Manual de Practicas Microbiologia Medica 3ed

MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
3.a Edición
MANUAL PRÁCTICO DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
UNIVERSIDAD DEL SINÚ

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
AREA DE MICROBIOLOGÍA
MONTERÍA
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MANUAL PRÁCTICO DE
Escrito y diseñado por:
CATALINA TOVAR ACERO

Bacterióloga, MSc. en Infecciones y Salud del Trópico
Grupo de Enfermedades Tropicales y Resistencia Bacteriana
Docente – Investigadora
DINA MARCELA RICARDO CALDERA

Bacterióloga, MSc. en Microbiología Tropical
Grupo de Enfermedades Tropicales y Resistencia Bacteriana
SHIRLEY SALCEDO ARTEAGA

Bióloga, MSc. en Biología
Grupo de Investigación Biomédica y Biología Molecular
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MANUAL PRÁCTICO DE
Índice
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................................................................................................4
OBJETIVOS.....................................................................................................................................................................................................................5
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Y MANEJO DE RESIDUOS.......................................................................................................6
MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA...............................................................................................11
ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................................................................15
TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS.......................................................................................................21
MANEJO DEL MICROSCÓPIO......................................................................................................................................................................................28
COLORACIONES ESPECIALES: GRAM, ESPORAS Y CÁPSULA...................................................................................................................................32
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS.........................................................................................................................................................41
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS..................................................................................................................................................................48
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS...................................................................................................................................................................58
MICOLOGÍA..................................................................................................................................................................................................................64
PARASITOSIS INTESTINALES POR HELMINTOS Y PROTOZOOS...............................................................................................................................71
UROANÁLISIS...............................................................................................................................................................................................................77
ANEXOS........................................................................................................................................................................................................................86
Tablas CLSI Staphylococcus.........................................................................................................................................................................................87
Tablas CLSI Enterobacterias.......................................................................................................................................................................................88
Tabla de identificación para enterobacterias...........................................................................................................................................................89
4
MANUAL PRÁCTICO DE
INTRODUCCIÓN
La microbiología es una ciencia que alberga el estudio de un gran número de patógenos de

diferentes familias, al igual que los procedimientos y las técnicas que han permitido
evidenciar la existencia de estos seres. Está es una disciplina muy extensa, sin principio ni
final muy claro, como muchas en la actualidad se encuentra en constante cambio, renovación
y actualización, debido a todos los estudios científicos a su alrededor, con el afán de proveer
conocimientos, para controlar o eliminar microorganismos patógenos que afecten la salud
humana o animal.
Este manual se creó tratando de hacer un amplio recorrido a través de los diferentes campos
de la microbiología, como son, bacteriología, micología y parasitología, para brindar al
5
MANUAL PRÁCTICO DE
estudiante de las diferentes ciencias de la salud, una visión global y cercana de las técnicas de
laboratorio que permiten evidenciar y reconocer microorganismos patógenos, lo cual, junto
con herramientas clínicas permitirán el entendimiento, manejo y prevención de las
infecciones causadas por estos.
La tercera edición de este manual se presenta de una forma más dinámica, que precisa
mayor claridad en los conceptos presentados al estudiante y mejor asimilación de estos, de
igual manera se acompaña con actualizaciones conceptuales en las diferentes temáticas.
Con la guía de conceptos básicos de la microbiología clínica, que se ofrecen en este manual
se pretende que, a lo largo del semestre, el estudiante desarrolle capacidades técnicas y
cognitivas de las diferentes temáticas, se motive en la investigación y en la constante
actualización de los temas englobados en esta ciencia.
Este manual, de ninguna manera trata de desplazar la literatura científica (libros, revistas,
etc.) por el contrario, busca generar pautas para fomentar la lectura crítica en este campo, y
el aprovechamiento de estas herramientas en el ejercicio profesional.
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MANUAL PRÁCTICO DE
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Orientar a los estudiantes en el desarrollo de competencias tecno-cognitivas en el área de la

microbiología clínica mediante la implementación de las metodologías propuestas en este
manual.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Dar al estudiante una introducción de las temáticas comprendidas en el manual de

microbiología.
 Motivar al estudiante a la lectura de cada temática previa al desarrollo de cada

práctica.
 Llevar a la práctica las metodologías propuestas en este manual.
 Evaluar los procesos técnico-cognitivos mediante informes, quices y talleres.
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MANUAL PRÁCTICO DE
PRACTICA No. 1
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Y MANEJO DE RESIDUOS
OBJETIVOS
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MANUAL PRÁCTICO DE
 Socializar con el estudiante los mecanismos que garantizan la integridad física de las
personas dentro de los laboratorios en cada uno de sus niveles.
 Socializar con el estudiante la importancia de la clasificación de los diferentes residuos

generados dentro de las prácticas de laboratorio.
PRELABORATORIO
1. . Elabore un glosario con la terminología técnica utilizada en la presente guía (Mínimo 5

términos)
 Bioseguridad: conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de

factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos.
 Patógenos: Organismos, incluidos virus, bacterias o quistes, capaces de causar una
enfermedad.
 Parásitos: organismo que vive sobre un organismo huésped o en su interior y se
alimenta a expensas del huésped.
 Hongos: un organismo eucariota que pertenece al reino Fungí. Los hongos forman un
grupo polifilético y son parásitos o viven sobre materias orgánicas en
descomposición.
 Bacterias: son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas
las partes de la Tierra. Son vitales para los ecosistemas del planeta.
2. Proponga dos normas generales de bioseguridad para el trabajo en el laboratorio

adicionales a las anteriormente mencionadas.
Uso correcto o ensamble de instrumentos, herramientas o objetos de laboratorio para su uso

continuo sin riesgos de contaminacion biologica o deterioro de las herramientas
Protocologo de limpieza y desinfección al entrar o salir despues de ensayar en las instalaciones
3. Organice los siguientes residuos de acuerdo con su clasificación
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MANUAL PRÁCTICO DE
Residuo Clase de residuo Color de Bolsa o caneca

Lancetas Punzantes y cortantes Guardian
Envoltura de la jeringa Material reciclable Gris
Hojas de cuaderno Peligroso e infeccioso Gris
Muestras biológicas Peligroso e infeccioso Rojo
Catéter Punzantes y cortantes Guardian
INTRODUCCIÓN
El laboratorio de microbiología es el lugar que nos provee las herramientas necesarias para el
estudio, identificación, cultivos y diversos ensayos para patógenos bacterianos, virus,
parásitos y hongos. Por tal motivo es considerado, tanto el lugar físico como los
procedimientos que allí se realizan de alto riesgo para el personal que en él se desempañan.
Es indispensable entonces decretar normas de bioseguridad destinadas a proteger la salud y
seguridad del personal durante los procedimientos que se vayan a desarrollar, desde las
barreras físicas de protección, manejo de material, técnicas de desinfección y rutas de
desecho.
Los siguientes ítems son de cumplimiento obligatorio para todos los estudiantes:
Normatividad para el personal dentro del laboratorio
- Todo el personal dentro del laboratorio debe estar dotado de bata blanca, guantes a
la medida, tapabocas y gorro desechable.
- Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer
completamente cerrada.
- Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las
áreas de laboratorio.
- Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podrían ser fuente de contaminación
(por ejemplo, relojes, pulseras, anillos).
10
MANUAL PRÁCTICO DE
- En el laboratorio está prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contactos y

maquillarse.
- Todas las personas que tengan el cabello largo se lo deben recoger y ponerse un
gorro desechable.
- Está prohibido el uso del celular dentro del laboratorio
Normatividad del trabajo dentro del laboratorio:
1. Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar los bolsos, morrales, libros y otros
objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.
Castillo estrada, cuadrado, hoyos sosa
2. Antes de comenzar la práctica, léase el manual de laboratorio esto le permitirá
desarrollar su trabajo con más eficiencia.
3. Los materiales del laboratorio son para el uso de toda la comunidad estudiantil, por
ello es imprescindible su buen manejo y cuidado de este.
4. Antes de iniciar cualquier practica se deben realizar un lavado exhaustivo de manos.
5. Preparar el sitio de trabajo: primero realizar una limpieza del sitio de trabajo con
Alcohol y posteriormente colocar una hoja de papel kraff en el área de trabajo.
6. Mantener siempre al alcance un recipiente con hipoclorito al 5 %
7. Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura.
8. Al terminar la práctica deseche el papel del área de trabajo en la bolsa roja y
desinfecte el sitio de trabajo.
9. Después de utilizar el microscopio debe guardarse adecuadamente (objetivo 4X en
posición de observación, platina abajo, condensador abajo, luz apagada y cable de
conexión recogido)
10. El material de la práctica debe ser desechado o recogido siguiendo la instrucción del
docente y de acuerdo con la clasificación de residuos establecida en el presente
manual.
11. Lávese las manos al terminar la practica
11
MANUAL PRÁCTICO DE
12. Los elementos cortopunzantes deben ser desechados en el guardián
PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD
BARRERAS
1. Barreras primarias: Elementos de protección personal como guantes, bata,

delantales, cobertores de zapatos, máscaras faciales, gafas de seguridad. Se incluyen
dentro de este grupo equipos de seguridad: cabinas de seguridad biológica,
recipientes cerrados y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar
las exposiciones a materiales biológicos peligrosos.
2. Barreras secundarias: Se refiere al diseño y construcción de las instalaciones del
laboratorio para la seguridad de los que allí trabajan, y se establecen de acuerdo con
los agentes químicos y patógenos que se manipulen. Dependerán del riesgo de
transmisión de los agentes específicos.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Nivel de Bioseguridad I: Están destinados a la adecuación de laboratorios de educación o

capacitación. Donde se trabaja con agentes microbiológicos conocidos y que no son
generados de enfermedades en humanos adultos sanos. Ejemplo: Bacillus subtilis. Es un nivel
de contención básica se debe trabajar con procedimientos estándar y se recomienda el uso
obligatorio de lavado de manos.
1. Nivel de Bioseguridad II: Son normas aplicadas a laboratorios con fines educativos,
diagnostico, clínicos u otros donde se trabajan con agentes de riesgo moderado, es
decir se encuentran en la comunidad y pueden causar enfermedad. Se trabaja bajo
normas estándares y seguras, y se manejan muestras biológicas, como sangre y
fluidos corporales entre otros. Ejemplo: Virus de la Hepatitis B, VIH. Se requieren la
implementación de las barreras primarias y secundarias de protección.
2. Nivel de Bioseguridad III: Las prácticas, equipos de seguridad, diseño y construcción
de instalaciones se aplican a instalaciones clínicas, de producción, investigación,
educación o diagnóstico. Se trabajo con agentes exóticos con potencial de
transmisión respiratoria, que pueden provocar infección y es potencialmente letal.
12
MANUAL PRÁCTICO DE
Ejemplo: Mycobacterias. Se hace un mayor énfasis en las barreras primarias y

secundarias.
3. Nivel de Bioseguridad IV: Son normas aplicables al trabajo con agentes peligrosos o
tóxicos de alto riesgo. Aparte de las barreras primarias y secundarias, generalmente
se hace indispensable el uso de trajes completamente cerrados de cuerpo entero, con
suministro de aire y presión positiva, y generalmente son instalaciones que se
encuentran en un edificio separado u zona aislada
MANEJO DE RESIDUOS DENTRO DEL LABORATORIO
Es de vital importancia mantener una clasificación apropiada de los residuos generados en

las prácticas de laboratorio con el fin, de minimizar el riesgo de quienes por su actividad
académica o laboral entren en contacto con estos residuos y les puedan generar
enfermedad, así como, disminuir en lo posible el impacto generado por estos al medio
ambiente. De tal manera ponemos a conocimiento de los estudiantes la siguiente
clasificación de residuos.
CLASIFICACIÓN DE RESIDUOS
CLASE DE COLOR BOLSA

CONTENIDO ROTULAR CON
RESIDUO y/o CANECA
No peligroso Hojas, tallos de árboles, restos NO PELIGROS

alimenticios, papel sucio, pero no con
Biodegradable residuos biológicos BIODEGRADABLES
(Verde)
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MANUAL PRÁCTICO DE
Guantes, tapabocas, papel kraff

contaminado, gorro desechable,
algodón sucio con sangre o fluidos
RIESGO BIOLOGICO
biológicos, compuestos de cultivos,
Peligrosos
medios de cultivos, fluidos corporales
Infecciosos (orina, sangre, materia fecal), material
contaminado, elementos con sangre,
muestras para análisis, jeringas
plásticas (NO la aguja).
(Rojo)
MATERIAL
Material
Papel, cartón, envases plásticos
reciclable
RECICLABLE
(Gris)
Elementos RIESGO BIOLOGICO

cortopunzante Agujas, lancetas, hojas de bisturí
ELEMENTOS
s CORTOPUNZANTE
(Guardián)
REFERENCIAS
- Centro de control de enfermedades (CDC) y Institutes nacional of Health.

Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina. Cuarta edición.
- Ministerio de salud conductas básicas en bioseguridad manejo integral. Protocolo
Básico para el Equipo de Salud. Disponible en: http://cursos.juanncorp
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MANUAL PRÁCTICO DE
PRACTICA No 2
MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
OBJETIVOS
 Conocer los diferentes elementos, materiales y equipos empleados en las prácticas de

laboratorio.
 Identificar la utilidad de cada uno de los elementos y equipos dentro del laboratorio.
INTRODUCCIÓN
En el laboratorio de microbiología se utilizan materiales y equipos diseñados para la

realización de las técnicas y procedimientos. En la tabla a continuación se listan una serie de
elementos utilizados en las prácticas de microbiología.
En el espacio donde dice figura deben dibujar el material o equipo que corresponda.
MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Materiales Figura Función
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MANUAL PRÁCTICO DE
La placa de Petri, o cápsula de

Petri, es un recipiente
redondo, de cristal o plástico
Cajas de Petri
Se utiliza principalmente para
el cultivo de bacterias, mohos
y otros microorganismos.
Nos ayuda transportar

microorganismos de un medio
Asas bacteriológicas a otro para su adecuado
desarrollo, así como para la
realización de frotis
Pueden ser de vidrio o

plástico, de distintos tamaños
Tubos de ensayo
y se utilizan para realizar
reacciones químicas.
Permiten contener sustancias

Frascos goteros que se agregan en pequeñas
cantidades
Portaobjetos es una fina placa de cristal

sobre el cual se disponen
16
MANUAL PRÁCTICO DE
muestras o preparaciones
para su examen microscópico
Es una fina hoja de material

transparente que se coloca
Cubreobjetos
sobre las muestras a observar
al microscopio
Instrumento de laboratorio de
vidrio o plástico, que se
Probeta
emplea para medir el volumen
de los líquidos.
Aparato de laboratorio que

sirve para sacar las sustancias
Espátula
sólidas de los recipientes que
las contienen.
Mechero de Bunsen Fuente de calor.
17
MANUAL PRÁCTICO DE
Es una jarra plástica

transparente que cierra
Jarra de
herméticamente para crear
anaerobiosis
una atmosfera de
anaerobiosis.
Material de vidrio que se

emplea en el laboratorio para
Erlenmeyer
calentar líquidos o preparar
soluciones
Sirven para transferir

Pipetas Pasteur
pequeños volúmenes
Gradillas Sirve para sostener los tubos

de ensayo. Pueden estar
fabricadas de madera, plástico
o metal.
18
MANUAL PRÁCTICO DE
Sirven para sujetar los tubos

Pinzas para tubos
de ensayo mientras se
de ensayo
manipulan
EQUIPOS
Se utilizan para medir la masa

Balanza
de los compuestos.
Es un equipo cerrado que

permite controlar la
temperatura, humedad y
Incubadora
otras condiciones necesarias
para el desarrollo de un
cultivo microbiológico.
Autoclave Es un equipo de paredes

gruesas y cierre hermético, en
el que se realizan reacciones a
altas presiones y
temperaturas. Se utiliza para
esterilizar materiales y
preparados de microbiología.
19
MANUAL PRÁCTICO DE
Es un instrumento que
permite observar objetos que
Microscopio
son demasiado pequeños
para ser vistos a simple vista.
Es un equipo que permite la

separación de componente de
una muestra mediante una
Centrifuga
fuerza rotativa, provocando la
sedimentación de las
partículas de mayor densidad.
REFERENCIAS
- López Reyes, Cecilia; escudero, Eliana. Guía de materiales de laboratorio. DuocUC

(Departamento universitario obrero campesino universidad católica). Escuela de
medicina. Chile.
- Forbes, Betty, Sahm, Daniel; Weissfeld; Alice. Bailey & Scott: diagnostico
microbiológico.12 ed Buenos Aires: médica panamericana, 2009.1160p.
20
MANUAL PRÁCTICO DE
PRACTICA No 3
ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
21
MANUAL PRÁCTICO DE
OBJETIVOS
 Identificar las principales técnicas de esterilización, desinfección y antisepsia en el

laboratorio.
 Conocer los diferentes medios de cultivo y su preparación.
ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
INTRODUCCIÓN
La esterilización tiene como objeto la destrucción de los microorganismos, incluyendo

formas resistentes como esporas, capsulas, virus y hongos. Es importante recordar que para
cualquier procedimiento en el laboratorio se requiere un ambiente libre de agentes
patógenos y contaminantes, tanto para garantizar resultados confiables como para proteger
la salud del operador. Algunos métodos de esterilización son:
 Calor húmedo: el objeto es la destrucción de los microorganismos por coagulación de las

proteínas celulares. El principal método es la esterilización por vapor a presión, esta se
lleva a cabo en una autoclave, equipos que emplean vapor de agua saturado, a una
presión de 15 libras y que alcanzan una temperatura de 121º C. Existen protocolos
dependiendo del tipo de material que se quiere esterilizar, donde varían los tiempos y la
temperatura. Generalmente para material limpio se utiliza entre 10 y 15 minutos y para
material contaminado se utiliza de 30 a 40 minutos.
 Calor seco: La destrucción de los microorganismos se produce por oxidación de sus

componentes celulares. Dentro de este se contemplan métodos como: aire caliente,
llama directa e incineración.
 Filtración: utilizando filtros de partículas de alta eficiencia (HEPA).
22
MANUAL PRÁCTICO DE
 Rayos ultravioletas o radiación ionizante: Los rayos ultravioletas son altamente

mutagénicos, causan alteraciones en el DNA. Las radiaciones ionizantes producen iones y
radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y
estructuras para la viabilidad de los microorganismos.
 Esterilizante gaseoso: ejemplo óxido de etileno, formaldehído gaseoso, peróxido de

hidrogeno. Son agentes alquilantes funcionan por medio de tres mecanismos diferentes,
los cuales todos alcanzan el mismo resultado - la interrupción de la función del ADN y la
muerte celular.
 Esterilizantes químicos: como el ácido paracético y el glutaraldehido. Agentes con

actividad oxidante; cuya actividad se relaciona con la alquilación de componentes
celulares alterando la síntesis proteica de los ácidos ADN Y ARN.
La desinfección es un procedimiento que busca eliminar patógenos utilizando métodos

químicos y físicos, aunque los más resistentes pueden sobrevivir. Se conocen tres grados de
desinfección:
 Desinfectante de grado alto: mata patógenos microbianos, tiene una eficiencia

semejante a la esterilización, pero hay algunas formas resistentes como microorganismos
formadores de esporas. Ejemplos: calor húmedo, glutaraldehido, peróxido de hidrogeno,
compuestos clorados entre otros.
 Desinfectante de grado medio: erradica microorganismos patógenos, con excepción de

endosporas bacterianas. Ejemplos: alcoholes, compuestos yodados entre otros.
 Desinfectante de grado bajo: mata la mayoría de las bacterias en estado vegetativo y

virus de tamaño intermedio y con envoltura lipídica. Ejemplos: compuestos de amonio
cuaternario.
Antisepsia es un procedimiento en caminado a combatir y prevenir las infecciones

ocasionadas por microbios; pero este término se reserva para agente que se aplican en
tejidos vivos. Los antisépticos se utilizan para reducir el número de microorganismos
patógenos presentes en la superficie cutánea. Algunos de los compuestos utilizados son:
alcoholes, compuestos yodados, clorhexidina entre otros.
23
MANUAL PRÁCTICO DE
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la
variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo
se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar al momento de usarlos.
Los medios de cultivo pueden clasificarse según su estado físico, composición, y al uso que se
destinan:
Según su estado físico
Se dividen en sólidos, semisólidos y líquidos:
 Sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos y presentan en su composición un

agente solidificante como el agar que es un polímero de azúcares, obtenido de algas
marinas. En este tipo de medio se utiliza en una proporción de 1.5 a 2 % de agar.
 Semisólidos: presentan agar en su composición, pero a una concentración menor que el

medio sólido. En este medio se utiliza 0.5% de agar. Uno de los usos de este tipo de medio
es la investigación de la movilidad de las bacterias.
 Líquidos: también son llamados caldos, estos medios no presenta ningún agente
solidificante.
Según su composición
 Definidos: se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos que los

conforman ya sean de tipo orgánico e inorgánico.
 Complejos: están compuestos de un número limitado de sustancias complejas de

extractos de plantas y animales cuya composición química exacta no se conoce.
24
MANUAL PRÁCTICO DE
Según su utilización
 Medios básicos o comunes: contienen sustancias nutritivas mínimas para el crecimiento

de las bacterias metabólicamente no exigentes, también son la base para la preparación
de otros medios. Agar nutritivo, agar base sangre, agar tripticasa.
 Medios enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran

número de factores de crecimiento. Generalmente contienen extractos biológicos poco
usuales como sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc.
Agar sangre, agar chocolate, agar BHI.
 Medios selectivos: Son aquéllos que poseen uno o más componentes añadidos, los
cuales inhibirán o prevendrán el crecimiento de ciertos tipos de especies de bacterias y/o
promoverán el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede ajustar las condiciones
físicas de un medio de cultivo tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo
para los organismos de interés. Un medio selectivo es el MacConkey que permite el
crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram
positivos.
 Medios diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de

bacterias con base en alguna característica observable en su patrón de crecimiento en el
medio, ya sea por producción de algún pigmento o por cambios de color en el medio
debido a indicadores de pH, o por halos de degradación de algún componente en el
medio de cultivo. Agar SS, Mc Conkey, CLED.
 Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que contienen un agente que inhibe las
especies no deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente infeccioso.
Caldo tetrationato, caldo selenito.
 Medios de transporte: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin

multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de su extracción
hasta su posterior estudio. Utilizan
25
MANUAL PRÁCTICO DE
 generalmente cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se

recomienda un límite de dos horas desde la recolección de las muestras y su estudio en el
laboratorio. s. Los medios de transporte más frecuentemente utilizados son los de Stuart,
Amies, Carey – Blair, buffer glicerinado.
 Medios bioquímicos: son aquellos que revelan las características bioquímicas particulares
de las bacterias. TSI, SIM, UREA, LIA, citrato.
MATERIALES
 Bata*
 Guantes*
 Tapabocas*
 Marcador de vidrio*
 Encendedor*
 Erlenmeyer
 Balanza
 Mechero de Bunsen
 Espátula
 Probeta
 Medios de cultivo (agar sangre, agar nutritivo, Mc Conkey)
 Autoclave
 Agua destilada
 Cinta indicadora
*Deben ser traídos por el estudiante
PROCEDIMIENTO
26
MANUAL PRÁCTICO DE
 Lea cuidadosamente las indicaciones del medio asignado y siga las indicaciones de la
casa comercial para la preparación.
 Realice los cálculos para preparar 200 ml de medio de cultivo y pese la cantidad de
medio necesaria para la preparación.
 Mida el volumen del agua destilada con una probeta y agregue el medio de cultivo,
mezcle bien hasta que desaparezcan los grumos.
 Tape el Erlenmeyer con papel kraft y selle con cinta indicadora, marcar el recipiente
con el nombre del medio y el número del grupo.
 Esterilizar en autoclave según las indicaciones impresas en el producto.
 Una vez esterilizado saque de la autoclave deje reposar y sirva de forma aséptica
cerca del mechero, sirva de 15 a 20 ml en cajas de Petri grandes.
 Deje solidificar por 30 minutos.
POSTLABORATORIO
1. Complete la información de la siguiente tabla
Tipo de medio
(Estado físico,
Medio de cultivo Composición del medio Microorganismos
Composición y
Utilización)
27
MANUAL PRÁCTICO DE
Agar Nutritivo
Agar Sangre
Caldo BHI
(Brain Heart Infusion)
Agar McConkey
Agar TSI
(Triple Sugar Iron)
28
MANUAL PRÁCTICO DE
Agar LIA
(Lysina Iron Agar)
Agar EMB
(Eosin Methylene blue
Lactose)
REFERENCIAS
- López Reyes, Cecilia; escudero, Eliana. Guía de materiales de laboratorio. DuocUC

(Departamento universitario obrero campesino universidad católica). Escuela de
medicina. Chile.
- Pedrique de Aulacio M, Gutiérrez S. Microbiología. Manual de métodos generales.
Facultad de farmacia universidad central de Venezuela.2001.
29
MANUAL PRÁCTICO DE
LABORATORIO N° 4
TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
OBJETIVOS
 Manejar las técnicas bacteriológicas básicas.
 Realizar siembras en medios líquidos, sólidos y semisólidos.
PRELABORATORIO
1. ¿Cuál es la finalidad de la siembra por agotamiento?
2. ¿Diga cuál es la utilidad de la siembra masiva?
3. ¿Cuál es la utilidad de la siembra en un medio semisólido?
4. Defina los siguientes términos:
Cultivo puro:
30
MANUAL PRÁCTICO DE
Cultivo mixto:
Inoculo:
Pase bacteriano:
Colonia bacteriana:
INTRODUCCIÓN
Técnicas Bacteriológicas Básicas
La inoculación de medios de cultivo y la manipulación de cultivos microbianos en el

laboratorio de microbiología son procedimientos que deben realizarse siguiendo una serie de
pasos para evitar la contaminación del material con que estamos trabajando, ya sea con el
ambiente o con el operador. Esta serie de pasos se conoce como técnica aséptica o técnicas
bacteriológicas básicas.
31
MANUAL PRÁCTICO DE
1. Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa de
trabajo, ni en la bata. Al acabar la práctica, coloca la gradilla con los tubos en la
incubadora a 37 °C hasta que lo indique el profesor.
2. Rotular el tubo con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del alumno.
3. Flamear el asa en el mechero la cual se sostiene con la mano dominante, como

sosteniendo un lápiz o una pluma. Dejar que el alambre se ponga al rojo vivo. Dejar
enfriar el asa unos breves segundos.
4. Tomar una colonia con el asa de la caja de petri que contiene el aislamiento bacteriano.
5. Sostener el tubo con la mano no dominante. Si el tubo tienen un tapón en rosca, aflójalo
de manera que solo se necesite levantarlo para quitarlo. Si tiene un tapón de algodón,
sácalo un poco de manera que no esté muy apretado.
6. Retirar la tapa del tubo con el dedo meñique, mientras sostiene el asa. Nunca poner las
tapas sobre la mesa.
7. Flamear la boca del tubo para eliminar cualquier microorganismo presente en el aire que
pueda contaminar la parte superior del tubo durante las manipulaciones.
8. Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de
contaminación sea mínimo.
9. Sembrar en el tubo estéril que contiene el medio de cultivo un poco de inóculo. En el caso
de los caldos únicamente inserta el asa en el medio y agitela. En el caso del agar
inclinado,hacer una puncion en el medio y dibuja con el asa un “zig zag” en la superficie
del agar.
10. De nuevo flamee la boca del tubos y tápelos de nuevo.
MATERIALES Y EQUIPOS
 2 Cajas con medios de cultivo (Agar sangre,MC Conkey, Agar Nutritivo)
 1 Tubo con medio inclinado
 1 Tubos con medio liquido
 Caja con cultivo bacteriano
32
MANUAL PRÁCTICO DE
 Tubo con cultivo bacteriano
 Asas de siembra rectas
 Asas de siembra curvas
 Láminas portaobjetos
 Guantes, bata, encendedor*
PROCEDIMIENTO
Inoculación en tubos
1. Transferir de medio líquido a medio líquido: Transferir asépticamente, con el asa de

siembra, una pequeña muestra del microorganismo, desde el tubo que contiene el
material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y
agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en
incubadora, durante 24 horas a la temperatura óptima de crecimiento.
2. Transferir de medio solido a medio sólido (agar inclinado): Con el asa de siembra recta
estéril tomar los microorganismos de la muestra e introducir el asa hasta la mitad del
33
MANUAL PRÁCTICO DE
tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo

y va avanzando hacia la parte superior por el área inclinada. Incubar durante 24-48 horas
a la temperatura óptima de crecimiento.
3. Transferir de medio sólido a medio semisólido (siembra vertical o por picadura): La

siembra en este tipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los
medios sólidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un asa de siembra recta
esterilizada, con el cual se toma un par de colonias del aislamiento. El medio queda
inoculado al introducir el asa en profundidad de manera vertical hasta la mitad del medio
retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la inoculación.
Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de
crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana.
Interpretación
 Crecimiento en medio líquido: se evidencia por un cambio en el medio como turbidez,

sedimentación, presencia de una película.
34
MANUAL PRÁCTICO DE
 Crecimiento en medio semisólido: se evidencia en la movilidad de la bacteria.
 Crecimiento en medio solido: se evidencia por la presencia de colonias en la superficie

del medio.
OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como

poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos,
necesitamos tenerlos como cultivos puros. Un cultivo puro es aquel en el que todos los
microorganismos provienen de una sola célula.
Siembra en cajas de petri
1. Siembra por agotamiento o estria
 Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toman de 2 a 3 colonias del

cultivo y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar
nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no quebrar el
agar.
 Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se

extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se
repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas
siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en
posición invertida. (Ver figura).
 Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que
contenga un elevado número de gérmenes.
35
MANUAL PRÁCTICO DE
2. Siembra masiva
 Consiste en distribuir de manera uniforme por la superficie del medio de cultivo la

muestra a estudiar, esto se puede realizar con el asa de Drigalsky, el escobillon, y el
asa calibrada. Este metodo se utiliza para obtener un gran numero de
microorganismos, y para realizar recuento de colonias y antibiogramas.
3. Morfología de las colonias en medio sólido
Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo sólidos, las células aisladas
se multiplican sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de
colonia, las características de estas colonias son estudiadas y se usan en la identificación de
las especies. Las características que se estudian son: forma, borde, elevación y superficie
36
MANUAL PRÁCTICO DE
RESULTADOS
1. Dibuje y describa la morfología de las colonias en el medio de cultivo:

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
REFERENCIAS
37
MANUAL PRÁCTICO DE
- Pedrique de Aulacio, M, Gutiérrez. Microbiología .Manual de métodos generales.

Facultad de farmacia universidad central de Venezuela.2001
- Guía práctica de microbiología e inmunología. Universidad Complutense de Madrid.

Departamento de microbiología.2010.
PRACTICA No 5
MANEJO DEL MICROSCÓPIO
OBJETIVOS
 Reconocer las partes y funciones del microscopio.
 Visualizar estructuras celulares, aplicando recomendaciones propias al uso de las partes

de microscopio.
INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento que nos permite observar estructuras que a simple vista el
ojo humano no puede ver. El estudio de los diferentes microorganismos llámense bacterias,
virus, hongos o parásitos hace inminente el uso de este aparato, para su identificación y para
el conocimiento de las características morfológicas propias de cada uno, además de aquellas
que nos permiten establecer diferencias. Generalmente un microscopio requiere los
siguientes elementos: una fuente luz proveedora de fotones o de electrones, cuyos haces
son enfocados por el condensador, una muestra a la que se aplica la incidencia de la fuente
de luz y el receptor que captura la información en forma de imagen resultado de la
interacción entre la fuente y la muestra.
PARTES DEL MICROSCOPIO
38
MANUAL PRÁCTICO DE
El microscopio óptico consta de tres componentes fundamentales que son: el sistema

mecánico, el sistema óptico, y el sistema de iluminación.
Sistema mecánico
Pie o base: es la parte más sobresaliente del microscopio pues cumple la función de dar
estabilidad.
Brazo o soporte vertical: Parte por medio de la cual debe sostener el microscopio para
transportarlo de un lugar a otro.
Tornillo Macrométrico: Son dos estructuras circulares que se localizan lateralmente y sirven
para dar un enfoque grueso de la preparación.
Tornillo Micrométrico: Son estructuras circulares pequeñas que generalmente se

desprenden del macrométrico y tiene como finalidad proveer el enfoque fino de la
preparación.
Platina: superficie plana metálica en la que se coloca la preparación tiene unas pinzas con las
cuales se sujeta lámina.
Carro mecánico: Sistema de dos pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para
desplazar la muestra mediante una serie de perillas ubicadas en el costado de la platina.
Sistema óptico
Objetivos: son los lentes situados cerca de la muestra, pueden ser cuatro de diferentes
aumentos, generalmente son de 4X, 10X, 40X y 100X. Existen dos tipos de objetivos los secos
y el de inmersión; los objetivos secos son los de aumento débil o mediano como los objetivos
de 4X, 10X, 40X, mientras que el objetivo de inmersión es el de mayor aumento (100X) y para
su uso requiere aceite de inmersión.
39
MANUAL PRÁCTICO DE
Normalmente los objetivos tienen información escrita sobre diversas características propias
de cada uno de ellos como muestra la siguiente figura.
Tomado de: Rojas Triviño, A. Conceptos y prácticas de microbiología general.
E: es la referencia de fábrica que identifica estos objetivos en particular.
A: significa que estos objetivos son acromáticos, es decir, que vienen corregidos para ciertas
longitudes de onda, con el fin que coincidan en el mismo plano y que de este modo la imagen
obtenida tenga mejor definición.
Apertura numérica: es la capacidad que tiene el objetivo para recibir el cono de luz que pasa
a través de la muestra, procedente de la fuente de luz. La apertura numérica es directamente
proporcional al índice de refracción del medio en que se propaga la luz (agua, aire, vidrio,
aceite de inmersión), pues mientras mayor sea el índice de refracción, mayor será el cono de
luz, lo cual origina un mayor poder de resolución.
Longitud mecánica del tubo: es la distancia que hay en entre la parte inferior del objetivo y
los oculares. Está indicada en los objetivos y generalmente tiene un valor de 160 milímetros,
observe como al lado de este número, separados
40
MANUAL PRÁCTICO DE
lentes pueden usarse para observar muestras sin que sea estrictamente necesario el uso de
cubreobjetos; y la cifra indica que es necesario utilizar un cubreobjetos de 17 mm de espesor.
Aumento: cada objetivo tiene un número específico (4, 10, 40, 100) que indica cuantas veces
se aumenta la imagen del objeto observado. En microscopia se utiliza la letra X para indicar
“veces” y por eso se acostumbra, al referirse a un aumento particular.
Oculares: son un sistema de lentes cuya función es aumentar la imagen real proyectada por
el objetivo tantas veces indique el numero inscrito en ellos.
Sistema de iluminación
Fuente de luz: proporciona la luz necesaria para la observación de la muestra. Puede ser una
bombilla o un espejo orientable.
Diafragma: es una estructura que permite regular manualmente el paso de la luz según la
necesidad.
El condensador: Consta de un sistema de lentes colocados bajo la platina. Su función es

condensar el haz de rayos luminosos, permitiendo una iluminación uniforme del campo
microscópico. Se acciona por medio de un tornillo, el cual permite graduar la intensidad.
RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO
1. No tocar los lentes, su limpieza debe realizarse con un material suave y que no libere
fibras, lo más adecuado es utilizar papel de arroz.
2. Retirar las muestras de la platina y limpiarla, con una gasa húmeda impregnada con
agua destilada.
3. Limpiar siempre el objetivo de inmersión después de usarlo con papel de arroz.
41
MANUAL PRÁCTICO DE
4. Cuando el microscopio no esté en uso este debe cubrirse con un forro para
protegerlo del polvo.
5. No forzar el microscopio si surge algún percance comunique al técnico de laboratorio.
6. Protegerlo de elementos cortopunzantes.
PROCEDIMIENTO
1. Identifique las partes del microscopio y señálelas en el siguiente esquema.
MICROSCOPIO OLYMPUS CX 41
42
MANUAL PRÁCTICO DE
www.olympuslatinoamerica.com
REFERENCIAS
Rojas Triviño, A. Conceptos y prácticas de microbiología general. Universidad nacional de

Colombia. Sede Palmira, 2011.
43
MANUAL PRÁCTICO DE
Sanabria Gómez, Janet; Acevedo, Danny. Manual de laboratorio microbiología. Curso de

microbiología Ambiental. Universidad del valle.2001
PRÁCTICA No. 6
COLORACIONES ESPECIALES: GRAM, ESPORAS Y CÁPSULA
OBJETIVOS
 Conocer los fundamentos de las coloraciones especiales y su utilidad.
 Diferenciar una bacteria Gram positiva de una Gram negativa a partir de coloraciones.
 Identificar las diferentes morfologías bacterianas.
 Observar la morfología bacteriana y distinguir sus diversas agrupaciones.
PRELABORATORIO
1. ¿Qué son coloraciones positivas y coloraciones negativas?
44
MANUAL PRÁCTICO DE
2. ¿Enuncie cinco microorganismos por cada morfología (cocos, bacilos, espirales,

cocobacilos)
- -
- -
Cocos - Cocobacilos -
- -
- -
- -
- -
Bacilo
- Espirales -
s
- -
- -
3. ¿Mencione 5 microorganismos que tengan la capacidad de desarrollar esporas?
-
-
-
-
-
4. ¿Por qué las esporas son más resistentes a las condiciones ambientales?
45
MANUAL PRÁCTICO DE
5. ¿Mencione 3 microorganismos que posean capsula?
-
-
-
INTRODUCCIÓN
Debido a que las bacterias y otros microorganismos poseen un índice de refracción cercano
al del agua, se requiere de tinciones biológicas para visualizar su morfología y mostrar los
detalles de su estructura.
Tipos de colorantes
En las tinciones utilizamos colorantes que son sales compuestas de un ión positivo y ión
negativo, el ión colorido recibe el nombre de cromóforo; así, tenemos tres tipos de
colorantes:
Básicos (cationicos): El ión colorido (cromóforo) es positivo (catión colorido y anión

incoloro). Tiñen componentes ácidos
Ácidos (aniónicos): El ión colorido (cromóforo) es negativo (anión colorido y catión
incoloro). Tiñen componentes básicos.
Neutros: Sal compuesta de un colorante ácido y un colorante básico.
Tinciones
De acuerdo a los fines para los que son utilizadas y los tipos de colorantes empleados, las
tinciones pueden dividirse en varios grupos:
46
MANUAL PRÁCTICO DE
Tinción simple: Se hacen empleando un solo colorante y se usan por lo general sólo para
resaltar las características morfológicas más marcadas de la célula bacteriana; el valor de esta
clase de tinción es su simplicidad y facilidad de empleo.
Tinción diferencial: Se usan dos o más colorantes y uno de ellos sirve de contraste. Se
denominan diferenciales porque discriminan ciertas características y permiten agrupar a los
microorganismos; ejemplos: Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen. Una de las
coloraciones más importantes es la tinción de Gram, la cual separa las bacterias en dos
grupos, Gram positivos y Gram negativos. La técnica se basa en la decoloración del cristal
violeta por alcohol-acetona y un posterior contraste con safranina
Tinción especial: Se usa para resaltar características o estructuras específicas; gránulos
metacromáticos, cápsulas, flagelos, esporas.
MATERIALES
 Guantes, tapabocas, encendedor*
 Tinta china de color negro*
 Láminas portaobjeto
 Solución salina estéril
 Colorantes para la coloración de Gram, esporas, cápsula
 Cultivos bacterianos de gérmenes Gram positivos y Gram negativos, gérmenes

esporulados y gérmenes productores de cápsula.
 Aceite de inmersión
 Asas bacteriológicas
PROCEDIMIENTO
Tinción de Gram
Es una coloración diferencial positiva, siendo la tinción bacteriana más utilizada ya que
permite la clasificación de las bacterias Gram positivas teñidas de azul violeta y Gram
negativas teñidas de rosado o fucsia.
47
MANUAL PRÁCTICO DE
Composición:
- Cristal violeta: colorante primario o básico que se une a la pared celular bacteriana (color
azul o violeta).
- Lugol: solución de yodo, utilizado como mordiente, el cual facilita la adhesión del cristal
violeta a la pared celular.
- Alcohol-acetona: decolorante.
- Safranina o fucsina de Gram: colorante secundario, que imparte una coloración de contraste
(color rojo o rosado).
Fundamento de la tinción de Gram: se basa en una diferencia de permeabilidad y

composición entre las paredes celulares de los organismos Gram positivos y Gram negativos.
El yodo forma con el cristal violeta un barniz que se une al protoplasto. Este barniz no es
soluble en agua, pero si en alcohol acetona. En la decoloración la pared de las bacterias Gram
positivas no permite la salida del colorante mientras que si sucede esto con las Gram
negativas. Los microorganismos Gram negativos quedan sin teñir después de lavar con
alcohol y se tiñen de rojo con el colorante de contraste, la fucsina, mientras que las Gram
positivas mantienen el cristal violeta.
Técnica de la tinción de Gram*
 Preparar un frotis del material en estudio y dejar secar al aire. Flamearlo en el mechero
para fijar el material.
 Colocar el preparado sobre un puente de tinción.
 Cubrir la superficie de la lámina con solución de cristal violeta durante un (1) minuto.
Lavar la lámina con agua destilada.
 Agregar lugol sobre el frotis fijado y esperar un (1) minuto. Transcurrido el tiempo, lavar
con agua destilada.
 Agregar alcohol acetona sobre el frotis fijado y esperar 20 segundos. Lavar con agua
destilada.
 Adicionar sobre el frotis fijado safranina o fucsina de Gram y esperar 30 segundos. Lavar
con agua destilada
48
MANUAL PRÁCTICO DE
 Colocar la lámina en posición vertical, dejando que se seque el extendido.

 Observar la lámina coloreada al microscopio con objetivo de inmersión 100X, agregando
una gota de aceite de inmersión.
Nota: Los tiempos de coloración pueden variar dependiendo de la casa comercial de los
reactivos utilizados.
MORFOLOGÍA Y AGRUPACIONES BACTERIANAS
Los microorganismos especialmente las bacterias son estudiadas a nivel microscópico para
identificar en ellas su forma, su tamaño, agrupación, la presencia de estructuras como pared
celular, cápsulas, esporas, gránulos y su comportamiento tintorial. El conocimiento de las
Bacterias como microorganismos causantes de diferentes patologías a nivel humano, animal,
vegetal, ambiental o industrial, debe comenzar por el estudio de su morfología o estructura.
Formas bacterianas
Tienen forma esférica, la división celular da

Cocos lugar a una distribución característica de las
células hijas.
Bacilos Bacterias cilíndricas en forma de varilla.
Se presentan como bacilos curvos en forma

Vibrio
de coma.
Morfología intermedia entre cocos y bacilos

Cocobacilos
Son bacterias flageladas de forma helicoidal

Espirilos
o espiral.
49
MANUAL PRÁCTICO DE
Espiroquetas Presentan forma de sacacorchos.
Agrupaciones bacterianas
Agrupaciones de cocos Agrupaciones de bacilos
COLORACIÓN DE ESPORAS
Las endosporas son formas de resistencia que desarrollan ciertos bacilos y cocos Gram
positivos. Algunas especies de bacterias cuando se encuentran en ambientes adversos son
50
MANUAL PRÁCTICO DE
capaces de transformarse en células especiales de alta resistencia, llamadas endosporas o

esporas. Estas formas soportan los efectos bactericidas del calor, radiaciones, congelación,
desecación y ciertos productos tóxicos (desinfectantes). Pueden permanecer en estado
latente durante largos períodos de tiempo. Desde el punto de vista clínico se destacan dos
géneros bacterianos productores de endosporas: Bacillus y Clostridium.
Técnica de coloración de esporas: Schaffer Fulton.
 Prepare una lámina y fije el extendido con calor. Cubra la lámina con verde de malaquita
al 5% (solución acuosa)
 Caliente sobre la llama hasta que se produzcan vapores por 30 segundos, durante 3-5
minutos.
 Lave con agua
 Cubra la extensión con una solución de safranina al 0.5% durante 30 segundos.
 Lave con agua.
 Deje secar al ambiente y observe al microscopio.
 Las esporas se observan en forma de esferas verdes libres o en el interior de los bacilos
coloreados de rojo.
51
MANUAL PRÁCTICO DE
TÉCNICA DE COLORACIÓN DE LA CÁPSULA
La cápsula se define como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus
ambientes naturales, consiste en acumulación de material mucoso o viscoso, situado
externamente respecto de la pared celular (o en su caso, respecto de la capa S y de la vaina).
Las cápsulas se pueden describir en función de: su grado de asociación con la superficie
celular adyacente (pared), su consistencia y sus límites externos.
52
MANUAL PRÁCTICO DE
Se considera un importante factor de virulencia al permitir la evasión de la fagocitosis. Es

característica de algunos microorganismos como Streptococcus pneumoniae, Klebsiella
pneumoniae.
Tinta china
Es una técnica de tinción negativa que incorpora una sustancia como la tinta china que está
compuesta por partículas grandes que le impiden penetrar a la célula bacteriana. Al adicionar
la safranina, ésta penetra en la bacteria y el resultado es la visualización de la cápsula como
una zona clara alrededor de la pared.
 Sobre un portaobjetos y con el asa bacteriológica mezclar una gota de tinta china y una
muestra de la suspensión bacteriana.
 Hacer una extensión de este material con otra lámina de vidrio, suavemente (similar al
frotis de sangre).
Tomado de: Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general.
Universidad autónoma metropolitana.
 Dejar secar a temperatura ambiente y fijar al calor.

 Cubrir la preparación con cristal violeta durante 1 minuto.
53
MANUAL PRÁCTICO DE
 Lavar la preparación con agua corriente y dejar secar al aire.
Las cápsulas se observan como un halo claro translúcido sobre un fondo negro y la bacteria
de color violeta.
RESULTADOS

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. Describa y dibuje la morfología, tinción y agrupación observada en la tinción de Gram

(objetivo de 100X)
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
54
MANUAL PRÁCTICO DE
3. Dibuje el resultado de la coloración de esporas y señale las esporas. (Objetivo 100X)
4. Dibuje el resultado de la coloración de capsula, señale la capsula (Objetivo 100X)
55
MANUAL PRÁCTICO DE
56
MANUAL PRÁCTICO DE
REFERENCIAS
- T Stuart Walker. Mc Graw Hill. México-2000. Editores SA- Microbiología

- Murray Patric 2ª Edicición. 1993. Harcourt Brace-Microbiología Médica
- B.A Freeman. Microbiología Burrows. Interamericana Mc Graw Hill. México 1997
- Aquiahuatl María, Pérez María. Manual de prácticas de laboratorio de microbiología
general. Universidad autónoma metropolitana. Departamento de biotecnología.
Mexico.2004
- Coloración BK.IHR Diagnostica.2007
- Rodríguez Cavallini, Evelyn / Gamboa Coronado, María del Mar / Hernández Chavarria,
Francisco / García Hidalgo, Jorge Danilo Bacteriología General: Principios Y Prácticas
de Laboratorio. EDITORIAL: EUCR. ISBN: 9977-67-980-0. 2005 - 475 páginas
PRACTICA No 7
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS
OBJETIVOS
 Aislar e identificar bactérias pertencentes al grupo de los cocos Gram positivos.
 Conocer las características microbiológicas generales de los géneros Staphylococcus y

Streptococcus.
INTRODUCCIÓN
Dentro de los microorganismos correspondientes a los grupos de cocos aerobios o

anaerobios facultativos pertenecen a un amplio grupo con características metabólicas,
bioquímicas y genéticas más o menos diferentes, aunque taxonómicamente se estudian de
forma conjunta debido a que dichos grupos de microorganismos presentan morfología
idéntica tipo cocoidea y necesitan la presencia de medios aerobios.
57
MANUAL PRÁCTICO DE
En la tinción de Gram presentan una coloración azul violácea debido a que el colorante que
los tiñe es Cristal Violeta, a esta característica pertenecen los géneros:
 Staphylococcus.
 Streptococcus.
 Enterococcus.
Género Staphylococcus.
Corresponde a cocos Gram positivos inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, no

formadores de esporas y de tamaño entre 0,5 y 2 micrómetros. Se agrupan en forma de
racimo, producen catalasa en su metabolismo y degradan por fermentación los azucares.
Crecen bien en medios generales y son bastante resistentes a muchos agentes externos; de
ahí su amplia distribución en la naturaleza. Es frecuente que formen parte de la flora normal
de las mucosas y de la piel; y son además responsables de procesos infecciosos, tales como
intoxicaciones alimentarías, heridas y otros procesos patógenos.
Dentro del género Staphylococcus, se pueden distinguir las siguientes especies:
- Staphylococcus aureus.
- Staphylococcus epidermidis.
- Staphylococcus saprophyticus.
- Staphylococcus haemolyticus.
S. aureus se considera la especie más patógena, agente etiológico de muchas infecciones.
También es conocido como estafilococo dorado por el pigmento no difusible de color
amarillo que forma. Bioquímicamente produce coagulasa y fermenta el manitol.
S. epidermides y S. saprophyticus son estafilococos oportunistas, encontrándose
frecuentemente en el medio ambiente, en la piel y mucosas, ocasionando solo en situaciones
de debilidad por parte del paciente, casos de patogenicidad. No producen toxinas, no
58
MANUAL PRÁCTICO DE
producen coagulasa, no fermentan el manitol y no forman el pigmento amarillo

característico de S. aureus
Género Streptococcus
Corresponden a cocos Gram positivos, de tamaño relativamente pequeño (1 – 1,5

micrómetros de diámetro), anaerobios facultativos y que se disponen en pares y sobre todo
en cadenas. Son catalasa y oxidasa negativa y fermentan la glucosa con la producción
consiguiente de ácidos. Muchas especies este género son saprofitos para el hombre, otros
son oportunistas y algunos patógenos.
Para clasificar al género Streptococcus se tienen en cuenta varias consideraciones, siendo una
de ellas la capacidad que tienen de producir hemólisis alrededor de sus colonias en medio
agar sangre o agar chocolate. Esto debido a la presencia de las hemolisinas que son enzimas
que lisan los hematíes; de acuerdo a esto tenemos:
 Gamma hemolítico: son llamados estreptococos no hemolíticos, ya que no van a

producir ningún tipo de modificación en la periferia de sus colonias. No producen
hemólisis.
 Alfa hemolíticos: Son estreptococos tipo viridans y corresponden a aquellos que van a
producir una hemólisis parcial en torno a la colonia (coloración parda – verdosa).
 Beta hemolítico: Son llamados estreptococos hemolíticos y van a corresponder a

aquellos que producirán una destrucción total de los glóbulos rojos próximos a su
colonia, produciendo halos de transparencia generalmente grandes en torno a su
colonia.
Otras características a tener en cuenta son: Caracteres antigénicos y comportamiento

antigénico frente a diversas pruebas serológicas. El resultado de todo esto es la clasificación
en tres importantes grupos:
59
MANUAL PRÁCTICO DE
 Streptococcus Beta hemolíticos, que corresponden a los grupos A, B, C, G y F.
 Streptococcus correspondientes al grupo D enterococo, que pueden ser Alfa, Beta

y Gamma hemolíticos y grupo D no enterococo.
 Streptococcus tipo Viridans.
MATERIALES
 Guantes, bata, tapabocas. * (por estudiante).
 Marcador de vidrio, encendedor* (por grupo de trabajo).
 Agar sangre.
 Cultivos bacterianos en agar nutritivo.
 Asas rectas y calibradas.
 Portaobjetos.
 Plasma sanguíneo.
 Peróxido de Hidrogeno.
 Tubos de ensayo.
 Hipoclorito de Sodio.
 Incubadora.
 Mecheros
PROCEDIMIENTO
60
MANUAL PRÁCTICO DE
1. Aislamiento e identificación de cocos Gram-positivos
Del cultivo bacteriano en agar nutritivo, tome una asada de una colonia aislada y deposite la
muestra en el extremo de una placa de agar sangre. Extienda el inóculo con un asa por
agotamiento (estrías, figura 1). Incube a 37º C por 24 horas. Al hacer la lectura determine en la
placa sembrada si se produjo hemólisis y de que tipo.
Figura 1. Siembra por agotamiento (estrías)
2. Prueba de la Catalasa.
Fundamento: determinar la capacidad que tienen algunas bacterias para degradar el

peróxido de hidrógeno, uno de los agentes oxidantes producidos como consecuencia de
determinadas reacciones metabólicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima
encargada de degradar este producto es la catalasa y aparece en casi todos los
microorganismos aerobios obligados o facultativos.
2H2O2 ==========> 2H2O + O2
61
MANUAL PRÁCTICO DE
Esta prueba se utiliza para diferenciar entre otros, los siguientes géneros: Streptococcus
(catalasa -) de Staphylococcus (catalasa +).
La prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente se hace de la siguiente manera:
Método del portaobjetos:
 Con el asa de siembra recoger del cultivo en agar nutritivo una colonia pura de 18-24
horas de crecimiento.
 colocarla sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
 Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de peróxido de hidrogeno (H2O2) al
30% sobre la colonia sin mezclarlo.
 Observar la formación inmediata de burbujas.
 Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Nota: tenga cuidado de no invertir el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) ya que pueden producirse falsos positivos.
Resultados
Positivo: aparición de burbujas de O2
Negativo: No formación de burbujas de O2
3. Prueba de la Coagulasa.
Fundamento: La coagulasa es un enzima capaz de activar la protrombina, lo que va a acelerar

el paso del fibrinógeno a fibrina, coagulando de esta forma el plasma sanguíneo. Esta prueba
se utiliza para diferenciar microorganismos las especies del género Staphylococcus:
Staphylococcus aureus: coagulasa positiva.

Staphylococcus epidermides, Staphylococcus saprophyticus, entre otros: coagulasa negativa.
62
MANUAL PRÁCTICO DE
La prueba de rutina de la coagulasa se hace siguiendo el siguiente método:
- Con el asa estéril obtenga una colonia bien aislada del agar nutritivo.
- Añadalas a un tubo pequeño con 1 cc de plasma sanguíneo.
- Incube a 37 °C y observé la coagulación entre las 4 y 24 horas posteriores.
Interpretación
Positivo: coagulación del plasma.
Negativo: No hay coagulación del plasma.
RESULTADOS

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. Describa y dibuje la morfología, tinción y agrupación observada en la tinción de Gram en

el objetivo de 100X
63
MANUAL PRÁCTICO DE
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
3. Resultado de la prueba de la Catalasa:

___________________________________________
4. Resultado de la prueba de la coagulasa: _________________________________________
64
MANUAL PRÁCTICO DE
5. De acuerdo a los resultados obtenidos en la practica de laboratorio, el microorganismo

identificado corresponde a: ___________________________________________________
POSTLABORATORIO
1. ¿Qué prueba se llevaría a cabo para diferenciar un Staphylococcus de un Streptococcus?
2. Dibuje el cuerpo Humano y señale en que partes del cuerpo es frecuente encontrar
Staphylococcus aureus.
65
MANUAL PRÁCTICO DE
3. Mencione 5 medios de cultivo en los cuales Staphylococcus aureus es capaz de crecer.

-
66
MANUAL PRÁCTICO DE
4. Dibuje los tipos de hemolisis que producen los streptococos y explique en qué consiste
cada una de ellas.
67
MANUAL PRÁCTICO DE
REFERENCIAS
- T Stuart Walter. Mac Graw Hill. México – 2000. Editores SA – Microbiología.

- Murray Patric. 2ª Edición. 1993. Harcourt Brace – Microbiología Médica.
- B.A Freeman. Microbiología Burrows. Interamericana Mac Graw Hill. México
PRACTICA N° 8
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
OBJETIVOS
 Desarrollar técnicas de aislamiento e identificación para Enterobacterias.
 Conocer y aplicar la utilidad de las pruebas bioquímicas para la identificación de

microorganismos
 Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas.
 Interpretar clínicamente los resultados arrojados por las pruebas bioquímicas
PRELABORATRORIO
1. ¿Mencione dos sistemas de identificación rápida?
68
MANUAL PRÁCTICO DE
2. Exponga ventajas y desventajas de la utilización de los sistemas rápidos de

identificación.
Ventajas Desventajas
3. Complete la tabla con los componentes de los medios selectivos y diferenciales para
enterobacterias.
Sustancias
Medio de cultivo Carbohidratos Indicador de pH
selectivas
Agar MacConkey
Agar EMB
(Eosina, Azul de metileno)
Agar SS
(Salmonella-Shiguella)
Agar Hektoen
69
MANUAL PRÁCTICO DE
4. Mencione dos especies por cada genero de Enterobacterias
Genero Especies
-
Klebsiella
-
-
Proteus
-
-
Salmonella
-
-
Shiguella
-
-
Yersinia
-
-
Enterobacter
-
-
Citrobacter
-
-
Vibrio
-
-
Morganella
-
INTRODUCCIÓN
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, anaerobios

facultativos que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo oxidasa negativos; reducen
los nitratos a nitritos. Algunas de estas bacterias son móviles, en cuyo caso utilizan como
70
MANUAL PRÁCTICO DE
estructura de movilidad flagelos perítricos. Son llamadas Enterobacterias porque con

frecuencia residen en el aparato digestivo de animales y humanos, pero algunas especies
también viven en la tierra y en el agua. Incluye los géneros Escherichia, Shigella, Edwardsiella,
Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Morganella, Proteus,
Providencia, Yersinia, Erwinia y Pantoea. La mayoría forman parte de la flora normal o son
bacterias ambientales, a excepción de los géneros Salmonella, Shigella y Yersinia, quienes son
causantes de infecciones gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces, es
muy probable que estén causando alteraciones fisiopatológicas.
Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estéril, producen

enfermedades como neumonía, infecciones de vías urinarias, septicemia, infecciones
neonatales, infecciones de heridas y de cirugías. Se comportan como patógenos
oportunistas sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.
La identificación de las Enterobacterias se basa principalmente en la presencia o ausencia de

diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Los
sustratos con los cuales pueden reaccionar estas enzimas se incorporan al medio de cultivo
junto con indicadores que detectan la utilización del sustrato o la presencia de productos
metabólicos específicos, estableciéndose así un perfil bioquímico para hacer la identificación
de la especie. Por tanto, los medios de cultivos deben satisfacer las exigencias de
crecimiento de cada microorganismo.
MATERIALES
 Bata*
 Guantes *
 Tapabocas*
 Encendedor*
 Marcador de vidrio (por grupo de trabajo). *
 Papel filtro.
 Cultivos de Enterobacterias.
 Portaobjetos.
 Asas calibradas y rectas.
71
MANUAL PRÁCTICO DE
 Pipetas de pasteur.
 Tubos de ensayo.
 Gradillas.
 Medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, Citrato, RMVP.
 Reactivo de kovacs.
 Incubadora.
PROCEDIMIENTO
1. Agar TSI (agar Triple azúcar hierro)
Siembre el agar TSI con asa recta haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y
estrías en la superficie.
Principio: en el agar TSI se determina la capacidad de un microorganismo para hidrolizar los

hidratos de carbono Glucosa, lactosa y sacarosa, la producción de gases y la producción de
ácido sulfhídrico (H2S).
Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Se hace la lectura como un
quebrado, la reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte
aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador
(parte anaerobia) la acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la
letra K (color rojo).
72
MANUAL PRÁCTICO DE
Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

Fermentación de la glucosa (K/A).
Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (A/A).
No fermentación de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza hidratos de carbono,
produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio. Algunas bacterias no
fermentadoras solamente atacan la peptona aeróbicamente dando un TSI (K/N), es decir que
no hay cambio en el fondo del tubo.
Producción de gas: ruptura del medio
Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.
2. Agar LIA (agar Lisina Hierro)
Sembrar con asa recta haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y estría en la
superficie.
Principio: En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes

para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El
citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color
amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
73
MANUAL PRÁCTICO DE
Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y

esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar
en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de
la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs
de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el
fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno se visualiza por el ennegrecimiento
del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la
lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37 ° C .se lee un quebrado, la

reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la
reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte
anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K
(color purpura).
Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
Fermentación de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca aminoácidos solo fermenta la glucosa.
Descarboxilación de la lisina:
Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo.
Producción de gas: ruptura del medio

Producción de H2S: ennegrecimiento del medio
3. Agar citrato de Simmons
74
MANUAL PRÁCTICO DE
superficie.
Principio: se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como única

fuente de carbono en ausencia de fermentación de azucares o de producción de ácido
láctico.
Lectura: se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.
Interpretación:
La prueba es positiva cuando el medio se alcaliniza y vira a un color azul.
La prueba es negativa cuando no hay cambio de color.
4. Agar urea
superficie.
75
MANUAL PRÁCTICO DE
Principio: el agar urea se determina la capacidad de un microorganismo para producir ureasa

y desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoniaco.
Lectura: se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.
Interpretación: la prueba es positiva si el medio vira a un color fucsia que indica la

alcalinización del medio.
La prueba es negativa si el medio se torna amarillo.
5. Agar SIM (Sulfuro, indol, motilidad)
Sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo.
76
MANUAL PRÁCTICO DE
Principio: determina la capacidad de un microorganismo de moverse (presencia de flagelos),

de producir INDOL y producir H2S.
Lectura: se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Primero se debe realizar la lectura

de la movilidad (Observando la presencia o no de turbidez) y luego adicionar 2 o 3 gotas del
reactivo de Kovacs para detectar la producción de indol.
Interpretación: La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen

macroscópico del medio para observar crecimiento alrededor de la línea de siembra.
El indol se observa al desarrollarse un anillo de color rojo después de agregar el reactivo de
Kovacs lo que indica una prueba positiva.
La producción de H2S se evidencia por el ennegrecimiento del medio.
6. Caldo Rojo de Metilo Vogues Proskauer (MR-VP)
Para la realización de estas dos pruebas se debe Inocular el tubo de caldo MRVP agitando
suavemente el asa curva y se incuba a 37 °C durante 24 Horas. Al revelar las pruebas, se
separa el cultivo en dos porciones que servirán, para cada uno de los ensayos. Uno para
hacer la prueba con rojo de metilo y otro para hacer la prueba de Vogues Proskauer.
77
MANUAL PRÁCTICO DE
Principio de la prueba de Rojo de Metilo: Determinar la habilidad de las bacterias para

producir ácidos estables por fermentación de la glucosa. La bacteria puede fermentar la
glucosa por la vía acido mixta con producción de metabolitos como ácido láctico, fórmico y
succínico, los cuales van a hacer descender el pH inicial lo cual se visualiza al agregar el
indicador de pH rojo de metilo, el cual a pH acido vira a un color rojo.
Principio de la prueba de Vogues Proskauer: Determinar la capacidad de producir acetoína a

partir de la fermentación de la glucosa por la vía butilen glicólica.
Lectura:
Rojo de metilo: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.agregar 10 gotas de
rojo de metilo al tubo MR, la aparición de un color rojo indica que la prueba es positiva para
MR, la aparición de un color amarillo indica que la prueba es negativa.
Vogues Proskauer: al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de alfa naftol,
mezclar fuerte después de la adición década reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparición
de un color rojo indica una prueba de VP positiva, la aparición de un color amarillo o café
indica una prueba de VP negativa.
RESULTADOS
1. Dibuje y describa la morfología de las colonias en el medio de cultivo MacConkey:

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
78
MANUAL PRÁCTICO DE
2. Describa y dibuje la morfología, tinción y agrupación observada en la tinción de Gram en

el objetivo de 100X
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
3. Dibuje y describa los resultados obtenidos en cada una de las pruebas bioquímicas,
realizadas en la práctica.
 Agar TSI: _______________________________________________________________
79
MANUAL PRÁCTICO DE
 Agar LIA: _______________________________________________________________
 Agar citrato de Simmons:

__________________________________________________
80
MANUAL PRÁCTICO DE
 Agar urea: ______________________________________________________________
 Agar SIM: _______________________________________________________________
 Rojo de Metilo – Vogues Proskauer: ________________________________________

_____________________________________________________________________________
81
MANUAL PRÁCTICO DE
4. De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas. ¿Cuál es el

microorganismo identificado? Ver anexo 3. (Tabla de identificación para enterobacterias)
_____________________________________________________________________________
REFERENCIAS
- T Stuart Walter. Mac Graw Hill. México – 2000. Editores SA – Microbiología.

- Murray Patric. 2ª Edición. 1993. Harcourt Brace – Microbiología Médica.
- B.A Freeman. Microbiología Burrows. Interamericana Mac Graw Hill. México 1997.
- María Piedad Sánchez. Manual de Procedimientos en Bacteriología Clínica. Biobacter
Ltda. 5ª. Edición 19
82
MANUAL PRÁCTICO DE
PRACTICA N°9
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS
OBJETIVO
 Evaluar la actividad antimicrobiana de los antibióticos mediante la técnica de Kirby-

Bauer.
PRELABORATORIO
1. Mencione mínimo tres variables que pueden afectar la exactitud y fiabilidad de los
resultados de un antibiograma.
83
MANUAL PRÁCTICO DE
2. ¿Qué es una cepa ATCC?
3. ¿Qué otros métodos se utilizan para determinar la susceptibilidad antimicrobiana?
4. ¿En qué casos debe solicitarse un antibiograma?
84
MANUAL PRÁCTICO DE
INTRODUCCIÓN
Los antibióticos son compuestos orgánicos que inhiben el crecimiento bacteriano. Sin
embargo, no todas las bacterias son igual de sensibles frente a un mismo antibiótico, de ahí
que antes de usar cualquier antibiótico se hace necesario probar la sensibilidad de la bacteria
frente a diferentes antibióticos para escoger el de mayor sensibilidad y con una dosis menor,
lo que permitirá reducir los posibles efectos secundarios cuando ese antibiótico se use
terapéuticamente. La técnica in vitro más usada para realizar estas pruebas de sensibilidad o
antibiogramas es la técnica de Kirby-Bauer.
Método de antibiograma por sensidiscos:
En este método, se disponen discos de papel de filtro, impregnados con cantidades

conocidas de antibióticos, sobre un medio de Agar sembrado con un cultivo puro de la
bacteria del paciente. A medida que el antibiótico se difunde en el Agar, se produce un
gradiente de concentración que, después de una incubación apropiada, permite determinar
la actividad del antibiótico mediante la medida de la zona de inhibición alrededor del disco.
Este método estandarizado se conoce como " METODO DE KIRBY BAUER" y es útil para
cultivos puros y gérmenes de crecimiento rápido.
La técnica incluye la utilización de Agar Mueller Hinton, un inoculo estándar y sensidiscos

comerciales de potencia conocida. Las zonas de inhibición se describen como "Sensibles,
intermedios o resistentes”, de acuerdo a la acción que ejerce el antibiótico sobre la bacteria
en estudio.
85
MANUAL PRÁCTICO DE
Existen comercialmente métodos miniaturizados manuales y automatizados que dan

oportunidad de probar un mayor número de antibióticos y obtener resultados en menor
tiempo, lo cual es de gran ayuda para la terapia dirigida a los pacientes.
MATERIALES
Tubos con solución salina.

Cultivo puro del germen que se va a probar
Caja de Petri con Agar Mueller Hinton con una profundidad de 4 mm
Sensidiscos con antimicrobianos de acuerdo a las concentraciones estipuladas por el método
Tubos estandarizados a la escala 0.5 de Mac Farland.
Asas calibradas.
Escobillones estériles.
Mecheros.
Gradillas.
Papel kraft.
Incubadora.
Guantes, bata, encendedor*
PROCEDIMIENTO
Preparación del inoculo
 Con un asa tocar la superficie de 4 ó 5 colonias aisladas y transferirlas al tubo que

contiene solución salina, mezcle la suspensión hasta obtener una solución homogénea.
86
MANUAL PRÁCTICO DE
 Comparar la turbidez de la suspensión bacteriana con la del tubo 0.5 de la escala

turbidimétrica de Mac Farland, estas deben ser iguales, repita el procedimiento cuantas
veces sea necesario para alcanzar la turbidez deseada.
Inoculación de la caja de Mueller Hinton
 Impregne el escobillón estéril totalmente con la suspensión bacteriana.

 Exprimir el exceso contra la pared del tubo, y sembrar el Mueller Hinton en cuatro planos
diferentes rotando la caja 90 grados cada vez. Tapar la caja y dejar en reposo por 5
minutos para permitir la absorción del exceso de líquido.
Aplicación de los Sensidiscos
 Seleccionar 6 sensidiscos de acuerdo a la bacteria inoculada

 Con la ayuda de una pinza (o con un dispensador de sensidiscos) obtener
cuidadosamente los discos de los tubos y disponerlos sobre el Agar, presionando
suavemente para conseguir completo contacto entre el antibiótico y el Agar.
 Los discos deben quedar a 15 mm de la orilla de la caja y a 24 mm de otro sensidisco
 Incubar las cajas a 37 oC por 18 a 24 horas
 A las 24 horas realizar lecturas de las zonas de inhibición con la ayuda de una regla
milimetrada, midiendo el diámetro del halo inhibición
 Comparar con las tablas el tamaño del halo inhibición de cada antibiótico para determinar
sí es sensible , intermedio o resistente, con las tablas de
referencia del CLSI para cada microorganismo . Ver
Anexos (Tablas CLSI Sthaphylococcus; Tablas
CLSI Enterobacterias).
87
MANUAL PRÁCTICO DE
88
MANUAL PRÁCTICO DE
RESULTADOS
1. Germen: ___________________________________________________________________
Diámetro del halo Interpretación

Antibióticos Sigla
en mm (Sensible, intermedio o resistente)
1.
1.
1.
1.
1.
1.
2. Escriba Para cada uno de los antibióticos seleccionados la familia y el mecanismo de

acción
1.___________________________
89
MANUAL PRÁCTICO DE
2.__________________________
3. __________________________
4. __________________________
5. __________________________
6. __________________________
90
MANUAL PRÁCTICO DE
3. ¿Cuál es el tratamiento de elección de acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica

de laboratorio? justifique su respuesta.
91
MANUAL PRÁCTICO DE
REFERENCIAS
- María Piedad Sánchez. Manual de Procedimientos en Bacteriología Clínica. Biobacter

Ltda. 5ª. Edición 1998
- Mindy J. Perilla, MPH. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de
Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para
la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Organización Mundial de la Salud 2004,
CDS Centro de Recursos de Información Organización Mundial de la Salud 1211 Geneva
27 Switzerland.
PRACTICA No. 10
MICOLOGÍA
OBJETIVOS
 Identificar las formas de crecimiento de las levaduras y mohos macroscópicamente.
 Realizar la identificación morfológica de los hongos mediante un montaje directo y

con coloraciones.
PRELABORATORIO
92
MANUAL PRÁCTICO DE
1. ¿En que difieren los hongos filamentosos de las levaduras?
2. ¿Qué es la quitina y cuál es su función?
3. Por qué se realiza la tinción con azul de lactofenol. ¿Qué función cumple el azul del
colorante? ¿Cuál es la función del lactofenol?
4. Investigue 4 medios de cultivo para hongos, cuáles son sus componentes y que hongos
se cultivan en cada uno de ellos.
Hongos que crecen en el

Nombre del medio Componentes
medio
93
MANUAL PRÁCTICO DE
INTRODUCCIÓN
94
MANUAL PRÁCTICO DE
Los hongos son microorganismos eucariotas, heterotróficos y esencialmente aeróbicos con

capacidad anaeróbica limitada. Los hongos sintetizan lisina, su pared celular posee quitina y
glucanos, la membrana plasmática contiene ergosterol, 80SrRNA y microtúbulos
compuestos de tubulina.Crecen como levaduras o formas miceliales, o la combinación de
ambos (dimorfismo), Morfológicamente la levadura se define como una célula que se
reproduce mediante gemación o fisión, por lo general son unicelulares y producen colonias
redondeadas, pálidas o mucoides en las placas de agar.
Las formas miceliales son microorganismos pluricelulares formados por hifas, las cuales
pueden ser cenocíticas o septadas, y su conjunto recibe el nombre de micelios. Las colonias
formadas por estos tienen una estructura filamentosa, vellosa o lanosa. Cuando crecen en
medios sólidos, producen unas hifas denominadas hifas vegetativas (crecen por encima y
debajo del medio de cultivo), así como hifas que se proyectan por encima de la superficie
conocidas como hifas aéreas.
Las técnicas básicas de Bacteriología son, en general aplicables a las levaduras y mohos de
importancia médica. No obstante, hay diferencias con respecto a las bacterias que es
necesario destacar. El período crecimiento es más largo, por lo tanto, debe mantenerse en
incubación durante un tiempo prolongado. Los dermatofitos, por ejemplo, pueden demorar
hasta 4 semanas. Los hongos oportunistas, en cambio, son de desarrollo más o menos
rápido, como por ejemplo Mucorales 24-48 horas, Aspergillus 48-72 horas; Crytococcus 48-72
horas.
95
MANUAL PRÁCTICO DE
El diagnóstico de laboratorio de las infecciones fúngicas requiere:
1. Presunción diagnóstica por parte de los clínicos.

2. Apropiada recolección de muestras.
3. Procedimientos especiales de laboratorio.
El estudio micológico consta de:
 Observación directa al fresco con líquidos clarificantes (KOH 10-20%, lactofenol) para
pesquisa de levaduras e hifas.
 Cultivos de hongos en agar Sabouraud glucosado, con o sin antibióticos, con y sin
ciclohexamida, en que se consideran tiempo de desarrollo, características macroscópicas
y microscópicas (hifas y esporas).
 Estudio histológico.
 Inmunodiagnóstico.
 Técnicas de biología molecular.
96
MANUAL PRÁCTICO DE
MATERIALES
 Asa de punta recta
 Guantes, tapabocas, bata, encendedor*
 KOH al 10 %
 Colorante azul de lactofenol
 Hidróxido de Potasio
 Laminas y laminillas
 Cultivos de levaduras y micelios en agar saboureaud
 Microscopio
 Mechero
PROCEDIMIENTO
 En una lámina coloque una gota de azul de lactofenol.
 Esterilice el asa con el mechero y de la muestra de moho obtenga un pequeño corte

triangular, colóquelo sobre la gota de azul de lactofenol.
97
MANUAL PRÁCTICO DE
 Coloque una lámina sobre la muestra y suavemente presione para que está quede
homogénea
 Observe al microscopio en objetivo de 40 X.
 Realice el mismo procedimiento, pero empleando Hidróxido de Potasio.
 Observe las cajas de cultivo y describa las características macroscópicas.
 Obtenga una muestra del cultivo y realice un montaje en azul de lactofenol y observe
al microscopio.
RESULTADOS
Tipo de hongo (Filamentoso o levaduriforme):
Morfología macroscópica de la colonia:

Forma: _____________________________
Color: ______________________________
Textura: ____________________________
Reverso: ____________________________
98
MANUAL PRÁCTICO DE
Morfología microscópica (40X)

____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
______
Tipo de hongo (Filamentoso o levaduriforme):
Morfología macroscópica de la colonia:

Forma: ______________________________
Color: _______________________________
Textura: _____________________________
Reverso: _____________________________
99
MANUAL PRÁCTICO DE
Morfología microscópica 40X

____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
______
REFERENCIAS
- Pemán, E Martín-Mazuelos, MC Rubio Calvo. Guía Práctica de Identificación y

Diagnóstico en Micología Clínica. Revista Iberoamericana de Micología, Bilbao, 2001.
Disponible en: http://www.guia.reviberoammicol.com/ç
- Murray Patric. 2ª Edición. 1993. Harcourt Brace – Microbiología Médica
- Baron, Samuel, editor. Medical Microbiology. University of Texas Medical
Branch; 4th Edición, Galveston (TX). c1996 Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv. fcgi?rid=mmed.TOC&depth=2
100
MANUAL PRÁCTICO DE
101
MANUAL PRÁCTICO DE
PRACTICA No. 11
PARASITOSIS INTESTINALES POR HELMINTOS Y PROTOZOOS
OBJETIVOS
 Identificar la morfología de protozoos y helmintos por observación directa de láminas

de referencia y el montaje en fresco de muestras de materia fecal de individuos
infectados.
 Conocer los principales exámenes de diagnóstico parasitológico.
 Conocer los métodos de diagnóstico parasitológico de rutina y especializados.
INTRODUCCIÓN
Los tres principales grupos incluidos en el estudio de la parasitología médica son: protozoos,
helmintos y los artrópodos que causan enfermedad directa o que actúan como vectores. Los
parásitos afectan a millones de personas en el mundo, muchas de estas son consideradas por
la Organización Mundial de la Salud como enfermedades desatendidas, encontrándose
estrechamente ligadas a la pobreza y a la migración de poblaciones por diferentes causas,
posicionados como un problema de salud pública. Recientemente muchas de ellas también
han sido ubicadas como enfermedades reemergentes principalmente asociada al aumento
de pacientes con SIDA, como son: la Cryptosporidiosis, Pneumocystis carinii, Strongyloidisis,
Toxoplasmosis y Leishmaniasis entre otros.
TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
102
MANUAL PRÁCTICO DE
COPROLÓGICO
Obtención de la muestra fecal: La muestra emitida espontáneamente es adecuada para el

examen coprológico, debe ser almacenada en un recipiente estéril, está deber ser llevada
inmediatamente al laboratorio y no debe estar mezclada con orina, no debe haber
permaneció por más de un día a temperatura ambiente. La cantidad de muestras a recolectar
es de aproximadamente un gramo de materia fecal.
Examen coprológico directo.
El examen coprológico consta de dos etapas: un examen macroscópico y un examen

microscópico.
Examen macroscópico: Permite evaluar por observación directa de la muestra la

consistencia, el color y presencia de moco, sangre, restos alimenticios o helmintos en la
materia fecal.
Examen microscópico: Permite evaluar la presencia de formas parasitarias como quistes,

huevos, larvas, trofozoítos. Adicionalmente, se deben reconocer otros elementos que
pueden encontrarse eventualmente como: leucocitos, eritrocitos, cristales de Charcot-
Leyden, restos alimenticios de origen vegetal y animal, flora bacteriana, levaduras, células de
descamación entre otras.
EVALUACIÓN DE PARAMETROS QUÍMICOS EN MATERIA FECAL
- pH: Normalmente es de 7.0. En diarrea por bacterias invasivas es ácido, diarreas de

origen toxico es neutro, diarreas virales es acido. Aunque este parámetro no es válido
en pacientes que estén tomando antibióticos.
- Azucares reductores: Este examen tiene mayor valor en paciente menores de 5 años
en enfermedad diarreica aguda. Estos son detectados con el reactivo de Benedict, los
más comúnmente encontrados son: la maltosa y lactosa, estos encuentran en la
103
MANUAL PRÁCTICO DE
materia fecal adquiridas de disacaridasas intestinales y son producidas en las

vellosidades intestinales. Las diarreas osmóticas se presentan por fermentación de los
carbohidratos por los virus o bacterias sacarolíticas intestinales.
- Sangre oculta: cuando la cantidad de sangre es muy pequeña se utilizan reactivos que
detectan la presencia de hemoglobina como bencidina o guayaco, etc. Se recomienda
no ingerir carnes rojos 3 días antes de examen
MÉTODOS DE RECUENTO DE HUEVOS
Son métodos útiles para conocer el valor aproximado de la infección por ciertos helmintos
de acuerdo a los parásitos en el Intestino, sirve también para evaluar la eficacia de los
tratamientos. Los métodos empleados son: Recuento en placa microscópica, técnica de
Kato-Katz y técnica de Stoll-Hausheer.
MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN
Su finalidad es aumentar el número de parásitos en el volumen de materia fecal que se

examina, mediante procedimientos de sedimentación y flotación. Los métodos más
empleados son: Técnica de Ritchie o centrifugación con formol-éter, técnica simplificada con
formol-éter, técnica de Faust o de flotación y técnica de flotación por Sheather.
MATERIALES
 Bata, tapabocas, guantes, encendedor*
 Muestras de materia fecal*
 Laminas y laminillas
 Colorante de lugol
 Solución salina al 0.85 %
 Palillos
 Papel Kraft
104
MANUAL PRÁCTICO DE
 Toallas de papel absorbente
PRELABORATORIO
1. Investigue acerca de las recomendaciones que se deben dar a los pacientes para una
adecuada recolección de una muestra de materia fecal, incluyendo la preparación previa
del paciente.
2. Describa las recomendaciones para realizar la toma de muestra de materia fecal de niñ@
que utilice pañal.
105
MANUAL PRÁCTICO DE
3. ¿Qué es un coprocultivo y en qué casos debe realizarse este tipo de examen?
106
MANUAL PRÁCTICO DE
4. ¿Qué es un coprológico seriado y en qué casos debe realizarse este tipo de examen?
PROCEDIMIENTO
COPROLÓGICO
Examen macroscópico
107
MANUAL PRÁCTICO DE
 En la zona de trabajo destape con precaución la muestra de materia fecal realice la

observación de la consistencia, el color y presencia de moco, sangre, restos alimenticios o
helmintos.
Examen microscópico
 En un lamina portaobjetos se coloca una gota de colorante de lugol parasitológico y una

gota de solución salina al 0.85 %. Con ayuda de un palillo se toma una pequeña cantidad
de materia fecal y se hace una suspensión clara con cada una de las soluciones. Cada una
de estas se cubre con una laminilla y se observa al microscopio en objetivo de 40 X
RESULTADOS
1. Examen macroscópico:
Consistencia ____________________
Color __________________________
Otros _____________________________________________________________________
2. Examen microscópico: Haga el reporte de los elementos encontrados en el montaje

_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
3. En cada uno de lo microscopios se encuentra un montaje de un parásito, observe sus

características morfológicas. Escriba el género y especie a la que pertenecen y realice un
dibujo de cada uno de ellos señalando las principales partes de cada organismo y mencione
que forma es la que observa, huevo, quiste, larva o trofozoíto.
108
MANUAL PRÁCTICO DE
109
MANUAL PRÁCTICO DE
POSTLABORATORIO
1. El color y la consistencia de la materia fecal puede variar, y la razón de ello puede tener
un significado clínico. Investigue al respecto y complete la siguiente información:
Alteración Explicación
Materia fecal de
color negro
Materia fecal con

hallazgos de sangre
macroscópica
Materia fecal de
color verde
Materia fecal acólica
Materia fecal líquida
REFERENCIAS
110
MANUAL PRÁCTICO DE
- Jackeline Alger. Entamoeba histolytica I Entamoeba dispar Interpretation of the

Parasitologic Diagnosis. Revista médica Hondurena - vol. 66 - no. 3 – 1998
- David Botero, Marcos Restrepo. Parasitosis Humanas. Tercera edición. Corporación
para Investigaciones Biológicas. Medellín, Colombia 1998.
- Baron, Samuel, editor. Medical Microbiology. University of Texas Medical Branch; 4th
Edición, Galveston (TX). c1996 Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.
fcgi?rid=mmed.TOC&depth=2
PRACTICA N° 12
UROANÁLISIS
OBJETIVOS
 Realizar el examen macroscópico y microscópico de la orina.
 Identificar e interpretar los parámetros físicos y químicos de la orina.
 Conocer e interpretar los componentes del sedimento urinario.
INTRODUCCIÓN
El análisis de la orina es un conjunto de procedimientos y técnicas que nos permiten obtener

información sobre el estado general de las vías urinarias, detectar alteraciones funcionales o
metabólicas de esta. Se compone de un análisis físico químico, macroscópico y microscópico
teniendo en cuenta diferentes parámetros. El volumen de la orina no hace parte de un
examen de rutina, pero es indispensable en estudios de 12 a 24 horas. Normalmente en el
adulto oscila entre 700 y 2000ml/día aunque estos valores se ven modificados por hábitos
personales de ingestión de líquidos. Sin embargo, una eliminación elevada, Poliuria puede
observarse en diabetes mellitus, diabetes insípida, glomerulonefritis crónica, pielonefritis
entre otras. Una disminución en la eliminación, Oliguria ocurre en casos de nefrosis y
glomérulonefritis aguda. La Anuria, ausencia de micción, refleja una condición grave que
puede ser debida a la obstrucción de las vías urinarias o a una glomérulonefritis severa.
111
MANUAL PRÁCTICO DE
Recolección de la muestra de orina
La muestra ideal de orina es la primera de la mañana (que la orina halla permaneció por lo
menos cuatro horas en la vejiga), después de un lavado general de los genitales externos, se
descarta a primera parte de la micción y se recoge la orina en un recipiente plástico estéril.
Otros medios para obtener una muestra de orina son a través de una punción suprapúbica o
cateterización uretral las cuales solo deben realizar bajo la recomendación médica y por
profesionales de la salud.
Análisis macroscópico
El estudio macroscópico tiene como objeto analizar el aspecto de lo orina, se evalúan tres
parámetros: color, olor y turbidez. La orina tiene un color ámbar (amarillo claro) que
depende de los urocromos allí presentes, como porfirinas, bilirrubina y uroeritrina. Cambios
en el color nos puede estar indicando alteraciones metabólicas por ejemplo un pigmento
café puede deberse a alteraciones biliares (bilirrubina), presencia de mioglobina, un
pigmento rojo nos alerta de la presencia de hematíes, hemoglobinuria como resultado de
procesos infecciosos, medicamentoso o alimenticio. El olor normal de la orina es sui generis,
descrito como urinoide. Algunos de los olores que se pueden ser percibidos y algunas de sus
causas son: olor a alcohol (intoxicación por etanol), fruta fresca (acidosis metabólica),
sulfuro de hidrógeno (infecciones del tracto urinario con proteinuria). El aspecto de la orina
debe limpido (transparente), el hallazgo de orinas turbias puede deberse a la presencia de
cremas, moco, espermatozoides, liquido prostático, precipitación de cristales, piuria,
infecciones bacterianas o micóticas.
Análisis Fisicoquímico
El análisis fisicoquímico se realiza con una tira reactiva que debe sumergirse en la orina, esta
es una tira de plástico que lleva fijadas unas almohadillas de celulosa impregnadas de tampón
y varios indicadores químicos. Cada almohadilla tiene sustratos químicos que reaccionan con
componentes presentes en la orina, cuya reacción es evidencia por un cambio de color. Los
parámetros se evalúan cualitativa o cuantitativamente. Estos son:
112
MANUAL PRÁCTICO DE
pH: El valor normal es de 5,5 a 6,5 en la orina de la primera micción. Esta prueba es útil en la
evaluación del estado ácido – básico de cada paciente, que puede estar alertando de
alteraciones metabólicas.
Gravedad especifica: el Valor de referencia: 1.016 a 1.030, la gravedad especifica depende del
número y del peso de partículas en la orina. En la práctica un valor menor 1.010 indica una
relativa hidratación y un valor mayor a 1.030 sugiere una relativa deshidratación.
Proteínas: La proteinuria es uno de los aspectos más característicos de la enfermedad renal,

es definida como la excreción urinaria de proteínas mayor de 150 mg/día. Sin embargo, esta
no es una prueba confirmatoria y debe complementarse con otros examenes.
Glucosa: Normalmente la glucosa es filtrada por el glomérulo, pero ésta es reabsorbida casi
completamente en el túbulo proximal. La glucosuria ocurre cuando la carga de glucosa
filtrada excede la capacidad de reabsorción del túbulo, es decir 180 mg/dL, El valor de
referencia: negativa (< 30 mg/dL).
Cetonas: Las cetonas (ácido acetoacético, beta-hidroxibutírico y acetona) aparecen en la

orina cuando en el organismo se produce un aumento de la degradación de las grasas por un
aporte energético insuficiente de hidratos de carbono.
Urobilinógeno: Normalmente la orina contiene sólo pequeñas cantidades de urobilinógeno,

producto final de la bilirrubina conjugada luego de haber sido excretada por los conductos
biliares y metabolizada en el intestino por la acción de las bacterias allí presentes.
Bilirrubina: La bilirrubina conjugada es soluble en agua y en consecuencia puede encontrarse

en la orina de pacientes con ictericia obstructiva, daño hepático y cáncer de páncreas o de
conductos biliares, en tanto que la bilirrubina no conjugada, la que resulta de procesos
hemolíticos, es insoluble en agua y no pasa a través del glomérulo y por lo tanto no aparece
en la orina
Nitritos: Los nitritos normalmente no se encuentran en la orina, se producen cuando las

bacterias reducen los nitratos urinarios a nitritos. La mayoría de los organismos Gram
113
MANUAL PRÁCTICO DE
negativos y algunos Gram positivos son capaces de realizar esta conversión, por lo que un
resultado positivo indica que estos microorganismos están presentes en una cantidad
considerable
Leucocitos: Los leucocitos excretados en la orina son casi exclusivamente granulocitos

(polimorfonucleares neutrófilos y eosinófilos) y la tirilla reactiva detecta su presencia
mediante la actividad de la estearasa que poseen.
Sangre: La prueba detecta sangre completa (eritrocitos), sangre lisada (hemoglobina) y

mioglobina. La presencia de hematuria puede deberse a procesos fisiológicos con la
menstruación o ejercicio físico extenuante o procesos patológicos.
Análisis microscópico
El examen microscópico es una parte indispensable del uroanálisis para la identificación de

cilindros, células, cristales y microorganismos que ayudan a dirigir el diagnóstico de una
variedad de condiciones. Dentro de los constituyentes del sedimento urinario se encuentran:
Células: Es posible identificar dos tipos de células en el sedimento urinario de acuerdo con su
origen: las que proceden (de la descamación: células tubulares o renales, de transición y
células escamosas) del tracto urinario y las que proceden de la sangre (glóbulos rojos y
glóbulos blancos).
Cilindros: Los cilindros son estructuras longitudinales formadas en los túbulos renales debido
a la precipitación o gelificación de la mucoproteína de Tamm-Horsfall o a la inclusión de
diferentes elementos a una matriz proteica. Los cilindros pueden ser utilizados para localizar
el sitio específico del tracto urinario donde ocurre la enfermedad. Los tipos de cilindros son:
hialinos, eritrocitarios, leucocitarios, bacterianos, epiteliales, granulares (finos, burdos y
pardos), anchos, grasos, céreos y mixtos por combinación de los anteriores. En condiciones
normales no deben encontrarse exceptuados eventos de ejercicio físico excedido.
Cristales: Son elementos que se forman debido a la precipitación de diferentes componentes

urinarios como consecuencia de su aumento en la orina, o por la alteración en la solubilidad
de esta última4. Los cristales más frecuentes son los uratos y los fosfatos amorfos, los
114
MANUAL PRÁCTICO DE
oxalatos de calcio, los de ácido úrico y los de trifosfato de amonio y magnesio. La presencia
de cristales en la orina puede tener un valor diagnóstico importante, sin embargo, en raras
ocasiones ofrecen información clínica fundamental. Los cristales de mayor importancia
clínica son: cristales de cistina, leucina, tiroxina, colesterol, bilirrubina, sulfonamidas.
Otros elementos: En el sedimento urinario pueden también hallarse bacterias, moco, gotas
de grasa y espermatozoides, cuya significancia clínica dependerá de las cantidades
encontradas y del análisis conjunto de otros parámetros médicos.
115
MANUAL PRÁCTICO DE
MATERIALES
Guantes, bata, tapabocas, encendedor*

Muestra de orina*
Tiras de orina
Tubo de vidrio para centrifugación
Lamina portaobjetos y cubreobjetos
Papel Kraff
Toallas absorbentes
PROCEDIMIENTO
116
MANUAL PRÁCTICO DE
 Análisis macroscópico
1. Agite el recipiente en donde el paciente deposito la orina para homogenizar la
muestra.
2. Vierta la orina en el tubo sin que este se llene completamente.
3. Observe el color y aspecto de la orina.
 Análisis Físico – Químico

1. Introduzca la tirilla dentro de muestra de orina
2. Sáquela escurriéndola con el borde del tubo
3. Colóquela horizontalmente sobre un papel absorbente y limpiar los excesos de
orina.
4. Empieza la lectura de abajo hacia arriba, apoyándose en la guía de lectura que se
encuentra en el frasco de las tiras. Anote los resultados.
 Análisis microscópico
1. Tome el tubo con la muestra de orina y llévelo a centrifugar por 5 minutos a 2000
rpm.
2. Descarte el sobrenadante y resuspenda el sedimento.
3. Realice un montaje de una gota del sedimento urinario entre lámina y laminilla.
4. Observe al microscopio en objetivo de 40 X y describa lo que observa.
117
MANUAL PRÁCTICO DE
RESULTADOS
 Análisis macroscópico
Color: _____________________
Aspecto: ___________________
Olor: ______________________
2. Análisis Físico – Químico:
Densidad _________
pH _________
Glucosa _________
Cuerpos cetónicos: _________
Bilirrubinas _________
Urobilinógeno _________
Sangre: _________
Nitritos: _________
Leucocitos: _________
3. Análisis microscópico
Dibuje y describa lo observado en el microscopio en el objetivo de 40X

_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
118
MANUAL PRÁCTICO DE
POSTLABORATORIO
1. Para cada uno de los parámetros evaluados en el análisis físico – químico de la orina
enuncie dos procesos patológicos relacionados con su alteración.
Parámetros
Procesos patológicos
fisicoquímicos
119
MANUAL PRÁCTICO DE
Densidad
pH
Glucosa,
Cuerpos cetónicos
Bilirrubinas
Urobilinógeno
Sangre
Nitritos
Leucocito
120
MANUAL PRÁCTICO DE
2. Enuncie dos procesos patológicos donde pueden encontrarse: cilindros hialinos,

eritrocitarios, leucocitarios y granulares en el sedimento urinario.
Cilindros Procesos patológicos
Cilindros hialinos
Cilindros eritrocitarios
Cilindros leucocitarios
Cilindros granulares
3. Dibuje e Indique en qué casos pueden encontrarse cristales de uratos amorfos, fosfatos
amorfos, oxalatos de calcio, ácido úrico y trifosfato de amonio.
121
MANUAL PRÁCTICO DE
Cristales Dibujo Casos
cristales de uratos
amorfos
Cristales de
fosfatos amorfos
Cristales de
oxalatos de calcio
Cristales de ácido
úrico
Cristales de
trifosfato de
amonio
122
MANUAL PRÁCTICO DE
REFERENCIAS
- Campuzano Maya Germán y Arbeláez Gómez Mario. El Uroanálisis: Un gran aliado del
médico. Articulo original. Urología Colombia. Marzo de 2007
- Rojas N, Chaves E y García F. Bacteriología Diagnóstica. Universidad de Costa Rica,
Facultad de Microbiología. 2006
123
MANUAL PRÁCTICO DE
124
MANUAL PRÁCTICO DE
ANEXOS
125
MANUAL PRÁCTICO DE
Anexo 1
Tablas CLSI Staphylococcus
126
MANUAL PRÁCTICO DE
127
MANUAL PRÁCTICO DE
Anexo 2
Tablas CLSI Enterobacterias
128
MANUAL PRÁCTICO DE
Anexo 3
Tabla de identificación para enterobacterias
129

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MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

UNIVERSIDAD DEL SINÚ

Escrito y diseñado por:

CATALINA TOVAR ACERO

DINA MARCELA RICARDO CALDERA

SHIRLEY SALCEDO ARTEAGA

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Y MANEJO DE RESIDUOS.......................................................................................................6

MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA...............................................................................................11

ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................................................................15

TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS.......................................................................................................21

MANEJO DEL MICROSCÓPIO......................................................................................................................................................................................28

COLORACIONES ESPECIALES: GRAM, ESPORAS Y CÁPSULA...................................................................................................................................32

IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS.........................................................................................................................................................41

SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS...................................................................................................................................................................58

PARASITOSIS INTESTINALES POR HELMINTOS Y PROTOZOOS...............................................................................................................................71

Tablas CLSI Staphylococcus.........................................................................................................................................................................................87

Tablas CLSI Enterobacterias.......................................................................................................................................................................................88

Tabla de identificación para enterobacterias...........................................................................................................................................................89

La microbiología es una ciencia que alberga el estudio de un gran número de patógenos de

Orientar a los estudiantes en el desarrollo de competencias tecno-cognitivas en el área de la

 Dar al estudiante una introducción de las temáticas comprendidas en el manual de

 Motivar al estudiante a la lectura de cada temática previa al desarrollo de cada

 Llevar a la práctica las metodologías propuestas en este manual.

 Evaluar los procesos técnico-cognitivos mediante informes, quices y talleres.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Y MANEJO DE RESIDUOS

 Socializar con el estudiante la importancia de la clasificación de los diferentes residuos

1. . Elabore un glosario con la terminología técnica utilizada en la presente guía (Mínimo 5

 Bioseguridad: conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de

2. Proponga dos normas generales de bioseguridad para el trabajo en el laboratorio

Uso correcto o ensamble de instrumentos, herramientas o objetos de laboratorio para su uso

Protocologo de limpieza y desinfección al entrar o salir despues de ensayar en las instalaciones

3. Organice los siguientes residuos de acuerdo con su clasificación

Residuo Clase de residuo Color de Bolsa o caneca

Normatividad para el personal dentro del laboratorio

- En el laboratorio está prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contactos y

Normatividad del trabajo dentro del laboratorio:

12. Los elementos cortopunzantes deben ser desechados en el guardián

1. Barreras primarias: Elementos de protección personal como guantes, bata,

Nivel de Bioseguridad I: Están destinados a la adecuación de laboratorios de educación o

Ejemplo: Mycobacterias. Se hace un mayor énfasis en las barreras primarias y

MANEJO DE RESIDUOS DENTRO DEL LABORATORIO

Es de vital importancia mantener una clasificación apropiada de los residuos generados en

CLASE DE COLOR BOLSA

No peligroso Hojas, tallos de árboles, restos NO PELIGROS

Guantes, tapabocas, papel kraff

Elementos RIESGO BIOLOGICO

- Centro de control de enfermedades (CDC) y Institutes nacional of Health.

MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

 Conocer los diferentes elementos, materiales y equipos empleados en las prácticas de

En el laboratorio de microbiología se utilizan materiales y equipos diseñados para la

MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

La placa de Petri, o cápsula de

Nos ayuda transportar

Pueden ser de vidrio o

Permiten contener sustancias

Portaobjetos es una fina placa de cristal

Es una fina hoja de material

Aparato de laboratorio que

Mechero de Bunsen Fuente de calor.

Es una jarra plástica