Curso Académico 2018/19

Máster en Nuevos Alimentos

Tema 6 Compuestos fenólicos

Prof. Marín Pródanov
marin.prodanov@uam.es

1
Grupos principales de fitoquímicos
Fenilpropanoides

Isoprenoids
Isopropanoides

Alkaloides 2
Clasificación de los fenilpropanoides (compuestos
fenólicos o fitofenóles)
 Gran variedad de estructuras en las que hay al
menos un anillo bencénico, sustituido con uno
o varios grupos hidroxilo (-OH) y unido a una
cadena lateral funcional (-R) OH

1973 más de 4000 fitofenoles

1993 entorno a 8000 fitofenoles R

2005 Polyphenols in foods are more complex

than often thought Cheynier, Am J Clin Nutr, 81:223S
Fitofenoles polímeros y complejos: 50-3
70% de los fitofenoles extraíbles
Ruta de síntesis de
los fitofenóles: Shikimic acid

ruta metabólica
del siquimato/
fenilalanina

Naczk y Shahidi (2004) Journal of 4

Chromatography, 1054: 95
 Fenilalanina 4-Cumaril-CoA Malonil-CoA Acetil-CoA

Ruta de síntesis de OH

los flavonoides HO OH

Chalcona

OH O

OH

HO O

OH
HO O
OH O HO O

Flavanona
OH
OH O
OH OH O
Isoflavonas Flavanonoles
OH
OH
HO O
HO O

OH
OH
OH O
Flavan-3-oles
Flavonas
OH OH

HO O HO O+

OH OH

OH O OH
5
Flavonoles Antocianidinas
Estructuras principales de los compuestos fenólicos

6
Procedencia y características fisicoquímicas de
los compuestos fenólicos
 Proceden del metabolismo secundario de las
plantas.
 Son constituyentes minoritarios y
estructuralmente muy variados.
 Se encuentran en distinto grado de:
- hidroxilación (-OH),
- glicosilación (Glu, Rha, Gal, hexosas,
pentosas, etc.),
- acilación (ácido gálico, tartárico, málico,
caféico, etc.),
- fenilación (-C6H6),
- metilación (-CH3), metoxilación (-OCH3),
7
- prenilación (-CH2CHC(CH3)2)
Procedencia y características fisicoquímicas de
los compuestos fenólicos
 Una > hidroxilación, glicosilación o fenilación
potencia el carácter hidrófilo y una >
metilación, metoxilación, prenilación o
acilación potencia el carácter hidrófobo.
 Se encuentran básicamente en los tejidos
sólidos de las plantas: pieles, semillas,
cubiertas, hojas, corteza o raíces.
 En su mayoría son antioxidantes (reductores)
y por tanto son sensibles a la oxidación frente
al O2, radicales libres, enzimas, etc.
 Son sensibles al calor y a la luz: se pueden
degradar e inactivar.
 Suelen ser especies reactivas: tienen facilidad
8
de reaccionar con otras moléculas del medio.
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:

 Ácido benzóico y derivados

Ácido benzóico y sus sales (E-210-212)
Fuentes: frutos rojos (arándanos, moras, etc.)
Funcionalidad: conservante alimentos ácidos frente
a hongos, levaduras y algunas bacterias, antiséptico
tópico, precursor síntesis de aromas artificiales.
Benzaldehido
Fuentes: almendras y muchas frutas.
Funcionalidad: aroma a almendra amarga
9
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
 Ácidos monohidroxibenzóicos y derivados
Ácido 2-hidroxibenzoico (ácido salicílico)
Fuentes: Sauce (Salix), arándanos, moras, uva,
kiwi, albaricoque y un largo etc.
Funcionalidad: fitohormona, antipirético,
antiinflamatorio (precursor en la producción y
metabolito activo de la Aspirina), en
cosmética: tratamientos de acné, seborrea,
etc., conservante.
Metil-, etil- y propil esteres del ácido 4-
hidroxibenzóico y sus sales (E-214-219)
Fuentes: almendras y muchas frutas.
Funcionalidad: conservantes de alimentos

10
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
 Ácidos dihidroxibenzoicos y derivados
Ácido 3,4-dihidroxibenzóico
(protocatéquico)
Fuentes: frutas (palma Euterpe
oleracea)
Funcionalidad: anticancerígena

Ácido 4-Hydroxy-3-metoxibenzóico (vainíllico)

Fuentes: frutas (Euterpe oleracea), pino rojo
Funcionalidad: saborizante.

4-Hydroxy-3-metoxibenzaldehido (Vainillina)
Fuentes: vainas de las semillas de Vanilla
plantifola, pino rojo, café tostado, roble
tostado, etc.
11
Funcionalidad: saborizante
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
Ácidos dihidroxibenzoicos y derivados
 Hidrólisis enzimática del vainillin β-D-glucósido
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
Ácidos trihidroxibenzóicos y derivados
Ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico (gálico)
Fuentes: agallas, hojas de zumaque, corteza de
roble, té, frambuesa, banana, ...
Funcionalidad: antioxidante (AO), antifúngico,
galotaninos

Ácido digálico: uniones meta- o para- dépsido

13
Fuentes: lentisco (pistacho), agallas, zumaque
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
Galotaninos: oligogaloilglucósidos (de mono a deca)
Monogaloil glucósido: es el
oligogalotanino más simple.
Fuentes: agallas, hojas de zumaque,
corteza de roble, Cornejo officinalis
Funcionalidad: AO

Pentagaloil Decagaloil
14
glucósido glucósido
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
 Derivados del ácido gálico
Ácido hexahidroxidifénico (HHDP)
Fuentes: castaño, roble, granada, Cornejo
officinalis
Funcionalidad: AO, anticancerígena (AC),
antimicrobiana.
Ácido elágico (dilactona del ácido HHDP)
Fuentes: castaño, roble, granada, Cornejo
officinalis, Rubus (moras, frambuesas),
arándanos, fresas, nueces, pecanes, etc.
Funcionalidad: AO, anticancerígena (AC),
antimicrobiana.

Ácido elágico glucósido

Fuentes: castaño, roble, granada, 15
Cornejo officinalis
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
Elagitaninos: Hirtellin Q1 (Reaumuria hirtella)

HHDP

16
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
Elagitaninos

17
C6-C Ácidos fenólicos y derivados:
 Derivados del ácido gálico
Etilgalato (E-313)
Fuentes: nuez, otras nueces (Terminalia
chebula)
Funcionalidad: AO
C6-C2 Feniletanoides y derivados:
 Fenilatanoides y derivados
4-hidroxifenil etanol (tirosol), 3,4-dihidroxifenil
etanol (hidroxitirosol) y oleuropeina (ester
glicosilado del hidroxitirosol y el ácido
elenólico)

Fuentes: aceitunas
Funcionalidad: el hidroxitirosol es
uno de los AO naturales más
potentes, antimicrobiana,
antiinflamatoria (AI).
C6-C3 Ácidos hidroxicinámicos y derivados:

20
Naczk y Shahidi (2004) Journal of Chromatography, 1054: 95
C6-C3 Ácidos hidroxicinámicos y derivados:
 Ácido cinámico y derivados
Ácido trans-cinámico
Fuentes: corteza y aceite esencial del árbol
Cinnamomum, etc.
Funcionalidad: aroma
a miel, materia prima
para la síntesis de metil-, etilcinamatos
Cinamaldehido
Fuentes: Cinnamomum
Funcionalidad: aroma a canela
Metil cinamato
Fuentes: Cinnamomum, fresa,
pimienta de Sichuan, albahaca
Funcionalidad: sabor pimienta,
afrutado (cítricos), alimentos,
perfumes, anestésico local
C6-C3 Ácidos hidroxicinámicos y derivados:
Ácido 3,4-dihidroxicinamico (caféico)
Fuentes: en todas las plantas (precursor en
la síntesis de la lignina): café
Funcionalidad: AO, AC.

Ácido 3(5)-cafeoilquinico (clorogénico)

(neoclorogénico)
Fuentes: en todas las plantas (intermediador
en la síntesis de la lignina): café, manzana,
uva, bambú, etc.
Funcionalidad: AO, antihiperglucémica, AC.

22
C6-C3 Ácidos hidroxicinámicos y derivados:
Ácido rosmarínico (ester de los ácidos
caféico y 3,4-dihidroxifenil láctico)
Fuentes: plantas labiadas (Lamiaceae):
salvia, melisa, menta, tomillo
Funcionalidad: AO, AI, antivaral,
antibacteriana, etc.

23
 C6-C3 Ácidos hidroxicinámicos y derivados:
(C6-C3)2 Lignanos
Matairesinol Secoisolariciresinol
Fuentes: semillas de lino,
sésamo, calabaza, soja,
centeno, mostaza,
brócoli, etc.
Funcionalidad:
fitoestrógenos, AO,
Biota intestinal anticancerígenos

Enterolactona Enterodiol 24
C6-C2-C6 Estilbenóides (fitoalexinas) y derivados:
3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene (trans-
Resveratrol)
Fuentes: uva (Pinot noir), cacahuetes,
moras (Morus), arándanos, raíces de
Fallopia japonica
Funcionalidad: AO, AC,
antienvejecimiento, etc.
trans-Resveratrol-3-β-D-glucósido
(trans-Piceid)
Fuentes: uva, Fallopia japonica
Viniferinas (oligómeros
de resveratrol): α-
Viniferin
Fuentes: uva,
arándanos 25
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Estructura básica: 2-fenilbenzopirano
deriva del latín: flavus (amarillo)

2-fenilbenzopirano

26
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavonas: 2-fenil-1-benzopiran-4-on
Tricetina (5,7,3’,4’,5’-pentahidroxiflavona)
Fuentes: exclusivamente polen y miel de
Eucaliptus (Myrtaceae)
Funcionalidad: inhibe el crecimiento del
cáncer da mama.

Tricina
Fuentes: salvado de
arroz negro.
Funcionalidad: inhibe el cre-
27
cimiento del cáncer da mama.
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Isoflavonas: 3-fenil-1-benzopiran-4-on
5,7-Dihidroxi-3-(4-hidroxifenil)cromen-4-on
(Genisteina)
Fuentes: aglicona de varios glicósidos,
legumbres (soja, lupino, habas, garbanzos,
alubias), café.
Funcionalidad: fitoestrógeno, bloquea la
ovulación, favorece el metabolismo del Ca.
Genistein-7-glucósido (Genistina)
Fuentes: leguminosas (soja)
Funcionalidad: fitoestrógeno,
actividad antiviral, AC, favorece el
metabolismo del Ca.

28
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavonoles: 3-hidroxi-2-fenilcromen-4-on
(3-hidroxiflavonas)

Se conocen >1000 flavonoles 29

C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavonoles: 3-hidroxi-2-fenilcromen-4-on
Quercetina
Fuentes: roble, té, manzana, ajo, uva,
cítricos, brócoli, tomate, berries, …
Funcionalidad: adsorbe rayos UV, AO, AI
(inhibe la histamina), cardiotónica,
antiviral, antiulcérica.
Quercetin-3-O-rutinósido (Rutina)
Fuentes: cítricos, alforfón (trigo
sarraceno), espárragos, uva, berries, …
Funcionalidad: adsorbe rayos UV, AO...

30
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavanonas: 2,3-dihidro-2-fenilcromen-4-on
Hesperetin-7-O-rutinoside
(Hesperidina)
Fuentes: cítricos
Funcionalidad: aglicona
hesperetina, defensa de la planta
(sabor amargo), AO,
antihipercolesterolemía,
antihipertensión, AI, ...

Naringina
Fuentes: cítricos (pomelo)
Funcionalidad: aglicona
naringenina, amargos, AO, AI,
modulador sistema inmune. 31
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Antocianos: 2-fenilcromenilium
(benzopirilium) ion
Moléculas que absorben luz VIS. Amplio intervalo de
colores: desde naranja a violáceo. El color depende de
la composición de la especie y el pH.

32
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Antocianos: 2-fenilcromenilium
(benzopirilium) ion

Antocianos de lombarda a distintos pH (orden creciente de pHs)

33
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Antocianos
Malvidina-3-O-glucósido (Oenina)
Fuentes: uvas tintas Vitis vinifera L.
Funcionalidad: colorante, AO, etc.

Cianidina-3,5-diglucósido
Fuentes: frutas color rojo, uvas tintas
amaricanas (Vitis rotundifolia L.), ciruelas,
arándanos, endrinas, moras, sauco, maíz,
arroz negro, ...
Funcionalidad: colorante, AO, etc.
Enocianina: colorante alimentario (E-163)
Fuentes: mezcla de todos los antocianos presentes en uvas
tintas Vitis vinifera L.
Funcionalidad: colorante, AO, protección de cromosomas
34
de la destrucción por rayos UV y X.
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Antocianos

35
 C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavanoles: flavan-3-oles
Catequina (C), Epicatequina (EC), Epigalocatequina (EGC),
Epicatequingalato (ECG) y Epigalocatequingalato (EGCG)

(ECG)* (EGCG)** **

36
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavanoles: flavan-3-oles
Fuentes: uvas Vitis vinifera L. (semillas (C,
EC y ECG) y pieles (C, EC y EGC)), vino, té, cacao,
cidra, corteza de pino, aronia, berries, roble, ...
Funcionalidad: AO en alimentación y cosmética,
antihipercolesterolemía, antihipertensión, ACanc., etc.

37
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavanoles: flavan-3-oles
Proantocianidinas

38
 C6-C3-C6 Flavonoides:
 Flavanoles: Proantocianidinas dímeras
Procianidinas dímeras nogaloiladas
Fuentes: semillas y piles (+ prodelfinidinas) de uva Vitis
vinifera, vino, té, cacao, cidra, corteza de pino, berries, roble.
Funcionalidad: AO en alimentación y cosmética, favorecen el
aumento intracelular del contenido de la vitamina C,
antihipercolesterolemía, antihipertensión, ..
Dimeros R1 R2 R3 R4
B1 epicatequina-(4β→8)-catequina H OH OH H
B2 epicatequina-(4β→8)-epicatequina H OH H OH
B3 catequina-(4β→8)-catequina OH H OH H
B4 catequina-(4β→8)-epicatequina OH H H OH
B5 epicatequina-(4β→6)-catequina H OH H OH
B6 catequina-(4β→6)-catequina OH H OH H
B7 epicatequina-(4β→6)-catequina H OH OH H
39
B8 catequina-(4β→6)-epicatequina OH H H OH
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Procianidinas dímeras nogaloiladas

40
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Procianidinas trímeras nogaloiladas

41
C6-C3-C6 Flavonoides:
 Procianidinas tatrámeras nogaloiladas

42
 C6-C3-C6 Flavonoides:
 Procianidinas (galoiladas):
estructuras ilimitadas

C(EC) ECG
PC2 PC2Gª PC22G
PC3* PC3G PC32G PC33G
PC4 PC4G PC42G PC43G PC44G

Ejemplos:
*EC-EC-EC *EC-EC-C *EC-C-C *C-C-C *EC-C-EC

ªECG-EC (B2G)
ªC-ECG (B4-G)
ªECG-C (B1G)
ªEC-ECG (B3-G)
43
Fitofenoles: estructuras ilimitadas
 Estrategias de análisis
Análisis en fase sólida: muy raro, sólo para el análisis de
algunos biopolímeros por ESI o MALDI-TOF (MS).
Análisis en fase líquida: la mayoría de las moléculas de
interés se encuentran en las partes sólidas de las plantas
y por tanto es imprescindible pasarlas en fase líquida.
- Reducción de tamaño de partícula (trituración/molienda).
- Extracción S/L: normalmente mezclas hidroalcoholicas
de 0-100 % de agua, para fines analíticos el más preferido
es el metanol, aunque se pueden utilizar etanol, acetona,
acetonitrilo, etc., preferiblemente pH ácidos (3-5)
- Intensificación de la extracción: calor (hasta 60 ºC, tº >
60 ºC: tiempos reducidos) (convencional o microondas)
agitación con ultrasonidos, presión (de hasta 200 bar).
- Separación (eliminación) de sólidos en suspensión: filtro
de membrana de 0.45 µm de tamaño de poro. 44
- Concentración: tº < 30-35 ºC, presión reducida.
Preparación de la muestra
 Liofilizador
Fitofenoles: estructuras ilimitadas
 Estrategias de análisis
Análisis cualitativo: TLC, reacciones químicas simples
para la obtención de un efecto visiblemente apreciable
(cambio de color, fluorescencia, formación de
precipitados), depolimerización en presencia de
nucleófilos (floroglucinol, benzilmercaptano), ESI o
MALDITOF (MS), perfiles de polaridades, perfiles de
masas moleculares, etc.
Ventajas: relativamente simples, rápidos, proporcionan
información de la presencia o ausencia de un fitofenol o
de un grupo de fitofenoles.
Inconvenientes: información solamente cualitativa (sí o
no).

46
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cualitativo: TLC de un extracto de
semillas de uva (fracciones de distinto grado de
purificación de PCs).

47
 Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cualitativo: reacción de Bate-Smith
(depolimerización oxidativa en presencia de
alcohol caliente) para la afirmación de la
presencia de proantocianidinas.

Scofield et al. (2001) Animal Coloración roja48de la

Feed Sci. Technol. 91: 21 formación de antocianidina:
 Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cualitativo: determinación del grado
medio de polimerización (mDP) por
depolimerización parcial de los PACs en
presencia de nucleófilos (floroglucinol,
benzilmercaptano).

49
Scofield et al. (2001) Animal Feed Sci. Technol. 91: 21
 Análisis cualitativo: determinación del mDP por
depolimerización parcial de los PACs en
presencia de floroglucinol.
1. EGC-(4β-2)-phloroglucinol
2. EC-(4β-2)-phloroglucinol
3. C-(4α-2)-phloroglucinol
4. ECG-(4β-2)-phloroglucinol
ΣF3-phloroglucinol Aductos
5. EC
6. C
7. ECG
ΣF3Monómeros

ΣF3M + ΣF3-phAductos
mDP =
ΣF3M

Kennedy y Jones (2001) J. 50

Agric Food Chem. 49: 1740
 Análisis cualitativo: determinación del mDP por
depolimerización parcial de los PACs en
presencia de floroglucinol. Semillas de uva
1. EGC-(4β-2)-phloroglucinol
2. EC-(4β-2)-phloroglucinol
3. C-(4α-2)-phloroglucinol
4. ECG-(4β-2)-phloroglucinol
5. EC
6. C
7. ECG

Pieles de uva

Kennedy y Jones (2001) 51

J. Agric Food Chem. 49: 1740
 % Intensity

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

550
551.4 561.0
573.0 583.3
588.3
607.2
639.3
675.0
701.0 715.0
745.9737.0 759.3
803.5

866.2
889.2

P-Tr
929.3
973.5

1041.2

1135.3
1177.3
1194.3

1240
P-Tr-1G
1329.3
1345.3

1465.3
1481.3
(MALDI-TOF (MS).

1617.4
1633.3

% Intensity

1754.4

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

1769.4
4700

1783.3

1000
1041.2
1057.2

1906.4 1137.3

1930
1921.4
1177.3
1193.2
1208.2

2041.4
1313.3
1326.3 1329.3
1345.3

1448.3
1465.3
2194.5 1481.3
1497.3

1600
1620.3 1617.3
1633.3
2329.5

1750.3 1756.4 1753.4

1769.3
Reflector Spec #1 MC[BP = 413.3, 17693]

2497.5 1889.3
1905.4
1921.3
1937.3

2620
2025.4
P-Octamer
2634.5 2041.4
2078.3 2073.3

2191.4
2200

2194.4
2210.3

2329.4
2346.4
2361.4
P-Octamer-3G
Fitofenoles: estrategias de análisis

2484.4 2481.4
Mass (m/z)

2618.4
2634.4
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 1465.3, 2360]

2768.5 2771.5
2800

3310

2922.4

3059.5

3209.5

3361.5
3400
P-Undecamer (3484)

3650.5
matrix-asisted laser desorption/ionization time-of-flight

52
 Análisis cualitativo: ionización electrospray (ESI) o

4000
P-Undecamer-3G
1306.9

4000
2359.8
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis semicualitativo: perfiles de polaridades
(por RP-HPLC)
Extracto acuoso de semillas de uva
AG
C

EC

ECG

53
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis semicualitativo: perfiles de masas
moleculares (por NP-HPLC)
mAU

EC Extracto acuoso de cacao

150

PC2
100

PC3 PC4
PC5
50 PC6
PC7

0
54
-14
10 20 30 40 50
Minutes
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis semicualitativo: perfiles de masas
moleculares (por NP-HPLC)

0,23 AU ehmer'09-et70-30-11-2010001.DATA [280.00 nm (Channel 1)]

0,22 Extracto de pieles de uva

ehmer-50-sp-s-09-12-2010.DATA
ehmer'09-4.5-s-meoh01-12-2010001.DATA
[280.00 nm (Channel 1)]
[280.00 nm (Channel 1)]

0,21 C + EC ehmer-50-sp-9-s-meoh09-12-2010001.DATA [280.00 nm (Channel 1)]

0,2

0,19
0,18

0,17
0,16

0,15
0,14
0,13

0,12
PP
0,11

0,1
AG
0,09

0,08
0,07
PC2
0,06

0,05
0,04
PC3
0,03 PC4
0,02

0,01

-0,01 55
RT [min]
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis global por grupos (familias):
Colorimétricos*: por la producción de un cromóforo en
una reacción química.
Gravimétricos: por precipitación con proteinas (saliva,
BSA), Yb3+, celulosa, polímeros (polivinilpirrolidon (PVP)).
Hidrólisis ácida, alcalina o enzimática y análisis de las
agliconas por HPLC.
Ventajas: simples, relativamente rápidos, no requieren un
equipamiento especial, ni personal calificado,
proporcionan una idea genérica y aproximada del
contenido en un grupo de fitoquímicos, son más útiles en
la búsqueda de correlación con efectos biológicos.
Inconvenientes: inespecíficos, baja reproducibilidad, baja
56
fiabilidad.
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis global por grupos (familias):
Colorimétricos:
Polifenoles Totales (PPT) (Singleton y Rossi (1965) Am. J.
Enol. Vitic. 16: 144): reducción con un reactivo
phosphomolíbdico-phosphotúngstico conocido como
reactivo de Folin-Ciocalteu; recta de calibrado de ácido
gálico (GA).
Proantocianidinas totales (PACT)
- Ensayo con butanol ácido (Porter y col. (1986) Phytoch.
25: 223): se basa en la depolimerización oxidativa de los
PACs en presencia de butanol (100 ºC); recta de calibrado
de cianidina (Cy).
- Ensayo con vainillina (Swain y Hillis (1959) J. Sci. Fd
Agric, 10: 63): se basa en la condensación de las PACs con
aldehídos (vainillina) en medio ácido y formar cromóforos 57
que absorben a 500 nm; recta de calibrado de catequina (C).
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
 Proantocianidinas totales (PACT): ensayo con
vainillina

Scofield et al. (2001) Animal Feed Sci. Technol.5891: 21

Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis global por grupos (familias):
Colorimétricos:
Índice de Polifenoles Totales (IPT): medida directa (o del
extracto diluido 1:100) de la absorbancia a 280 nm.
Antocianos totales (AT)
- por decoloración (Ribéreau-Gayon y Stonestreet (1965)
Bulletin de la Société Chimie de France, 47: 2649): se basa
en la decoloración de los antocianos con SO2; recta de
calibrado frente a equivalentes de Malvidina-3-Glu (Mal-3-
Glu).
- por cambio de pH (Fuleki y Francis (1968) J. Food Sci.
33: 72): se basa en la capacidad de los antocianos de
cambiar de intensidad de color a pH bajos (1 frente a 4.5);
recta de calibrado frente a equivalentes de Mal-3-Glu.
59
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
HPLC, previa purificación de la muestra: normalmente en
fase inversa; detectores de fotodiodos alineados (PAD),
fluorescencia (FL), ionización por electrospry (ESI-MS) o
química a preción atmosférica (APCI-MS) o trampa de iones
(ES-IT-MS); tiempo de análisis: 60-90 min.
Ventajas: mayor resolución y precisión, datos cualitativos y
cuantitativos, normalmente se utilizan para el análisis de
compuestos de un mismo grupo: antocianos, flavonoles,
flavan-3-oles, estilbenos, etc.
Inconvenientes: laboriosos, caros (en equipos, tiempo y
consumibles): requieren equipamiento específico y
personal calificado, pueden requerir preparación laboriosa
de la muestra: extracción L/L, extracción en fase sólida
(SPE), precipitaciones, derivatizaciónes, hidrólisis, etc.60
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: antocianos.
Columna: Nova-Pak C18 (150mm x 3.9mm)
Fase móvil: A:agua/ac. formico;(90:10; v/v)
B:agua/metanol/ác. fórmico (45:45:10 v/v/v).
1. Dp-3-Glu
mAU
2. Cy-3-Glu
Mv-3-Gl
400
3. Pt-3-Glu
350
4. Pn-3-Glu
300 5. Mv-3-Glu
250 6. Dp-3-acetyl-Glu
200
7. Cy-3-acetyl-Glu
150
8. Pt-3-acetyl-Glu
9. Pn-3-acetyl-Glu
100
Pn-3-Gl

Dp-3-Gl-Ac

10. Mv-3-acetyl-Glu
Pn-3-Gl-Ac
Pt-3-Gl-Ac
Pt-3-Gl
Dp-3-Gl

Cy-3-Gl

50
11. Dp-3-coumaryl-Glu
0 12. Cy-3-coumaryl-Glu
0 10 min
13. Mv-3-coumaryl-Glu
5 15 20 25
14. Pt-3-coumaryl-Glu
Cabernet Sauvignon
15. Pn-3-coumaryl-Glu 61
16. Mv-3-coumaryl-Glu
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: antocianos.

62
Nuñez y col. (2004) Postaharvest Biol Technol., 31: 69
 Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: flavonoles.
Columna: Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250 mm; 5 µm particle;
Fase móvil: A:agua/acetonitrilo/ác. fórmico(87:3:10 v/v/v)
B:agua/acetonitrilo/ác. fórmico(40:50:10 v/v/v).

Castillo-Muñoz et al. (2007) JAFC, 55: 992

Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: flavonoles.

64
Castillo-Muñoz et al. (2007) JAFC, 55: 992
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: flavonoles.

Castillo-Muñoz et al. (2007) 65

JAFC, 55: 992
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: detectores PAD, FL, ESI(MS), APCI(MS),
ES-IT(MS); t de análisis: > 120 min.
Ventajas: alta resolución y precisión, datos cualitativos y
cuantitativos de alto valor y fiabilidad.
Inconvenientes: laboriosos, caros (en equipos, tiempo y
consumibles): requieren equipamiento específico y
personal calificado, a veces es necesaria una purificación
rápida: SPE, membranas de UF.

66
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS: extr. semillas de uva
mAU EsMerOp-20-40v-110919_9_20_2011 4_54_37 AM.DATA [UV 1]
300

290

280

270 AG
260

250 C EC
240

230

220

210

200

190

180

170

160

150
ECG
140

130

120

110

100 PC B2 AE
90

80

70

60

50

40

30

20

10
67
0 RT [min]
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS, inyección directa: extr. semillas de uva
Cromatograma a 280 nm

Corriente iónica total

68
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS, inyección directa: extr. semillas de uva

Ácido gálico: 273 nm, m/z 169.1

69
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS, inyección directa: extr. semillas de uva
Catequina: 280 nm, m/z 289.1

70
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
Análisis pormenorizado de compuestos individuales por
RP-HPLC-PAD-MS, inyección directa: extr. semillas de uva

PC B1: 280 nm, m/z 576.9

71
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo OH
OH

HO O

RP-HPLC-PAD-MSn
HO O
OH OH
OH
OH RDA OH
OH OH
HO O HO O
OH

OH OH
OH
OH OH

PC B1: 280 nm, m/z 576.9 m/z = 577

(- 152 Da)
m/z = 425

OH
H2O
QM

HO O
OH OH
OH OH
OH
O O HO O

OH
OH OH
m/z = 287 m/z = 407
OH
+ OH

O O

OH
OH
m/z = 289

OH
O
OH
HO O
O HRF OH
OH
OH
OH OH OH
HO O
OH
OH
HO O OH
HO OH OH
(- 126 Da)
OH
OH 72
m/z = 451
Fitofenoles: estrategias de análisis
 Análisis cuantitativo
RP-HPLC-PAD-MSn

DP DG Tipo Masa [M-H]- [M-H]2- Fragmentos(*)

1 0 B 290 289 271, 245, 179
1 1 B 442 441 397, 331, 289, 271, 169
2 0 B 578 577 559, 451, 425, 407, 289
2 1 B 730 729 577, 603, 559, 441,451, 425, 407, 289, 169
3 0 B 866 865 847, 739, 713, 695, 587, 575, 425, 407, 287,
3 1 B 1018 1017 729, 577, 559, 429, 307, 289
4 1 B 1306 1305 652 865, 729, 577, 559, 425, 289
2 0 A 576 575 557, 531, 513, 449, 423, 407, 351, 325, 287

73