Medición Del Crecimiento Microbiano

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:
ENUMERACIÓN DIRECTA, ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS

VIABLES
I Introducción
La población microbiana mantiene una relación con la calidad del ambiente en el que se
encuentran, ésta puede ser directa o indirecta dependiendo de los organismos que la
integren, por lo que la enumeración o el recuento de poblaciones microbianas es parte
del quehacer básico del microbiólogo.
Existen varias técnicas de recuento, unas directas y otras indirectas y la decisión para la
utilización de alguna de éstas depende del tipo de información que se necesite y los
recursos con los que se cuenten. Muchas de estas técnicas forman parte de normas
estándares para la evaluación de la calidad de ambientes, naturales o de recreación,
alimentos, fármacos y otros.
1.1. RECUENTO DIRECTO
Incluye técnicas microscópicas que permiten la visualización directa de los

microorganismos, en algunos casos pueden usarse sondas de ADN acompañadas por
colorantes fluorescentes que permiten además la identificación de taxones. Son muy
utilizadas en la industria y en la evaluación de ambientes naturales. La desventaja es que
existen limitaciones para determinar la viabilidad de los organismos por lo que se
recomienda asociar estos recuentos con el uso de colorantes vitales.
1.1.1. Recuento con Cámara de Neubauer
Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste

de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de
la cual se ha marcado una cuadrícula como la que se ve en la Figura 1.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de

0.25 mm.
El área sombreada y marcada con L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La

depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de
forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada
0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es
de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
Esta técnica se utiliza para recuentos celulares sanguíneos y el de microorganismos

para la determinación de dosis de inoculantes, calidad de materia prima y otros usos
de interés industrial.
Fig. 1. Cámara de Neubauer
Fig. 2. Cámara de Neubauer

Fig.3. Diseño de la cámara de
Neubauer.
1.2. RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES

1.2.1. Recuento de Colonias en Placa.
Este recuento se basa en que cada microorganismo desarrollará una colonia visible.
Pero debido a que una muestra no es totalmente homogénea con respecto a su
composición microbiológica, es posible que una colonia se origine de un
microorganismo o de cientos de ellos, dando en este último caso un recuento menor
del real.También es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no
puedan crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo,
tiempo, etc.). En este caso el recuento también será inferior al real. Lo que si se
sabe es que cada colonia observada se formó a partir de por lo menos un
microorganismo.
La colonia es considera una unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos de los
cálculos.Se admite, por lo tanto, que en los métodos de recuento de
microorganismos vivos, son inevitables los errores, especialmente cuando se
examinan muestras pequeñas.
La técnica se acompaña con la preparación de diluciones decimales de acuerdo a la
calidad de la muestra que se analiza. El tipo de siembra a utilizar dependerá de la
naturaleza muestra.
1.2.2. Recuento de microorganismos con técnicas de filtración

Para esto se hace pasar un volumen de la muestra por una membrana de filtración
de acetato de celulosa con poros y diámetro tal (0,45 diámetro) que capte la bacteria
en tanto que permita el paso libre del agua. Esta técnica es ideal para el análisis de
aguas o bebidas con baja turbidez aunque también existen procedimientos que
incorporan diluciones decimales para disminuir la concentración microbiana y
facilitar el filtrado.
Esta técnica tiene muchas aplicaciones útiles:
- Se puede examinar grandes volúmenes de agua; teóricamente casi cualquier
volumen de agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de
cualquier volumen quedaran en el disco.
- La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar
y diferenciar los microorganismos.
- Se obtienen resultados más rápidos, que con los métodos convencionales.
- Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias como
coliformes, cuando se usan los medios apropiados.
Ventajas del uso de Filtro de membrana para aguas:

- Rapidez en la obtención de resultados.
- Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los
materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.
- Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy fácilmente
durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente.
1.3. RECUENTO CON ESTIMACIÓN ESTADÍSTICA
1.3.1. Método del Número Más Probable (NMP).

Es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales
especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es
factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia en réplicas
de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes
en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este
método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población en
el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se
obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de
una tabla probabilística.
Algunas de las ventajas del NMP son:
(i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos
relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la
densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una
muestra de suelo usando el método de infección de plantas,
(ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos
diversificados,
(iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser
más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de
esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.
La mayoría de las tablas de NMP están generalmente limitadas a valores de pruebas
que comienzan con porciones de muestra de 10mL. Los resultados de pruebas que
empiecen por diluciones decimales requieren para su interpretación la siguiente
fórmula:
Valor de la tabla del NMP x 10 = NMP /100 mL

Vol. Muestra
Ej. Para una serie sembrada con volúmenes de muestra de 1mL, 0,1mL, 0,01mL, y
con tubos positivos correspondientes a 3, 2 y 0, tenemos que:
93 x 10 = 930 NMP / 100 mL

1
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear
para los cálculos la siguiente ecuación:
NMP/100 mL = No. de tubos positivos x 100

mL muestra en tubos negativos x mL muestra en todos los tubos
II. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

2.1. Recuento en cámara de Neubauer.
- Se coloca 0,1mL de la suspensión celular en las ranuras de la cámara y se coloca
un cubreobjetos.
- Se visualizan las células levaduriformes al microscopio ocular a 45 aumentos.
- Se cuentan las células de los cuadrantes 1, 2,3, 4, 5 según Figura 2.
- Se aplica la siguiente fórmula:
Células/microlitro Volumen = partículas contadas

0,2 mm2 . profundidad de cámara (mm) . dilución
2.2. Recuento de Colonias en Placa.

- Realizar el recuento de los microorganismos presentes en la muestra
seleccionando las placas que muestren entre 30 y 300 colonias. Para visualizar
mejor es conveniente ubicar la placa sobre una caja con tapa de vidrio y luz,
dividiendo la superficie total de la placa en sectores cuadriculados.
- Dar el resultado en ufc/mL (Nº en bacterias por mililitro):
ufc/g = N° de colonias en placa (entre 30 y 300) x inverso de la dilución x 10
2.3. Recuento de microorganismos con técnicas de filtración.

- Se examinan las placas de agar EMB para el reconocimiento de colonias verde
metalico características de E. coli.
2.4. Método del Número Más Probable (NMP).

- Reportar como positivos a los tubos con crecimiento microbiano y producción de
gas que se visualiza observando la presencia de éste en tubos de Durham.
Reportar como negativos los tubos que no tengan las características señaladas
anteriormente.
- Leer los resultados en la Tabla del NMP en ANEXO.
III. DISCUSIÓN GRUPAL

1. Qué es un organismo viable, será posible su recuento en cámara de Neubauer?
2. Porqué el recuento de bacterias se realiza sólo en placas que no exceden las 300
colonias?
ANEXOS
ESCALA DE MAC FARLAND
TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/mL E.coli

0,5 0,05 9,95 1,5x108
1 0,1 9,9 3,0x108
2 0,2 9,8 6,0x108
3 0,3 9,7 9,0x108
4 0,4 9,6 1,2x109
5 0,5 9,5 1,5x109
6 0,6 9,4 1,8x109
7 0,7 9,3 2,1x109
8 0,8 9,2 2,4x109
9 0,9 9,1 2.7x109
10 1,0 9,0 3,0x109
TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

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MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

ENUMERACIÓN DIRECTA, ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS

1.1. RECUENTO DIRECTO

Incluye técnicas microscópicas que permiten la visualización directa de los

1.1.1. Recuento con Cámara de Neubauer

Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste

Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de

El área sombreada y marcada con L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La

Esta técnica se utiliza para recuentos celulares sanguíneos y el de microorganismos

Fig. 2. Cámara de Neubauer

1.2. RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES

1.2.2. Recuento de microorganismos con técnicas de filtración

Ventajas del uso de Filtro de membrana para aguas:

1.3. RECUENTO CON ESTIMACIÓN ESTADÍSTICA

1.3.1. Método del Número Más Probable (NMP).

Valor de la tabla del NMP x 10 = NMP /100 mL

93 x 10 = 930 NMP / 100 mL

NMP/100 mL = No. de tubos positivos x 100

II. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Células/microlitro Volumen = partículas contadas

2.2. Recuento de Colonias en Placa.

2.3. Recuento de microorganismos con técnicas de filtración.

2.4. Método del Número Más Probable (NMP).

III. DISCUSIÓN GRUPAL

ESCALA DE MAC FARLAND

TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/mL E.coli

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