“Año de la universalización de la salud ’’

Universidad Nacional “Jorge Basadre Grohmann”

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia

CURSO : Diseños Experimentales

DOCENTE : Dr. Facundo Maquera

TITULO : Revisión Bibliográfica acerca de Nivel de Significación.

NOMBRE : Fiama Grecia Garrido Castrejón

CODIGO : 2017-110007

2020

Tacna - Perú
 TRABAJO DE INVESTIGACION

TEMA I: Prevalencia de la enfermedad renal poliquística autosómica dominante en gatos persas y

persas en Brasil

Resumen:

La enfermedad renal poliquística autosómica dominante (ADPKD) es la enfermedad genética más

común en los gatos. Sin embargo, en Brasil se dispone de escasos datos sobre su prevalencia. Los
gatos persas y las razas relacionadas con el persa fueron evaluados por genotipado molecular para
una transversión de C a A en el exón 29 del gen PKD1 para determinar la prevalencia de ADPKD en
una población brasileña. El ADN genómico extraído de la sangre entera periférica o de muestras de
hisopos orales se utilizó para amplificar el exón 29 del gen PKD1 empleando una metodología PCR-
RFLP. De un total de 616 animales, 27/537 gatos persas y 1/17 del Himalaya mostraron la variante
de un solo nucleótido (C a A) en la posición 3284 en el exón 29 de PKD1felino. Esta variación
patógena se ha identificado sólo en estado heterocigoto. La prevalencia de ADPKD en gatos persas
y razas relacionadas con el persa fue del 5,03% y 1,6%, respectivamente. No hubo una asociación
significativa entre la raza felina, el género o la edad con la prevalencia de ADPKD. Cabe destacar que
la prevalencia observada de ADPKD en gatos persas y razas relacionadas con el persa en Brasil fue
inferior a las reportadas en otras partes del mundo. Este hallazgo puede estar relacionado con el
asesoramiento genético y la consiguiente selección de gatos libres de ADPKD para su reproducción.

1. Introducción:

La enfermedad renal poliquística autosómica dominante en felino (ADPKD) se ha

identificado en razas persas y persas desde finales de la década de 1960, siendo la
enfermedad hereditaria renal felina más prevalente en todo el mundo. La enfermedad es
progresiva y se caracteriza por el crecimiento de quistes llenos de líquido de diferentes
tamaños en la corteza renal y la médula y, ocasionalmente, en el hígado y el páncreas Al
igual que la enfermedad presentada en los seres humanos, ADPKD puede dar lugar a una
enfermedad renal terminal en gatos afectados

El examen ultrasonográfico es un método útil y fiable para diagnosticar ADPKD. Los quistes
se pueden identificar como cavidades hipoecoicas a anecoicas que son redondas u ovaladas
y bien diferenciadas del parénquima renal. La sensibilidad y especificidad de la ecografía
para la detección de quistes son del 91% y 100% a las 36 semanas, respectivamente(Biller
et al., 1990). Este método de diagnóstico se ha recomendado para examinar gatos mayores
de 10 meses(Cannon et al., 2000; Barrs et al., 2001). Recientemente, nuestro grupo ha
establecido criterios ultrasonográficos basados en la edad para el diagnóstico de ADPKD en
gatos persas (Guerra et al., 2019).
(2004) identificaron una variante de un solo nucleótido (SNV) caracterizada por una
sustitución de C a A en la posición 3284 en el exón 29 de PKD1felino, el gen que codifica la
policistina-1. Esta variante resulta en un codón de parada prematura en el ARNm, lo que
 conduce a una pérdida de aproximadamente 25% de la proteína C-terminus. Esta
transversión fue encontrada heterocigota en gatos cruzados persas y persas y se asoció con
ADPKD felino (Lyons et al., 2004; Young et al., 2005). Es importante destacar que el
genotipado de PKD1 puede ser útil para la prevención de la enfermedad por parte del
propietario, ya que los gatos no muestran signos clínicos significativos en las primeras
etapas de la enfermedad y la erradicación depende de la selección activa de gatos libres de
ADPKD para la reproducción (Helps et al., 2007).

2. Métodos

2.1. Población del estudio

Se sometieron a genotipado molecular para la transversión C a A en el exón 29 del

gen 11 felinos y muestras de sangre periféricas o hisopos orales (Endobrush, INLAB®,
Brasil) de 859 gatos persas y razas relacionadas. Ambas muestras fueron preservadas
en RNAlater (Thermo Scientific®, USA) y enviadas por los propietarios (696 muestras) o
veterinarios (163 muestras) por correo postal regular al Laboratorio de Patología
Morfológica y Molecular (LAPMOL) en el Departamento de Patología, Escuela de
Medicina Veterinaria y Ciencias Animales, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil.
Las muestras se almacenaron a -80 oC hasta la extracción del ADN. Los propietarios
fueron informados minuciosamente sobre los protocolos de investigación y
proporcionaron su consentimiento informado por escrito. El proyecto fue aprobado por
el Comité de ética sobre el uso animal de la Escuela de Medicina Veterinaria y Ciencias
Animales de la Universidad de Sao Paulo (Número de Protocolo: 1812010514).

2.2. Aislamiento del ADN

El ADN se extrajo de muestras de sangre (300 l) de acuerdo con las recomendaciones

del fabricante del kit (Illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit, GE Healthcare, EE. UU.).
Los hisopos orales se homogeneizaron mecánicamente (ThermoMixer C, Eppendorf,
Alemania) en el tampón de lelisis tipo 1 y luego se incubaron con 20 mg/ml de
proteinasa K a 65 oC durante 45 minutos. Posteriormente, la proteinasa K se inactiva a
95 oC durante 15 minutos y el producto total utilizado para la extracción de ADN
siguiendo las instrucciones del fabricante (Illustra tissue and cells genomic Prep Mini
Spin Kit, GE Healthcare®, EE. UU.). Después del aislamiento, la concentración de ADN se
determinó utilizando el equipo NanoDrop (NanoDrop Technologies, EUA).

2.3. Amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR se utilizó para amplificar el exón 29 del gen PKD1. Un fragmento de PCR de par
base (bp) de 559 personas que contenía exón 29 se amplificó utilizando las
imprimaciones diseñadas por Domanjko-Petriá y otros (2008): PKD1F1 5'-
CAGGTAGACGGGATAGACGA-3' y PKD1R1 5'-TTCTTCGGCTGGTCACAGACTG-3'. La
mezcla de reacción contenía ADN genómico de 4 l, 4 dNTP de L (2,5 mM de cada dNTP),
cloruro de magnesio de 1,5 l (25 mM), PKD1F de 1,25 l,1 (10 m), PKD1R1 de 10 oL (10
 m), tampón de PCR de 10 l y polimerasa de ADN de Taq de 0,26 l (5 U/L; Invitrogen) en
un volumen final de 50 l. La reacción se llevó a cabo en un sistema PCR Mastercycle
(Eppendorf®, Alemania). Las condiciones de la PCR incluyeron la desnaturalización
inicial durante 3 minutos a 94 oC, 40 ciclos de amplificación con desnaturalización a 94
oC durante 1 minuto, el recocido de imprimación a 58 oC durante 1 minuto, la extensión
de imprimación a 72 oC durante 1 minuto y una extensión final a 72 oC durante 5
minutos. Con el fin de aumentar la sensibilidad y especificidad del ADN extraído de las
células orales de la mucosa (swabs), también se realizó PCR anidado con un par de
imprimaciones internas: PKD1F2 5'-AACTGTGTCGGCACTCAGC-3' y PKD1R2 5'-
GCCTGTAGAGAGAGGT-3'(Lee et al., 2010), un procedimiento que amplifica un
segmento de 465pb. El producto de PCR de primera ronda (2 l) se utilizó como plantilla
de ADN para la PCR anidada, mientras que la concentración de los otros reactivos y las
condiciones del ciclo se mantuvo igual.

2.4. Análisis del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP)

Dado que la variante patógena asociada a ADPKD crea un nuevo sitio de restricción
MLY1, el análisis RFLP se aplicó en la primera ronda de PCR (muestras de sangre) o en
productos anidados-PCR (muestras orales) para identificar esta variante. Se digirieron
aproximadamente 5 l de producto amplificado a 37 C durante 3 horas con 10 U de MLY1
(New England Biolabs, EE. UU.) en una reacción de 10 l que contiene 1o NE Buffer 4,
seguida de inactivación enzimática a 65oC durante 10 minutos. La reacción completa de
digestión fue analizada por electroforesis en geles de agarosa al 2% y documentación
posterior utilizando el sistema ChemiDoc (Bio-Rad, EE.UU.). La digestión del producto
que daba como resultado dos fragmentos indicaron la presencia de la transversión de C
a A, mientras que la observación de sólo el fragmento no digerido 559bp o 465pb (en
Nested-PCR) reveló la ausencia de esta variante genética (ver Figura 1). Todas las
reacciones incluyeron controles negativos sin plantilla de ADN, así como controles
positivos consistentes en una muestra de ADN de un felino afectado por ADPKD
diagnosticado en un laboratorio de referencia de América del Norte. Todos los
resultados positivos fueron confirmados por la secuenciación automatizada directa de
Sanger de los respectivos productos de PCR amplificados (datos no mostrados).
 Figura 1 PCR-RFLP para ADPKD felino. Los carriles (A) y (B) muestran gatos no afectados
con el producto PCR no digerido amplificado a partir del exón 29 del gen felino
PKD1; Lane (C) muestra un gato afectado por ADPKD con un producto PCR amplificado
digerido con la enzima de restricción MLY1 en dos fragmentos; El carril (D) es el control
negativo (en blanco).

3. Resultados

Un total de 859 muestras fueron enviadas a LAPMOL, de las cuales 675 (78,58%) se
obtuvieron por hisopo de células mucosas orales y 184 (21,42%) de sangre entera
periférica. A pesar del uso de PCR anidado para aumentar la sensibilidad y especificidad
para el ADN obtenido a partir de muestras de hisopos orales, 243/675 (36%) los gatos
mostraron resultados no concluyentes en PCR-RFLP para la prueba de diagnóstico felino
ADPKD. Toda la sangre (184) y el 64% (432/675) de las muestras de mucosa oral tuvieron
resultados concluyentes para las pruebas moleculares.
De los 616 gatos con pruebas concluyentes, 537 fueron persas, 59 exóticos de pelo
corto, 17 Himalaya, 2 Angora y 1 Maine Coon. La edad de los gatos osciló entre 3 y 168
meses, con 211 (34,25%) machos y 405 (65,75%) Hembras. Según la división geopolítica
brasileña, el Norte, Noreste, Centro-Oeste, Las regiones sureste y sur correspondieron,
respectivamente, al 0,162% (1/616), 0,33% (2/616), 1,62% (10/616), 79,55% (490/616)
y 18,34% (113/616) de muestras.
En cuanto a las pruebas moleculares, 28 (4,55%) los gatos tenían la C a A SNV en el
gen PKD1, todo en heterocigosidad (Tabla 1). Veintisiete de 537 gatos persas tenían la
variante patógena, mientras que sólo una raza relacionada con el persa (Himalaya)
presentaba esta variante. Todos los gatos exóticos de pelo corto, Angora y Maine
examinaron fueron negativos para la variante asociada a ADPKD. Basándose en este
cribado molecular, la prevalencia de ADPKD felino en gatos persas y razas relacionadas
en Brasil fue del 5,03% y del 1,62%, respectivamente.
 Tabla 1 Distribución de gatos según la variante patógena en el exón 29 del gen
felino PKD1, raza, sexo y edad.

N: número de animales.

4. Conclusión:

Ocho (28,6%) de los animales afectados eran machos, mientras que 20 (71,4%) de ellos
eran mujeres. La variante patógena relacionada con ADPKD, sin embargo, no se
correlacionó estadísticamente con el género (P-0.6566) por la prueba chi-cuadrada. Los
gatos ADPKD oscilaron entre los 6 y los 162 meses (edad media de 55,21 a 49,22
meses), mientras que los animales no afectados de 3 a 168 meses (edad media de 43,95
a 32,48 meses), estas distribuciones no fueron estadísticamente diferentes (P-0,6523).
Entre los gatos ADPKD, 27/28 (96,43%) de los gatos ADPKD vivían en la región sureste,
mientras que sólo 1/28 (3,57%) vivía en la región sur de Brasil.

Según la tabla 1 nos demostró que no existe diferencia significativa entre la raza persa
y la presencia del gen PKD1 SNV (P-0.2534) por la prueba chi-cuadrada de Pearson.
TEMA ll: Prevalencia de la enfermedad renal poliquística autosómica dominante en gatos persas y
persas en Brasil

Resumen:

Evaluamos la prevalencia deanticuerpos anti-Toxoplasma gondii en las muestras de suero recogidas

de gatos domésticos en Belém, Pará, Brasil. También correlacionamos la presencia de anticuerpos T.
gondii con variables ambientales y hábitos de propietario de gatos. Se analizaron cuatrocientas
cuarenta y siete muestras de suero de gatos domésticos. Los sueros se probaron utilizando un
ensayo indirecto de inmunofluorescencia. Entre los animales analizados, el 21,92% (98/447) fueron
seropositivos. Se encontró una asociación estadísticamente significativa en relación con la edad y la
serología entre los animales mayores de 1 año (p<0.01): en el grupo de hasta 1 año de edad, 12,82%
(20/156) de los animales fueron positivos, y en el grupo mayor de 1 año, 26,80% (78/291) fueron
positivos. Nuestros resultados muestran que los gatos de Belém, región de Pará tienen
anticuerposanti-T. gondii, y sus dueños no son conscientes de la toxoplasmosis o cómo prevenir su
transmisión.

1. Introducción:

Toxoplasma gondii (phylum Apicomplexa, familia Sarcocystidae) es un parásito coccidiano

entérico intracelular obligatorio que infecta a gatos domésticos y otros felinos (Bowman,
2010; Frenkel & Bermúdez, 2006). Este agente tiene una amplia distribución geográfica e
infecta a varios animales de sangre caliente, incluyendo mamíferos acuáticos y humanos.
Por lo tanto, la enfermedad causada por este patógeno, la toxoplasmosis, es una
antropozoonosis (Kawazoe, 2005). Los gatos son los huéspedes definitivos de T.
gondii,mientras que las otras especies susceptibles son huéspedes intermedios. La infección
generalmente ocurre mediante la ingesta de quistes tisulares o pseudoquistes presentes en
diferentes tejidos animales o por la ingesta de alimentos o agua contaminados con ovocitos
esporulados (Dabritz et al., 2007; Elmore et al., 2010).

En Belém, la capital del estado de Pará (Brasil), la población de gatos domésticos se estimó
en 48.838, según el Centro de Control de Zoonosis de Belém (contacto personal, 2010). La
capital del estado, a pesar de tener una alta tasa de toxoplasmosis congénita en los seres
humanos, que se caracteriza por una infección primaria en mujeres embarazadas que, en
consecuencia, se transfiere al feto a través de la placenta en el primer trimestre del
embarazo y puede conducir a problemas graves como aborto, muerte fetal, nacimientos
prematuros o efectos secundarios tardíos como problemas visuales (Bichara et al., 2012),
no tiene un programa para controlar la población de gatos callejeros, y no hay ningún
incentivo del gobierno para crear conciencia sobre la propiedad de mascotas responsables.

Varios estudios han proporcionado datos sobre la seroprevalencia de T. gondii en gatos

domiciliados en diferentes regiones del país (Lucas et al., 1999; Langoni et al., 2001; Netto
et al., 2003; Cavalcante et al., 2006; Dalla Rosa et al., 2010), sin embargo, faltan datos sobre
gatos en Belém. Por lo tanto, el presente estudio tenía como objetivo evaluar la prevalencia
de anticuerposanti-T. gondii IgG en los sueros de gatos domésticos en Belém. También
 examinamos los posibles factores de riesgo y el conocimiento del cat-owner de la
toxoplasmosis.

2. Métodos.

2.1. Muestreo

Se recogieron muestras biológicas de un gato por hogar en Belém, Pará totalizando 447
muestras de sangre, independientemente de su sexo, edad o raza. A partir de la estimación
del número de gatos que viven en la ciudad proporcionado por el Centro de Control de
Zoonosis sobre la base de la dosis vacunada dada a perros y gatos durante la campaña de
vacunación contra la rabia de 2009, se realizó un cálculo del tamaño de la muestra, con una
prevalencia de frecuencia de espera de 50% y 95% de confianza a intervalos utilizando la
fórmula de muestra aleatoria simple propuesta por thurfi.

La extracción de sangre se realizó asépticamente por venopunción de la vena cefálica o

yugular. Se recogieron aproximadamente 2-5 ml de sangre utilizando jeringas y tubos de 5
ml sin anticoagulantes. Las muestras fueron transportadas al Laboratorio de Zoonosis y
Salud Pública del Instituto de Medicina Veterinaria de la Universidad Federal de Pará
(IMV/UFPA), donde fueron centrifugadas a 1200 rpm durante 15 minutos para separar la
sangre coagulada del suero. El suero se colocó en 1,5 ml de Eppendorf tubos, etiquetado y
almacenado a -20 oC hasta su análisis.

Los animales se dividieron en dos grupos según la edad. El grupo 1 consistía en animales
menores o iguales a 1 año de edad, y el grupo 2 consistía en gatos mayores de 1 año de
edad. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de uso animal de la Universidad
Estatal de Pará bajo el protocolo no 23/2012. Además, los propietarios de animales firmaron
formularios de consentimiento informado (ICF), que también completaron encuestas
epidemiológicas.

2.2. Análisis de datos

Para el análisis de las respuestas a los cuestionarios, se creó una base de datos utilizando el
software SPSS v.20.0 (2011 IBM corporation, Estados Unidos). La verificación de las
asociaciones entre variables se llevó a cabo utilizando la prueba chi-cuadrada. Cuando las
asociaciones estaban presentes, se calculó la relación de probabilidades. El IC del 95% se
utilizó para determinar la importancia de las diferencias.

2.3. Analsis de muestra

El análisis del anticuerpo anti-T. gondii se realizó mediante la detección de IgG específico
utilizando un ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA), utilizando una dilución 1:16
 como corte. Los sueros se diluyeron hasta 1:1024 en solución salina tamponada con fosfato
y se colocaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con el antígeno T. gondii taquizoites
(tensión RH). Entonces, usamos fluoresceína-conjugado anti-gato IgG (SAB700065-2MG
anti-gato IgG FC específico + isotiocianato de fluoresceína (SIGMA-Aldrich, San Luis,
Missouri, EUA). Como control positivo, utilizamos una muestra de suero de gato positiva
para T. gondii tratada en el hospital veterinario de UNESP-Botucatu. Las muestras se
consideraron positivas cuando al menos el 50% de los taquizoítos por campo exhibieron
fluorescencia. El título de positividad estaba relacionado con la última dilución que todavía
mostraba fluorescencia.

3. Resultados.

Entre las 447 muestras analizadas utilizando IFA, se encontró que el 21,92% (98/447) de los
animales era seropositivo. Los valores de los títulos de anticuerpos oscilaron entre 16 y
1024. La mayoría de los animales, el 39,80% (39/98), tenían un título de 64, y el menor
proporción de animales, el 6,12% (6/98), tenía un título de 1024. No se encontró que las
variables, el género, la raza, la dieta y los hábitos conductuales se asociaron con resultados
serológicos. Con respecto a la edad, tener más de 1 año de edad se encontró que era un
factor de riesgo para la seropositividad de T. gondii; El 12,82% (20/156) de los animales del
grupo 1 fueron positivos, con las posibilidades de que los animales de ese grupo fueran 2,49
(cuotas) de presentar resultados positivos, mientras que el 26,80% (78/291) del grupo 2
fueron positivos, lo que indica una asociación entre la edad y los hallazgos serológicos (Tabla
1). Se observó que el 74% (331/447) y el 93,50% (418/447) de los criadores de gatos
desconocían la enfermedad y sus modos de transmisión, respectivamente (Tabla 2).

Tabla 1. Factores asociados con la seroprevalencia de Toxoplasma gondii en gatos

domésticos (Belém, Pará, Brasil).
 Tabla 2. Asociación entre la conciencia del propietario y la seroprevalencia de Toxoplasma
gondii en gatos domésticos (Belém, Pará, Brasil).

4. Conclusión

Muchos gatos domésticos en Belém tenían anticuerposanti-T. gondii. Los propietarios

también tendían a tener un conocimiento deficiente sobre los modos de transmisión del
agente infeccioso a los seres humanos y animales.

Se encontró una asociación estadísticamente significativa en relación con la edad y la

serología entre los animales mayores de 1 año (p<0.01)

BLIOGRAFIA

- J.M.Guerra, N.C.Cardoso y L.F. Onuchic. (2019). Prevalence of autosomal dominant

polycystic kidney disease in. Obtenido de
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1519-
69842020005013206&lang=es

- Katerine de Souza, Michele de Sousa y Betsy Tavares. (2020). Serological prevalence of

Toxoplasma gondii infection in. Obtenido de https://www.scielo.br/pdf/rbpv/v29n2/1984-
2961-rbpv-29-2-e022719.pdf