LABORATORIO Nº 4

CROMATOGRAFIA
4.1 OBJETIVOS
 Separar pigmentos de una muestra de espinaca y zanahoria triturada en un mortero
mediante el proceso de cromatografía.
 Determinar el factor de retención del azul de metilo, naranja de metilo y rojo de
metilo.
 Determinar el disolvente adecuado para desarrollar el cromatograma.
4.2 FUNDAMENTO TEORICO
4.2.1 CROMATOGRAFIA
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas
complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un conjunto
de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de
dichos componentes.
Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que
consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de
una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los
componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este
modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van
separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria,
separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la
concentración y del tipo de compuesto.
Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una
retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función
de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:
 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan
ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En
este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

4.2.2 CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

Los métodos cromatograficos se clasifican tomando en cuenta el estado de agregación, la
forma física del sistema y de acuerdo al proceso de separación, así tenemos:
Forma física de la fase móvil: liquida o gaseosa.
Forma física del sistema: plana o en columna.
Proceso de separación: adsorción, partición, intercambio iónico,
afinidad, exclusión molecular.
Fase Fase Técnica Proceso
estacionaria móvil cromatografica cromatografico
Capa fina Adsorción
Sólida Líquida Columna I. Iónico
Exc. Molecular
Gas Columna Adsorción
Papel
Líquida Líquida Capa Fina Partición
Columna
Gas Columna Partición
4.2.3 MECANISMOS CROMATOGRÁFICOS
La técnica cromatográfica tiene fenómenos diferentes, en los que se distinguen tres:
Cromatografía por adsorción, de partición o reparto, y por adsorción polar o intercambio
iónico.
En la cromatografía gaseosa, la fase móvil es un gas y usualmente, es en columna.
La cromatografía líquida puede realizarse en columna o ser plana. La primera puede tener
como fase estacionaria un sólido, un líquido impregnado en sólidos o resinas de intercambio
iónico. Si es plana, puede ser cromatografía de papel o cromatografía de capa fina.
El proceso cromatográfico de adsorción consiste en hacer pasar una solución de la sustancia
a través de un adsorvente o de adsorventes convenientes superpuestos. Los adsorventes son
sustancias pulverulentas, que pueden ser: alúmina, carbonato de calcio, cal carbón activado,
resinas sintéticas, gel de sílice, sacarosa, celulosa, etc.
Los constituyentes de las sustancias se retienen selectivamente sobre la superficie de los
adsorventes, al pasar por o sobre ellos. La relación de este proceso es con los tipos de
columna y de capa fina.
El proceso cromatográfico de partición consiste en separar los constituyentes de una
mezcla utilizando las diferencias en sus coeficientes de reparto o distribución de una sustancia
entre dos fases líquidas inmiscibles o parcialmente miscibles. Una sola fase es móvil, la otra
es generalmente agua inmovilizada por saturación en sólidos. Este proceso está relacionado
con el tipo de columna de papel.
El proceso cromatográfico de intercambio iónico, consiste en hacer pasar una solución por
una columna de cambiadores iónicos, donde la solución cambia sus aniones si la resina
(intercambiador) es cambiadora de iones, y la solución cambia sus cationes por los protones
de la resina si esta es catiónica.
Tanto en la cromatografía de adsorción, como en la de reparto es muy importante la relación
entre la velocidad del movimiento del sólido y la velocidad de movimiento del disolvente, es
decir, la siguiente expresión:
velocidad de movimiento del soluto
Rf 
velocidad de movimiento del disolvente
Para la cromatografía en capa fina y de papel el disolvente y el soluto empiezan a moverse
desde el mismo punto, dando lugar a la relación simplificada:
distancia recorrida por el soluto
Rf 
distancia recorrida por el disolvente
En la práctica, la distancia recorrida por el soluto en un tiempo determinado se mide desde el
punto de aplicación del soluto hasta el centro de su zona de distribución, en tanto que la
distancia recorrida por el disolvente se mide desde el mismo origen hasta el extremo de su
máximo recorrido.
Cromatografía en papel
La separación de las sustancias o componentes de una mezcla por migración diferencial sobre
la superficie del papel filtro, donde la selección de los disolventes es el factor más importante,
por lo que hay que considerar la naturaleza química de las sustancias químicas que se desean
separar más la viscosidad y polaridad del disolvente.
Etapas fundamentales del análisis cromatográfico
1. Adsorción de las sustancias a separar, normalmente disueltas en disolventes no polares
como el éter de petróleo.
2. Desarrollo, en que los materiales adsorbidos se extienden por la acción de un flujo
continuo de la disolución o de un disolvente puro.
3. Recuperación de los componentes separados , realizada normalmente por elusión del
material adsorbido mediante un disolvente más polar, o varios disolventes sucesivamente
empleados, que van separando a los materiales deseados.
4. Identificación y medida de las sustancias individuales por distintos medios, como
reacciones coloreadas, fluorescencia ultravioleta, espectrofotometría de absorción, etc.
La eficacia de la separación depende de factores como la naturaleza química de los
componentes a separar, el disolvente y del adsorbente.

4.2.4 TÉRMINOS EMPLEADOS EN CROMATOGRAFÍA

 Analito es la sustancia que se va a separar durante la cromatografía.

 Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas
de soporte o a las paredes internas de la columna.
 Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación
óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los
componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por

ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro
de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes
analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema óptimo, la señal es
proporcional a la concentración del analito específico separado.
 Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un
cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
 Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que se
van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase
estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.
 Efluente es la fase móvil que atraviesa la columna.
 Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre partículas de
soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.
 Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido
(cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido
supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La fase móvil consiste en la
muestra que está siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el
interior de la columna.
 Muestra es la materia que va a as er analizada en la cromatografía. Puede consistir en
un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso
del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de interés es llamada igualmente
muestra mientras el resto de sustancias cuya separación no resulta de interés es
llamada residuo.
 Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
 Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, y especialmente la fase
líquidamóvil en cromatografía de líquidos.
 Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de
la cromatografía. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografía en capa fina.

4.3 METODO EXPERIMENTAL

A continuación se da a conocer el procedimiento experimental que se debe realizar en la
cromatografía para la determinación del factor de retención y conocer los pigmentos.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Sembrar las
Colocar tiras de muestras de Azul
Preparar 10 tubos papel filtro en de metilo, Naranja
INICIO
de ensayo cada tubo de de metilo y Rojo
ensayo de metilo a una
10mm de la base
En 9 tiras de papel filtro
En 9 tubos de ensayo colocar las muestras de:
colocar una muestra de naranja de metilo, azul de
(etanol, etanol mas agua, y metilo y rojo de metilo. Y en
hexano) y en tubo de ensayo una tira de papel filtro la
el mejor disolvente. mezcla de las tres
sustancias para introducirla
en el mejor disolvente

Secar el papel Dejar recorrer una

filtro y calcular distancia que el
FINAL
Factor de disolvente
Retención realizara

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Sembrar las muestras de

Colocar la placa
las 3 sustancias ( naranja Dejar recorrer la
en el vaso de
INICIO de metilo, azul de metilo y distancia del
precipitado con el
rojo de metilo) y de la disolvente
mejor disolvente
mezcla en la placa

Secar y calcular el
FINAL Factor de
Retención

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Separar la fase orgánica

Triturar clorofila, Colocar en la columna:
y la fase acuosa
xantofila y caroteno lana, azucar, carbonato Colocar el extracto
agregándole 40ml de
INICIO juntamente con 20ml de calcio y oxido de en la parte
agua y cloruro de sodio
de etanol y 40ml de aluminio a una altura de superior
en un embudo de
hexano 4cm cada uno
decantación

Observar las
coloraciones y explicar
FINAL Eluir
afinidades con la fase
estacionaria

4.4 DATOS, CALCULOS Y RESULATADOS

4.4.1 DATOS
4.4.1.1 DATOS DE LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Para el etanol:
TABLA Nº 1
Distancia recorrida Distancia recorrida
Sustancia por el disolvente  cm por la sustancia  cm 
Azul de metilo 9.6 6.6
Naranja de metilo 8.8 8.8
Rojo de metilo 10.7 3
Para el etanol mas agua:
TABLA Nº 2
Distancia recorrida Distancia recorrida
Sustancia por el disolvente  cm por la sustancia  cm 
Azul de metilo 9.2 6.2
Naranja de metilo 7.3 6.7
Rojo de metilo 6.8 5.3
Para el hexano:
TABLA Nº 3
Distancia recorrida Distancia recorrida
Sustancia por el disolvente  cm por la sustancia  cm 
Azul de metilo 12.1 0
Naranja de metilo 12.8 0
Rojo de metilo 11.1 0.6
Para el mejor disolvente (ETANOL):
TABLA Nº 4
Distancia recorrida Distancia recorrida
Sustancia por el disolvente  cm por la sustancia  cm
A. M. 1.6
Mezcla 7.5 N. M. 5.4
R. M. 3.4
Azul de metilo 7.5 3.4
Naranja de metilo 7.5 5.3
Rojo de metilo 7.5 7.5
4.4.1.2 DATOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
Para el mejor disolvente (ETANOL):
TABLA Nº 5
Distancia recorrida Distancia recorrida
Sustancia por el disolvente  cm por la sustancia  cm
A. M. 0.2
Mezcla 4.5 N. M. 3.6
R. M. 3.6
Azul de metilo 4.5 0.9
Naranja de metilo 4.5 3.8
Rojo de metilo 4.5 4.5
4.4.2 CALCULOS Y RESULATADOS OBTENIDOS
4.4.2.1 PARA LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Etanol:
6.6cm
Rf 1   R f 1  0.69
9.6cm
8.8cm
Rf 2   R f 2  1.00
8.8cm
3.0cm
Rf 3   R f 3  0.28
10.7cm
Etanol mas agua:
6.2cm
Rf 1   R f 1  0.67
9.2cm
6.7cm
Rf 2   R f 2  0.91
7.3cm
5.3cm
Rf 3   R f 3  0.78
6.8cm
Hexano:
0cm
Rf 1   Rf 1  0
12.1cm
0cm
Rf 2   Rf 2  0
12.8cm
0.6cm
Rf 3   R f 3  0.05
11.1cm
Para la mezcla con el etanol:
3.4cm 1.6cm
Rf 1   R f 1  0.40 R f 1´   R f 1´  0.21
7.5cm 7.5cm
5.3cm 5.4cm
Rf 2   R f 2  0.71 R f 2´   R f 2´  0.72
7.5cm 7.5cm
7.5cm 3.4cm
Rf 3   R f 3  1.00 R f 3´   R f 3´  0.45
7.5cm 7.5cm
4.4.2.2 PARA LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
0.9cm 0.2cm
Rf 1   R f 1  0.20 R f 1´   R f 1´  0.04
4.5cm 4.5cm
3.8cm 3.6cm
Rf 2   R f 2  0.84 R f 2´   R f 2´  0.80
4.5cm 4.5cm
4.5cm 3.6cm
Rf 3   R f 3  1.00 R f 3´   R f 3´  0.80
4.5cm 4.5cm

4.5 OBSERVACIONES
 Se debe hacer notar que la muestra utilizada correspondiente a zumo de
zanahoria y extracto de espinacas, mostraban una coloración débil en el cromatograma.
Aún concentrando la coloración en el punto de la siembra, la coloración se difunde a
través del papel y al medir la distancia recorrida por la muestra se ha tomado el punto más
distante del punto de siembra donde aún se aprecia una ligera coloración de la muestra. Y
el tiempo fue muy corto para el desarrollo del cromatograma y no se pudo apreciar la
totalidad del cromatograma.
 Se debe hacer notar que los valores obtenidos para el factor de retención
sufrieron una pequeña variación tanto en cromatografía en papel y en capa fina.
 En el desarrollo de la cromatografía en capa fina se cometió errores de
medición porque no se contaba con un instrumento adecuado de medición y se empleo
solo una regla común y corriente.
4.6 CONCLUSIONES
 Se logro separar los pigmentos de la muestra de zanahoria y espinaca dándonos las
siguientes coloraciones: Clorofila (Verde), Xantofila (Amarillo), Caroteno (Naranja).
 Se determino los factores de retención para: el azul de metilo (0.31), el naranja de
metilo (0.81) y el rojo de metilo (0.71).
 Determinamos que el mejor disolvente llego a ser el etanol porque logro un mayor
desplazamiento de las sustancias como el azul de metilo, naranja de metilo y rojo de
metilo.
4.7 BIBLIOGRAFIA
 Química Orgánica I, Prácticas de Laboratorio - Invernizzi, Eduardo - Álvarez, Alfredo
 Curso Práctico de Química Orgánica - Brewster, Ray Q. – Vanderwerf, Calvin A. –
McEwen, William E.
 Química Orgánica - Morrison & Boyd
4.8 CUESTIONARIO
1. ¿Cual es el origen de los colores de la tinta en los marcadores? ¿Esta hecha de varios
colorantes o solamente de uno?¿Como se obtiene el color que observamos en la tinta
utilizada a partir de los distintos colorantes que la componen?
R. El origen de la tinta de los marcadores son la combinación de los colores rojo, amarillo y
azul. Por lo tanto esta hecha de varios colorantes, así mismo la tinta que se utilizan se
obtienen generalmente por la mezcla de los colores mencionados anteriormente.
2. ¿Utiliza el fabricante los mismos colorantes para obtener diferentes colores de tintas?
Sí es así, estos colorantes (manchas) deberán mostrar idéntica tonalidad y moverse la
misma distancia relativa con respecto al agua o al solvente utilizado.
R. El fabricante no usa los mismos colorantes sino mas bien hace una combinación de los
distintos tipos de colorantes que existen para obtener diferentes colores de tintases así que
estos colorantes deberán mostrar deferente tonalidad y moverse distintas distancias relativas
con respecto al solvente utilizado.
3. ¿Qué ocurre si el agua es alterada adicionándole algo como sal de mesa (cloruro de
sodio)? ¿Causa esto algún cambio en los movimientos de los colorantes (manchas) o en la
eficacia del método de separación?
R. Disminuye la polaridad del agua y esto causa cambios en el desplazamiento de las
manchas y disminuye el factor de retención y altera la eficacia de la separación.
4. Indicar la respuesta correcta en cromatografía de capa fina
a. El valor de Rf esta comprendido entre 0 y 1.
b. El Rf es independiente de la fase móvil (eluyente) empleada.
c. El Rf es constante para cada grupo funcional.
d. El valor de Rf da información cuantitativa del compuesto.
5. La separación por extracción líquido-líquido consiste en:
a. Separar solutos que no producen una respuesta similar a la del compuesto a analizar.
b. Separar un soluto mediante su distribución entre dos fases miscibles entre si.
c. Separar los componentes de una mezcla por medio de varios disolventes de distinta
polaridad.
d. Separar solutos de una mezcla mediante volúmenes iguales de un disolvente.
6. Indíquese la respuesta NO correcta:
a. La separación por volatilización se basa en la modificación del estado físico de la
muestra.
b. La destilación fraccionada permite separar mezclas cuyo coeficiente de partición
entre la fase líquida y vapor no difiere considerablemente.
c. La separación por precipitación es una técnica útil para la separación de polímeros.
d. La separación por precipitación se basa en las diferentes solubilidades entre las sales
que pueden formar los analitos y los compuestos interferentes.
7. Indíquese la respuesta correcta:
a. En la elusión en cromatografía, la muestra se añade modo continuo a la columna
hasta la separación completa de sus componentes.
b. La cromatografía de permeabilidad sobre gel se basa en un fenómeno de filtración
molecular en el que influyen el tamaño y forma de las moléculas.
c. En la cromatografía de intercambio iónico, se intercambian cationes de la muestra
con aniones de la resina iónica que constituye la fase estaci0onaria.
d. La cromatografía de permeabilidad sobre gel es un tipo de cromatografía sólido-
líquido.
8. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos, clorofila
a, clorofila b y xantofila. Indicar que pigmento corresponde a cada banda.
R. Para la clorofila el pigmento es de color verde y para la xantofila es de color amarillo.
9. ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?
R. Porque la clorofila se disuelve fácilmente en el éter etílico y se tiene un factor de retención
mayor a la xantofila y al caroteno.
10. ¿Qué pigmentos son los mas abundantes?
R. El pigmento mas abundante es el verde de la clorofila.
11. Por encima de las clorofilas aparece mas de una banda, ¿Qué significado tiene?
R. Las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la
mezcla en bandas o zonas, que se localizan a lo largo de la columna.
 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
Facultad de Ingeniería
Curso Básico
Lab. – QMC 200 C
LABORATORIO Nº 4
“CROMATOGRAFÍA”

NOMBRE DEL ESTUDIANTE:

UNIV. RAMOS MAQUERA BERNARDINO

NOMBRE DEL DOCENTE:

ING. PARRA ZEBALLOS ROBERTO

NOMBRE DEL AYUDANTE:

UNIV.

FECHA DE REALIZACION:
LUNES 12 DE ABRIL DE 2010

FECHA DE ENTREGA:
LUNES 19 DE ABRIL DE 2010

CARRERA:
ING. PETROLERA

GRUPO:
“C”

PERIODO ACADEMICO:

I/2010

LA PAZ - BOLIVIA