TRABAJO PRÁCTICO 1: FUNDAMENTOS BÁSICOS

PARA EL TRABAJO EN ESTERILIDAD

EN EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

Segundo cuatrimestre - AÑO 2023
Ing. Verónica Kyanko – Dra. Alfonsina Moavro
 Objetivos

 Recordar aquellas acciones que permitan el trabajo en

esterilidad esencial en un laboratorio de microbiología de
alimentos.

 Determinar la concentración de un cultivo O/N de E. coli

mediante diluciones seriadas y siembra en superficie y en
profundidad.
 Metodología

a) Preparación de medios de cultivo

b) Preparación de material de vidrio

c) Acondicionamiento del área de trabajo

d) Trabajo en esterilidad : diluciones seriadas de un cultivo O/N y siembra para

determinar su concentración

e) Decontaminación de material utilizado.

 a) Preparación de medios de cultivo

Los medios de cultivo son diseñados

con los nutrientes necesarios para que
crezcan los microorganismos deseados.

Macronutrientes: Fuentes de Carbono, Nitrógeno, Fósforo,Calcio, Magnesio, Potasio, Sodio y Hierro

Micronutrientes: Cobalto, Zinc, Molibdeno, Cobre, Manganeso, Níquel, Selenio y Tungsteno.

Factores de crecimiento: Vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas.

 Medios de cultivo

Inhibe el crecimiento de bacterias no deseables y favorece el crecimiento de

las deseables. La selectividad es debida a agentes o condiciones que son
Selectivo antagónicas o inhiben el crecimiento de microorganismos competitivos.
Ej: caldo Selenito Cistina para Salmonella.

Diferencial Para distinguir colonias del organismo deseado

sobre otras colonias. Ej: Agar Baird Parker tiene
telurito
S. aureus lo reduce a teluro (negro) y tiene yema de
huevo. S. aureus en Baird Parker

Usualmente liquido, se utiliza para

aumentar el numero de bacterias que
se encuentren en baja cantidad. Enriquecimiento
Ej: caldo lactosado para Salmonella.
 Agentes selectivos

 Antibióticos: polimixina B, ampicilina, novobiocina, etc.

 Sales : sales biliares, telurito de potasio, verde brillante, lauril sulfato de sodio.

 anaerobiosis: azida de sodio/ cianida de potasio/ glicina inhiben catalasa

positivos + agregado de aceite o agar.

 pH: medios acidificados para aislamiento de hongos y levaduras

 Actividad de agua: ClNa, glucosa, etanol, polietilenglicol, glicerol

 Temperatura de incubación y atmosfera gaseosa

 Agentes diferenciales
Indicadores de pH: determinación de la actividad metabólica
(fermentación de azúcares ) o (descarboxilación de aminoácidos
e hidrólisis posterior)- Rojo fenol/rojo de metilo/ púrpura de
bromocresol.

Indicadores de sulfuro de hidrogeno: se evidencian con el uso de

sales de hierro (citrato ferrico, citrato de amonio férrico, citrato
ferroso)

Reacción yema de huevo: enzimas lipolíticas liberadas al medio.

Reacción de hemólisis: agar sangre.

 Esterilización de medios de cultivos
( NO TODOS LOS MEDIOS DE CULTIVO SE AUTOCLAVAN)
121°C
15 minutos
1 atm
 Esterilización de medios por Filtración

Filtros de membrana
Esteres de celulosa o
polímeros de plástico

Poros de 0.22 a 0.45 μm

diámetro

Utilizados para medios

sensibles al calor:
Enzimas, antibióticos.
 Ejercicio 1: Preparación de 10 placas de Baird Parker
(Especificar qué material de vidrio utilizará y la capacidad del mismo, como lo prepararemos y con
qué elementos del laboratorio.)

Considerar:
 Instrucciones medio base
 No se preparan volúmenes grandes ya que se debe plaquear rápidamente y
no se puede volver a fundir una vez solidificado.
 Calcular 30 ml por placa de petri.

Instrucciones Agar Baird Parker Base :

Suspender 60 g del polvo en 940 ml de agua purificada. Dejar en reposo 5 a
10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto,
hasta disolución total. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°-50°C y agregar 50 ml de
emulsión de yema de huevo y 10 ml de la solución de telurito (Emulsión Yema
de Huevo con Telurito).Homogeneizar y distribuir en placas de Petri estériles.
Ejercicio 1: Preparación de 10 placas de Agar Baird
Parker
 Ejercicio 1: Preparación de placas de Agar Baird Parker

9,6 g
150

7,98 ml
1,6 ml
Ejercicio 2: Preparación de 20 tubos de Agar Nutritivo en pico de flauta.

Explique el procedimiento para preparar 20 tubos con 10 ml

de agar nutritivo en pico de flauta, teniendo en nuestro
laboratorio caldo nutritivo y agar agar como componentes.
Tener en cuenta el modo de preparación del Caldo Nutritivo y
que se agregan 15 g por litro de agar - agar para convertir el
caldo en agar .

Instrucciones caldo nutritico : Suspender 8 g del polvo en 1 litro de agua purificada.

Reposar 5 minutos y calentar con agitación frecuente, llevando a ebullición para
disolución total. Distribuir en tubos u otros recipientes apropiados y esterilizar en
autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.
Ejercicio 2: Preparación de 20 tubos de Agar Nutritivo en pico de flauta.
Ejercicio 2: Preparación de 20 tubos de Agar Nutritivo en pico de flauta.
 Ejercicio 3: Preparación de 20 placas de Agar Bismuto Sulfito

Agar Bismuto Sulfito:

Instrucciones: Suspender 52,3 gramos de medio en un litro de agua destilada.
Mezclar bien y disolver con calor y agitación frecuente. Hervir durante un
minuto hasta la disolución completa. EVITAR SOBRECALENTAR. NO
AUTOCLAVAR. Enfríar a 45ºC (muy importante), mezclar bien y dispensar en
placas.
Ejercicio 3: Preparación de 20 placas de Agar Bismuto Sulfito
Ejercicio 3: Preparación de 20 placas de Agar Bismuto Sulfito
 Ejercicio 4: Preparación de 25 tubos de Caldo MacConkey

Caldo Mac Conkey:

Instrucciones: Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar
5 minutos. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición 1 a 2 minutos
hasta disolver completamente. Distribuir en recipientes apropiados y
esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Ejercicio 4: Preparación de 25 tubos de Caldo MacConkey

Preparamos un poco más

Ejercicio 4: Preparación de 25 tubos de Caldo MacConkey
 b) Preparación de material de vidrio

El material debe estar todo esterilizado para poder trabajar en el laboratorio de

microbiología. Hay elementos que podemos esterilizar en estufa por calor seco.

160°C 3 horas
180°C 2 horas

Pipetas Placas
Papel de filtro
 c) Acondicionamiento del área de trabajo

•El laboratorio debe estar aislado del exterior y no debe haber corrientes de aire. La
mesada y las manos se desinfectan con el uso de alcohol 70:30 (es conveniente tener
siempre preparado en una piseta en el laboratorio).

•Se colocan dos mecheros distanciados a 30 cm aproximadamente para trabajar en

ese espacio y se aconseja, en el caso que se disponga, trabajar dentro del flujo
laminar.
 d) Trabajo en esterilidad: diluciones seriadas
Antes de sembrar de un tubo el mismo se debe homogeneizar en vortex por 5 seg

Diluyentes:
Agua de peptona 0,1 %
Buffer fosfato
Peptona buffereada
Peptona salina

Criterio a utilizar: 30 y 300 colonias para que el recuento sea estadísticamente significativo
d) Trabajo en esterilidad: Métodos de siembra para el recuento en placa
Profundidad 1 ml Superficie 0.1 ml
Condiciones de Incubación: TEMPERATURA

• Mesofilos ( 35-37°C)

• Termofilos (55°C)

• Psicrotrofos ( 7°C)
 CONDICIONES DE INCUBACION: PRESENCIA /AUSENCIA DE OXIGENO

Equipamiento para producir

ambiente enriquecido en CO2

Cámara anóxica

Jarra para cultivar bacterias

anaeróbicas

Jarra anóxica
 e) Decontaminación de material utilizado

•Para el descarte del material utilizado se procede a sumergir las placas de

Petri y pipetas de vidrio en una solución de lavandina al 10% durante 24
hs, se desecha el agar y luego se realiza un lavado con detergente y agua.
Se les saca el rótulo a las placas con una esponja o con alcohol.

•Los tubos de las diluciones se autoclavan a 1,3 atm durante 20 minutos,

se lavan con detergente y agua, y se retiran los rótulos con la ayuda de una
esponja o de alcohol.

•El material descartable se desecha en una bolsa roja para luego ser
retirado para su incineración. Caso contrario existen bolsas aptas para
autoclave, en las que se puede introducir el material descartable para
decontaminar y se le aplica el tratamiento térmico para posteriormente
desecharlo.
Actividad: Determinación de la concentración de un cultivo O/N de E. coli

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

1:10 1:100 1:1.000 1:10.000 1:100.000 1:1.000.000 1:10.000.000

Cultivo O/N

Tubos con 9 ml de diluyente

Siembra de
1 ml en profundidad y
luego agrego PCA
fundido

Siembra de 0,1 ml
en superficie en placas con
PCA ya plaqueado.
 Ejercicio 5: Determinación de la concentración del cultivo O/N

Se realiza un cultivo O/N de E.coli y se desea conocer la

concentración final luego de su incubación. Para ello se Dilución -5 Dilución -6 Dilución -7
realizan 7 diluciones decimales seriadas en tubos de 9 ml 4586 295 50
de diluyente y se siembran 1 ml en profundidad las últimas
tres diluciones (-5, -6 y -7). Se obtienen los resultados en
las placas que figuran en la tabla. Informe la concentración
final del cultivo.
1 ml de dilución -7 ___ 50 colonias
10 ml___ x= 500 colonias
1 ml de dilución -6 ___ 295 colonias
10 ml___ x= 2.950 colonias 1 ml de dilución -6___ 500 colonias
10 ml___ x= 5000 colonias
1 ml de dilución -5 ___ 2.950 colonias
10 ml___ x= 29.500 colonias 1 ml de dilución -5 ___ 5000 colonias
1 ml de dilución -4___ 29.500 colonias
10 ml___ x= 50.000 colonias Las diluciones -6 y -7
10 ml___ x= 295.000 colonias 1 ml de dilución -4___ 50.000 colonias entran en rango 30-300
10 ml___ x= 500.000 colonias
1 ml de dilución -3___ 295.000 colonias
10 ml___ x= 2.950.000 colonias 1 ml de dilución -3___ 500.000 colonias
10 ml___ x= 5.000.000 colonias
1 ml de dilución -2___ 2.950.000 colonias
10 ml___ x= 29.500.000 colonias 1 ml de dilución -2__ 5.000.000 colonias
1 ml de dilución -1___ 29.500.000 colonias
10 ml___ x= 50.000.000 colonias Hago promedio
10 ml___ x= 295.000.000 colonias 1 ml de dilución -1__ 50.000.000 colonias
10 ml___ x= 500.000.000 colonias
1 ml del cultivo O/N __ 295.000.000 colonias
1 ml del cultivo O/N __ 500.000.000 colonias

(2,95 x 108 + 5,0 x 108)/2 = 4,0 x108 UFC/ml de cultivo O/N

 Ejercicio 5: Determinación de la concentración del cultivo O/N

Se realiza un cultivo O/N de E.coli y se desea conocer la concentración final

luego de su incubación. Para ello se realizan 7 diluciones decimales seriadas
en tubos de 9 ml de diluyente y se siembran 1 ml en profundidad las últimas
tres diluciones (-5, -6 y -7). Se obtienen los resultados en las placas que
figuran en la tabla. Informe la concentración final del cultivo.

Dilución -5 Dilución -6 Dilución -7

4586 295 50

Concentración final: (295 x 106 + 50 x 107)/2 = 4,0 x108 UFC/ml de cultivo O/N
 Ejercicio 6: Determinación de la concentración del cultivo O/N

Se realiza un cultivo O/N de E.coli y se desea conocer la

concentración final luego de su incubación. Para ello se Dilución -4 Dilución -5 Dilución -6
realizan 7 diluciones decimales seriadas en tubos de 9 ml 3800 250 45
de diluyente y se siembran 0,1 ml en superficie de las
diluciones -4, -5 y -6 Se obtienen los resultados en las
placas que figuran en la tabla. Informe la concentración final
del cultivo.
0,1 ml de dilución -6 ___ 45 colonias
10 ml___ x= 4.500 colonias
0.1 ml de dilución -5 ___ 250 colonias
10 ml___ x= 25.000 colonias 1 ml de dilución -5___ 4.500 colonias
10 ml___ x= 45.000 colonias
1 ml de dilución -4___ 25.000 colonias
10 ml___ x= 250.000 colonias 1 ml de dilución -4 ___ 45.000 colonias
1 ml de dilución -3___ 250.000 colonias
10 ml___ x= 450.000 colonias Las diluciones -5 y -6
10 ml___ x= 2.500.000 colonias 1 ml de dilución -3___ 450.000 colonias entran en rango 30-300
10 ml___ x= 4.500.000 colonias
1 ml de dilución -2___ 2.500.000 colonias
10 ml___ x= 25.000.000 colonias 1 ml de dilución -2___ 4.500.000 colonias
10 ml___ x= 45.000.000 colonias
1 ml de dilución -1___ 25.000.000 colonias
10 ml___ x= 250.000.000 colonias 1 ml de dilución -1__ 45.000.000 colonias
10 ml___ x= 450.000.000 colonias Hago promedio
1 ml del cultivo O/N __ 250.000.000 colonias
1 ml del cultivo O/N __ 450.000.000 colonias

(2,5 x 108 + 4,5 x 108)/2 = 3.5 x108 UFC/ml de cultivo O/N

 Ejercicio 6: Determinación de la concentración del cultivo O/N

Se realiza un cultivo O/N de E.coli y se desea conocer la concentración final

luego de su incubación. Para ello se realizan 7 diluciones decimales seriadas
en tubos de 9 ml de diluyente y se siembran 0,1 ml en superficie las diluciones
-4, -5 y -6. Se obtienen los resultados en las placas que figuran en la tabla.
Informe la concentración final del cultivo.

Dilución -4 Dilución -5 Dilución -6

3800 250 45

Concentración final: (250 x 105 x 10+ 45 x 106 x 10 )/2 = 3,5 x108 UFC/ml de cultivo O/N