A Novel FMR1 mtodo de PCR que amplifica de manera

reproducible del cromosoma X frgil completa mutaciones en

concordancia con Southern Blot y fiable Detecta Los alelos
expandidos de baja abundancia.

Abstracto
FONDO
Sndrome X Frgil (SXF) es una enfermedad de repeticin de trinucletidos que
es causada por la expansin de las secuencias CGG en la regin 5 'no traducida
del gen
FMR1 gen. Diagnsticos
moleculares
de
FXS
y
otros
emergentes FMR1 trastornos normalmente se basan en dos pruebas, PCR y
transferencia de Southern.Sin embargo, el desempeo o rendimiento
limitaciones de estos mtodos actualmente limitan las pruebas de rutina.
MTODOS
Se evalu una novela FMR1 tecnologa de genes especficos de PCR con 20
moldes de ADN de lneas celulares y 146 muestras clnicas cegados. El nmero
de repeticiones CGG fue determinada por el tamao de fragmento de
amplicones de PCR usando electroforesis capilar y se compar con los
resultados de FMR1transferencia de Southern realizado con las mismas
muestras.
RESULTADOS
El FMR1 PCR detectar con precisin los alelos mutacin completa hasta por lo
menos 1300 repeticiones CGG y que comprende> 99% carcter GC. Todas las
categoras de alelos detectados por transferencia de Southern, incluyendo 66
muestras con mutaciones completas, tambin se identificaron por FMR1 PCR
para cada uno de 146 muestras clnicas. Dado que todos los alelos mutacin
completa en muestras de mujeres heterocigotos se detectaron por PCR,
cigocidad alelo se acopl en cada caso. Los reactivos de la PCR tambin
detectaron una proporcin en masa 1% de un CGG alelo 940 en un fondo de
99% 23 CGG alelo de ms o menos 5 veces mayor sensibilidad que la
transferencia de Southern.

CONCLUSIONES
La nueva tecnologa de PCR puede clasificar con precisin el espectro
de FMR1 alelos, incluyendo alelos que antes se consideraban demasiado
grande para amplificar, reproducible detectar baja abundancia alelos mutacin
completa y correctamente inferir la homocigosis en especmenes femeninos, lo
que reduce considerablemente la necesidad de la muestra Reflexing de
transferencia de Southern.
INTRODUCCIN
El sndrome del cromosoma X frgil (SXF), la forma ms comn de deterioro
mental hereditario y la causa gentica conocida de autismo, fue una de las
primeras enfermedades humanas para vincularse a una expansin de
repeticiones de tripletes de nucletidos ( 1 - 4 ). FXS es causado por la
expansin de la secuencia-guanina-citosina guanina (CGG) de repeticin se
encuentra en el 5'UTR del retardo mental X frgil ( FMR1 ) gen ( 2 ). Los
individuos con normal (<45 repeticiones CGG) o intermedio (45-54
CGG)FMR1 alelos se cree actualmente para ser asintomticos para los
trastornos asociados con el FMR1 gene. Sin embargo, los individuos que son
portadores de un alelo premutacin (55-200 CGG) pueden desarrollar el
sndrome frgil temblor / ataxia X-asociado (FXTAS) ( 5 ) o frgiles insuficiencia
ovrica primaria X-asociado (FXPOI) ( 6 - 8 ), mientras que sujetos con
el FMR1 mutacin completa (> 200 CGG) tpicamente tienen FXS ( 9 ). Se cree
que cerca de 1.5 millones de personas en los EE.UU. a estar en riesgo de al
menos un FMR1 trastorno ( 10 ). Por lo tanto, estas enfermedades son
clnicamente significativos y afectan a una amplia gama de poblacin y edad.
Actualmente, la mayora de los paradigmas de ensayo de diagnstico
para FMR1 trastornos dependen de PCR con la resolucin tamao por
electroforesis capilar (CE), o de agarosa o electroforesis en gel de
poliacrilamida para detectar hasta 100-150 repeticiones CGG. FMR1 anlisis de
transferencia Southern se usa para caracterizar las muestras con CGG repeat
nmeros demasiado grandes para amplificar por PCR, y para determinar el
estado de metilacin del gen de ( 11 ). Desafortunadamente, este flujo de
trabajo es costoso, en tiempo y mano de obra intensiva y requiere grandes
cantidades de ADN genmico, y es por lo tanto inadecuado para los volmenes
de prueba superiores o cribado de la poblacin. PCR potencialmente puede
abordar cada una de estas limitaciones, sin embargo, el carcter altamente
rica en GC de la secuencia de repeticin de triplete X frgil histricamente ha

sido refractaria a la amplificacin. Innovaciones de PCR tales como el uso de

adyuvantes osmolticas, nucletidos modificados, ciclismo y condiciones
especficos han mejorado la deteccin de hasta ~ 300-500 repeticiones CGG
( 12 , 13 ), sin embargo, incluso esta actuacin no seran capaces de detectar
muchos, si no la mayora, mutacin completa alelos ( 14 ). Es importante
destacar que, PCR de premutacin y hembras mutacin completa ha sido
mucho menos xito debido a la amplificacin preferencial del alelo ms
pequeo ( 12 ). En consecuencia, el> 20% de las muestras femeninas que son
biolgicamente homocigotos debe reflexed a transferencia de Southern para
resolver la ambigedad potencial de un unamplified ya alelo.
Aqu, se presenta el desempeo de una novela de genes especficos
de FMR1 tecnologa PCR que puede resolver muchos de los desafos
tecnolgicos que limitan actualmente la prueba de X frgil rutina. Este mtodo
amplifica reproducible alelos con ms de 1.000 repeticiones CGG, y demostr
una excelente concordancia con transferencia de Southern en una evaluacin
de las muestras clnicas cuyos FMR1 alelos abarcado toda la gama de
repeticiones CGG. La consistencia y la sensibilidad de los reactivos para
detectar premutacin y alelos mutacin completa, incluyendo especies de
mosaico que slo pueden estar presentes en un pequeo porcentaje de las
clulas, tambin resuelto ambigedades en la identificacin de muestras
homocigticas femeninas que pueden confundir convencionales FMR1 ensayos
de PCR. La deteccin reproducible de alelos mutacin completa por PCR tiene
implicaciones para la adopcin ms amplia de anlisis FMR1.
MATERIALES Y MTODOS
Las muestras de ADN clnicos y la lnea celular
Las muestras de sangre se obtuvieron de sujetos evaluados en el Instituto
Clnica mente, segn el consentimiento informado y de acuerdo con un
protocolo Junta de Revisin Institucional aprobado. ADN genmico se aisl a
partir de leucocitos de sangre perifrica (5 ml de sangre total) utilizando
mtodos estndar (Qiagen, Gentra Puregene kit de sangre). Slo el nmero de
cdigo era conocido por el tcnico que maneja las muestras. Un total de 146
muestras codificadas fueron enviados a Asuragen, Inc. para el anlisis de
PCR. Todas las muestras de ADN de lneas celulares se obtuvieron de los
depsitos de Coriell Cell (CCR, Instituto Coriell de Investigacin Mdica,
Camden, Nueva Jersey). muestras de ADN clnicos y la lnea celular se
cuantific usando un espectrofotmetro NanoDrop (Thermo Scientific,

Wilmington, DE) y se diluyeron en Tris 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH 8,8 a 20 ng / l

antes de la PCR y se almacenaron a -15 a -30 DO.
Todos los lotes de muestra de PCR incluyen al menos una lnea celular de
"control de procesos." Agrupada El control del proceso se genera a partir de 4
muestras-NA20239 lnea celular (10 ng / l), NA07541 (5 ng / l), NA20230 (12 ng
/ l) y NA06891 (10 ng / l) -admixed en agua desionizada. El uso de este control
proporcionado picos de productos identificados utilizando CE correspondiente a
20 1, 29 1, 31 1, 54 1, 119 y 199 3 5 repeticiones CGG.
Para evaluar la sensibilidad analtica de PCR y transferencia de Southern, una
muestra de control heterocigotos hembra mock se prepar mezclando el ADN
aislado a partir de dos muestras de lnea celular, NA06895 (23 CGG) y
NA09237 (940 CGG). Estos admixes conservan la misma entrada de masa en
cada caso, 7 g de transferencia de Southern y 40 ng por PCR en el que la masa
por ciento del alelo 940 CGG se vari de 1% a 100%.
Genes especficos de FMR1 PCR
Las muestras fueron amplificadas por PCR mediante la preparacin de una
mezcla maestra que contiene 11,45 l de tampn rico en GC AMP (# 49387), 1,5
l de FAM-etiquetados FMR1 cebadores (# 49386), y 0,05 l rica en GC de la
polimerasa Mix (# 49388) de Asuragen Inc. (Austin, TX). La mezcla maestra se
someti a vrtice antes de la dispensacin de una placa de microtitulacin
(placas de 96 o 384 pocillos, Phenix Research Products, Candler, Carolina del
Norte). Las alcuotas de la muestra de ADN, tpicamente 2 l a 20 ng / l, se
transfirieron a la placa. Se agitaron en vrtex, se centrifugaron y se transfieren
a un termociclador placas selladas (ABGene aluminio, Phenix Research
Products) (9700, Applied Biosystems, Foster City, CA).Las muestras se
amplificaron con un paso de desnaturalizacin inicial de calor de 98 C durante
5 minutos, seguido por 25 ciclos de 97 C durante 35 s, 62 C durante 35 seg
y 72 C durante 4 min, y 72 C durante 10 minutos . Despus de la PCR, las
muestras se almacenaron a -15 hasta -30 C protegido de la luz antes del
anlisis por electroforesis en gel de agarosa (AGE) o electroforesis capilar
(CE). Un diagrama esquemtico de la tecnologa y de flujo de trabajo se
muestra en la Figura 1 .

La electroforesis en gel de agarosa (AGE)

Un total de 6 l de la reaccin de PCR se combin con 3 l de 3 AGE colorante
de carga (15% de glicerol y 0,25% de azul de bromofenil (Sigma, St. Louis,
MO)), y todos 9 l se cargaron en un 1,75% gel de agarosa.Los geles se tieron
con SYBR Gold 10.000 veces (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la imagen con UV
usando un sistema Alpha Innotech FluorChem 8800 Imaging deteccin (Alpha
Innotech, San Leandro, CA).
La electroforesis capilar (CE)
Excepto donde se indique, un 3130xl analizador ABI gentico (Applied
Biosystems, Foster City, CA), corriendo polmero POP-7 (Applied Biosystems)
con 36 cm capilares se utiliz para todos los experimentos.Las muestras se
prepararon para el anlisis de CE mediante la mezcla de 2 l de producto de PCR
no purificado con 11 l de Hi-Di formamida (Applied Biosystems) y 2 l de una
escalera de tamao ROX marcado (# 46083, Asuragen, Inc.). Las muestras
preparadas en escalera Hi-Di formamida / ROX-Size se desnaturalizaron por
calor a 95 C durante 2 min seguido de enfriamiento a 4 C durante al menos
2 min.Excepto donde se indique, todas las inyecciones fueron de 2,5 kV
durante 20 s con un plazo de 40 min a 15 kV.
Anlisis de los datos
Los productos de PCR fueron analizados por edad en relacin con el tamao
MW escalera hasta unos 1.500 repeticiones CGG. Los productos de PCR
detectados por CE se analizaron usando el software GeneMapper 4.0 (Applied
Biosystems). La conversin de pico del tamao en pares de bases a nmero de
repeticiones CGG se determin tomando como referencia el tamao de pares
de bases de los alelos de control de procesos con el tamao de pares de bases
de los picos del producto muestra. Las indicaciones de genotipo siguen las
pautas de ACMG para el normal (NOR) (<45 CGG), intermedia (INT) (45-54
CGG), premutacin (PM) (55-200 CGG), y la mutacin completa (FM) (> 200
CGG) ( 9 , 15 ). Mosaico mutacin completa (Fm) se utiliz slo para las
muestras que contienen tanto una premutacin y un alelo mutacin completa.
Southern Blot
Para el anlisis de transferencia de Southern, 7-10 g de ADN aislado se digiri
con EcoRI y NruI y se separaron en un gel de agarosa al 0,8% / Tris acetato

EDTA (TAE). Despus de la transferencia de ADN, las membranas se hibridaron

con el FMR1 especfico de StB12.3 sonda genmica. Los detalles adicionales
del mtodo son como se presentan en ( 16 ).
RESULTADOS
Desde FMR1 trastornos tales como FXS, FXPOI, y FXTAS estn asociados con el
nmero de repeticiones de tripletes en la 5 'UTR del gen, los ensayos basados
en ADN que interrogar a la longitud del tracto CGG son los mtodos de eleccin
para las pruebas moleculares. Aunque los procedimientos tales como la
secuenciacin de transferencia y el ADN del Sur pueden enumerar el segmento
de repeticin, estos enfoques estn limitados principalmente por el, la cantidad
de material de ADN genmico que se requiere, o el flujo de trabajo de
consideraciones que son incompatibles con los procedimientos de alto
rendimiento (nmero o exactitud de repeticin de cuantificacin 17 ). Por estas
razones, la PCR es la tcnica molecular preferido. El objetivo de este estudio
fue caracterizar un nuevo conjunto de reactivos de PCR de genes especficos
con ambas lneas celulares y de muestras de ADN clnicos, se hace referencia a
los resultados de transferencia de Southern, como un primer paso en el
desarrollo de una tecnologa de PCR-slo para FMR1 anlisis.
Para establecer el comportamiento de los genes especficos de FMR1 reactivos
con las plantillas definidas de ADN, se amplificaron una coleccin de ADN
genmico de lneas celulares (gDNA) desde los repositorios de Coriell Cell
(CCR). Los productos se caracterizan por tanto electroforesis en gel de agarosa
(AGE) tanto para hombres y mujeres ( Figura 2 ) y electroforesis capilar (CE)
( Suppl Tabla 1 ). El nmero de repeticiones CGG para cada plantilla se
extrapol a partir de la movilidad de amplificacin en relacin con las normas
de tamao para ambas plataformas de electroforesis. Las plantillas de ADN
incluyen varios materiales gDNA previamente evaluados por secuenciacin y /
o el consenso de repeticin CGG encolado ( 18 ). Como se muestra en la Figura
2 , los FMR1 reactivos amplificaron las plantillas de la lnea celular con un
nmero de la repeticin CGG que abarcan todas las categoras de los alelos, de
normal a mutacin completa. Plantillas con un mximo de ~ 1.000 repeticiones
fueron detectados fcilmente (vase la Figura 2A , carril 6 y Figura 6 ), tanto
por la edad y la CE. En cada caso, el nmero de repeticiones CGG inferidos
fueron consistentes con los del mtodo de referencia ( Suppl Tabla 1 ).
Los resultados de la amplificacin de un conjunto de plantillas de gDNA lnea
celular hembra subrayaron an ms la eficiencia de la reaccin de

PCR. Histricamente, FMR1 PCR ha sufrido de amplificacin sesgada. Este

sesgo se ve agravada por el contexto de la secuencia muy rica en GC de la
regin de repeticin de triplete que favorece el alelo ms fcilmente
amplificable y compuestos de la diferencia en la acumulacin de producto
cuando ambos cortos (por ejemplo, normal) y largos (por ejemplo, premutacin
o mutacin completa) alelos estn presentes en la misma reaccin. Por el
contrario, los alelos de los nmeros de repeticiones variable se detectaron
fcilmente en alelos heterocigotos utilizando los genes especficos
deFMR1 reactivos de la PCR ( Figura 2B ). Las combinaciones de un medio
docena de FMR1 alelos que abarcan la normal al rango de mutacin completa
(por ejemplo, 20, 29, 119, 199, 336, y 645 CGG) podran ser cada fcilmente
coamplificadas en el mismo tubo ( Suppl Figura 1 , carril 3) .
El FMR1 mtodo de PCR fue evaluada junto con un conjunto de 146 muestras
clnicas cegados proporcionados por el Instituto MIND de la Universidad de
California, Davis, y anteriormente caracteriza por Southern blot como se
describe ( 16 ). Comparativo transferencia de Southern y los resultados de PCR
para un conjunto representativo de 17 muestras de un grupo ms grande de
146 especmenes se muestran en la Figura 3 . Los datos demuestran una
sorprendente similitud en la distribucin del patrn y tamao de
lasFMR1 alelos. Por ejemplo, los alelos se representan a menudo como varias
bandas de espejo por ambos mtodos, incluso para los alelos expandidos (ver
calles correspondientes a las muestras # 54, 55, 57, 62, 66 y 68-70). Por lo
tanto, a pesar de PCR y transferencia de Southern se basan en diferentes
modalidades de procesamiento de muestras y de deteccin, las especies UTR 5
'que comprenden las regiones de repeticin CGG fueron consistentes en su
distribucin relativa y el rendimiento. El acuerdo de los datos entre los
mtodos, ms notablemente el patrn de muestra especfica de productos
complejos, sugiere que la PCR y Southern blot mtodos son muy coherentes
entre s, y que refleja el verdadero nmero de repeticiones molecular de los
pacientes FMR1 alelos.
Los productos de PCR especficos de genes tambin se analizaron por
electroforesis capilar ( Figura 4 ). En consonancia con la alta resolucin de este
mtodo, los alelos heterocigotos que difieren por una nica repeticin CGG se
diferenciaron fcilmente ( Figura 4A , # 34), mientras que el lmite de
resolucin del gel de agarosa fue de ~ 5 CGG para los alelos en el rango
normal (datos no mostrada). Usando CE, FMR1 alelos podran ser de un tamao
con precisin dentro de 1 CGG hasta 70 CGG y 3 CGG a aproximadamente 120

repeticiones ( Suppl Tabla 1 y ( 19 )). Alelos mutacin completa, sin embargo,

no pudieron ser resueltos ms all de aproximadamente 200 CGG-el umbral de
repeticin de una mutacin del cromosoma X frgil lleno-CE utilizando la
configuracin descrita. Por ejemplo, el CE de los amplificados de PCR de la
muestra N 118, que comprenda alelos mutacin completa que abarca ~ 3751,200 CGG mediante transferencia Southern, revel un pico de la movilidad y
morfologa similares como la muestra # 55, que presenta alelos de ~ 450-650
CGG por Southern Blot ( Figura 4A ). Sin embargo, las mutaciones identificadas
completos del anlisis CE estaban de acuerdo coherente con las evaluaciones
categricas de los mismos amplicones por electroforesis en gel de agarosa o
transferencia de Southern. todo el conjunto completo de 146 muestras, 42
normales
y
3
muestras
intermedias
fueron
identificados
por
tanto FMR1 transferencia de Southern y de genes especficos de PCR. Adems,
el anlisis de transferencia Southern identificaron 66 mutaciones
completas. Todos los 66 de estas muestras tambin fueron detectados como
mutaciones completas de genes especficos de FMR1 PCR (Suppl Tabla 2). El
anlisis de PCR tambin identific dos muestras con alelos de mutacin y
premutados completos que se calificaron como premutaciones solamente por
Southern Blot (vase ms adelante). Las muestras restantes que se clasificaron
como premutaciones mediante transferencia Southern fueron exactamente
concordante con los resultados de FMR1 PCR.
Las dos muestras discrepantes, # 22 y # 101, revelaron fragmentos
destacados premutacin de tamao tanto por transferencia de Southern y PCR,
sino tambin de baja intensidad amplificados por PCR mutacin completa
cuando se analizaron por CE ( Figura 5 ). Alelos mutacin completa en otros
especmenes que slo eran apenas visibles por Southern blot fueron tambin
ms claramente detectados por PCR / CE. Esto fue particularmente cierto para
los alelos expandidos que se extendi por una amplia distribucin de tamao,
pero se "derrumb" a travs de la migracin en el polmero CE y, por tanto codetectado como una coleccin de grandes amplicones con movilidades
electroforticas similares ( Figura 5 , # 125). Esta deteccin mejorada plante
la cuestin de si el mtodo de PCR / CE puede ser ms sensible que la
transferencia de Southern para la deteccin de alelos de baja abundancia.

Para ayudar a resolver esta cuestin, se determin el lmite analtico de

deteccin tanto de PCR y transferencia de Southern despus de la titulacin de
dos gDNAs lnea celular masculino bien definido, uno compuesto por un CGG
940 FMR1 alelo y el otro, 23 CGG. Como se muestra en la Figura 6 , se detect
tan poco como una fraccin 1% en masa de la plantilla 940 CGG (400 pg, ~
120 copias de genes) en un fondo de 99% 23 CGG alelo (39,6 ng). Por el
contrario, una entrada de 175-veces mayor de gDNA en la transferencia de
Southern revel un lmite de deteccin de aproximadamente 5% de la 940 CGG
alelo. Por lo tanto, el FMR1 PCR gen especfico es 5 veces ms sensible que la
transferencia de Southern (o 5 * 175 = 875 veces ms sensible dadas las
diferencias en la entrada de 940 CGG alelo que se analiz por los dos
mtodos), al menos con estas plantillas gDNA. Este resultado es consistente
con la observacin de que los alelos mutacin completa en muestras clnicas
pueden ser identificadas por PCR cuando no pueden ser detectados por
transferencia de Southern. DISCUSIN
La amplificacin por PCR ineficiente de los 5 'UTR del gen FMR1 gen ha
dificultado mucho el desarrollo de alto rendimiento y diagnstico molecular de
automatizacin de usar X frgil. Aunque un puado de metodologas de PCR
han sido publicados que puede amplificar> 200 repeticiones CGG
( 12 , 20 - 22 ), todos se han limitado a la evaluacin de las mutaciones
completas ms pequeas, por lo general slo en varones. De hecho, los
protocolos utilizados actualmente por los laboratorios de diagnstico se
restringen comnmente a la deteccin de 100-150 repeticiones, y mutaciones
completas a menudo se sospecha por su fracaso para amplificar, en lugar de su
xito ( 23 , 24 ). Como resultado, el flujo de trabajo para el diagnstico frgiles
X se basa en la transferencia de Southern para entregar la informacin
molecular actualmente no alcanzable con PCR. En este informe se describe el
funcionamiento de un mejorado FMR1 tecnologa PCR que reproducible puede
amplificar mutaciones completas, tanto en hombres como en mujeres,
incluyendo alelos hasta al menos 1.300 CGG en el pliegue de tamao varias
mayor que cualquier otro estudio publicado ( 12 , 13 ) . Como tal, esta
tecnologa aborda muchos de los problemas clave que histricamente han
limitado la utilidad de FMR1 PCR, y por lo tanto puede reducir en gran medida
el nmero de muestras que deben ser reflexos a transferencia Southern.
Una caracterstica clave de la FMR1 tecnologa de PCR descrito aqu es la
eficiencia
por
la
que
largas
repeticiones
CGG
se
pueden
amplificar. Especmenes de mutacin full hembra proporcionan dos FMR1alelos,
tpicamente una que es <40 CGG y uno que es> 200 CGG. Puesto que el alelo
ms corto se amplifica mucho ms fcilmente, esta plantilla puede outcompete
el alelo ms tiempo durante la PCR y reducir el rendimiento del amplicn

mutacin completa que se producira de otro modo si el alelo mutacin

completa se amplificaron de forma aislada. Este desequilibrio es exagerada al
aumentar la longitud CGG, como la eficiencia de la PCR disminuye. Los
reactivos de la PCR descritos aqu, sin embargo, producen muy "equilibrado"
rendimientos de producto de PCR ( Figura 2 ). De hecho, tan slo ~ 120 copias
(400 pg) de una CGG alelo 940 se pueden detectar en un fondo de un exceso
de 99 veces de un 23 CGG alelo ( Figura 6). Por otra parte, las combinaciones
de media docena o ms alelos, incluyendo varios alelos de mutacin completa,
se pueden amplificar y detectar con xito estos reactivos ( Suppl Figura 1 ). Un
beneficio prctico de esta capacidad es el uso de un control de proceso 6-alelo
que se extiende normal a alelos mutacin completa, y se incluy con todas las
reacciones de PCR realizadas en este estudio ( Figura 4B ).
Rendimiento de los reactivos de PCR con muestras clnicas cegados produce
una excelente correlacin con los resultados de la transferencia de
Southern. Cabe destacar que todas las 66 mutaciones completas detectados
por Southern blot tambin fueron detectados por FMR1 PCR. Adems, hubo una
notable similitud en los patrones de alelos heterogneos muestra a muestra
reveladas por la comparacin de los datos producidos por los dos
mtodos. Adems, dos muestras con alelos premutados bien definidos que
fueron detectados por ambos mtodos tambin proporcionan evidencia de baja
abundancia alelos mutacin completa mediante PCR, pero no por Southern
blot. Una valoracin analtica de la plena mutacin y de DNA genmico
normales demostr que la PCR es 5 veces ms sensible que la transferencia de
Southern para la deteccin del alelo mutacin completa ( Figura 6 ), incluso
despus de descontar la diferencia 175 veces en la entrada del ADN. Por lo
tanto, la PCR puede reportar al menos algunos alelos mutacin completa que
estn por debajo del lmite de deteccin por Southern blot.
Una pregunta ms amplia es, cules son las implicaciones de la deteccin de
tales mutaciones completas baja abundancia? Alelos del mosaico estn
presentes en un subconjunto de la poblacin de clulas, y, basndose en los
resultados mostrados en la Figura 6 , el FMR1 PCR pueden detectar
tericamente alelos mutacin completa en <5% de las clulas, y tal vez tan
pocos como 1% de las clulas. Por un lado, la falta deFMR1 produccin de
protenas en una minora de tales clulas es poco probable que tenga un gran
impacto en el frgil X fenotipo. Por otro lado, FMR1 prueba X se lleva a cabo
con una muestra clnicamente accesibles (sangre total) que no es ms que un
sustituto para la interrogacin del tejido diana (cerebro) que es responsable de

las consecuencias neurolgicas del sndrome del cromosoma X frgil. Los

estudios de casos han demostrado discrepancias dentro del mismo paciente
del nmero de repeticiones CGG en sangre entera en comparacin con las
clulas, como las clulas epidrmicas, que estn ms estrechamente
relacionados en el linaje de cerebro ( 25 de - 27 de ). Las muestras que
presentan detectables alelos mutacin completa en un subconjunto de clulas
sanguneas pueden valer la pena reflejas en las clulas epidrmicas como una
forma de comenzar a evaluar las consecuencias moleculares de dichos alelos
de baja abundancia mutacin completa. Este concepto tambin puede ser
relevante para FXPOI, un FMR1 trastorno cuyas consecuencias biolgicas se
realizan en clulas que no sean los de la sangre entera.
La deteccin reproducible de mutaciones completas por los FMR1 reactivos de
PCR tambin tiene importantes implicaciones para la muestra Reflexing de
transferencia de Southern. Actualmente, los laboratorios de cualquiera de los
procesos de cada muestra clnica de transferencia de Southern (debido a la
insuficiencia de la mayora de FMR1 pruebas PCR), o muestras sospechosas de
reflejo de transferencia de Southern. Tales muestras sospechosas pueden
incluir especmenes machos que no amplifican o especmenes femeninos que
slo admiten un nico producto de PCR. En este ltimo caso, las muestras de
homocigotos, que representan> 20% de todas las muestras de mujeres, no se
pueden distinguir del caso heterocigotos con un alelo inamplificable. Las
capacidades de los nuevos FMR1 reactivos de PCR para amplificar cada
mutacin completa en este estudio traducido a las evaluaciones zygosity
precisos para todas las muestras. Por otra parte, el rendimiento de los
reactivos sugiere que slo las muestras que requieren informacin de
metilacin necesitan ser reflexos a transferencia Southern. Debido a que
muchos laboratorios restringen evaluaciones de metilacin a premutacin y
especmenes mutacin completa, y estas categoras representan quizs 2% de
todas las muestras ( 28 ), slo que esta pequea fraccin de especmenes
requerira prueba de reflejo. Por lo tanto, las capacidades de PCR descritos aqu
representan una mejora significativa sobre los procedimientos actuales, en el
que 10 a 100% de las muestras se reflexed a transferencia Southern.
En resumen, esta tecnologa PCR ofrece una alternativa atractiva tanto para la
transferencia de Southern y PCR metodologas actuales, y representan un paso
crtico hacia la eliminacin de la transferencia de Southern del flujo de trabajo
X frgil. Adems, los reactivos son compatibles con las evaluaciones de
metilacin basado en la PCR de FMR1 alelos utilizando enzimas de restriccin

sensibles a la metilacin. Ampliado utilidad de estos reactivos de PCR

utilizando un novedoso diseo de cebadores de repeticin triple, y sus
implicaciones para las evaluaciones moleculares ms completa de la FMR1 gen, se describe en la obra de compaa ( 19 ).
Expresiones de gratitud
Este proyecto fue apoyado en parte por los premios de la Kennedy Shriver
Instituto Eunice Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano incluyendo
R43HD060450 en AGH, HD044410 al FT, y HD040661 a PJH. El contenido es
responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la
opinin oficial de la Kennedy Shriver Instituto Nacional Eunice de Salud y
Servicios Humanos de Desarrollo Infantil o de los Institutos Nacionales de
Salud.