APLICACIÓN DE HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS PARA LA OPTIMIZACIÓN DE

QUITINASAS CON USOS INDUSTRIALES EN ÁREAS COMO LA AGRICULTURA Y LA

BIOTECNOLOGÍA.
Juan Sebastián Orozco G1,2,3, Alejandro Santiago Triana B1,2.4.
1
facultad de Ciencias Básicas, Química Industrial, Microbiología general.2Universidad Francisco de
Paula Santander.3Juansebastianog@ufps.edu.co.4Alejandrosantiagotb@ufps.edu.co.

RESUMEN
En la actualidad los microorganismos son usados ampliamente en la industria, ya sea si son deseados
como biomasa (el propio organismo vivo), o por una enzima que producen que posee alguna
aplicación en la industria. se están llevan a cabo investigaciones con el uso de herramientas
bioinformáticas, como base investigativa para la aplicación de mutagénesis dirigida de las enzimas
con el fin de mejorar su eficiencia catalítica.
en el presente trabajo, con el uso de herramientas bioinformáticos se evaluó la secuencia de una
quitinasa obtenida de una base metagenómica de un lecho marino, esta se modeló su
estructura y se verificó para posteriormente ser usada en ensayos de acoplamiento molecular
con ligandos homólogos a 1,4-B-N-acetyl glucosamine con el objetivo de observar la
interacción entre estos, para posteriormente realizar modificaciones a la secuencia de
aminoácidos de la proteína rehacer acoplamientos y comparar resultados. Se demostró que
modificando los aminoácidos más idóneos suministrados por la herramienta hot spot wizard
se podían obtener mejores interacciones entre sustrato-enzima evidenciados en los valores de
∆G y full fitness, este ligero aumento en los valores se debe a la presencia de interacciones
hidrofóbicas y de otros tipos entre los aminoácidos modificados y los sustratos.

Palabras clave: puntos calientes, quitinasa, quitina, enzimas industriales, mutagénesis,

docking molecular.
ABSTRACT
At present, microorganisms are widely used in industry, either if they are desired as biomass
(the living organism itself), or by an enzyme they produce that has some application in
industry. Research is being carried out using bioinformatic tools, as a research basis for the
application of targeted mutagenesis of enzymes to improve their catalytic efficiency.
In the present work, with the use of bioinformatic tools, the sequence of a chitinase obtained
from a metagenomic base of a seabed was evaluated, its structure was modeled and verified
to be used later in molecular coupling tests with ligands homologous to 1,4-B-N-acetyl
glucosamine with the objective of observing the interaction between these, to later make
modifications to the sequence of amino acids of the protein re-coupling and compare results.
It was demonstrated that by modifying the most suitable amino acids supplied by the hot spot
wizard tool, better interactions between substrate-enzyme could be obtained, as evidenced
by the values of ∆G and full fitness. This slight increase in the values is due to the presence
of hydrophobic and other interactions between the modified amino acids and the substrates.

Keywords: hot spots, chitinase, chitin, industrial enzymes, mutagenesis, molecular docking
INTRODUCCION. que forma parte del grupo de alta
producción, pero con baja eficiencia
Las enzimas son consideradas catalítica, esta enzima puede degradar la
catalizadores de origen natural o quitina y el quitosano realizando una
biocatalizadores, la mayoría de las hidrólisis en los enlaces β-1-4 N-acetil
enzimas de uso industrial son producidas glucosamina, presente en la quitina y en la
por medio de fermentación de materiales quitodextrina. La quitina es el segundo
con base biológica. En la actualidad se compuesto orgánico más abundante
conocen miles de enzimas con diferentes después de la celulosa, cumple funciones
especificidades de sustrato, pocas de estas de protección en animales inferiores y
se han podido aislar de forma pura y hongos.5
cristalizada, de las otras, existe un escaso La quitina y las enzimas que la degradan
conocimiento acerca de la función que tienen una amplia gama de aplicaciones,
cumplen y su estructura. 1 desde la producción y diseño de drogas
La aparición de nuevas técnicas de hasta la fabricación de productos
ingeniería de proteínas con aplicación en químicos usados como plaguicidas en el
importantes enzimas industriales, como sector agrícola, todo esto es debido a que
las Proteasas, Lipasas, Amilasas y las enzimas degradadoras son altamente
Quitinasas, usadas con una alta eficiencia específicas dada la composición de la
en detergentes, procesamiento de almidón estructura de la quitina.6
y controles patógenos, entre otros. Esto En el presente artículo se busca aplicar
permite elegir las enzimas correctas, ingeniería enzimática a las quitinasas, por
prever qué productos pueden ser obtenidos medio de herramientas bioinformáticas,
y también minimizar las reacciones como la base de datos MetaBioME de la
secundarias que generan productos no cual se extrae la secuencia de aminoácidos
deseados en el proceso.2 de la enzima, hasta modeladores de
Las enzimas de origen microbianas son, proteínas como Swiss Model que permiten
por lo general, más útiles que las obtenidas obtener una estructura 3D usando la
de plantas o animales debido a la gran cadena de aminoácidos y programas como
variedad de procesos catalíticos a su alta Hot Spot Wizard que nos proporciona
eficiencia, a su fácil manipulación y información para realizar mutaciones en la
modificación genética, además del fácil cadena.
cultivo de microorganismos de forma En 1997 Francés H. y Jeffrey C. Moore
económica ya que estos son pensados para dieron un enfoque particularmente
cumplir un proceso en la industria.3 atractivo para la ingeniería de enzimas de
Los procesos industriales que utilizan interés industrial, creando una p-
biocatalizadores o enzimas se pueden nitrobencil esterasa eficiente aplicando
separar en dos grupos, en el primero se durante seis generaciones mutagénesis
ubican aquellos que tienen baja puntual aleatoria y recombinación,
producción de biomasa pero una alta detectando los mejores variantes,
eficiencia enzimática, el segundo grupo demostrando así que las sustituciones de
son aquellos que requieren un alto aminoácidos para mejorar la actividad son
volumen de biomasa para producir pequeñas, pero la acumulación de
pequeñas cantidades del producto debido a múltiples mutaciones permite una mejora
su baja actividad biológica.4 significativa del biocatalizador para
La quitinasa es una enzima cuyo origen reacciones con el sustratos y en
puede ser microbiano, animal o vegetal
condiciones que no están optimizadas en la modelado de las estructuras 3D de las
naturaleza.7 proteínas y posteriormente su verificación
Se espera que las investigaciones con los programas Errat y Rampage
realizadas en el presente artículo se usen ramachandran para comprobar que tan
como trabajo preliminar para el desarrollo buenos eran cada uno de los modelos,
práctico de la mutagénesis en las Errat verifica la estructura proteica
quitinasas con el fin de minimizar los modelada por cristalografía, los valores de
tiempos y costos de investigación error se presentan en función de una
ahorrando generaciones enteras de ventana de 9 residuos, se espera que una
mutaciones y recombinaciones aleatorias., buena estructura proteica tenga un factor
además de disminuir el volumen de de calidad con porcentajes mayores al
producción de la enzima manteniendo la 95%9
actividad biológica o mejorándola.
Rampage ramachadran proporciona
METODOLOGÍA. porcentajes de comprobación de la
estructura de la enzimas en las regiones
Selección de la enzima industrial permitidas, favorecidas y atípicas, los
Se seleccionó una quitinasa debido a que resultados ideales son porcentajes altos
posee mecanismos para degradar la quitina que oscilan del 93 al 99%en las regiones
y el gran valor industrial que posee para la permitidas y favorecidas, en la atípica el
fabricación de plaguicidas diseño de valor ideal es cero. (0).10
drogas para control de parásitos entre Comprobación del sitio activo.
otros, el proceso de selección se realizó
utilizando la base de datos metagenómica La determinación del sitio activo de la
MetaBioME, los criterios de selección de enzima, se realizó con la plataforma
la secuencia estuvieron influenciados por CASTp 3.011 la cual proporciona los
la múltiple aplicación de la enzima en las clúster que forman parte del sitio activo, al
diferentes áreas desde la agricultura hasta igual que la plataforma I-TASSER,12 estos
la biotecnología, escogiendo el lecho resultados se analizaron comprobando que
marino como la fuente metagenómica, una había similitud entre ellos.
vez depurados los resultados se escogió la
secuencia con mayor homología y Posterior a esto y como una medida
cobertura.8 preventiva se utilizó The Consurf Server
la cual suministraba los puntajes de
Modelado de la enzima, verificación de conservación de cada una de las regiones
su estructura y selección del modelo que posee el modelo estructural de la
usado como base para docking enzima.13;14
Por medio de las herramientas Ensayo de docking molecular
SwissModel e I-TASSER se realizó el
En este caso SwissModel nos proporcionó evaluar la interacción entre el sustrato y el
ligandos que se unen a la proteína y estos sitio activo, usando la plataforma virtual
son lo que se utilizaron para todos los de Swiss dock estos valores de afinidad
ensayos de docking Con Los sustratos 2- sustrato-enzima se utilizan como
deoxy-2-(ethanethioylamino)-beta –D- referencia para la evaluación de los
glucopyranose (SN5)15 y N-Acetyl- resultados posteriores obtenidos de
glucosamine thiazoline (NGT)15;16 y el modificar genéticamente la proteína.
modelo inicial de la proteína, se procede a
Análisis de la secuencia de aminoácidos industriales, obteniendo como resultado
para posibles modificaciones genética posibles aplicaciones de la enzima en
con objetivo de mejorar la estructura de Industrias como la agricultura,
la enzima y su eficiencia. biotecnología, energía y medio ambiente,
en base a todo lo mencionado la secuencia
HotSpot Wizard 3 es un servidor web para homologa escogida fue la quitinasa con
ayudar en el diseño de mutaciones. La Swiss-Prot ID: P07254 que presentaba
identificación de puntos calientes de una cobertura de 99.82% y de identidad
mutagénesis se basa en la integración de del 77%8 esta secuencia fue recuperada de
información estructural, funcional y la Colección de meta genomas obtenidos
evolutiva obtenida de varias bases de datos durante la Expedición Mundial de
bioinformáticas y herramientas Muestras Oceánicas realizada en 2004.18
computacionales, con la ayuda de este, y el
modelo de la proteína seleccionamos Para el modelado de la estructura se usaron
algunos aminoácidos que podrían ser dos plataformas virtuales SwissModel y I-
modificados,17 y modelamos sus teasser, I-Teasser Primero identifica las
estructuras haciendo su debidos análisis y plantillas estructurales del PDB mediante
verificación, teniendo como referencia el el enfoque de subprocesos múltiples
modelo escogido de la enzima inicial. LOMETS, con modelos atómicos de
longitud completa construidos mediante
RESULTADOS Y DISCUSIONES. simulaciones iterativas de ensamblaje de
Análisis y selección del modelo fragmentos basados en plantillas19; De otra
estructural de la enzima. manera SwissModel maneja un sistema de
modelado mediante un canal de homología
Para la selección de la secuencia de nuestra del servidor SwissModel basado en
enzima por medio de MetaBioME, se ProMod3, el cual es un motor interno de
tuvieron en cuenta varios factores, el modelado comparativo en función de
primero fue la fuente metagenómica, la openStructure, ProMod3 extrae la
cual fue el lecho marino debido a la gran información inicial de la estructura de la
cantidad de especies de crustáceos, plantilla. Las inserciones y eliminaciones,
organismos que presentan exoesqueletos y definidas por la secuencia de alineación se
la gran población microbiana se esperaban solucionan buscando primero una plantilla
una gran cantidad de variantes homologas viable en la Base de datos estructural.20
a nuestra enzima de interés, los resultados
no fueron los esperados, la respuesta a este Teniendo En cuenta el funcionamiento de
suceso radica en las pocas investigaciones los modeladores se modelo la Secuencia,
de recopilación de datos de secuencias con cada una de las plataformas, los
metagenómicas microbianas que se han modelos obtenidos fueron sometidos a
realizado teniendo como población de unas pruebas de verificación con
estudio el lecho marino. Ramachandran y Errat, los valores
obtenidos se presentan en la tabla 1.
El segundo factor fueron las aplicaciones
posibles de la enzima en diferentes áreas
 Región favorecida, R.P: Región permitida, R.A: Región
atípica
I-Teasser
Errat 88.818 Con respecto a los resultados evidenciados
Ramachandran Rampage en la Tabla 1, el mejor modelo es el
R.F: 78.5 presentado por SwissModel ya que el
R.P: 16 factor de calidad es superior en 6.83% al
R.A: 5.0 de I-Teasser y la región favorecida
SwissModel muestra mejores resultados al igual que la
Errat 95.01 atípica, donde el resultado esperado debe
Ramachandran Rampage R.F: 98.0 ser cercano a 0.
R.P: 2.0
R.A: 0.2
Tabla 1 Valores de verificación estructura 3D de los
modelos de I-Teasser y SwissModel. , Nota: R.F:

Ilustración 1. Estructura 3D del modelo obtenido de SwissModel utilizando el programa UCSF Quimera para la
visualización interactiva de estructuras proteicas.20

Selección de los sustratos para el que se unen al sitio activo de la proteína,

acoplamiento molecular referencia y los cuales son 2-deoxy-2-
Determinación de sitio activo (ethanethioylamino)-beta Dglucopyranose
(SN5) y N-Acetyl-glucosamine thiazoline
Una vez definido el modelo de proteína (NGT) ambos sustratos tienen un
que se usará en los ensayos de estructura química similar al 1,4 β-N-
acoplamiento molecular procedemos a acetyl glucosamine este tipo de enlace es
seleccionar los ligandos que van a ser hidrolizados por las quitinasas y forman
emparejados, en este caso SwissDock parte de la estructura de la quitina, por los
proporciona junto al modelo dos ligandos tanto nuestros sustratos pueden servir
como referencia para los dockings de la conservados de la proteína siendo este el
proteína base y las modificadas. Para la correspondiente al sitio activo de la
determinación del sitio activo de la enzima molécula, analizando la ilustración 2
se hizo uso de la plataforma CASTp 3.0 el donde se muestran los modelados de
cual indica con confianza el sitio catalítico CASTp 3.0 y TheCosnsurf server, se
de la proteína, para la verificación del sitio puede denotar una correlación entre los
activo se hizo uso del servidor sitios más conservados de la enzima y el
TheCosnsurf server el cual indica con una Pocket del sitio activo.
tonalidad morada los sitios más

Ilustración 2. a) Determinación del sitio activo mediante CASTp 3.0; b) modelado de la quitinasa por medio del servidor
TheConSurf Server mostrando los lugares mas conservados de la estructura.

Una vez ubicado el sitio activo se procede En primera instancia se realizó el docking
a evaluar la interacción molecular entre los con la enzima sin modificaciones tanto con
sustratos y la estructura proteica mediante SN5 como con NGT, al finalizar el
la ayuda de la plataforma Swiss dock un docking se pueden observar resultados de
programa diseñado para proporcionar una FullFitness y ∆G, denotados en la Tabla 2.
solución flexible al acoplamiento
SwissDock se basa en el software de
acoplamiento EADock DSS, cuyo FullFitness ∆G
algoritmo consta de generar muchos
modos de acoplamiento en una caja
(acoplamiento local) o en las proximidades SN5 -2071,91 -6,84
de todas las cavidades de destino
(acoplamiento ciego), Simultáneamente, NGT -2145,68 -6,3
sus energías CHARMM se estiman en una
cuadrícula. Y los modos de unión con las Tabla 2. Resultados de docking molecular utilizando
los sustratos SN5, NGT Con la Enzima primigenia.
energías más favorables se evalúan con
FACTS, y se agrupan pudiendo visualizar
los clúster más favorables.21
Modificación Del modelo base con los resultados obtenidos de la enzima
aplicando mutagénesis con la ayuda del primigenia que están consignados en la
servidor web HotSpot Wizard 3.0 y tabla 2.
análisis del acoplamiento molecular de
los sustratos SN5 y NGT con las enzimas Modificación 1 Modificación 2
modificadas genéticamente. FullFitnes FullFitnes
s ΔG s ΔG
HotSpot Wizard facilita la obtención de - -
los puntos calientes identificando por
6,8 7,0
medio de una estrategia de ingeniera de
proteínas los puntos calientes funcionales SN5 -2147,38 5 -2090,31 8
representados por residuos altamente - -
mutables que se encuentran ubicados en la 6,8 6,4
zona catalítica, además de esto, se NGT -2146,39 5 -2091,76 1
enumeraron los residuos ordenados por
Tabla 3.Resultados obtenidos de los ensayos de
idoneidad de mutagénesis, lo que permitió acoplamiento molecular de los sustratos SN5 y NGT
reducir la lista de puntos calientes solo a con las enzimas modificadas geneticamente
los que podían obtener resultados similares
o mejores al original. al comparar los resultados con los
obtenidos del dockings con la proteína
En base a estos resultados se realizaron 2
original se puede observar que no hay
modificaciones, cambiando 3 y 4
cambios sustanciales ni en ∆G ni en el full
aminoácidos en cada una respectivamente,
fitness, aunque hay un leve aumento, este no
los cuales estaban ubicados en la zona
provoca cambios perceptibles en la interacción
catalítica y/o en los túneles de acceso,
entre la proteína y el ligando.
estos aminoácidos fueron reemplazados
por otros que presentaran una idoneidad la interacción entre el ligando y la proteína es
para la mutagénesis. En la tabla 3 se muy variada, aunque generalmente se da por
muestra la modificación y los cambios enlaces covalentes como lo son los puentes de
realizados.17 hidrógeno, también puede suceder por enlaces
Modificación 1 Modificación 2 iónicos, fuerzas de dispersión, fuerzas de
# AA AAm # AA AAm Vander Waals etc.
449 Arg Lys 372 Lys Tyr Se esperaba que estos aumentos de ∆G y Full
371 Asp Phe 396 Asn Asp Fitness estuvieron fundamentados en la
formación de nuevos enlaces de puentes de
400 Thr Asp 421 Try Leu
hidrógeno formados entre el sustrato y la
371 Asp Phe proteína, por el contrario el número de estos
enlaces se vio reducido, como el aumento no
Luego de realizadas las modificaciones y fue sustancial se puede deducir que otro tipo
obtenido el modelo de las proteínas de interacciones se están presentado,
modificadas, se procedió a hacer los analizando los aminoácidos que fueron
dockings con los ligandos SN5 y NGT a sustituidos en la modificación 1, se puede
observar que el cambio Thr por Asp explicaría
cada una de las modificaciones, la reducción de puentes de hidrógenos ya que
obteniendo los siguientes resultados de el Thr posee algunos grupos R que contienen
FullFitness y ∆G, los cuales se compararon grupos funcionales hidroxilos que pueden
establecer enlaces de hidrógeno. El cambio de investigaciones y recopilación de datos de
Arg por Lys no presenta cambios sustanciales secuencias metagenómicas microbianas y
en la estructura ya que ambos aportan cargas de fauna que se han realizado teniendo
positivas debido a sus grupos R cargados
como población de estudio el lecho
positivamente, contrario a esto, el reemplazo
del aminoácido Asp con grupos R polares marino, aun así se demostró que las
cargados negativamente por una aminoácido enzimas obtenidas de esta fuente pueden
como la Phe que presenta grupos no polares tener aplicaciones importantes dentro del
hidrofóbicos, pudo provocar interacciones área industrial y a su vez pueden ser blanco
hidrofóbicas entre los sustratos y la enzima, de investigación que estén enfocadas en el
estas interacciones pueden ser las responsables
uso de ingeniera de proteínas, obteniendo
del ligero aumento de los valores del ∆G y el
FullFitness. resultados dentro de la medida óptimos.

Con respecto al análisis de la modificación 2 REFERENCIAS.

se denotan dos cambios que pueden ser
responsables tanto de la pérdida de los puentes
de hidrógeno (Sustrato-enzima) como del 1. Hasan F, Shah AA, Hameed A.
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