Artículo: Ingeniería de Proteínas para El Mejoramiento de Enzimas

1 de diciembre de 2014 | Vol. 15 | Núm.
12 | ISSN 1607 - 6079
ARTÍCULO
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS PARA EL

MEJORAMIENTO DE ENZIMAS
Claudia Martínez Anaya (Instituto de Biología, UNAM) y

José Fernando García Guevara
(Instituto de Biotecnología, UNAM)
Dirección General de Cómputo y de Tecnologías de Información y Comunicación - UNAM

Departamento de Acervos Digitales
“Ingeniería de proteínas para el mejoramiento de enzimas”,
Claudia Martínez Anaya y José Fernando García Guevara
1 de diciembre de 2014 | Vol. 15 | Núm. 12 | ISSN 1607 - 6079
http://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art93
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS PARA EL MEJORAMIENTO DE

ENZIMAS
Resumen
Las condiciones en las que suceden las reacciones catalizadas por enzimas que son usa-
das en la industria son muy diferentes a las condiciones de su entorno natural, afectando
en ocasiones su función. Para contender con esta limitación existen métodos de inge-
niería de proteínas que tienen como objetivo el mejoramiento de las propiedades de
las enzimas. Estos métodos utilizan una combinación de técnicas computacionales y de
evolución dirigida. En este artículo se explica en qué consisten estos métodos, y se ejem-
plifican tres casos de éxito de enzimas mejoradas.
Palabras clave: Estructura proteica, enzimas, in-

geniería de proteínas, diseño racional, evolución di-
rigida.
Las enzimas o biocatalizadores

PROTEIN ENGINEERING FOR EN-
son energéticamente eficientes
ZYME IMPROVEMENT
y prácticamente todas llevan a
cabo su función bajo condiciones Abstract
moderadas: temperatura
The conditions under which enzyme-catalyzed reac-
ambiente, presión atmosférica y tions occur during industrial processes are very dif-
en ambientes acuosos. ferent to those found in their natural environment,
sometimes affecting their activities. To contend with
this limitation different methods of protein engi-
neering are directed at improving the properties of
enzymes. These methods combine the techniques
of computational analysis and directed evolution. This article explains the basis of these
methods, and three case studies of improved enzymes are presented.
Keywords: Protein structure, enzymes, protein engineering, rational design, directed evo-
lution.
Departamento de Acervos Digitales. Dirección General de Cómputo y de Tecnologías de Información y Comunicación – UNAM 2
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS PARA EL MEJORAMIENTO DE

ENZIMAS
Introducción
L
a definición del diccionario de biocatalizador es: “aquella sustancia, en especial una
enzima, que inicia o modifica la velocidad de una reacción química sin ser ella misma
afectada por esta reacción”. Efectivamente, las enzimas son macromoléculas (nor-
malmente proteicas) que tienen la capacidad de aumentar la velocidad de las reacciones
en millones de veces comparadas con el tiempo que les tomaría ocurrir espontánea-
mente. Estas enzimas o biocatalizadores son energéticamente eficientes y prácticamen-
te todas llevan a cabo su función bajo condiciones moderadas: temperatura ambiente,
presión atmosférica y en ambientes acuosos. Además, generan muy pocos productos de
desecho. Sin embargo, para poder llevar a cabo procesos aplicados de manera rentable,
las capacidades de las enzimas pueden mejorarse mediante métodos de ingeniería de
proteínas (PEÑA-MONTES, 2008; SEGOVIA, 2010). Estos métodos tienen la finalidad de
generar variantes enzimáticas que sean aún más activas o duraderas, o que puedan ac-
tuar sobre sustratos diferentes al original o funcionar en condiciones diferentes a las que
trabajan de manera fisiológica dentro de su organismo de origen, tales como: temperatu-
ras elevadas, presencia de compuestos inhibitorios o solventes diferentes al agua. La cre-
ciente presión para llevar a cabo procesos ambientalmente amigables es un motor para
el uso de enzimas, por lo que su mejoramiento en el laboratorio es deseable.
Al emplear técnicas que intentan imitar la evolución natural en un proceso de
generación de variabilidad-selección, la ingeniería de proteínas utiliza diferentes estrate-
gias dependiendo del grado de conocimiento que se tenga sobre ellas. De una enzima es
posible conocer la secuencia del gen que la codifica, que es indicativa de su secuencia de
aminoácidos, según el código genético. A esta secuencia lineal de aminoácidos se le de-
nomina estructura primaria. La posición que los diferentes aminoácidos adoptan puede
resultar en la formación de hélices o láminas conocidas como alfa-hélices u hojas-beta
plegadas. En su conjunto, a éstas se les conoce como estructura secundaria. La forma
tridimensional del acomodo completo de todos los aminoácidos en el espacio se cono-
ce como estructura terciaria (Figura 1), y se determina experimentalmente, entre otras
maneras, mediante difracción de rayos X de arreglos cristalinos de las proteínas. Por esta
razón es que comúnmente se puede llamar también a la estructura tridimensional de una
proteína, estructura cristalina1.
[1] Se puede encontrar más Aunque la determinación de la estructura tridimensional de las proteínas se ha
información al respecto
de la estructura de
vuelto más cotidiana, solamente un pequeño porcentaje de las enzimas con las que se
las proteínas y de trabaja en los laboratorios cuenta con datos estructurales. Por este motivo, es muy co-
los métodos para su
análisis en: http:// mún tener datos de la secuencia primaria y secundaria de una proteína, pero no siempre
laguna.fmedic.unam. se conoce la estructura terciaria. Esta información determina el método que se quiera
mx/~evazquez/0403/
proteinas.html aplicar para llevar a cabo el mejoramiento de una enzima. En general, los métodos de
* Un ejemplo ilustrativo de ingeniería de proteínas pueden dividirse ampliamente en dos tipos: a) métodos de evolu-
la evolución dirigida de ción dirigida, y b) métodos de diseño racional. En muchos casos exitosos la combinación
proteínas se puede ver
en el siguiente video de ambos enfoques ha permitido mejores resultados.
animado: http://youtu.
be/r7mSweNf54c
Figura 1. Se muestra la
secuencia lineal (indicada
por las fechas pequeñas) que
corresponde a la estructura
primaria de una proteína.
Cada bloque indica el
nombre del aminoácido
con el código de una sola
letra, ejemplo: G = glicina.
El color de esta secuencia de
aminoácidos corresponde al
lugar que ocupa en el espacio
en la formación de hélices u
hojas (estructura secunda-
ria). La estructura terciaria
o tridimensional resulta
del plegamiento de toda la
cadena de aminoácidos, y en
este ejemplo se indica con
color el lugar dentro de toda
la proteína del fragmento de
en medio.
Evolución dirigida
Cuando la información estructural de una enzima es limitada, la producción adecuada
de la proteína en el laboratorio es suficiente para llevar a cabo ensayos de evolución
dirigida. En este caso, la teoría de la evolución conocida para las especies, en la que la
acumulación de mutaciones genera variabilidad, es aplicada en la evolución dirigida de
proteínas, aunque en escalas de tiempo miles de veces más cortas.
Para este propósito el gen de la enzima de interés es sometido a la técnica co-
nocida como PCR (por sus iniciales en inglés: polymerase chain reaction), en la que el
fragmento de DNA que codifica a la enzima es copiado y replicado millones de veces por
una enzima polimerasa de DNA. Si esta polimerasa replica al DNA introduciendo errores
que no son reparados, al final de la reacción de PCR se tendrán millones de moléculas
portadoras de cambios (o mutaciones) con respecto a la original. Cuando se desconoce
qué secuencia de aminoácidos es la que conferirá una mejor actividad a la enzima, es
deseable que los cambios que se producen en la reacción de PCR ocurran al azar y con
poca frecuencia (para evitar generar muchas variantes inactivas) (Figura 2).
Las técnicas actuales en el laboratorio permiten manipular o controlar la tasa de
error durante la replicación de un gen, pudiendo llegar a tener de 2 a 8 mutaciones por
cada 1000 pares de bases replicadas. Las poblaciones de moléculas variantes que llegan
a obtenerse con este método deben ser posteriormente clonadas en un vector para su
producción y la verificación del cambio enzimático buscado (Figura 3). Los genes de la o
las variantes que presenten cambios positivos pueden ser sometidos a nuevos ciclos de
PCR para intentar obtener aún mejores actividades. Cuando la mutagénesis ocurre a lo
largo de toda la secuencia proteica, el número de variantes generadas es inmenso y en
la práctica es posible el análisis de sólo una fracción infinitesimal de estas colecciones
(también llamadas librerías).
Figura 2. Mediante PCR

mutagénico se genera
variabilidad a partir de la
secuencia de un solo gen.
Con esta técnica la molécula
parental (indicada en gris) es
replicada a través de muchos
ciclos (aproximadamente 30),
y cada vez son introducidos
errores en diferentes posi-
ciones (indicados con líneas
rojas). El método de barajeo
de DNA involucra el corte de
varias secuencias genes si-
milares (indicados por líneas
dobles de diferente color) y
su posterior re-ensamblaje
al azar originando genes
compuestos de diferentes
fragmentos parentales
(mostrados en líneas dobles
de colores combinados). Des-
pués, las moléculas obtenidas
por cualquiera de estas dos
formas son clonadas en un
fragmento de DNA llamado
vector en el que se liga cada
fragmento modificado para
generar las librerías conte-
niendo miles de variantes.
Figura 3. Las librerías de

mutantes son introducidas
dentro de células –que
pueden ser de bacterias o
levaduras, por ejemplo– para
que, mediante los mecanis-
mos celulares (indicados por
las flechas pequeñas), sean
producidas enzimas con
pequeños cambios respecto
a la proteína original (en este
caso se ilustra una proteína
de color pálido como aquella
que por azar resultó con una
mejor actividad). La flecha
larga indica la producción en
alta cantidad de la enzima y
su exportación hacia afuera
de la célula.
Otra manera en la que puede llevarse a cabo la evolución dirigida es mediante

barajeo de DNA que genera diversidad mediante la combinación de secuencias de genes
similares que existen naturalmente. Las colecciones de DNA recombinantes son genera-
das mediante la fragmentación al azar de los genes homólogos, seguida del ensamblaje
de los fragmentos, lo que genera entrecruzamientos en las áreas en las que existe iden-
tidad en la secuencia.
El éxito de las técnicas de evolución dirigida depende de contar con un método
que permita la identificación de la variante con la actividad deseada de entre los mi-
llones de mutantes generados en una sola librería. Debido a que no todas las enzimas
son sujeto para el desarrollo de sistemas de búsqueda sencilla dentro las librerías, en
muchas ocasiones el método para la selección de las variantes mejoradas es difícil de

implementar, y esto constituye la principal desventaja de la evolución dirigida al azar. Por
esta razón, los esfuerzos actuales se enfocan en la obtención de librerías inteligentes que
produzcan un número de variantes mucho menor mediante la identificación de los me-
jores aminoácidos candidatos a la mutagénesis. Por ejemplo, las zonas de funcionalidad
de una proteína pueden ser identificadas usando información evolutiva que permite la
identificación de aquellos aminoácidos que son comunes entre genes de diferentes orga-
nismos, y que indican que su posición en la secuencia o en la estructura es importante, lo
que delimita la mutagénesis a estas zonas blanco haciendo más sencilla la búsqueda de
las variantes mejoradas.
Diseño racional
El diseño racional se refiere a la capacidad de predecir los cambios requeridos para lograr
alguna función preconcebida de una enzima. Esta estrategia requiere de un conocimien-
to profundo de la estructura de una enzima y de su sitio activo, que es el lugar en donde
se lleva a cabo la catálisis (Figura 4), o de los cambios moleculares que ocurren durante la
reacción, debido a que la función está estrechamente relacionada a la estructura.
Figura 4. Estructura tridi-

mensional de una proteína,
en la que se ha marcado con
color rojo el sitio activo. A
la izquierda se muestra una
vista lateral y a la derecha una
vista de frente de la enzima.

Como se mencionó anteriormente, la determinación de las estructuras cristalo-
gráficas de muchas proteínas ha permitido que las bases de datos en donde se deposita
esta información estén en constante crecimiento. Por otro lado, existen herramientas
computacionales cada vez más poderosas que permiten la generación de modelos tri-
dimensionales de proteínas para las cuales no hay datos cristalográficos, y que se basan
en la información de proteínas homólogas cuya estructura ya ha sido determinada. Al
contar con una estructura (real o modelada)los aminoácidos que forman el sitio activo
de la enzima (también conocidos como residuos) pueden ser visualizados , así como otros
residuos clave cercanos a éste, residuos que se encuentran en la frontera entre los di-
ferentes fragmentos que componen una enzima, o aquellos que le permiten movilidad.
La identificación de estos puntos clave permite proponer cambios que resulten en una
actividad diferente a la original. El cambio necesario puede ser a nivel de sustitución de
aminoácidos específicos, los cuales, por ejemplo, adicionan o eliminan carga eléctrica, o
son más o menos voluminosos para acomodar a sustratos de cierto tamaño requerido,
como puede verse en el ejemplo del siguiente video. Otros cambios involucran la adición
o eliminación de pequeñas regiones de una proteína para promover o restringir los cam-
bios conformacionales que ocurren durante la catálisis.
Las proteínas en la vida

moderna
http://youtu.be/kg2hcJtpSRs
Casos de éxito de proteínas mejoradas

El número reportado de enzimas mejoradas mediante ingeniería de proteínas es grande,
y existen ejemplos para diferentes propósitos tales como: enzimas con usos terapéu-
ticos, industriales o medioambientales. A continuación se describen tres ejemplos del
mejoramiento de enzimas utilizando diferentes métodos.
Ejemplo 1
Para eliminar restos biológicos de la ropa, algunos detergentes incorporan en su fórmula
enzimas como proteasas, lipasas o amilasas. Las enzimas añadidas deben ser estables
en las condiciones de lavado que incluyen la presencia de surfactantes, agentes oxidan-
tes y, en ocasiones, altas temperaturas. La subtisilina es una proteína con actividad de
proteasa –es decir, que destruye otras proteínas– que probó ser útil al ser incorporada
en detergentes. Sin embargo, se encontró que el aminoácido metionina, cercano al sito
activo, es susceptible a ser oxidado y esto reduce la actividad catalítica de la enzima.
Con base en este dato se planteó modificar dicho residuo por cada uno de los otros 19
aminoácidos para identificar un reemplazo de la metionina resistente al daño oxidativo
(ESTELL et al., 1985). Los resultados del trabajo mostraron que, en general, los cambios
por aminoácidos pequeños conservaban la actividad mientras que aminoácidos grandes
o cargados eléctricamente provocaban una disminución considerable en la misma. El
cambio de metionina por serina o alanina mantuvo actividades suficientemente buenas
y generó resistencia al daño oxidativo. Este caso ejemplifica la solución a un problema de
inestabilidad de la enzima que fue abordado al generar una pequeña librería de variantes
del sitio único responsable de esta inestabilidad.
Ejemplo 2
En este estudio se requería el cambio de especificidad de sustrato de una enzima, es
decir, que ésta prefiriera actuar sobre un compuesto diferente al que transforma natu-
ralmente. El objetivo fue invertir la especificidad de la enzima xilosa reductasa de una
levadura llamada Pichia stipitis, que naturalmente utiliza NADP como cofactor, para que
en su lugar utilizara NAD en la reacción. Este cambio disminuiría el desbalance oxidativo
poco favorable en la producción de alcohol a partir de xilosa. Este trabajo tuvo un en-
foque semi-racional usando una combinación de diseño racional y evolución dirigida. La
estrategia utilizada consistió en el análisis de la estructura tridimensional de la proteína
para identificar y hacer una lista de los aminoácidos que están involucrados en el reco-
nocimiento del cofactor(KRAHULEC et al., 2009).
Al momento del estudio, la enzima xilosa reductasa no contaba con datos crista-
lográficos de estructura, pero fue posible predecir un modelo estructural por su parecido
a proteínas homólogas con estructura conocida. En el modelo estructural se identifica-
ron 6 aminoácidos involucrados en el reconocimiento del cofactor lo que los convertía
en candidatos a ser modificados. Dos de los sitios candidatos se mutaron al azar simultá-
neamente en una primera ronda de mutación, y la variante con mejor actividad se eligió
como molde de una segunda ronda de mutación donde se cambiaron otros dos sitios
de la lista inicial. Una tercera ronda de mutaciones se realizó con la mejor mutante de
la segunda ronda. La variante final pasó de preferir dos veces NADP a preferir 25 veces
NAD. Esta estrategia se basó en el uso de la información estructural de la proteína lo que
redujo considerablemente el número de variantes posibles, lo cual fue de gran ayuda
debido a que el método de selección no permitía abarcar el análisis de muchas variantes.
Ejemplo 3
En este ejemplo se abordó el problema de la degradación de compuestos tóxicos in-
troducidos al ambiente por procesos industriales y agrícolas mediante la estrategia de
barajeo de DNA. Como sistema, se eligieron dos enzimas llamadas atzA y triA, que pre-
sentan solamente nueve aminoácidos de diferencia entre sí. Éstas inician la hidrólisis de
los compuestos s-triazinas, una mediante la eliminación de cloro (desclorinación) y la
otra mediante la eliminación del grupo amino (desaminación) de los compuestos atrazina
y melamina, respectivamente. Las s-triazinas comenzaron a usarse recientemente como
herbicidas, pesticidas o en plásticos, por lo cual su liberación en el ambiente ha sido
extensa. Para el estudio se diseñó una familia de 15 compuestos distintos de s-triazinas.
Posteriormente, se combinaron las secuencias de ambos genes para crear una colección
de variantes para examinar su capacidad hidrolítica contra cada uno de los sustratos. De
esta colección se identificaron enzimas que hidrolizaban cinco de ocho sustratos que no
eran hidrolizados por las enzimas parentales. Mientras que para los otros siete sustratos,
donde las enzimas parentales mostraban algo de actividad, la librería produjo variantes
con actividades mejoradas que presentaron hasta 150 veces más actividad que la mejor
enzima parental. Además de esto, fue posible extraer, a partir de las variantes encontra-
das, algo de información acerca de la relación entre la secuencia y la función en estas
enzimas(RAILLARD et al., 2001).
Conclusión
El uso de biocatalizadores podría satisfacer la creciente demanda de procesos industria-
les limpios. Sin embargo, la producción de enzimas a gran escala es todavía costosa. El
uso de enzimas que resistan, por más tiempo, las diferentes condiciones operacionales,
podría ayudar a aliviar este problema. La ingeniería de proteínas es una alternativa para
la producción de actividades específicas tomando como base lo que la naturaleza ha
creado. El conocimiento cada vez mayor sobre la genética y bioquímica de las proteínas,
junto con el número creciente de secuencias de proyectos de secuenciación masiva y
que se encuentran públicamente disponibles, y sobre la estructura de diferentes tipos
de proteínas, han facultado el desarrollo de técnicas que en su conjunto permiten iden-
tificar residuos clave para la manipulación y confección de enzimas con características
mejoradas.
Glosario de términos
Aminoácido: Bloque de construcción de las proteínas que se une con otro en sus extre-
mos para formar cadenas. Existen 20 aminoácidos diferentes en las proteínas encontra-
das en la naturaleza.
Proteína: Cadena compuesta por los 20 aminoácidos con un orden específico indicado
por el gen que la codifica.
Secuencia: Es el orden en que se encuentran los aminoácidos (que forman las proteínas)
o los nucleótidos (que forman el DNA) en una cadena lineal.
Residuo o residuo de aminoácido: Aminoácido que forma parte de la secuencia de una

proteína.
DNA: También llamado ADN, es la molécula que guarda la información para especificar la
secuencia de las proteínas (entre otras funciones) en los seres vivos.
Gen: Cadena de DNA que contiene la información que indica la secuencia específica de
una proteína.
Polimerasa de DNA: Un tipo particular de enzima cuya función es replicar nuevas cade-
nas de DNA.
Mutación: Cambio en la secuencia de la cadena de DNA.
Mutagénesis: Generación de mutaciones en el DNA.
Homólogo: Proteína que tiene cierto parecido en su secuencia con otra.

Catálisis: Aceleración de una reacción química.
Lipasas, proteasas, amilasas: Proteínas que degradan grasas, proteínas y almidón, res-
pectivamente.
Surfactantes: Agentes químicos que humedecen, emulsifican y dispersan compuestos

cuando se disuelven en agua.
Agentes oxidantes: Son compuestos que aceptan electrones en una reacción de oxida-
ción/reducción.
Serina, alanina, metionina: Nombres de tres aminoácidos de los 20 encontrados en las

proteínas.
NADP, NAD: Son sustancias que actúan en conjunto con algunas proteínas para permitirles
llevar a cabo reacciones de oxidación/reducción.
Cofactor: Moléculas que actúan en conjunto con algunas proteínas para permitirles lle-
var a cabo su función, como el NADP o el NAD.
Reductasa: Enzima que acelera reacciones de oxidación/reducción.
Hidrólisis: Reacción química que consiste en la ruptura de un enlace con la formación de

una molécula de agua en el proceso.
Bibliografía
[1] ESTELL, D.A., T.P. Graycar, y J.A. Wells, “Engineering an enzyme by site-directed
mutagenesis to be resistant to chemical oxidation”. Journal of Biological Chemistry,
1985. 260(11): p. 6518-6521.
[2] KRAHULEC, S., M. Klimacek, and B. Nidetzky, “Engineering of a matched pair

of xylose reductase and xylitol dehydrogenase for xylose fermentation by
Saccharomyces cerevisiae”. Biotechnology Journal, 2009. 4(5): p. 684-694.
[3] PEÑA-MONTES, C. y A. Farrés Gonzalez-Saravia, “Evolución Dirigida en la generación

de biocatalizadores: Biocatalizadores hechos a medida”. BioTecnología, 2008. 12(2):
p. 5-23
[4] RAILLARD, S., et al., “Novel enzyme activities and functional plasticity revealed by
recombining highly homologous enzymes”. Chemistry & Biology, 2001. 8(9): p. 891-
898.
[5] SEGOVIA, L. y M. Peimbert, “Ingeniería de Proteínas y Evolución Dirigida”. Mensaje

Bioquímico, 2010. XXXIV: p. 135-141.

Artículo: Ingeniería de Proteínas para El Mejoramiento de Enzimas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Artículo: Ingeniería de Proteínas para El Mejoramiento de Enzimas

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Artículo: Ingeniería de Proteínas para El Mejoramiento de Enzimas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

1 de diciembre de 2014 | Vol. 15 | Núm.

12 | ISSN 1607 - 6079

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS PARA EL

Claudia Martínez Anaya (Instituto de Biología, UNAM) y

Dirección General de Cómputo y de Tecnologías de Información y Comunicación - UNAM

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS PARA EL MEJORAMIENTO DE

Palabras clave: Estructura proteica, enzimas, in-

Las enzimas o biocatalizadores

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS PARA EL MEJORAMIENTO DE

Figura 2. Mediante PCR

Figura 3. Las librerías de

Otra manera en la que puede llevarse a cabo la evolución dirigida es mediante

muchas ocasiones el método para la selección de las variantes mejoradas es difícil de

Figura 4. Estructura tridi-

Las proteínas en la vida

Casos de éxito de proteínas mejoradas

Residuo o residuo de aminoácido: Aminoácido que forma parte de la secuencia de una

Mutación: Cambio en la secuencia de la cadena de DNA.

Mutagénesis: Generación de mutaciones en el DNA.

Homólogo: Proteína que tiene cierto parecido en su secuencia con otra.

Surfactantes: Agentes químicos que humedecen, emulsifican y dispersan compuestos

Serina, alanina, metionina: Nombres de tres aminoácidos de los 20 encontrados en las

Reductasa: Enzima que acelera reacciones de oxidación/reducción.

Hidrólisis: Reacción química que consiste en la ruptura de un enlace con la formación de

[2] KRAHULEC, S., M. Klimacek, and B. Nidetzky, “Engineering of a matched pair

[3] PEÑA-MONTES, C. y A. Farrés Gonzalez-Saravia, “Evolución Dirigida en la generación

[5] SEGOVIA, L. y M. Peimbert, “Ingeniería de Proteínas y Evolución Dirigida”. Mensaje

También podría gustarte