Laboratorios de Biología de Microorganismos. Semestre III.

Docente: Adalucy Alvarez Aldana. BSc, MSc, PhD.

LABORATORIO: COLORACIÓN Y TECNICAS DE SIEMBRA

OBJETIVOS:
-Describir las formas y agrupaciones bacterianas.
-Conocer la principal coloración en microbiología.
-Practicar la siembra en medios de cultivos para aislamiento bacteriano.
-Recordar el manejo y cuidado del microscopio.

GENERALIDADES
La microbiología es la subdivisión de la biología encargada del estudio de aquellos seres tan
pequeños (promedio de 1 m) que requieren un sistema de amplificación para observarlos en
detalle.

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA:
Este término se refiere al cultivo en el laboratorio. En microbiología, cultivar es promover
“in vitro” el desarrollo masivo de los microorganismos. Hoy en día es posible hacerlo en
todos los grupos (bacterias, hongos, virus, protozoos) aunque no en todos los miembros de
cada grupo.
Un cultivo se hace con uno o varios de los siguientes propósitos:
Identificación microbiana de género y/o especie, producción de gran cantidad de
microorganismos, realización de pruebas con fármacos, inoculación en animales de
experimentación, preparación de vacunas y antígenos.

A la acción de colocar un microorganismo sobre un medio se denomina sembrar. El material

para sembrar se denomina inóculo. Al producto de colonias bacterianas obtenidas sobre
medio sólido se denomina Unidades Formadoras de Colonias (UFC). A las acciones de
colocar el medio de cultivo en ciertas condiciones de gases (O 2 , CO2 ), temperaturas entre
23-37°C, y tiempos de 24 a 48 horas y en algunos hasta 4 semanas se denomina incubar.

MÉTODOS DE SIEMBRA: Los métodos de siembra bacteriana en medios de cultivos están

directamente relacionados con la consistencia de los mismos:

Medios líquidos: Se inoculan por medio de asas, pipetas Pasteur, hisopos y/o depositando
una porción de la muestra. La utilidad de estos medios es aumentar las posibilidades de
crecimiento cuando las bacterias no son muy abundantes en el inóculo.

Medios sólidos: Su siembra se puede hacer por agotamiento o masiva en caja de petri y en
los tubos puede ser por picadura o estrías.

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MEDIOS LIQUIDOS MEDIOS SÓLIDOS TUBO

MEDIOS SÓLIDOS AGAR

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO

Caja Flamear
Flamear con
agar

Asa
Bacteriólogica

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MORFOLOGIA DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS UFC: El estudio de la

morfología de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a ésta puede
iniciarse una identificación preliminar de los microorganismos aislados.
Cuando una célula bacteriana prolifera sobre una superficie sólida ésta da lugar a la
formación de un acúmulo de millones de bacterias que pueden observarse a simple vista y
que reciben el nombre de colonia, clona y/o UFC.

Las colonias bacterianas presentan características morfológicas muy variadas, que son
constantes para cada especie de bacterias en idénticas condiciones de cultivo.
Cuando se va a describir una UFC bacteriana se tiene en cuenta las siguientes
características:
Color: Blanca, Amarilla, Beige, Negra, Gris, Café, Transparente, etc.
Forma, Elevación y Margen como se indica en la figura.
Superficie: Rugosa, Membranosa, Lisa, Mucoide.

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FORMA
Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Fusiforme

ELEVACION
Plana Elevada Convexa Pulvinada Umbilicada

MARGEN
Entero Ondulado Lobulado Erosionado Filamentoso Rizado

Un cultivo será puro cuando se observa un solo tipo de UFC y mixto cuando se observan dos
o más.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA:
Se refiere a la observación de las bacterias al microscopio y se pueden hacer distintos
montajes ya sea en fresco o con coloraciones.

FORMAS Y AGRUPACIONES BACTERIANAS: Las bacterias de importancia médica tienen

un tamaño promedio de 1 micrómetro y diferentes formas por las cuales reciben su nombre
así:
Circulares: cocos Alargadas: bacilos Coma: vibrios Espirales:
espiroquetas

En el proceso de división los cocos pueden permanecer unidos y reciben su nombre así:
Pares: diplococos Cadenas: estreptococos Acúmulos: estafilococo
En dos ejes: tétradas En tres ejes: sarcinas

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MONTAJES PARA OBSERVACIÓN cantidad de la colonia elegida, se mezcla

MICROSCÓPICA: bien, se hace la extensión y se seca al
aire. Cuando la extensión esta
PREPARACIONES EN FRESCO:
perfectamente seca, se fija, pasándola
A partir de cultivo en medio sólido: Se
dos o tres veces por la llama (evitar
suspende una parte de la colonia elegida
sobrecalentamiento) y se deja enfriar
en una gota de solución salina, colocada
antes de proceder a teñirla.
previamente sobre un portaobjeto bien
A partir de un cultivo en medio líquido:
limpio. A continuación y evitando que
queden burbujas de aire, se pone encima Cuando se trata de un medio líquido, se
toma la muestra con asa de redondela y la
el cubreobjetos. La observación se
realiza con cualquiera de los objetivos extensión se hace directamente sin
secos. (Recuerde que es material necesidad de solución salina, y se
continúan los pasos anteriormente
infeccioso no tocar los objetivos con la
placa). anotados.

A partir de un cultivo en medio líquido: COLORACIONES EN MICROBIOLOGÍA:

Se toma con el asa de redondela una
Tinción de Gram: la más importante en
muestra del cultivo líquido sin necesidad
de usar solución salina y se continúan los bacteriología, ideada por el bacteriólogo
pasos anteriormente anotados. danés Christian Gram en 1884, en la que
las bacterias se someten sucesivamente a
PREPARACIONES COLOREADAS: soluciones de cristal violeta(CV), yodo(I2 ),
A partir de un cultivo en medio sólido: alcohol y fuschina o safranina y que
Se coloca sobre un portaobjeto bien clasifican las bacterias en dos grupos:
limpio una gota de solución salina y luego Gram + y Gram -.
con el asa se le añade una pequeña

COLORACIÓN DE GRAM

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DESARROLLO DEL LABORATORIO

DIA 1: PREPARACIÓN DEL MATERIAL PARA LA PRÁCTICA POR ESTUDIANTE

 2 cajas con agar nutritivo  1 tubo con solución salina estéril

 Escobillones  2 tubos con caldo de nutritivo
 Asas bacteriológicas
 Tubos con agar nutritivo

DIA 2: LECTURA PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL MATERIAL PREPARADO Y

SIEMBRAS

Siembra en caja de petri y en tubos con caldo de cultivo: En toda siembra se debe
anotar en la caja de petri con agar en la base en forma clara la FECHA Y NOMBRE. Las
cajas se incuban a 37oC e invertidas para evitar que el agua de la condensación y los
productos tóxicos producidos por las bacterias caigan sobre el cultivo. Las asas
bacteriológicas con la cual se realiza la siembra deben esterilizarse en la llama del mechero
antes y después de su uso.
Existen dos tipos de siembra en caja, una llamada siembra masiva y otra siembra por
agotamiento, en los dos casos la caja debe mantenerse en la palma de la mano izquierda
ligeramente inclinada, con la mano derecha se maneja el asa o escobillon (Recomendaciones
para los diestros y caso contrario para los zurdos).

Todo lo anterior hágalo siempre cerca al mechero. No hable mientras siembra.

PASOS A SEGUIR DÍA 2:

1. Tomar una caja de petri con agar nutritivo y hacer siembra por agotamiento (muestra con
el aplicador humedecido en solución salina estéril ya sea de suelo, mesones, piel, uñas,
cabello, encías, dientes etc.). En uno de los lados sembrar la muestra con el aplicador y
luego hacer las estrías con el asa de punta.

2. Tomar la otra caja de petri con agar nutritivo y con el mismo aplicador anterior realizar
siembra masiva.

3. Sembrar de cualquiera de las muestras anteriores con un aplicador nuevo en un medio de

cultivo líquido y el otro medio de cultivo líquido déjelo como control.

DÍA 3: MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y MACROSCÓPICA

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Realice todo el trabajo siempre cerca al mechero. No hable mientras realiza los
procedimientos. Observe los cultivos que sembró previamente y realíceles coloración de
Gram. No olvide observar la morfología de las UFC antes de proceder a la observación
microscópica.

MATERIALES:  Asas bacteriológicas

 Láminas  Solución salina
 Laminillas
 Colorantes de Gram

PASOS A SEGUIR:
1. Cuando se trata de cajas de Petri se examina a simple vista o con una lupa, y con un lápiz
de cera se hace en el fondo de la placa un círculo alrededor de la UFC escogida.

2. La práctica de preparación de frotis mixtos es imperdonable. NO DEBE TOMARSE MAS

QUE UNA SOLA COLONIA, AUNQUE VARIAS DE ELLAS PAREZCAN IGUALES. Si se
dudase de la identidad de las mismas habría que preparar frotis separados de cada una de
ellas.

3. Nunca se tocarán las colonias con el asa caliente. Primero debe enfriarla, hundiéndola en
el agar donde no exista crecimiento o esperar que se enfrié al interior de la caja de petri.

4. Realice una preparación de un espécimen para observación microscópica por coloración de

Gram a partir de las UFC obtenidas en el medio de cultivo sólido y también del crecimiento
obtenido en el medio de cultivo líquido, como se describe en la introducción:
(PREPARACIONES COLOREADAS: A partir de un cultivo en medio sólido y a partir de un
cultivo en medio líquido)
Coloracion de Gram:
a. Cubra la muestra con cristal violeta durante dos minutos. Lave con agua corriente y
escurra.
b. Agregue solución de Lugol durante dos minutos. Lave con agua corriente y escurra el
exceso.
c. Decolore con la mezcla alcohol-acetona por 15 segundos a un minuto. Lave con agua
corriente y escurra el exceso.
d. Cubra la preparación con fuschina o safranina por 1 minuto. Lave con agua corriente
suficiente y deje secar.

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OBSERVACIONES:

Según lo observado en los cultivos sembrados por agotamiento y caldos de cultivo y sus
correspondientes coloraciones con Gram observados al microscopio, llene los siguientes
cuadros, recuerde que la introducción le sirve para guiarse en el llenado de los mismos:

Siembra por agotamiento, colonia 1

Morfología Coloración de Características de la UFC
bacteriana Gram Color Forma Elevación Margen Superficie

Siembra por agotamiento, colonia 2

Morfología Coloración de Características de la UFC
bacteriana Gram Color Forma Elevación Margen Superficie

Siembra masiva
Morfología bacteriana Coloración de Gram Es un cultivo mixto?

Caldo de cultivo
Morfología bacteriana Coloración de Gram Es un cultivo mixto?

TALLER:
1. Por qué cree usted, que se hace necesario esterilizar el asa microbiológica cada vez que
se va a sembrar y cuando se va a realizar las estrías?
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2. Por qué se hace necesario trabajar cerca a la llama del mechero?

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3. Cuál es la razón para que algunas bacterias retengan el complejo cristal violeta-yodo y
otras no lo hacen?
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4. Por qué las colonias desarrolladas en una caja de petri densamente sembrada son más
pequeñas que las colonias de una siembra escasa?
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5. Qué diferencia macroscópica observo entre el cultivo en medio líquido inoculado y el

medio de cultivo control, cuál es la explicación?
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