PROTOCOLO DE

ANLISIS
MICROBIOLOGICO
PARA JUGO DE
FRUTAS SIN
PASTEURIZAR
DANIELA RIVERA
JUAN DAVID PINZON
DAVID BOTIA
PROTOCOLO DE ANLISIS MICROBIOLOGICO PARA JUGO DE FRUTAS SIN PASTEURIZAR

INTRODUCCIÓN

Los alimentos pueden contaminarse con diferentes tipos de agentes que pueden
alterar o no sus características y dependiendo del agente se puede distinguir la
contaminación física, química y biológica. En este caso tenemos jugo de frutas el cual
contiene glúcidos, vitaminas y sales minerales los cuales representan un sustrato
optimo para la colonización de diversos microorganismos, es por esto, que la sanidad
juega un papel importante ya que las alteraciones se pueden presentar y
normalmente se pueden eliminar y controlar mediante una debida aplicación del
sistema de control desde la materia prima hasta el producto final.
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PROBLEMAS
Se ha planteado que los problemas de contaminación en los
jugos son generados por factores que son:

Causas mecánicas: preparación y conservación de jugos.

Causas mecánicas: preparación y conservación de jugos.

Dada la composición química de las frutas, estas son un

excelente medio de cultivo para los microorganismos.

Contaminación del agua con que son preparados los jugos.

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RESOLUCION 3292 DE 2013

Para este protocolo se uso como base la resolución 3929 de 2013 la cual nos
habla de el el reglamento técnico sobre los requisitos sanitarios que deben
cumplir las frutas y las bebidas con adición de jugo (zumo) o pulpa de fruta o
concentrados de fruta, clarificados o no, o la mezcla de estos que se
procesen, empaquen, transporten, importen y comercialicen en el territorio
nacional
PRODUCTO REQUISITO PARÀMETRO
n m M c
Jugos (zumos) sin tratamiento Recuento de E. Coli ufc/g o ml 5 <10 - 0
térmico congelados o no.
Recuento de mohos y levaduras 5 1000 30000 2
ufc/g o ml
Detección de Salmonella / 25 grs 5 Ausenc - 0
ia

Donde:
n = Número de unidades a examinar .
m = Índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad.
M = Índice máximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad.
c = Número máximo de muestras permisibles con resultado entre m y M.
< = Léase menor de.
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PARA JUGO DE FRUTAS SIN PASTEURIZAR

OBJETIVO:

Evaluar la calidad microbiológica de los jugos de frutas sin pasteurizar con el fin de
garantizar la inocuidad del producto y verificar el cumplimiento de los parámetros
microbiológicos definidos en la resolución 3929 de 2013.

METODO:

Las muestras que se tomen para el análisis deben ser representativas para poder
determinar así su calidad microbiológica. Para su recogida se deben utilizar los elementos y
materiales de laboratorio completamente estériles y recolectarse cantidades exactas e
iguales para que los resultados no se vean afectados así mismo el análisis debe comenzar
antes de que hayan transcurrido 4 h desde el momento de la toma de las muestras. En
circunstancias excepcionales las muestras pueden conservarse a una temperatura menor a
4 ºC durante un periodo máximo de 24 h.
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METODOLOGÍA
Recuento de E. Coli:

El método consiste en desarrollar una prueba presuntiva en el que los resultados se

basan en la técnica del número más probable.

Método:
• Suspensión inicial
Tomar 10 ml del jugo con una pipeta esterilizada, transferir al frasco schott de 90 ml al
0,1% y homogenizar por dos minutos, esta dilución corresponderá a 10-1. Preparar
diluciones de 10-2 y 10-3.
Inocular 9 tubos de lactosa bilis verde brillante con su campana de Durham con 1 ml
de cada dilución e incubar a 37ªC para coliformes totales durante 24 ò 48 h.
Repetir el mismo procedimiento anterior para coliformes fecales pero esta vez incubar
a 45ºC durante 24 ò 48 h.
Si se observa crecimiento de gas completo a las 24 h o antes la prueba de coliformes totales
comprada con la tabla del NMP e informar.
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• Aislamiento en agar MACCONKEY:

Tome una asada de uno de los tubos positivos de coliformes fecales
y realice una siembra por estría o aislamiento en el medio
MacConkey. Incube a 35 °C por 24 – 48 horas.
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• Pruebas bioquímicas:
CITRATO DE PRUEBA DE INDOL ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER
SIMMONS
Con un asa redonda, De la misma De la misma colonia, De la misma colonia,
tome la colonia con un asa redonda, con un asa redonda,
característica del colonia, con un
siembre en el caldo RM siembre en el otro
microorganismo asa recta, tome la VP. Lleve a incubar a 35 tubo con caldo RM VP.
seleccionado del agar
MacConkey y siembre en colonia °C por 24 a 48 horas. Lleve a incubar a 35 °C
zigzag sobre el pico de característica y Posterior al período de por 24 a 48 horas.
flauta del medio Citrato incubación, adicione 5 Posterior al período
de Simmons. Incube a 35
siembre en el
gotas del reactivo rojo de incubación,
°C por 24 a 48 horas. medio SIM. de metilo y espere 1 adicione 5 gotas de
Medio cambia de color a Incube a 35 °C de minuto para alfa naftol y 5 gotas de
azul.(azul de
bromotimol) 24 a 48h. interpretar. KOH y espere 1
minuto para
interpretar la
reacción.
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METODOLOGÍA
Recuento de mohos y levaduras:

Método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo
específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a
los polisacáridos que contiene el medio.

Método:
Suspensión inicial
Tomar 10 ml del jugo con una pipeta esterilizada, transferir al frasco schott de 90 ml al 0,1% y
homogenizar por dos minutos, esta dilución corresponderá a 10-1. Preparar diluciones de 10-2 y
10-3 utilizando una pipeta estéril.
Sembrar por duplicado en profundidad 1 ml de cada una de las diluciones utilizando una pipeta
estéril., agregar de 15 a 20 ml de agar OGY fundido para mohos y levaduras homogenizar y
dejar solidificar.
Incubar en posición invertida de 2 a 5 días a 25ºC.
Contar aquellas placas que tengan entre 10 a 150 colonias de hongos y/o levaduras y reportar
por separado como UFC/g o ml de muestra, indicando tiempo de incubación.
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• Aislamiento en agar PDA u OGY:

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• Pruebas de confirmación:
TINCIÓN AZUL DE LACTOFENOL O AZUL ALGODÓN PARA TINCION DE GRAM PARA LEVADURAS
HONGOS
Sobre un porta limpio y seco depositaremos 2 gotas de azul de Teñir el frotis de cristal violeta durante 1 minuto.
lactofenol. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
Cortaremos un trozo de cinta y la pegaremos en el extremo del asa Cubrir la preparación con Lugol durante 1 minuto.
estéril. Se lava con agua destilada hasta eliminar el exceso de Lugol.
Con cuidado pasaremos el extremo por el borde exterior de la Lavar con alcohol/acetona por 15 sg.
colonia. Lavar de nuevo con agua destilada para retirar los restos de
Pegaremos la cinta en el portaobjetos que tiene el colorante alcohol/acetona.
retirando con cuidado el asa. Teñir la preparación con fucsina durante 30 sg.
Añadiremos una gota de colorante. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
Cubriremos la preparación con un cubreobjetos. Secar la preparación al aire y observaremos al microscopio.
Observaremos al microscopio.

Figura: tinción de Gram para levaduras visto en

Figura: tinción de mohos visto en microscopio microscopio
Fuente: https://labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist- Fuente: https://es.123rf.com/photo_44243062_ciernes-
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METODOLOGÍA
Detección de Salmonella / 25ml

La búsqueda de este microorganismo en alimentos es primordial para garantizar la inocuidad de

estos productos, pues son su principal vehículo de transmisión el cual se basa en realizar un pre
enriquecimiento, enriquecimiento después una siembra en cultivo y por último pruebas
bioquímicas.

Método:
PRE-ENRIQUECIMIENTO Salmonella sp.
Tomar 25 ml del jugo en condiciones asépticas y llevarlo directamente a un frasco de dilución
con 225 ml de caldo lactosado o agua peptonada tamponada, agitar vigorosamente para
homogenizar la muestra. Esta dilución corresponderá a 10-1 . incubar a 35-37 °C por 18 a 24 h
en aerobiosis.

ENRIQUECIMIENTO Salmonella sp.

Transferir 1 ml del caldo de Pre-enrequecimiento al tubo de caldo Rappaport-Vassiliadis e
incubar a 35-37 °C por 24 h en aerobiosis.
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• Aislamiento en agar XLD Y SS:

Del tubo de enriquecimiento sembrar por estriamiento con asa redonda en Agar XLD y Agar
SS incubar a 35-37 °C por 24 h en aerobiosis y analizar resultados e interpretar
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• Aislamiento en agar XLD Y SS:

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• Pruebas de bioquímicas:
TINCIÓN DE GRAM PRUEBA DE CATALASA AGAR KLIGLER O TSI, LISINA-HIERRO

Teñir el frotis de cristal violeta durante 1 Tomar una colonia del medio XLD o Se transfiere con un filamento una
minuto. SS y agregar 1 gota de peróxido de colonia típica en cada uno de los
Lavar con agua destilada hasta eliminar el hidrógeno y observar la aparición de medios, haciendo la inoculación en
exceso de colorante. burbujas, como positivas. profundidad (por pinchazo) y en la
Cubrir la preparación con Lugol durante 1 superficie siguiendo un trazo
minuto. longitudinal.
Se lava con agua destilada hasta eliminar Incubar a 35-37 °C por 24 h los medios
el exceso de Lugol. Kligler o TSI, y por 24 a 48 H el agar
Lavar con alcohol/acetona por 15 sg. lisina-hierro
Lavar de nuevo con agua destilada para Producción de sulfito de hidrógeno
retirar los restos de alcohol/acetona. que se manifiesta por ennegrecimiento
Teñir la preparación con fucsina durante total o parcial del agar kliger
30 sg. Descarboxilación de la lisina. En este
Lavar con agua destilada hasta eliminar el medio puede también observarse
exceso de colorante. ennegrecimiento total, parcial o
Secar la preparación al aire y ausente en agar hierro-lisina.
observaremos al microscopio.
su color a la hora de la tención será de un
color rojo o rosa,

Prueba de catalasa para Salmonella negativa y

positiva
Fuente:http://microbitosblog.com/2011/09/27/prueb
as-bioquimicas-primarias/ Agar TSI. Salmonella (H2S+) y (H2S-); Citrobacter sp., S. arizonae Fuente:
http://www.publicdomainfiles.com/show_file.php?id=13544318417791
Agar TSI. Salmonella (H2S+) y (H2S-); Citrobacter sp., S. arizonae Fuente:
http://www.publicdomainfiles.com/show_file.php?id=13544318417791
 El agua como materia prima
Recordemos que el agua contiene gran cantidad de bacterias y microorganismos.
 Legislación colombiana del agua

Las normas microbiológicas se encuentran dictadas en el

decreto 1575 resolución 2115 de 2007.
 Conceptos previos
Estos son algunos conceptos previos encontrados en la norma relacionados

con el manejo del agua como materia prima:

Análisis microbiológico del agua: Son los procedimientos de laboratorio que se efectúan a una
muestra de agua para consumo humano para evaluar la presencia o ausencia, tipo y cantidad de
microorganismos.

Análisis básicos: Es el procedimiento que se efectúa para determinar turbiedad, color aparente, pH,
cloro residual libre o residual de desinfectante usado, coliformes totales y Escherichia coli.

Análisis Complementarios: Es el procedimiento que se efectúa para las determinaciones físicas,

químicas y microbiológicas no contempladas en el análisis básico, que se enuncian en la presente
Resolución y todas aquellas que se identifiquen en el mapa de riesgo.

Análisis físico y químico del agua: Son aquellos procedimientos de laboratorio que se efectúan a una
muestra de agua para evaluar sus características físicas, químicas o ambas.
Coliformes: Bacterias Gram Negativas en forma bacilar que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a
37ºC, produciendo ácido y gas (CO2 ) en un plazo de 24 a 48 horas. Se clasifican como aerobias o
anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimática de la
β galactosidasa. Es un indicador de contaminación microbiológica del agua para consumo humano.

Escherichia coli - E-coli: Bacilo aerobio Gram Negativo no esporulado que se caracteriza por tener
enzimas específicas como la β galactosidasa y β glucoronidasa. Es el indicador microbiológico preciso de
contaminación fecal en el agua para consumo humano

Sustrato definido enzimático: Prueba que contiene sustratos hidrolizables para la detección de las
enzimas ß D galactosidasa de los coliformes y de las enzimas ß D galactosidasa y ß glucoronidasa de la
E. Coli. El nutriente indicador permite que los microorganismos objeto de la prueba, una vez incubados
en un medio reactivo, produzcan color o fluorescencia, indicando y confirmando la presencia del
microorganismo objeto de investigación
Características microbiológicas

Técnicas para realizar análisis microbiológicos. Las técnicas aceptadas para realizar los análisis
microbiológicos del agua para consumo humano son las siguientes:

Para Escherichia Coli y Coliformes totales: Filtración por membrana, sustrato definido, enzima
sustrato y presencia-ausencia. Se pueden adoptar otras técnicas y metodologías debidamente
validadas por el Instituto Nacional de Salud, INS, o este realizará una revalidación con base en
documentos soporte de organismos internacionales que presenten los solicitantes;

Para Giardia y Cryptosporidium: Las técnicas y metodologías de análisis para estos

microorganismos deben ser validadas por el Instituto Nacional de Salud, INS, o revalidadas por este
con base en documentos soporte de organismos internacionales que presenten los solicitantes.
 Características
microbiológicas
del agua
Características microbiológicas. Las características
microbiológicas del agua para consumo humano deben
enmarcarse dentro de los siguientes valores máximos

aceptables desde el punto de vista microbiológico, los cuales son establecidos teniendo en
cuenta los límites de confianza del 95% y para técnicas con habilidad de detección desde 1
Unidad Formadora de Colonia (UFC) ó 1 microorganismo en 100 cm3 de muestra:
Características microbiológicas del agua
 Otras consideraciones
importantes en la norma
PARÁGRAFO 1. Como prueba complementaria se recomienda realizar la determinación de
microorganismos mesofílicos, cuyo valor máximo aceptable será de 100 UFC en 100 cm3 .

PARÁGRAFO 2. Ninguna muestra de agua para consumo humano debe contener E.coli en 100 cm3 de
agua, independientemente del método de análisis utilizado.

PARÁGRAFO 3. El valor aceptable para Giardia es de cero (0) Quistes y para Cryptosporidium debe
ser de cero (0) Ooquistes por volumen fijado según la metodología aplicada.
Características microbiológicas de
las frutas
 MINISTERIO DE SALUD
RESOLUCIÓN NÚMERO 7992 DE 1991 (21 de julio de 1991)
Por Ia cual se reglamenta parcialmente el Título V de Ia Ley 09 de
1979, en lo relacionado con la elaboración, conservación y
comercialización de Jugos. Concentrados, Néctares, Pulpas, Pulpas
Azucaradas y Refrescos de Frutas.
 ACIDEZ TITULABLE EXPRESADA PORCENTAJE MÍNIMO DE SÓLIDOS
FRUTA COMO ÁCIDO CÍTRICO ANHÍDRO % DISUELTOS POR LECTURA
m/m MÍNIMO REFRACTOMÉTRICA A 20ºC (Brix)

Limon 4,5 6,0

Mandarina 0,5 9,0

Maracuya 1,8 12,0

Naranja 0,5 9,0

Piña 0,3 10,0

Toronja 0,7 8,0

Uva 1,0 12,0

Características microbiológicas
de las frutas sin tratamiento
térmico
Las características microbiológicas de los jugos y pulpas de frutas:

n m M
c

Recuento microorganismos mesófilos/gr 3 20.000 50.000 1

NMP Coliformes Totales/gr 3
9 29 0 NMP Coliformes
Fecales/gr 3 <3
- 0 RTO - Esporas Clostridium Sulfito reductor/gr
3 <10 - 0
Recuento Hongos y levaduras/gr 3
1.000 3.000 1

n = Número de muestras a examinar

m = Índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad
M = Índice máximo permisible para identificar nivel de calidad aceptable
c = Número de muestras permitidas con resultados entre m y M
Recuento de mesófilos
Determinación de NMP Coliformes totales y
fecales
Esporas Clostridium Sulfito reductor
Recuento Mohos y levaduras
 Referencias

• Mac, F,. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, 3ed, Panarmericana,
Argentina,( 2003). obtenido de:http://microbitosblog.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas-primarias/.
• Alonso, X.; Poveda, J. 2008. Estudio comparativo en técnica de recuento rápido en el mercado y placas
PetrifilmTM3MTM para el análisis de alimentos. Tesis Pontificia Universidad Javeriana. Consultada en:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis230.pdf.
• https://irp-
cdn.multiscreensite.com/b5e5fcd9/files/uploaded/Resolucion%207992%20de%201991%20Jugos%20concentrados
%20Nectares%20pulpas%20refrescos.pdf
• https://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis105.pdf
• https://www.minambiente.gov.co/images/GestionIntegraldelRecursoHidrico/pdf/Disponibilidad-del-recurso-
hidrico/Decreto-1575-de-2007.pdf
¡GRACIAS!