphology of bacteria exposed to antibiotics.
pp: 65-72. Pie influence of antibiotics on the hostparasite 11, ed. Adam D., Hahn H.,
Opferkuch. Springer-Vverlag, Berlin Heidelberg.
155. Lucas, M. 2009. Alternativas terapéuticas para el manejo racional de la
mastitis subclínica por staphylococcus aureus. Tesis doctoral. Catedra de farmacologia
farmacotecnia y terapeutica. UNLP.
156. Lucas. M. F, Errecalde. J. O. and Mestorino. N. 2010. Pharmacokinetics of azithromycin in
lactating dairy cows with subclinical mastitis caused byStaphylococcus aureus. Journal of
Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 33: 132–140. doi:10.1111/j.1365-
2885.2009.01128.x
157. MacGowan AP, Wise R. Establishing MIC breakpoints and the interpretation of in vitro
susceptibility tests. .J Antimicrob Chemother, 48 (2001), pp. 17-28
158. Magoffin, R.L., Spink, W.W. 1951. The protection of intracellular Brucella against
streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J Lab Clin Med; 37: 924-929.
159. Mandell, G.L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest 1973; 52:
1673-1679.
160. Mandell, G.L. Catalase, superoxide dismutase, and virulence of Staphylococcus aureus. In
vitro and in vivo studies with emphasis on staphylococcal-leukocyte interaction. J Clin Invest
1975; 55: 561-566.
161. Mandell, G.L., Coleman, E. Uptake, transport and delivery of antimicrobial agents by human
polymorphonuclear neutrophils. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 1794-1798.
162. Mandell, G.L, Petri, W.A. Antimicrobial agents. in: J.G Hardman, L.E Limbird, P.B Molinoft
(Eds.)Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. 10th ed. McMillan
Co, New York; 2001:1073–1098.
163. Martínez, Elsa. Utilización de métodos de diagnóstico simplificados para estimar la situación
de mastitis bovina en los rebaños. La Habana. 115 h. Tesis (en opción al grado científico de
Candidato a Doctor en Ciencias)-- CENSA. 1984.
417
164. Marshall AJ, Piddock LJ. 1994. Interaction of divalent cations, quinolones and bacteria. J
Antimicrob Chemother. Oct; 34(4):465-83.
165. Mastitis Council Homepage (1997b).
166. Mattie H. (1981) Kinetics of Antimicrobial Action. Rev. Infect. Dis. 3, 19-27.
167. Mattie, T., Dokkum, A.M., van Brus-Weijer, L., Krul, A.M. and Strijen, E. Antibacterial Activity
of Four Cephalosporins in an Experimental Infection in Relation to in vitro Effect and
Pharmacokinetics. J. Infect. Dis. 1990 ; 162, 717-722.
168. Mattie, H., L.-C. Zhang, E. van Strigen, B. R. Sekin, and A. E. A. Douwes-Idema. 1997.
Pharmacokinetic and pharmacodynamic models of the anti staphylococcal effects of
meropenem and cloxacillin in vitro and in experimental infection. Antimicrob. Agents
Chemother. 41:2083-2088.
169. Mazzei T, Novelli A. How macrolide pharmacodynamics affect bacterial killing. Infect Med.
1999. 16:22-28.
170. Mc Dowell, R.E. Limitations for dairy production in developing countries. Journal of Dairy
Science, 1981; 64:2463-2474.
171. McDonald, P. J., W. A. Craig, and C. M. Kunin. Persistent effect of antibiotics on
Staphylococcus aureus after exposure for limited periods of time. J. Infect. Dis. 1977;
135:217–223.
172. McKinnon P, Davis S. Pharmacokinetic and pharmacodynamic issues in the treatment of
bacterial infectious diseases. Eur J Clin Infect Dis 2004; 23: 271-88.
173. Mediavilla A, J Florez y J García-Lobo. Farmacología de las enfermedades infecciosas:
principios generales, selección y asociaciones de antibióticos. En: Florez J, Armijo J y
Mediavilla A (eds.). Farmacología humana. Tercera edición. Editorial Masson. Barcelona,
España. 1997. Pp 1062-1066.
174. Meglia, G.E.; Mata, H.T. Mecanismos específicos e inespecíficos de defensa, con relación a a
la glandula mamaria de los bovinos productores de leche. Producción Bovinos para Leche.
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam., Gral. Pico, La Pampa., gmeglia@ciudad.com.ar.
175. Menezes Ferreira. L. et al. Variabilidades fenotípica e genotípica de estirpes de
Staphylococcus aureus isoladas em casos de mastite subclínica bovina. Ciência Rural.
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), v. 36, n. 4, p. 1228-1234, 2006. Disponible en:
<http://hdl.handle.net/11449/29344>.
176. Mestorino N. Control de residuos químicos en animales productores de leche. Primeras
Jornadas Técnicas de Ciencia y tecnología de Carnes y Alimentos. Montevideo, Uruguay.
2001.
177. Mestorino, N. Estudio Farmacocinético del Tianfenicol en vacas lecheras Holando Argentino.
Tesis Doctoral, FCV - UNLP. 1993.
178. Mestorino, N and Errecalde Jorge O. (2012). Pharmacokinetic – Pharmacodynamic
Considerations for Bovine Mastitis Treatment, A Bird's-Eye View of Veterinary Medicine, Dr.
Carlos C. Perez-Marin (Ed.), InTech, DOI: 10.5772/31721. Available from:
http://www.intechopen.com/books/a-bird-s-eye-view-of-veterinary-
medicine/pharmacokinetic-pharmacodynamic-considerations-for-bovine-mastitis-treatment
418
179. Minguez, F., J. Izquierdo, M. M. Martin, F. Fuentes, and J. Prieto. In vivo postantibiotic effect
of isepamicin and other aminoglycosides in a thigh infection model in neutropenic mice.
Chemotherapy 1992; 38:179–184.
180. Moise P, Forrest A, Bhavnani S, Birmingham M, Schentag J. Area under the inhibitory curve
and a pneumonia scoring system for predicting outcomes of vancomycin therapy for
respiratory infections byStaphylococcus aureus. Am J Health Syst Pharm 2000; 57 (Suppl 2):
4-9.
181. Molski, T.F.P., Naccache, P.H., Volpi, M., Wolpert, L.M., Sha'afi, R.I. Specific modulation of the
intracellular pH of rabbit neutrophils by chemotactic factors. Biochem Biophys Res Commun
1980; 94: 508-514.
182. Moore, G.A., and Heider, L.E. 1984. Treatment of mastitis. Vet. Clin. of North America. Large
An. Prac., 6:323-333.
183. Morin, D.E. and Hurley, W.L. Mastitis. Lesson B. [en línea]. Lactation Biology. ANSCI 308.
University of Illinois (1994). Urbana-Champaign.
184. Moulder, J.W. Comparative biology of intracellular parasitism. Microbiol Rev 1985; 49: 298-
337.
185. Mouton. Johan. W, Michael N. Dudley, Otto Cars, Hartmut Derendorf, and George L.
Drusano. 2005. Standardization of pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) terminology
for anti-infective drugs: an updateJ. Antimicrob. Chemother. (May 2005) 55 (5): 601-607.
186. Mozeris. Bases para el plan estratégico de la cadena láctea Argentina 2008-2020. Informe de
Avance. Disponible en: http://www.lacteos2020.org.ar /docs/Documento %20PEL%20
Final.pdf.
187. Mtairag, E.M., Abdelghaffar, H., Douhet, C., Labro, M.T. Role of extracellular calcium in vitro
uptake and intraphagocytic location of macrolides. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39:
1676-1682.
188. Mulazimoglu L, Tulkens PM, Van Bambeke F. Macrolides. In: Yu VL, Edwards G, McKinnon PS,
Peloquin C and Morse GD (eds), Antimicrobial Therapy and Vaccines, Volume II: Antimicrobial
Agents (2nd Ed) Pittsburg, ESun Technologies, p. 2005. 243-280.
189. Muñoz R, De La Campa AG. ParC subunit of DNA topoisomerase IV of Streptococcus
pneumoniae is a primary target of fluoroquinolones and cooperates with DNA gyrase A
subunit in forming resistance phenotype. Antimicrob Agents Chemother. 1996
Oct;40(10):2252-7.
190. National Mastitis Council. 1995. Mastitis Control in Dairy Herds. Cap. 9:229-277.
191. National Mastitis Council. 1997 A practical look at environmental mastitis National.
192. Nash, D. L, Rogers, G. W., Cooper, J. B, Hargrove, G. L, Keown, J. F. Heritability of
Intramammary Infections at First Parturition and Relationships with Sire Transmitting
Abilities for Somatic Cell Score, Udder Type Traits, Productive Life, and Protein Yield. J Dairy
Sci. 2003; 86:2684-2695.
193. National Committee for clinical laboratory Standards. Performance Standards for
Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Test for Bacteria Isolated from Animals;
Approved Standard NCCLS Document M31-A The National Committee for Clinical Laboratory
Standards. Wayne, P.A. USA. (1999a)
419
194. National Committee for clinical laboratory Standards Development of in vitro Susceptibility
Testing Criteria and Quality Control Parameters for Veterinary Antimicrobial Agents;
Approved Standard NCCLS Document M37-A The National Committee for Clinical Laboratory
Standards. Wayne, P.A. USA. (1999b).
195. National Committee for clinical laboratory Standards. Disk diffusion supplemental tables.
Document M100-S10. USA: NCCLS, Wayne P.A.; 2000.
196. National Committee for clinical laboratory Standards. Peformance Standards for
Antimicrobial Disk Susceptibility Tests - Approved standard - document M2-A7. USA: NCCLS,
Wayne P.A.; 2000.
197. National Committee for clinical laboratory Standards. Performance standards for
antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from animals -
Approved standard - document M31-A2 2 ed. USA: NCCLS. 2002.
198. Nazar, JC. Biofilms bacterianos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Rev. Otorrinolaringol. Cir Cabeza
Cuello 2007; 67: 61-72.
199. Nguyen, H. A., J. Grellet, D. Paillard, V. Dubois, C. Quentin, and M. C. Saux. 2006. Factors
influencing the intracellular activity of fluoroquinolones: a study using levofloxacin in
a Staphylococcus aureus THP-1 monocyte model. J. Antimicrob. Chemother. 57:883-890
200. Nielsen, S. L., N. Obel, M. Storgaard, and P. L. Andersen. The effect of quinolones on the
intracellular killing of Staphylococcus aureus in neutrophil granulocytes. J. Antimicrob.
Chemother. 1997. 39:617–622.
201. Nickerson, S.C. (1998). Estrategias para controlar la mastitis. Memorias del congreso
panamericano de control de mastitis y calidad de la leche. Mérida Yucatán, México.
202. Neerman, R., Keller, N., Barziali, A., Korenman, Z., Sela, S. Prevalence of internalisation-
associated gene, prtF1, among persisting group-A Streptococcus strains isolated from
asymptomatic carriers. Lancet 1998; 352: 1974-1977.
203. Nikaido, H., Thanassi, D.G. 1993. Penetration of lipophilic agents with multiple protonation
sites into bacterial cells: Tetracyclines and fluoroquinolones as examples. Antimicrob Agents
Chemother; 37: 1393-1399.
204. Noguera, E. La mejor manera de controlar la mastitis bovina [en línea]. FONAIAP-CIAE.
Ministerio de Ciencia y Tecnología. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Venezuela
(1999).
205. Novelli A, Fallan S, Cassette MI, Arrigucci S, Mazzei T. In vivo pharmacodynamic evaluation of
clarithromicin in comparison to erytromicin. J Chemother 2002; 14:584-590.
206. Odenholt, I., Holm, S. E., Cars, O. Effects of benzylpenicillin on Streptococcus pyogenes during
the postantibiotic phase in vitro. J Antimicrob Chemother 1989; 24: 147-156.
207. Odenholt, I., S. E. Holm, and O. Cars. Effects of supra and sub-MIC benzylpenicillin
concentrations on group A b-haemolytic streptococci during the postantibiotic phase in vivo.
J. Antimicrob. Chemother. 1990; 26:193–201.
208. Odenholt-Tornqvist, I., E. Lo¨wdin, and O. Cars. Postantibiotic effects and postantibiotic sub-
MIC effects of roxithromycin, clarithromycin, and azithromycin on respiratory tract
pathogens. Antimicrob. Agents Chemother. 1995; 39:221–226.
209. O'Gara, JP, Humphreys H, Staphylococcus epidermidis biofilms: importance and implications.
J. Med. Microbiol. 2001; 50: 582-587.
420
210. Okada, N., Tatsuno, I., Hanski, E., Caparon, M., Sasakawa, C. Streptococcus pyogenes protein
F promotes invasion of HeLa cells. Microbiology 1998; 144: 3079-3086.
211. Oliveira M, Bexiga R, Nunes SF, Carneiro C, Cavaco LM, Bernardo F Vilela CL. Biofilm-forming
ability profiling of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis mastitis isolates.
Vet. Microbiol. 2006; 118: 133-140.
212. Onyeji C, Nicolau D, Nightingale C, Quintiliani R. Optimal times above MICs of ceftibuten and
cefaclor in experimental intra-abdominal infections. Antimi- crob Agents Chemother 1994;
38: 1112-17.
213. Otero, J.L.; Mestorino, O.N.; Errecalde, J.O. (2001). Enrofloxacina: Una Fluorquinolona de uso
exclusivo en veterinaria. Parte I: Química, Mecanismo de acción, Actividad Antimicrobiana y
Resistencia Bacteriana. Analecta Veterinaria 21 (1): 31-41.
214. Otero, J.L; Mestorino, O.N.; Errecalde, J.O. (2001). Enrofloxacina: Una Fluorquinolona de uso
exclusivo en veterinaria. Parte II: Farmacocinética y Toxicidad. Analecta Veterinaria 21 (1):
42-49.
215. Otto M. Staphylococcal biofilms. Curr. Top. Microbiol. Immunol.2008; 322: 207- 228.
216. Owens WE. Mastitis therapy: rationale for new routes and regimens of treatment for
Staphylococcus aureus mastitis. Dairy, Food and Environmental Sanitation. 1991, 11: 11, 654-
655.
217. Owens. W.E, C.H. Ray, J.L. Watts, R.J. Yancey. 1997. Comparison of success of antibiotic
therapy during lactation and results of antimicrobial susceptibility tests for bovine mastitis
J. Dairy Sci, 80 (1997), pp. 313–317
218. Paillard, D., J. Grellet, V. Dubois, M. C. Saux, and C. Quentin. Discrepancy between uptake
and intracellular activity of moxifloxacin in a Staphylococcus aureus-human THP-1 monocytic
cell model. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46:288–293.
219. Pascual, A., García, I., Conejo, M.C., Perea, E.J. Fluorometric and High-Performance Liquid
Chromatographic measurement of quinolone uptake by human neutrophils. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis 1991; 10: 969-971.
220. Pascual, A., García, I., Perea, E.J. Fluorometric measurement of ofloxacin uptake by human
polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33: 653-656.
221. Pascual, A., García, I., Perea, E.J. Uptake and intracellular activity of an optically active
ofloxacin isomer in human neutrophils and tissue culture cells. Antimicrob Agents Chemother
1990; 34: 277-280.
222. Pastor, A., Cantón, E., Gobernado, M. Efecto postantibiótico (EPA). I. Metodos de estudio y
factores influyentes. Rev Esp Quimioterap 1992; 5 (3): 201-210.
223. Pellegrino, M.S, frola, I.D., Odierno, L.M. y Bognia, C.I. Mastitis Bovina: Resistencia a
antibióticos de cepas de Staphylococcus Martínez et al. 72 aureus asiladas de leche. REDVET
Rev. Electrón. Vet. (2011). 12 (7). Disponible en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070711/071110.pdf.
224. Pemán, J., Cantón, E., Ramón, M.S., Jiménez, T., Gobernado, M. Penetración y actividad de los
antimicrobianos en el interior de los fagocitos. Rev Esp Quimioterap 1991; 4: 27-36.
421
225. Pedersen, M., T. L. Benfield, P. Skinhoej, and A. G. Jensen. Haematogenous Staphylococcus
aureus meningitis. A 10-year nationwide study of 96 consecutive cases. BMC Infect. Dis.
2006; 6:49.
226. Peterson, L.R., Vanetta, L.L., Fasching, C.E., Gerding, D.N. Effect of protein binding on
stimulated intravascular and extravascular kinetics of cefotaxime in an in vitro model.
Antimicrob Agents Chemother 1984; 25: 58-61.
227. Philpot, W.N. and Nickerson, S.C. Mastitis: El contraataque. Una estrategia para combatir la
mastitis. Publicado por Babson Bros. Co. 1993.
228. Ping Li, Juan Li, ChangzhuWu, QingshengWu, and Jian Li. 2005. Synergistic antibacterial
effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles. Nanotechnology, 16:1912–
1917.
229. Poutrel, B. and Rainard, P. Predicting the Probability of quarter Infection (by major
pathogens) from Somatic Cell Concentrations. Am. J. Vet. Res. 1982; 43:1296.
230. Poiata. A, Tuchilus. C. Comparative In vitro activity of azithromicyn and other antimicrobial
agents against Staphylococci isolates. Analele tiinifice ale Universitii „Alexandru Ioan Cuza”,
Seciunea Genetic i Biologie Molecular, TOM XII, 2011
231. Preston S L, Drusano G L, Berman A L et al. Pharmacodinamics of levofloxacin: A new
paradigm for all clinical trials. JAMA 1998; 279: 125-9.
232. Prescott, J.F. and J.D. Baggot (1988). Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine.
233. Prescott J.F., J.D. Baggott and R.D., Walker. Terapeutica Antimicrobiana en Medicina
Veterinaria. Editorial Intermédica. 2002. Pg. 613-642.
234. Pyörälä Satu, Suvi Taponen, 2009 Coagulase-negative staphylococci-Emerging mastitis
pathogens.
235. Pyörälä, S. (2009). Treatment of mastitis during lactation. Irish Veterinary Journal, 62(Suppl
4), S40–S44. http://doi.org/10.1186/2046-0481-62-S4-S40
236. Ramadan, M.A., Tawfik, A.F., Shibl, A.M. Impact of post-antibiotic effect (PAE) of new
macrolides on adherence, PMP functions and production of haemolysin by streptococcal
species. 33th Interscience Conference on Antimicrobial Agents Chemotherapy 1993; Abstr.
656.
237. Rato, MG., Bexiga, R., Nunes, SF., Cavaco, LM., Vilela, CL., Santos-Sanches, I. Molecular
epidemiology and population structure of bovine Streptococcus uberis. Journal of Dairy
Science 2008; 91(12): 4542-51.
238. Rebuck J, Fish D, Abraham E. Pharmacokinetics of intravenous and oral levofloxacin in
critically ill adults in a medical intensive care unit. Pharmacotherapy 2002; 22: 1216-25.
239. Reinoso, R.F., Lanao, J.M., Lorente, F., López, F.G., Domínguez-Gil, A. Uptake of antibiotics by
phagocytic cells: Study methods and therapeutic implications. Rev Esp Quimioterap 1995; 8:
100-108.
240. Renard, C., Vanderhaeghe, H.J., Claes, P.J., Zenebergh, A., Tulkens, P.M. Influence of
conversion of penicillin G into a basic derivative on its accumulation and subcellular
localization in cultured macrophages. Antimicrob Agents Chemother 1987; 31: 410-416.
241. Renard, L. Modélisation de la Relation Pharmacocinetique-Pharmacodynamique en
Antibiotherapie Vétérinaire. Thèse de l’Université de Limoges. Faculté de Pharmacie. 1994.
422
242. Renard, L., Sanders, P., Laurentie, M. And Delmas, J.M. Pharmacokineticpharmacodynamic
model for spiramycin in staphylococcal mastitis. Journal of Veterinary Pharmacology and
Therapeutics, 1996; 19, 95-103.
243. Reymond, F., Carrupt, P.A., Testa, B., Girault, H.H. Charge and delocalisation effects on the
lipophilicity of protonable drugs. Chem Eur J 1999; 5: 39-47.
244. Riviere J.E. Comparative Pharmacokinetics. Principes, techniques and aplications. Iowa State
University Press. Ames, Iowa. 1999.
245. Ribeiro M.G., A.C. Paes, F.J.P. Listoni (2006) Minimal inhibitory concentration of azithromycin
in Rhodococcus equi strains isolated from foals. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.58, n.6,
p.1244-1246
246. Romero, A. T. Situación actual de la mastitis en México. Dpto. Producción Animal, FMVZ-
UNAM. 2004; México D. F. pp.122-134.
247. Ronald CL. Review: New pharmacodynamic parameters for antimicrobial agents. Int J
Antimicrob Agents 2000; 13:229-235.
248. Ruiz. Jhon D. Nicolás F. Ramírez 1 ; Ofelia Arroyave. Determinación de concentraciones
inhibitorias mínimas a algunos antibióticos de las bacterias aisladas de glándula mamaria
bovina en San Pedro de los Milagros, Antioquia. Rev Col Cienc Pec Vol. 14: 2, 2001 143.
249. Russi, N. 2008. Susceptibilidad de antibióticos de Staphylococcus aureus aislados de mastitis
bovina. Tesis para optar el título de Magíster Scientiae en Ciencias Veterinarias, Mención
Salud Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad del Litoral. Esperanza,
Argentina.
250. Bhavsar. S. K. and A. M. Thaker (2012). Pharmacokinetics of Antimicrobials in Food Producing
Animals, Readings in Advanced Pharmacokinetics - Theory, Methods and Applications, Dr.
Ayman Noreddin (Ed.), ISBN: 978-953-51-0533-6, In Tech, Available from:
http://www.intechopen.com/books/readings-in-advancedpharmacokinetics-theory-
methods-and-applications/pharmacokinetics-of-antimicrobials-in-food-producinganimals
251. Sanchez, M.S., Ford, C.W. and Yancey, R.J. Effect of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1
beta and antibiotics on the killing of intracellular Staphylococcus aureus. J. Dairy Sci. 1994;
77:1251-1258.
252. San Martín, B., Morales, M.A., Agüero, H., León, B., Esppinoza, S., Iragúen, D., Puga, J. y Boire,
C. 2002. Resistencia bacteriana en cepas patógenas aisladas de mastitis en vacas lecheras de
la V Región Metropolitana y Xa Región, Chile. Archivos de Medicina Veterinaria 34 (2): 221-
234
253. Saran A; Ziv G; Glikman A; Israeli Y; Luxembourg D; Saran A (ed.); Soback S The efficacy of an
antibiotic preparation [Vetipen DC, nafcillin, benzylpenicillin and dihydrostreptomycin] for
the treatment and prevention of subclinical bovine mastitis during the non-lactating period
and antibiotic persistence in milk and various organs after calving. Proceedings of the Third
IDF International Mastitis Seminar Tel Aviv, Israel, 28 May – 1 June 1995. Book 2. 1995, s-
5,134-135.
254. Saran, A., y Chaffer, M. 2000. Mastitis y calidad de la leche. Ed. Inter-Médica. Buenos Aires.
pp. 14-16, 31-42.
255. Sarasola P, Lees P, AliAbadi FS, McKellar QA, Donachie W, Marr KA, Sunderland SJ & Rowan
TG. 2002. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of danofloxacin administered by
two dosing regimens in calves infected with Mannheimia (Pasteurella) haemolytica.
423
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46 (9), 3013-3019. doi:10.1128/AAC.46.9.3013-
3019.2002
256. Sarvaiya J.G.; Bhavsar S.K.; Mody S.K.; Thaker A.M. and Tripathi R.M. (2006). Multiple dose
pharmacokinetics and safety of Ciprofloxacin in Buffalo calves (Bubalus bubalis). Journal of
Veterinary Pharmacology and Toxicology, Vol. 5, No 1& 2, (December 2006), pp.15-18, ISSN
0972-8872.
257. Schentag. J. J. 1999. Antimicrobial action and pharmacokinetics/pharmacodynamics: the use
of AUIC to improve efficacy and avoid resistance. J Chemother. Dec; 11(6): 426–439.
258. Scorneaux, B. and Shryock T. R. Intracellular Accumulation, Subcellular Distribution, and
Efflux of Tilmicosin in Chicken Phagocytes Poultry Science 1998; 77:1510.1521.
259. Selbie FR. Comparison of sodium and procaine penicillin in treatment of experimental
staphylococcal infection in mice. Br Med J 1954;4875:1350-3.
260. Seral C, Van Bambeke F, Tulkens PM. 2003. Quantitative analysis of gentamicin, azithromycin,
telithromycin, ciprofloxacin, moxifloxacin and oritavancin (LY333328) activities against
intracellular Staphylococcus aureus in mouse J774 macrophages. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 47:2283-2292. (PDF) (UCL only - Copyright owned by the publisher)
261. Shryock TR, Mortensen JE, Baumholtz M. The effects of macrolides on the expression of
bacterial virulence mechanisms. J Antimicrob Chemother 1998; 41:505-512.
262. Shah, P.M., Huebner, K.G., Stille, W. In vitro untersuchungenzur intermittierenden therapie
mit penicillin G und ampicilin. Med Welt 1978; 29: 888-892.
263. Smith, K.L. and Hogan, J.S. The world of mastitis [en línea]. Proceedings of the 2 International
Symposium on Mastitis and Milk Quality. p.1. NMC Homepage (2001).
264. Solberg, C.O. Protection of phagocytized bacteria against antibiotics. A new method for the
evaluation of neutrophil granulocyte functions. Acta Med Scand 1972; 191: 383-389.
265. Soriano Garcia F. Aspectos farmacocinéticos y farmacodinámicos para la lectura interpretada
del antibiograma. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2010. doi:10.1016/j.eimc.2010. 02.005.
266. Soriano, F. (2002). Aspectos farmacocinéticos y farmacodinámicos para la lectura
interpretada del antibiograma. Enferm Infecc Microbiol Clin; 20(8):407-12.
267. Soriano F, Ponte C. Comments on: Functional relationship between bacterial cell density and
the efficacy of antibiotics. J Antimicrob Chemother. 2009; 63: 1301.
268. Sumano, L.H. 1995. Farmacología clínica en bovinos. Editorial Trillas. México. D.F.
269. Sumano L.H., Mateos T.G. y Brumbaugh G.W.: Bases farmacológicas del tratamiento de la
mastitis. Veterinaria México 27 (1): 63-82 (1996).
270. Sumano L.H., Ocampo C.L. y Paez E.D. Actividad antibacteriana in vitro y biodisponibilidad en
vacas de varios preparados de benzilpenicilina-G, sola o combinada con sulfato de
dihidroestreptomicina. Veterinaria México. 31: En prensa, (2000).
271. Taira, K., Koga, H., Kohno, S. Accumulation of a newly developed fluoroquinolone, OPC-
17116, by human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37:
1877-1881.
272. Takács-Nováck, K., Béla, N., Hermecz, I., Kerexztúri, G., Podányi, B. Szasz, G. Protonation
equilibria of quinolone antibacterials. J Pharma Sci 1990; 79: 1023-1028.
424
273. Taponen. S, K. Dredge, B. Henriksson, A-M Pyyhtiä, L. Suojala, R. Junni, K. Heinonen, S.
Pyörälä. 2003. Efficacy of intramammary treatment with procaine penicillin G vs. procaine
penicillin G plus neomycin in bovine clinical mastitis caused by penicillin-susceptible, gram-
positive bacteria--a double blind field study. J Vet Pharmacol Ther. 2003 Jun; 26(3): 193–198.
274. Teagle. C.P. and David. G.P. 1999. Antibiotic resistance in mastitis bacteria. In the British
mastitis conference. Pp. 24 – 29. Axient institute of animal healt milk development council
Novartis animal healt. Steneleg USA.
275. Thomas, J.K., Forrest, A., Bhaunani, S.M., Hyatt, J.M., Cheng, A., Ballow, C.H. and Schentag,
J.J. (1998) Pharmacodynamic evaluation of factors associated with the development of
bacterial resistance in acutely III patients during therapy. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 42, 5210-5217.
276. Timmers, K., Sternglanz, R. Ionization and divalent cation dissociation constants of nalidixic
and oxolinic acids. Bioinorg Chem 1978; 9: 145-155.
277. Tormo MA, Marti M, Valle J, Manna AC, Cheung AL, Lasa I, Penades JR (2005) SarA is an
essential positive regulator of Staphylococcus epidermidis biofilm development. J Bacteriol
187:2348-2356.
278. Trouet, A.L., Tulkens, P. Intracellular penetration and distribution of antibiotics: The basis for
an improved chemotherapy of intracellular infections. En: Ninet, L., Bost, P.E., Bouanchaud,
D.H., Florent, J. (Eds.). The future of antibiotherapy and antibiotic research. Academic Press,
London 1981; 336-349.
279. Turnidge JD. The pharmacodynamics of β-lactams. Clin Inf Dis 1998; 27:10-22.
280. Toutain, P. L. and Lees, P. 2004. Integration and modelling of pharmacokinetic and
pharmacodynamic data to optimize dosage regimens in veterinary medicine. Journal of
2885.2004.00613.
281. Toutain, P. L. and Bousquet -Mélou, A. 2004. Bioavailability and its assessment. Journal of
2885.2004.00604.
282. Tu Quoc P; Genevaux P; Pajunen M; Savilahti H; Georgopoulos C; Schrenzel J, Kelley W.L.
Isolation and characterization of biofilm formation-defective mutants of Staphylococcus
aureus. Infect. Immun. 2007: 75: 1079-1088.
283. Turic Esteban. (2010) Farmacocinética de Azitromicina en vacas lecheras Holando Argentino.
Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de La Plata
284. Uivarosi. Valentina. 2013 Metal Complexes of Quinolone Antibiotics and Their Applications:
Department of General and Inorganic Chemistry, Faculty of Pharmacy, Carol Davila University
of Medicine and Pharmacy, 6 Traian Vuia St, Bucharest 020956, Romania; E-Mail:
uivarosi.valentina@umf.ro; Tel.: +4-021-318-0742; Fax: +4-021-318-0750.
285. UNAD. 2014., Curso de Microbiología. Lección 16: Cinética del crecimiento microbiano.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_6_cre
cimiento.pdf
286. Van den Broek, P.J. Antimicrobial drugs, microorganisms and phagocytes. Rev Infect Dis
1989; 11: 213-245.
425
287. Van den Broek, P. J. Activity of antibiotics against microorganisms ingested by mononuclear
phagocytes. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1991. 10:114–118.
288. Van Bambeke, F., M. Barcia-Macay, S. Lemaire, and P. M. Tulkens. 2006. Cellular
pharmacodynamics and pharmacokinetics of antibiotics: current views and perspectives.
Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 9:218–230.
289. Van Bambeke F, Tulkens PM. Macrolides: pharmacokinetics and pharmacodynamics. Int J
Antimicrob Agents 2001, 18:S17-S23.
290. Van Bambeke F. 2014. Renaissance of antibiotics against difficult infections: Focus on
oritavancin and new ketolides and quinolones. Ann Med. 2014 Nov;46(7):512-29. doi:
10.3109/07853890.2014.935470. Epub 2014 Jul 24.
291. Van Bambeke F, Tyteca D, Ouadrhiri Y, Tulkens PM. Optimisation des traitements
antibactériens sur base de propriétés pharmacodynamiques des antibiotiques. Louvain Med
1999; 118:43-63.
292. Van Bambeke F. Macrolides and Ketolides 2014. In Fundamentals of Antimicrobial
Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Eds. Alexander A. Vinks, Hartmut Derendorf and
Johan W. Mouton. Ed. Springer New York Heidelberg Dordrecht London. 257-279.
293. Vasiľ M., Fotta M., Elečko J. (2005): Výskyt a druhová špecifikácia Staphylococcus sp.
izolovaných z prvový- roby ovčieho mlieka. Mliekarstvo, 36: 25–27.
294. Vasudevan P, Nair MKM, Annamalai T, Venkitanarayanan KS. Phenotypic and genotypic
characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation.
Vet. Microbiol.2003; 92: 179-185.
295. Vazifeh, D., Abdelghaffar, H., Labro, M.T. 1997. Cellular accumulation of the new ketolide RU
64004 by human neutrophils: Comparison with that of azithromycin and roxithromycin.
Antimicrob Agents Chemother; 41: 2099-2107.
296. Vazifeh, D., Bryskier, A., Labro, M.T. 1999. Mechanism underlying levofloxacin uptake by
human polymorphonuclear neutrophils. Antimicrob Agents Chemother; 43: 246-252.
297. Waage S, Bjorland J, Caugant DA, Oppegaard H, Tollersrud T, Mork T, Aarestrup FM. 2002
Spread of Staphylococcus aureus resistant to penicillin and tetracycline within and between
dairy herds. Epidemiol Infect. 129(1):193-202.
298. Waddell, W.J., Bates, R.G. Intracellular pH. Physiol Rev 1969; 49: 285-329.
299. Wallace, Richard L. Production of Quality Milk Through Environmental Mastitis Control. Illini
DairyNet. http://traill.outreach.uiuc.edu/dairynet/paperDisplay.cfm?ContentID=198.
300. Walters JD, Zhang F, Nakkula RJ. Mechanisms of fluoroquinolone transport by human
neutrophils. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:2710–5.
301. Watts, J.L.; Nickerson, S.C.; Boddie, R.L. and Ray, C. 1991. Effects of a 1.94% sulfonic acid teat
dip and a 1% iodophor teat dip canal infections lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 74(3):1115-
1123.
302. Wang Yang, Cong-Ming Wu, Li-Ming Lu, Gao-Wa Na Ren, Xing-Yuan Cao, Jian-Zhong Shen.
2008. Macrolide–lincosamide-resistant phenotypes and genotypes of Staphylococcus aureus
isolated from bovine clinical mastitis. Veterinary Microbiology 130: 118–125
303. Wellenberg, G.J., van der Poel, W. H. M. and Van Oirschot, J. T. 2002. Viral infections and
bovine mastitis: a review. Veterinary Microbiology, Article 2361, pp. 2-21.
426
304. Wetzstein HG, De Jong A. In Vitro bactericidal activity and postantibiotic effect of
fluorquinolones used in veterinary medicine. Suppl Compend Contin Educ Pract Vet. 1996; 18
(2): 22-29.
305. Wildfeuer, A., Laufen, H., Zimmermann, T. Uptake of azithromycin by various cells and its
intracellular activity under in vivo conditions. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 75-79.
306. Wilkinson GR. Pharmacokinetics: the dynamics of drugs absorption, distribution and
elimination. In: Hardman JG, Limbird LL, editors. Goodman & Gilman’s the pharmacological
basis of therapeutics. New York: McGraw Hill Medical Publishing Division; 2001. p. 3–30.
307. Wilson, C.D. and Richards, M.S. 1980. A survery of mastitis in British dairy herds. Vet. Rec.
106:431-435.
308. Wrigth, C.L. and Yoxall, A.T., (1993) Eds: Pharmacological basis of large animal medicine,
Philadelphia, Blackwell Scientific Publications.
309. Xiong, Y., Caillon, J., Drugeon, H., Potel, G. and Baron, D. (1996) Influence of pH on
Adaptative Resistance of Pseudomona aeruginosa to Aminoglycosides and their
Postantibiotic Effects. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Jan. 35-39.
310. Yadlin, B.; Leitner, O.; Olickman, A.; Lubashevshy, O. y Saran, A. 1998. Prueba de Elisa para
detectar anticuerpos contra Staphylococcus aureus en el bovino. Memorias del Congreso
Panamericano de Control de la Mastitis y Calidad de la Leche. Mérida, Yucatán, México. p.
132.
311. Yamaoka, K., Nakaawa, T. and Uno, T. (1978) Application of Akaike’s Information Criterion
(AIC) in the Evaluation of Linear Pharmacokinetic Equations. Journal of Pharmacokinetics and
Biopharmaceutics. 6, 165-175.
312. Yamaoka, k.; Nakagawa, T. and T.Uno (1978) Aplication of Akaike.s Information Criterion
(AIC) in the evaluation of linear pharmacokinetic equation. Journal of Pharmacokinetics.
313. Zadoks, RN., Gillespie, BE. Barkema, HW., Sampimon, OC., Oliver, SP., Schukken, YH. 2003.
Clinical, epidemiological and molecular characteristics of Streptococcus uberis infections in
dairy herds. Epidemiology and Infection 130(2): 335-49.
314. Zadoks, R.N., Schukken, Y.H., 2006 Use of the molecular epidemiology in veterinary practice.
315. Zhanel, G.G., Karlowsky, J.A., Hoban, D.J., Davidson, R.J. Antimicrobial activity of
subinhibitory concentrations of aminoglycosides against Pseudomonas aeruginosa as
determined by the killing-curve method and the postantibiotic effect. Chemotherapy 1991;
37: 114-121.
316. Zhanel, G.G. Influence of Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Principles on Antibiotic
Selection. Curr Infect Dis Rep. 2001 Feb;3(1):29-34.
317. Zandarín, A.; Rampone, A.; Giraudo, J. y Calzolar, A. 1996. Inducción de cápsula de
Staphylococcus. aureus “in vivo” e “in vitro”. Memorias del Congreso Nacional de Calidad de
la leche y Mastitis. Río Cuarto. poster A-3:5-6.
318. Zelenitsky SA, Harding GK, Sun S, Ubhi K, Ariano RE. Treatment and outcome of
Pseudomonas aeruginosa bacteraemia: An antibiotic pharmacodynamics analysis. Antimicrob
Agents Chemother. 2003; 52:668–74.
319. Ziebuhr W, Hennig S, Eckart M, Kranzler H, Batzilla C, Kozitskaya S. Nosocomial infections by
Staphylococcus epidermidis: How a commensal bacterium turns into a pathogen. Int. J.
Antimicrob. Agents. 2006; 28: S14-20.
427
320. Zhi, J. Nightingale, C.H. and Quintiliani, R. (1986) A Pharmacodynamic Model for the Activity
of Antibiotics against Microorganism under Nonsaturable Conditions. J. Pharm. Assoc. 77,
991-992.
321. Zhi, J. Nightingale, C.H. and Quintiliani, R. (1988) Microbial Pharmacodynamics of Piperacillin
in Neutropenic mice of Systematic Infection due to Pseudomonas aeruginosa. J.
Pharmacokinet. Biopharm. 16, 355-375.
322. Ziv, G. Drug selection and use in mastitis: Systematic vs. local therapy. JAVMA. 1980;
176:1109–1115.
323. Ziv, G. Practical pharmacokinetic aspects of mastitis therapy.1. Parenteral treatment. Vet.
Med.1980; 75:277–290.
324. Ziv, G. Practical pharmacokinetic aspects of mastitis therapy. 2. Practical and therapeutic
applications. Vet. Med. 1980; 75:469–474.
325. Ziv, G., Storper, M. Intramuscular treatment of subclinical staphylococcal mastitis in lactating
cows with penicillin G, methicillin and their esters. J. Vet. Pharmacol. Ther. 1985;8:276–283.
326. Ziv, G. and Sulman, F.G. 1974. Serum and milk concentrations of spectinomycin and tylosin in
cows and ewes. Am. J. Vet. Res., 34:329-333.
428

Documento Completo Versión PDF - pdf-PDFA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Documento Completo Versión PDF - pdf-PDFA

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Documento Completo Versión PDF - pdf-PDFA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Veterinarias

“Farmacocinética y Farmacodinamia intracelular de

Luis Alejandro Moncada Cárdenas

Trabajo de Tesis realizado como requisito para optar al título de

“Farmacocinética y Farmacodinamia intracelular de antimicrobianos

Autor: M.V. MONCADA CÁRDENAS, Luis Alejandro

Director: Doctora Nora Mestorino

Lugar de trabajo: Cátedra de Farmacología, Farmacotecnia y

Miembros del Jurado:

Título: Farmacocinética y Farmacodinamia intracelular de antimicrobianos utilizados en la

Palabras claves: Mastitis subclínica, Staphylococcus aureus, Intracelular, Farmacocinética,

El presente trabajo de tesis doctoral, tuvo como objetivo realizar un aporte al

The present doctoral thesis aimed at contributing to the knowledge of the

JUSTO PASTOR Y CARMEN ELISA

LUZ AMPARO, CARLOS ALBERTO, LILIA BIBIANA, DANIELITO

Porque… ya sabes, todo es posible!

A LA RAYUELA DE LA VIDA MISMA.

A la Universidad Nacional de La Plata por darme la posibilidad de realizar mi Tesis Doctoral, a

Al Dr Jorge Errecalde por recibirme en su grupo de trabajo y permitirme trabajar a su lado

A Martin Daniele. Gran amigo, compañero de viajes y tertulias, transcendental ayuda en

A la Dra Laura Marchetti. Admirable compañera, ecuánime profesional y generoso ser

A todos mis compañeros de trabajo de la Cátedra de farmacología, farmacotecnia y

A la Cátedra de Farmacología Básica de la facultad de medicina de la UNLP, donde me

A TODOS MIL Y UN MILLON DE GRACIAS!!!

TÍTULOS Y RESÚMENES ..................................................................................................... iii

4. RESULTADOS .......................................................................................................... 148

6. DISCUSION ............................................................................................................. 346

7. CONCLUSIONES. ..................................................................................................... 405

Tabla 1. Datos de calidad y precio por litro entregado por la industria

1.1. MASTITIS BOVINA

La mastitis bovina, es definida por la Federación Internacional de Lechería (1999)

Clásicamente ha sido considerada como una “enfermedad multifactorial” (Hans

La presentación de la mastitis se ve favorecida por diversas circunstancias que

Figura 1. Interacción de los factores que participan en la transmisión de la mastitis: vaca,

No obstante el conocimiento generado en los últimos años acerca de la patogénesis y

El detrimento económico directo atribuible a casos de mastitis, se compone

Evaluando el impacto económico de la mastitis, (Seegers et al., 2003) recopilaron

Generalmente los estudios dirigidos a estimar el efecto sobre la producción de la

Wilson et al., en 2004 utilizaron un enfoque similar para determinar el efecto de la

Si bien en algunos países como Holanda o Noruega, S. aureus, continúa siendo el

Los principales microorganismos reconocidos dentro de este grupo son Streptococcus

Streptococcus dysgalactiae ha sido descripto como una especie de naturaleza tanto

Dentro de los patógenos no comunes del medio ambiente, podemos mencionar a

Según la fisiopatología y epidemiología de los agentes patógenos involucrados en la

La mastitis subclínica solo se detecta aplicando pruebas de laboratorio que

La mastitis continúa siendo la enfermedad más prevalente y costosa en las

1.1.2. Impacto de la mastitis en la República Argentina

En el país, la mayor cuenca lechera, se encuentra ubicada en la región pampeana, la

La estructura de producción primaria de leche en Argentina hasta hace unos pocos

Actualmente, las producciones individuales muestran un fuerte incremento y, con

En términos generales, la rutina de ordeño, la infraestructura y el manejo de los

Según datos reportados por la Industria Lechera, desde octubre de 2010 a

Tabla 1. Datos de calidad y precio por litro entregado por la industria

Haciendo referencia al estudio realizado por Philpot (1993), en el cual se calcularon

Según un relevamiento de datos realizado por Castro en el año 2012, en el caso de

El trabajo presentado por Castro (2012), es particularmente interesante porque

Si bien, como se ha mencionado, en el país no se cuenta con información actualizada

Durante el trascurso de los últimos 30 años, se ha ido presentando una