Escuela Superior Politécnica de Chimborazo

ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
“IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS TERMODÚRICAS EN

LECHE UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE QUESOS
FRESCOS ARTESANALES EN LA PARROQUIA RURAL DE
QUIMIAG DE LA PROVINCIA DE CHIMBORAZO”
Trabajo de titulación
Tipo: Proyecto de investigación
Presentado para obtener al grado académico de:

BIOQUÍMICA FARMACEÚTICA
AUTORA: GISELA PAULINA RAMOS ILVIS

TUTORA: PAOLA FERNANDA ARGUELLO H. MSc.
Riobamba-Ecuador
2018
© 2018, Gisela Paulina Ramos Ilvis
Se autoriza la reproducción total o parcial, con fines académicos, por cualquier medio o
procedimiento, incluyendo la cita bibliográfica del documento, siempre y cuando se reconozca el
Derecho de Autor.
ii
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
El Tribunal de Trabajo de titulación experimental certifica que: El trabajo de investigación:

“IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS TERMODÚRICAS EN LECHE UTILIZADA PARA
LA ELABORACIÓN DE QUESOS FRESCOS ARTESANALES EN LA PARROQUIA
RURAL DE QUIMIAG DE LA PROVINCIA DE CHIMBORAZO”, de responsabilidad de la
señorita egresada Gisela Paulina Ramos Ilvis, ha sido prolijamente revisado por los Miembros del
Tribunal de Tesis, quedando autorizada su presentación.
Paola Arguello MSc.

DIRECTOR DE TESIS ___________________ ___________________
Janneth Gallegos PhD.

MIEMBRO DEL TRIBUNAL ___________________ ___________________
iii
Yo, Gisela Paulina Ramos Ilvis, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha
sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado
las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Escuela Superior Politécnica de Chimborazo puede hacer uso de los derechos correspondientes
a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por
la normativa institucional vigente.
_____________________________
Gisela Paulina Ramos Ilvis
060381547-3
iv
DEDICATORIA
A mi padre:
Cuyo más grande deseo era el que llegue a culminar con éxito mi carrera. Y que a su
ejemplo me convierta en una persona ética y honorable en el desarrollo de mi vida como
profesional.
A mi madre:
Con todo cariño a ella que ha compartido conmigo los más difíciles años, durante toda mi
vida estudiantil y en todo momento tuvo voces de aliento para que termine mis estudios.
A mi hermana Anita:
Que como una verdadera madre me ayudó con toda decisión y en todo sentido hasta
terminar mis estudios.
A mi tío P. Baltazar:
Que como hermano ha sido un pilar fundamental en mi vida, acompañándome en mis
momentos de alegrías y tristezas; agradezco de manera especial su acompañamiento
espiritual el cual me ha ayudado a sobrellevar las diferentes dificultades presentadas.
A amigos:
Carlitos B, Carlita H, Joha V., Miguel S., Benjamín R., Vero V., José Luis P., Jenny L.,
Fernando C., Jessy Z., Amparito J., Paola V., por estar presentes durante toda o la mayor
parte de mi vida. Gracias por demostrarme que las cosas y buenos actos son
recompensados con grandes personas como Uds.
A Vero M., Pao Chiluiza R. y Rafita P. por brindarme su amistad, apoyo incondicional y aportar
con sus valiosos conocimientos y experiencias en este trabajo.
De manera especial dedico este trabajo al Programa de Becas estudiantiles de Austria en la

persona de Ivonne Carrera S., Patricia Moreno y todas las personas que forman parte de este
maravilloso proyecto por depositar su confianza en mí, y haber sido un sustento importante
durante toda mi formación estudiantil.
Gise
v
AGRADECIMIENTO
A Dios y María Inmaculada

Por darme la vida, mi familia y la oportunidad de conocer personas que forman una parte
imprescindible en mi vida.
A la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo

Universidad donde durante todo este tiempo me he formado, adquiriendo los
conocimientos que me constituirán como una profesional ética y competente en el
desempeño de la vida profesional.
A la MSc. Paola Arguello H.

Quién, como directora de Tesis, me brindó todo su apoyo y generosa ayuda, junto con su
amplia experiencia y prueba de capacidad científica para llevar a feliz término mi tesis.
A la PhD. Janneth Gallegos

De quien guardo profundo reconocimiento y eterno agradecimiento, porque ella supo
brindarme todo el bagaje de sus conocimientos y experiencia en Microbiología, con la
fina sensibilidad de quién realmente es poseedor de la ciencia.
vi
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
SUMARY
INTRODUCCIÓN
CAPITULO I
1. Marco teórico referencial ............................................................................................. 18

1.1. Antecedentes de la investigación ................................................................................. 18
1.2. Microbiología .............................................................................................................. 18
1.3. Leche ........................................................................................................................... 19
1.3.1. Leche cruda.................................................................................................................. 19
1.3.2. Leche pasterizada ........................................................................................................ 19
1.4. Derivados de la leche ................................................................................................... 19
1.4.1. Queso ........................................................................................................................... 19
1.4.1.1. Queso artesanal ............................................................................................................19
1.4.2. Yogurt .......................................................................................................................... 20
1.5. Propiedades nutritivas.................................................................................................. 20
1.6. Microorganismos en alimentos .................................................................................... 20
1.6.1. Microorganismos patógenos contaminantes de la leche .............................................. 21
1.6.1.1. Bacterias termodúricas .................................................................................................21
1.7. Fuentes de bacterias termodúricas y defectos en la producción quesera. .................... 21
1.8. Clasificación de bacterias termodúricas ...................................................................... 21
1.8.1. Géneros de mayor importancia .................................................................................... 22
1.8.1.1. Género Bacillus ............................................................................................................22
1.8.1.2. Género Lactobacillus ...................................................................................................22
1.9. Tinción gram................................................................................................................ 22
1.10. Medios de cultivo ........................................................................................................ 24
1.10.1. Tipos de medios de cultivo .......................................................................................... 24
1.10.2. Composición química de medios ................................................................................. 25
1.11. Pruebas microbiológicas de identificación preliminar - lectura inmediata .................. 28
1.11.1. Catalasa........................................................................................................................ 28
vii
1.11.2. Oxidasa ........................................................................................................................ 28
1.12. Pruebas microbiológicas rápidas ................................................................................. 28
1.12.1. Movilidad..................................................................................................................... 28
1.12.2. Indol ............................................................................................................................. 29
1.13. Pruebas microbiológicas-reacción superada las 6 horas .............................................. 29
1.13.1. Hidrólisis de gelatina ................................................................................................... 29
1.14. Pruebas de identificación de bacterias termodúricas ................................................... 29
1.15. Susceptibilidad antimicrobiana .................................................................................... 29
1.15.1. Antibióticos ................................................................................................................. 30
1.15.2. Discos antibióticos ....................................................................................................... 30
1.15.3. Resistencia antimicrobiana .......................................................................................... 31
1.16. Mantenimiento de cultivos .......................................................................................... 31
1.16.1. Métodos de conservación a corto plazo ....................................................................... 31
1.16.2. Métodos de conservación a largo plazo ....................................................................... 33
CAPITULO II
2. Marco metodológico .................................................................................................... 34

2.1. Tipo de investigación................................................................................................... 34
2.2. Diseño de la investigación ........................................................................................... 34
2.3. Unidad de análisis ........................................................................................................ 34
2.4. Localización del muestreo y población de estudio ...................................................... 34
2.5. Lugar de la investigación ............................................................................................. 34
2.6. Etapas de la investigación............................................................................................ 35
2.7. Métodos y técnicas ...................................................................................................... 36
2.8. Pre ensayos para determinar dilución y temperatura para el crecimiento de bacterias
ácido lácticas y termodúricas ...................................................................................................... 36
2.9. Preparación de diluciones para la siembra en los medios de cultivo PCA, MRS ........ 37
2.10. Preparación de medios ................................................................................................. 38
2.10.1. Medio MRS ................................................................................................................. 38
2.10.2. Caldo MRS .................................................................................................................. 38
2.10.3. Agar PCA, SIM, Müeller-Hinton ................................................................................ 39
2.11. Métodos de siembra ..................................................................................................... 39
2.11.1. Siembra por inmersión o vertido en placa ................................................................... 39
viii
2.11.2. Siembra por punción .................................................................................................... 39
2.11.3. Siembra por estriamiento ............................................................................................. 40
2.12. Recuento de colonias (método de recuento en placa) .................................................. 40
2.13. Aislamiento de cepas bacterianas ................................................................................ 40
2.14. Características fenotípicas ........................................................................................... 41
2.14.1. Caracterización macroscópica ..................................................................................... 41
2.14.2. Caracterización microscópica ...................................................................................... 41
2.14.3. Caracterización bioquímica ......................................................................................... 41
2.14.4. Prueba de hidrólisis de gelatina ................................................................................... 42
2.14.5. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana.................................................................... 43
2.15. Conservación de cepas bacterianas .............................................................................. 43
2.16. Reactivación de cepas bacterianas mantenidas por el método de congelación ordinaria
a -20°c ………………………………………………………………………………………...43
2.17. Prueba de viabilidad .................................................................................................... 44
CAPÍTULO III
3. Resultados y discusión................................................................................................. 45
3.1. Recuentos bacterianos ................................................................................................. 45
3.1.1. Recuento de bacterias ácido lácticas en medio mrs ..................................................... 46
3.2. Caracterización morfológica de bacterias ácido lácticas termodúricas ....................... 48
3.3. Caracterización fenotípica ........................................................................................... 51
3.4. Susceptibilidad antibiótica ........................................................................................... 52
3.5. Conservación bacteriana .............................................................................................. 56
CONCLUSIONES…………………………………………………………..…………………58
RECOMENDACIONES……………………………………………………...……………….59
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
ix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1-1: Composición nutritiva de la leche...…………………………………………....20

Tabla 2-1: Procedimiento para Tinción Gram…...………………………………………...23
Tabla 3-1: Medio de cultivo Agar MRS……………………………………………………25
Tabla 4-1: Medio de cultivo Agua peptonada……………………………………………...26
Tabla 5-1: Medio de cultivo Caldo MRS….………………………………………….…....26
Tabla 6-1: Medio de cultivo Agar PCA..…………………………………………………..27
Tabla 7-1: Medio de cultivo SIM………………………………………………………......27
Tabla 8-1: Medio de cultivo Agar Müeller-Hinton..…………………………………….....28
Tabla 1-2: Pre ensayos utilizados en la investigación………...…………………………….36
Tabla 2-2: Diluciones para recuento de bacterias termodúricas…………………………...38
Tabla 1-3: Recuento de aerobios mesófilos en medio PCA….……………………...…….45
Tabla 2-3: Recuento de bacterias ácido lácticas en medio MRS………………………......47
Tabla 3-3: Morfología macro y microscópica de los aislados de
BAL.....………………………………………………………………………………………….49
Tabla 4-3: Pruebas Fenotípicos de Bacterias Ácido Lácticas Termodúricas..….………….51
Tabla 5-3: Prueba de susceptibilidad antimicrobiana en medio MRS…………….……….54
Tabla 6-3: Prueba de viabilidad y pureza………………………………………………….56
x
INDICE DE FIGURAS
Figura 1-1: Apariencia de bacterias Gram positivas y Gram negativas mediante Tinción
Gram………………………………………………………………………………..…………...23
Figura 1-2: Metodología…………………………………….……………………………...34
Figura 2-2: Técnica de diluciones.….……………………………………………………....37
Figura 1-3: Colonias de borde regular....…..………………………………………………. 50
Figura 2-3: Colonias de borde irregular.....………………………………………………....50
Figura 3-3: Cocos Gram positivos …….…..………………………………………………..50
Figura 4-3: Bacilos Gram positivos …...…..………………………………………………..50
Figura 5-3: Bacilos gram negativos …..…..………………………………………………...51
xi
INDICE DE ANEXOS
Anexo A: Muestreo de la Quesera Q1 Y Q2

Anexo B: Recuentos bacterianos
Anexo C: Cultivo bacteriano en caldo MRS
Anexo D: Aislamiento de bacterias termodúricas
Anexo E: Pruebas bioquímicas tradicionales
Anexo F: Tinción Gram
Anexo G: Pruebas de movilidad
Anexo H: Viabilidad de bacterias ácido lácticas termodúricas
Anexo I: Cepario de bacterias ácido lácticas termodúricas
Anexo J: Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en medio MRS
Anexo K: Fichas técnicas de conservación bacteriana
xii
RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue cuantificar e identificar bacterias termodúricas presentes en
la leche pasterizada utilizada en la elaboración de quesos frescos artesanales en la parroquia rural
de Quimiag de la provincia de Chimborazo. Se realizó un recuento de aerobios mesófilos y
bacterias ácido lácticas termodúricas en muestras de leche: cruda, con tratamiento en la quesera
y con tratamiento en el laboratorio; posteriormente se realizaron siembras sucesivas para obtener
aislados puros, a los que se les aplicó un test macro y microscópico, y pruebas fenotípicas (indol,
hidrólisis de gelatina, catalasa, oxidasa, sulfuro indol motilidad (SIM), susceptibilidad a
antibióticos). Los resultados muestran que el tratamiento térmico que la leche recibe en las
queseras disminuye el recuento de mesófilos aerobios y de bacterias ácidos lácticas comparados
con los resultados del tratamiento térmico que recibió en el laboratorio. En cuanto al aislamiento
e identificación, se obtuvieron veinte aislados identificados microscópicamente como, cocos
Gram positivos, bacilos Gram positivos y bacilos Gram negativos; por los test fenotípicos
demostraron ser catalasa y oxidasa negativas, no productores de indol ni hidrolizadores de
gelatina, con poca movilidad, altamente sensibles antibióticos como eritromicina, amoxicilina,
tetraciclina y resistentes a gentamicina y vancomicina. El tratamiento térmico en las queseras pese
a la falta de choque térmico disminuye más la carga microbiana de bacterias ácido lácticas con
respecto al tratamiento del laboratorio, lo cual explicaría el sabor y aroma menos acentuados en
quesos elaborados con este tipo de leche. Se recomienda la realización de pruebas moleculares
para la identificación de este tipo de bacterias, debido a que gran parte de ellas podrían ser
utilizadas en la industria alimenticia como probióticos o mejorar las características sensoriales y
nutritivas de los quesos.
PALABRAS CLAVE: < BIOQUÍMICA>, <MICROBIOLOGÍA >, < TERMODÚRICOS >, <
LECHE CRUDA>, >, < CALIDAD HIGIENICO – SANITARIA >, < QUESERA ARTESANAL
>. < QUIMIAG (PARROQUIA)>.
xiii
ABSTRACT
The objective of this study was to quantify and identify thermoduric bacteria present in
pasteurized milk used in the preparation of fresh artisan cheeses in Quimiag rural parish in
Chimborazo province. A count of aerobic mesophiles and thermoduric lactic acid bacteria was
made in samples of raw milk: with treatment in the cheese and with treatment in the laboratory;
subsequently, successive plantings to obtain isolated pure were made, to which a tests
(indole,hydrolysis of gelatin, catalase, oxidase, sulfide indole motility (SIM), susceptibility to
antibiotics). The results show that the heat treatment that the milk receives in the cheese factory
decreases the count of mesophilic aerobic and lactic acid bacteria, compared with the results of
heat treatment that you received in the laboratory. With regard to the isolation and identification,
twenty isolated identified microscopically were obtained, Gram-positive and Gram-negative
bacteria. By phenotypic test they proved to be catalase and oxidase negative, not producers of
indole and hidrolizadores of gelatin, with little mobility, highly sensitive antibiotics such as
erythromycin, amoxicillin, tetracycline and resistant to gentamicin and vancomycin. Despite the
lack of thermal shock, the heat treatment in the cheese factory decreases the load microbiana of
lactic acid bacteria with regard to the laboratory treatment, which would explain the less
accentuated taste aroma in cheeses made with this type of milk. It is recommended the realization
of molecular test for the identification of this type of bacteria, due to the fact that most of them
could be used in the food industry as probiotics or improve sensory and nutritional characteristics
of the cheese.
KEYWORDS: <BIOCHEMESTRY>, <MICROBIOLOGY>, <THERMODURIC>, <RAW

MILK>, <HYGIENIC-SAMITARY QUALITY>, <ARTESANAL CHEESE FACTORY>,
<QUIMIAG (PARISH)>
xiv
INTRODUCCIÓN
Se considera a la leche como el único producto procedente de la naturaleza capaz de actuar de

forma exclusiva como fuente de alimento, por sus propiedades nutritivas no ha sido superada
por otros alimentos conocidos por el ser humano (González, Molina y Coca, 2010, p.1). Sin embargo,
desde su obtención hasta llegar al consumidor, estas propiedades pueden verse sometidas a un sin
número de riesgos que presentan peligros físicos, químicos y microbiológicos, por tanto,
propician el deterioro de la calidad original de la misma (Magari, 2000, p.2).
Estos riesgos ya sea en conjunto o en forma aislada afectan negativamente la calidad sanitaria y
nutritiva de la leche, afectando a la salud pública y a la economía de cualquier país (González,
Molina y Coca, 2010, p.1).
Según un informe expedido por la OMS y el Grupo de Referencia sobre Epidemiología de la

Carga de Morbilidad de Transmisión Alimentaria (FERG), pese a las insuficiencias en datos y a
las limitaciones de estas estimaciones iniciales, manifiesta que la carga mundial de Enfermedades
Transmitidas por Alimentos (ETAs) es considerable y que la misma aqueja a personas de todas
las edades, con mayor prominencia a menores de cinco años y a quienes viven en regiones del
mundo en donde los ingresos económicos son muy bajos. (WHO/FOS, 2010, p.1).
Los microorganismos son la causa más frecuente de ETAs, un alimento puede contaminarse con
estos agentes por causas muy diversas, siendo la manipulación descuidada o incorrecta una de las
principales causas de contaminación, esto aunado a la composición química del alimento, lo
categoriza como un alimento de alto riesgo sanitario, por tanto, resulta imprescindible realizar los
controles sanitarios pertinentes para evitar dichas enfermedades.
Una forma de controlar la calidad sanitaria, en el caso particular de la leche cruda son los
microorganismos termodúricos, utilizados como microorganismos indicativos, útiles para juzgar
el funcionamiento de empresas productoras, de igual forma dan a conocer durante la
manipulación, el incumplimiento de pautas de higiene y permiten inferir la vida útil y la inocuidad
del alimento. (Signorini et al., 2008, p. 207)
Específicamente microorganismos del género Bacillus y Clostridium causan deterioro de la leche

como de productos lácteos y en casos más severos cobran importancia por sus efectos en la
xv
seguridad alimentaria debido a las toxinas que producen (Becker et al. 1994: p.9) (Reginensi et al. 2014:
p.39), a su vez el género Lactobacillus puede modificar las características sensoriales y nutritivas
del queso (Samaniego Fernández Luz M. 2010; p.1), por lo que es trascendental no solamente realizar un
recuento de los microrganismos termodúricos, sino también caracterizarlos.
xvi
OBJETIVOS
Objetivo General
Identificar bacterias termodúricas presentes en la leche pasterizada utilizada en la elaboración de

quesos frescos artesanales en la parroquia rural de Quimiag de la Provincia de Chimborazo.
Objetivos Específicos
Cuantificar las bacterias aerobias mesófilas y bacterias ácido lácticas presentes en la leche de
queseras artesanales de la Parroquia Rural de Quimiag como indicadores de la calidad higiénica.
Obtener aislados puros y caracterizarlos mediante examen macro y microscópico.
Caracterizar mediante pruebas fenotípicas las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) por ser géneros de
interés para la industria láctea.
Elaborar el banco de cepas de las bacterias ácido lácticas termodúricas aisladas, verificar su
viabilidad y pureza
xvii
CAPITULO I
1. MARCO TEÓRICO REFERENCIAL
1.1. Antecedentes de la investigación
En Ecuador uno de los productos de mayor consumo es el queso fresco y una parte importante es
elaborada artesanalmente (Arguello P.; Lucero O.; Castillo G.; Escobar S.; Albuja A., 2015: p.65) , sin embargo,
este producto se convierte en un alimento con mayor potencial de transmisión de ETAs, debido a las
condiciones de higiene no adecuadas en las que se elabora. Estos productos afectan gravemente a la
salud y crecimiento económico de un país. (Taylor y Akhtar, 2015, p.219).
Varios estudios realizados indican la relación de contaminación microbiana con la higiene de las
instalaciones de fabricación. (Sampayo et al., 2001: p.2), por esto es importante la evaluación de las
condiciones higiénico sanitarias de los lugares en los que se elaboran. Las queseras artesanales
generalmente se ubican en los sectores rurales, de ahí el planteamiento del proyecto de investigación
titulado “Evaluación Higiénico-Sanitaria de las Queseras Artesanales de la Parroquia Rural de
Quimiag Cantón Riobamba de la Provincia de Chimborazo”, cuyos resultados preliminares
demostraron la presencia de bacterias termodúricas en la leche las cuales resisten temperaturas de
pasteurización; dichos microorganismos pueden o no ser beneficiosos en este producto. (Ortíz y
Martínez, 2011: p.38)
1.2. Microbiología
La microbiología forma parte del estudio de seres vivos cuya dimensión se encuentra por debajo del
poder resolutivo del ojo humano. (González, 2015, p.1)
La microbiología estudia un heterogéneo grupo de microorganismos microscópicos que pueden vivir

ya sea en forma aislada o en asociaciones de células. (Brooks et al, 2011: p.1)
18
1.3. Leche
1.3.1. Leche cruda
La norma NTE INEN 0009:2012 define a la leche cruda como aquella que no ha sufrido ningún tipo
de tratamiento térmico luego de su extracción desde la ubre, es decir, la temperatura no ha superado
los 40°C. (INEN 009, 2012: pp. 1-9)
1.3.2. Leche pasterizada
Leche homogenizada que ha sufrido calentamiento térmico el mismo que garantiza la eliminación de
todos los microorganismos patógenos y casi la totalidad de microorganismos saprofitos, sin cambiar
las características físico-químicas, organolépticas y nutricionales. (INEN 0010, 2012: pp.1-12)
1.4. Derivados de la leche
1.4.1. Queso
El queso es el producto que resulta de la coagulación de la caseína de manera total o parcial, debido
a la acción que ejercen coagulantes idóneos, induciendo un escurrimiento del suero. El queso puede
ser fresco, semiduro, duro, madurado, no madurado (INEN 1528, 2012: pp.1-11)
1.4.1.1. Queso artesanal
La Sociedad Americana del Queso explica que al hablar de queso artesanal se hace referencia al queso
producido a mano esencialmente, su manufactura no es en grandes cantidades y no se utiliza en lo
posible procesos mecánicos; este posee diferentes sabores e incluyen en su elaboración todos los tipos
de leche. (Dominguez-Lopez et al., 2011: p.176)
19
1.4.2. Yogurt
Se obtiene mediante fermentación láctica de la leche o mezcla de estas, gracias a la acción de

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Sreptococcus salivaris subsp. thermophilus, aunque
puede haber la presencia de otras bacterias benéficas que gracias a su actividad pueden otorgar
algunas características al producto terminado; las mismas deben permanecer viables y activas al inicio
y durante toda la vida útil del producto. (INEN 2395, 2011: pp.1-10)
1.5. Propiedades nutritivas
Las propiedades nutritivas que poseen la leche y sus derivados son muy diversas, no obstante desde
su obtención hasta llegar al consumidor, estas propiedades pueden verse sometidas a un sin número
de riesgos que favorecen un deterioro de la calidad original de la misma.(Magari, 2000: p.2).
Tabla 1-1: Composición Nutritiva de la Leche

Nutriente (g) Vaca Búfala Mujer
Agua 88 84 87.5
Energía (Kcal) 61 97 7.0
Proteína 3.2 3.7 1.0
Grasa 3.4 6.9 4.4
Lactosa 4.7 5.2 6.9
Minerales 0.72 0.79 0.20
Fuente: Agudelo y Bedoya, 2008. (Composición Nutricional de

la leche de ganado vacuno)
Realizado por: Gisela Ramos.2018
1.6. Microorganismos en alimentos
Sanitariamente, los alimentos pueden servir como vehículos de infecciones e intoxicaciones graves
debido a la producción de toxinas generadas por microrganismos. Desde el punto de vista de industrial
los microrganismos poseen una importancia incuestionable, ya que pueden alterar los componentes
de los alimentos estabilizándolos y alargando su vida útil y, además, gracias a ciertos compuestos se
puede conferir sabores característicos. De esta manera se ve compensada la acción de los
20
microrganismos alterantes y responsables del deterioro de ciertos alimentos. (Rugama. y Castillo, 2010:
p.7)
1.6.1. Microorganismos patógenos contaminantes de la leche
1.6.1.1. Bacterias termodúricas
Las bacterias termodúricas pueden estar representados por formas esporuladas que resisten el
tratamiento térmico, es decir que sobreviven a temperaturas comprendidas entre los 60 - 80°C, los
géneros más comunes presentes en leche son los géneros Bacillus y Clostridium, además de formas
vegetativas termorresistentes como Microbacterium, Micrococcus, Streptococcus, algunos
Lactobacillus y otros. (Valbuena et al., 2004: p.9)
1.7. Fuentes de bacterias termodúricas y defectos en la producción quesera.
La contaminación de la leche ocurre durante y después del ordeño (Gleeson; O’Connell; Jordan, 2013, p.221).
La mayor parte de estos contaminantes son microorganismos Gram positivos y su termorresistencia
revelan que cuando están presentes en la leche cruda también pueden estar presentes en el producto
final. (Signorini et al. 2008)
Particularmente en la producción quesera la presencia de éstas bacterias se encuentra asociada al

defecto conocido como “hinchazón tardía” mientras que otras bacterias no productoras de esporas
termodúricas (heterofermentativos) frecuentemente se asocian a problemas de hinchazón por
producción de gas. (Reginensi et al., 2014: p.211)
1.8. Clasificación de Bacterias Termodúricas
Las bacterias termodúricas aisladas de productos lácteos pertenecen a diferentes grupos microbianos
e incluyen cepas de los géneros Microbacterium, Micrococcus, Enterococcus, Streptococcus,
Arthrobacter, Lactobacillus, y bacterias formadoras de esporas pertenecientes a los géneros Bacillus,
Paenibacillus y Clostridium. (Valbuena et al., 2004: p.9)
21
1.8.1. Géneros de mayor importancia
1.8.1.1. Género Bacillus
El género Bacillus es de especial importancia debido a su consideración como potencial patógeno de

los alimentos; su presencia es común en la leche. Gracias a investigaciones se ha confirmado que el
aumento de temperatura influye en la capacidad reproductiva de este género. (Science, 2007: p.7)
1.8.1.2. Género Lactobacillus
El género Lactobacillus es considerado beneficioso para la salud humana y animal porque pueden ser
utilizados como probióticos. Debido a su capacidad antagónica, que favorece a la producción de
metabolitos inhibidores como H2O2, ácidos orgánicos y otros derivados de compuestos aromáticos
como glicerol, enzimas bacteriolíticas, bacteriocinas. (Samaniego Fernandez Luz M., 2010: p.1)
Las bacterias heterolácticas en la industria de los alimentos se consideran de mayor importancia por
la producción de compuestos como el acetaldehído y diaceltaldehído; que tienen la propiedad de
intensificar el sabor y aroma de los productos. (Ramírez et al., 2011: p. 2)
1.9. Tinción Gram
Esta técnica permite la diferenciación taxonómica de bacterias en función de su capacidad para

retener o no determinados colorantes, clasificándolas en dos grandes grupos: (López-Hontangas, Castillo
y Salavert , 2007: p.30)
 Gram-positivas (color violeta azulado)

 Gram-negativas (color rojo-rosado)
22
Tabla 2-1: Procedimiento de la Tinción Gram
COLORANTES MODO DE ACCIÓN
Cristal Violeta Es el colorante primerio y se fija con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Lugol Es el mordiente e impide la salida del colorante primario debido a la formación del complejo
cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana.
Alcohol-acetona Deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma por lo que actúa como
decolorante.
Safranina Tiñe las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo; es decir se usa como
colorante secundario.
Fuente: López, 2014. (Tinciones básicas en el laboratorio de microbiología)
Realizado por: Gisela Ramos. 2018
Figura 1-1: Apariencia de bacterias Gram positivas

y Gram negativas mediante Tinción Gram
Fuente: (Vizcarrondo y Gutiérrez 2008). Morfología de mo.
Por lo cual los géneros esporulados Bacillus y Clostridium son significativos para la industria láctea
debido a su amplia distribución en los ambientes naturales y aunque su concentración inicial en la
leche sea mínima pueden esporular y resistir los tratamientos térmicos. (Nicholson et al., 2000: p.550)
23
1.10. Medios de cultivo
Un medio de cultivo contiene un conjunto de componentes (macronutrientes, micronutrientes,

factores de crecimiento) que crean las condiciones que favorecen el desarrollo de los microrganismos.
(Doménech y García, 2009: p.1)
1.10.1. Tipos de medios de cultivo
Existe una gran variedad de medios de cultivo utilizados en el mercado, su técnica y utilización
depende de la naturaleza de la investigación que se realice. (Brooks et al., 2011: p.70)
Medios sólidos: Permiten aislar todas las bacterias presentes en una muestra cualquiera. (Medina, 2012:
p. 9)
Medios líquidos: Se utilizan para aislar bacterias en donde su concentración sea mínima. (Medina, 2012:
p. 9)
Medio complejo: Son medios comúnmente utilizados, formados por tejidos animales y vegetales, por
lo que su composición que no es está exactamente definida. Su desventaja es que en condiciones
experimentales la reproductibilidad no puede ser exacta. (Medina, 2012: p.12)
Medio de enriquecimiento: Son sustancias nutritivas normales que incorporan factores indispensables
para el crecimiento de microorganismos exigentes. (Medina, 2012: p.10)
Medios selectivos: Permiten aislar bacterias a partir poblaciones mixtas; contienen sustancias que
favorecen e inhiben el crecimiento de algunas bacterias como: cloruro de sodio, citrato sódico,
cristal violeta, sales biliares, antibióticos, antisépticos. (Fernández Olmos et al., 2010: p.5)
Medios diferenciales: Ayudan dilucidar las características distintivas de las colonias en función del
color que estas presenten. (Fernández Olmos et al., 2010: p.5)
24
1.10.2. Composición Química de Medios
A continuación, se detalla en tablas la composición química de los medios de cultivo a utilizarse
Agar MRS
Gracias a la composición de glucosa, peptona, manganeso y magnesio, este medio es ideal para el
crecimiento de todas las cepas de Lactobacillus, incluso de cepas de cultivo difícil y lento; además se
obtiene un mejor crecimiento con la modificación del pH hasta un valor aproximado de 5.5. Sin
embargo, dificulta la gelificación del medio. (Panreac Química S.A, 2000: p.86)
Tabla 3-1: Medio de cultivo Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe)

Concentración del medio
Ingrediente
g/L
di- Amonio Hidrógeno Citrato 2,0
Extracto de carne 8,0
Extracto de levadura 4,0
D (+)- Glucosa 20,0
Magnesio Sulfato 0,2
Manganeso (II) Sulfato 0,05
Peptona Bacteriológica 10,0
di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0
Sodio Acetato 5,0
Tween 80 1,0
Agar 10,0
Fuente: Panreac Quimica SA, 2000. (Manual Básico de Microbiología) p.86

Cultivo de Agua Peptonada
Este medio es empleado como diluyente en muestras alimentarias, diversos materiales e inclusive
agua. Además, debido a su elevada concentración de triptófano puede ser usado para la determinación
de microrganismos Indol-positivos. (Panreac Química S.A, 2000: p.8)
25
Tabla 4-1: Medio de cultivo Agua Peptonada
Ingrediente
g/L
Peptona 10
Cloruro de sodio 5
Caldo MRS
El caldo MRS es utilizado para el enriquecimiento de productos alimenticios en general de productos

lácteos, además permite determinar microrganismos mediante el método del NMP. (Panreac Química
S.A, 2000: p.86)
Tabla 5-1: Medio de cultivo Caldo MRS (Man, Rogosa y Sharpe)

Ingrediente
g/L
di- Amonio Hidrógeno Citrato 2,0
Extracto de carne 8,0
D (+)- Glucosa 20,0
Magnesio Sulfato 0,2
Manganeso (II) Sulfato 0,05
Peptona Bacteriológica 10,0
di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0
Sodio Acetato 5,0
Tween 80 1,0

Realizado por: Gisela Ramos, 2018
Agar PCA
El medio Plate Count Agar es utilizado para realizar la determinación microbiológicos de agua, leche,
comida y otros productos lácteos. (Group, 2017: p.1)
26
Tabla 6-1: Medio de cultivo Plate Count Agar (PCA)
Ingrediente
g/L
Triptona 5,0
Dextrosa 1,0
Agar 12,0
Fuente: (Group 2017b) Plate Count Agar

Medio SIM
El medio SIM generalmente es utilizado para la diferenciación e identificación de Enterobacterias

debido a la producción de sulfuro, indol y movilidad. (Panreac Quimica SA, 2000: p.119)
Tabla 7-1: Medio de cultivo SIM

Ingrediente
g/L
Amonio Hierro(III) Sulfato 0,2
Peptona de Carne 6,1
Peptona de Caseína 20,0
Sodio Tiosulfato 0,2
Agar 3,5
Agar Müller-Hinton
Este medio debido a su composición es recomendado generalmente para la determinación de

susceptibilidad antimicrobiana, ya que es un medio nutritivo no selectivo que favorece el desarrollo
microbiano, por lo que ha sido recomendado por el Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI)
para la ejecución de antibiogramas en medio sólido debido a la buena reproducibilidad en pruebas de
sensibilidad. (Group, 2017; p.1)
27
Tabla 8-1: Medio de cultivo Agar Müller-Hinton
Ingrediente
g/L
Caseína ácida hidrolizada 17,5
Pasta de extracto de corazón 5,0
Almidón 1,5
Agar 12,0
Fuente: (Group 2017) Mueller Hinton Agar p.1

1.11. Pruebas Microbiológicas de Identificación Preliminar - Lectura inmediata
1.11.1. Catalasa
Enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen citocromos, esta permite
hidrolizar el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso liberándolo en forma de burbujas.
(Fernández Olmos et al., 2010: p.6)
1.11.2. Oxidasa
Determina la presencia de enzimas oxidasas y su reacción se debe al sistema conocido como

citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo; el cual es reducido por el oxígeno molecular
produciendo agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. (Fernández Olmos et al., 2010, p.6)
1.12. Pruebas microbiológicas rápidas
1.12.1. Movilidad
Determina si un organismo es móvil o inmóvil. Principalmente los bacilos tienen movilidad debido a
que poseen flagelos, sin embargo, existen algunos cocos que son móviles. (Lira et al., 2003: p.96)
28
1.12.2. Indol
Prueba empleada para identificar la liberación de indol en un cultivo bacteriano, debido a la acción
de la enzima triptofanasa sobre el aminoácido triptófano. (Fernández Olmos et al.; 2010: p.7)
1.13. Pruebas microbiológicas-Reacción superada las 6 horas
1.13.1. Hidrólisis de Gelatina
Permite conocer la capacidad que poseen ciertos microrganismos para hidrolizar la gelatina,
convirtiéndolos en aminoácidos y péptidos por la acción de enzimas especificas conocidas como
gelatinasas. (Fernández Olmos et al.; 2010: p.7)
1.14. Pruebas de identificación de bacterias termodúricas
Para lograr su multiplicación, estas bacterias requieren de elevadas temperaturas, es decir que para
determinar su presencia se debe realizar un tratamiento térmico en baño de María a 80ºC durante 10
min. (Coorevits et al., 2011: p.18)
Su determinación será eficiente mediante siembra en superficie utilizando Caldo MRS, además Agar
PCA. A partir de estas se identifica por sus características morfológicas diferentes colonias para luego
ser aisladas en el mismo medio y posteriormente identificadas mediante pruebas fenotípicas tales
como catalasa, oxidasa, SIM, hidrólisis de gelatina y susceptibilidad a antibióticos. (Moreno, 2011: p.18)
1.15. Susceptibilidad Antimicrobiana
El estudio de susceptibilidad antimicrobiana tiene por objetivo evaluar la respuesta que presenta un
microorganismo a uno o varios antimicrobianos, reflejando de este modo su capacidad para inhibir el
crecimiento de una bacteria o conjunto bacteriano. (Picazo et al., 2000: p.4)
29
1.15.1. Antibióticos
Son sustancias producidas por el metabolismo de organismos vivos, principalmente hongos y

bacterias; éstos tienen la capacidad de inhibir el crecimiento o destruir microorganismos. (Seija y
Vignoli, 2006: p.631). Su uso frecuente ha extendido el término de antibiótico a aquellos agentes
antibacterianos sintéticos como sulfonamidas y quinolonas. (Volfredo, 2010: p.7)
1.15.2. Discos antibióticos

Discos que contienen concentraciones predeterminadas de antibióticos permitiendo una correlación
más o menos precisa de la concentración inhibitoria de dichos antibióticos. (Bernal R. y Guzmán, 1984:
p.112)
 Eritromicina
Este antibiótico bacteriostático de moderada o rápida absorción; tiene la capacidad de estar

presente en leche hasta 72 horas equivalente a 6 ordeños y 30 días en carne después del último
tratamiento. (Carmona Solano y Vindas 2006; p. 51)
 Amoxicilina
Posee un amplio espectro pues actúa contra bacterias gram positivas y negativas; empelándose
como un bactericida en infecciones del ser humano y veterinarias (Mora y García 2007; p.53); puede
durar en leche hasta 72 horas y en carne 21 días.
 Gentamicina
Es un antibiótico bactericida que posee un amplio espectro de acción sobre bacterias gram
positivas y gram negativas; posee además un efecto post - antibiótico prologado por lo que su
rastro demora 80 días en carne y 96 horas en leche equivalente a 8 ordeños luego del último
tratamiento. (Mora y García 2007; p.42)
30
 Vancomicina
Pertenece al grupo de glucopéptidos con efecto bactericida. Posee un amplio espectro de acción
actuando sobre la mayor parte de bacterias gram positivas; además posee una casi exclusiva
excreción glomerular por lo que está presente en leche. (Mora y García 2007; p.96)
 Tetraciclina
Antibiótico de uso bacteriostático, poseen un espectro de acción amplio pues actúan sobre bacilos
y cocos gram positivos, bacilos gram negativos; su metabolismo es parcial y su excreción es por
filtración glomerular por lo que su rastreo en leche es de 72 horas y 28 días en carne. (Mora y García
2007; p.65)
1.15.3. Resistencia Antimicrobiana
Las terapias prolongadas con el uso de antibióticos de vía oral y/o parenteral conllevan al desarrollo
de cepas resistentes, las cuales no solo se pueden transferir a bacterias patógenas sino también a las
no patógenas. (Okolo, 1986: p.23)
1.16. Mantenimiento de cultivos
El mantenimiento de cultivo son procedimientos que a veces no son considerados como una prioridad
dentro del laboratorio, sin embargo; el desarrollo de medicamentos, aminoácidos, etc. ha generado la
necesidad de llevar a cabo procedimientos de mantenimiento que puedan brindar una mayor
estabilidad de las características de interés las cuales puedan ser aprovechadas en el campo industrial
o de investigación. (Leal y Ramírez, 2005: p.4)
Por otra parte, no existe un método universal de conservación debido a que existen diferentes grupos
taxonómicos en los que sus características de interés se ven afectadas pues su comportamiento es
diferente.
1.16.1. Métodos de conservación a corto plazo
31
 Subcultivo
Permite la inoculación de un cultivo en un medio fresco que favorezca su crecimiento y

almacenamiento; este método se basa en trasladar el cultivo a un medio fresco antes de que este
perezca. Este método es de bajo costo y aplicable en diferentes microrganismos, sin embargo,
existe un alto riesgo de contaminación del subcultivo, pérdida de las características y mutación.
(Instituto de Biotecnología, 2016: p.21)
 Inmersión en Aceite
Existen algunas bacterias las cuales pueden sobrevivir en aceite mineral de grado medicinal o con
parafina de gravedad específica durante meses e inclusive años. Este método preserva a los
cultivos mayores periodos de tiempo, sin embargo, las desventajas son iguales a las
experimentadas en el subcultivo. (Instituto de Biotecnología, 2016: p.22)
 Congelación Ordinaria -20ºC
Su conservación se mantiene a una temperatura de -20°C, y el éxito del mantenimiento se ve

sesgado por el tipo de microrganismos a conservar puesto que no todos reaccionan de manera
similar. El tiempo de conservación oscila entre los 6 meses y los 2 años, pero no es muy
recomendable debido al daño celular que producen a nivel de congelación. (Instituto de Biotecnología,
2016: p.23)
 Baja Congelación -70ºC
Esta conservación de cultivos se realiza a una temperatura de -70°C y es utilizado para una gran
variedad de bacterias, constituye un método fácil, rápido y su preservación ofrece una viabilidad
durante periodos de tiempo prologados, sin embargo, el equipo a utilizar posee un alto costo y no
es recomendable en muestras que se necesitan utilizar con frecuencia. (Instituto de Biotecnología, 2016:
p.24)
32
 Secado
Este método es utilizado en el mantenimiento de cultivos de hongos, en donde se procede a la

remoción del agua previniendo la rehidratación. Este método de desecación puede llevarse a
cabo mediante el uso de suelo o arena, papel de filtro, tapones pre - secados, gelatina, sílica gel,
perlas de vidrio y porcelana. (Instituto de Biotecnología, 2016: p.26)
1.16.2. Métodos de conservación a largo plazo
 Liofilización
Es uno de los métodos más empleados debido a las ventajas que presenta, entre las más
importantes resalta el tiempo de supervivencia prologando que alcanza una viabilidad de 50 años,
además de que permite lograr una buena estabilidad del material liofilizado.
Se pueden conservar cultivos de bacterias, hongos, levaduras y algunos virus, pero su eficiencia
se ve afectada en el mantenimiento de algas, protozoos, células animales y plantas. La
laboriosidad del proceso y el precio del equipo de liofilización constituyen las principales
desventajas del proceso. (Burguet, 2012: p.1)
 Ultracongelación
El método de ultracongelación a -140ºC (Fase vapor) y -196ºC (Fase líquida), se utilizado para
mantener cultivos que no pueden ser preservados por ningún otro método. Uno de los riesgos que
presenta el método es la pérdida del material biológico el cual puede disminuir mediante el uso
de agentes crioprotectores y el control de variables como condiciones de crecimiento,
congelación y descongelación.
Se considera un método económico, sin embargo, la evaporación del nitrógeno líquido predispone
la pérdida completa de cultivos, además existe el riesgo de explosión de los viales. (Instituto de
Biotecnología, 2016: p.36)
33
CAPITULO II
2. MARCO METODOLÓGICO
2.1. Tipo de investigación
Según la característica del objeto de estudio: Cualitativo.

Según el periodo y secuencia de estudio: Transversal.
Según el análisis y alcance de resultados: Descriptivo y observacional.
2.2. Diseño de la investigación
Estudio no experimental, pues permite trabajar de manera directa con el objeto de estudio.
2.3. Unidad de análisis
Tres tipos de muestras: Leche cruda, leche pasterizada en la quesera y leche pasterizada en el
laboratorio.
2.4. Localización del muestreo y población de estudio
Leche utilizada para la elaboración de quesos frescos en dos Queseras codificadas Q1 y Q2 ubicadas
en la parroquia rural de Quimiag, cantón Riobamba, provincia de Chimborazo.
2.5. Lugar de la investigación
Las muestras recolectadas se analizaron en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias

de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo.
34
2.6. Etapas de la investigación
En el siguiente esquema se muestra la metodología llevada a cabo durante la investigación
35
2.7. Métodos y técnicas
En las queseras Q1 y Q2 ubicadas en la Parroquia Rural de Quimiag se realizó el recuento

microbiológico de aerobios mesófilos y bacterias ácido lácticas termodúricas; de la leche utilizada
para la elaboración de quesos frescos artesanales, las muestras obtenidas fueron recolectadas
directamente de las marmitas a frascos estériles de vidrio de 200mL antes (leche cruda) y después del
tratamiento térmico (leche pasterizada), (Anexo A).
Posterior a la recolección, las muestras se almacenaron a una temperatura de ±4°C y se transportaron

en un cooler hasta el Laboratorio de Biotecnología ubicado en la Facultad de Ciencias de la Escuela
Superior Politécnica de Chimborazo para los estudios microbiológicos.
2.8. Pre ensayos para determinar dilución y temperatura para el crecimiento de

bacterias ácido lácticas y termodúricas
En la tabla 1-2 se dan a conocer los pre ensayos realizados para el recuento y verificación de
microrganismos termodúricos, los cuales permitan crear un ambiente adecuado para el crecimiento
de bacterias ácido lácticas termodúricas.
Tabla 1-2: Pre ensayos utilizados en la investigación
Pre Tipo de muestra Medio Tipo de Capa pH Incubación

ensayo siembra sellante
1 Leche cruda MRS Superficie No (6.0±0.2)
Leche pasterizada en PCA Superficie No 37°C
laboratorio* Vertido en placa No (7.0±0.2) (3 días)
2 Leche pasterizada en MRS Superficie No (4.5)
laboratorio* Vertido en placa Si (delgada) 37°C
(3días)
Leche cruda 30°C
3 Leche pasterizada en MRS Vertido en placa Si (delgada) (5.4) (5 días)
laboratorio* 37°C
(3 días)
4 Leche pasterizada en
laboratorio* MRS Vertido en placa Si (gruesa) (5.4) 30°C
(5días)
Leche pasterizada en laboratorio * shock térmico 63°C (30min) baño María termatizado;  4°C baño de hielo.
36
Una vez determinado que el cuarto pre ensayo es el adecuado para el crecimiento de bacterias
termodúricas, se realiza los ensayos para recuento y posterior aislamiento e identificación con pruebas
bioquímicas.
2.9. Preparación de Diluciones para la siembra en los medios de cultivo PCA, MRS
En la figura 2-2 se observan las diluciones utilizadas para el recuento de baterías ácido lácticas
Figura 2-2: Técnica de diluciones.

Fuente: (Manual de prácticas de laboratorio. Microbiología General) p.48
A continuación, se describe el procedimiento utilizado:
a) Se preparó tubos estériles con 9mL de agua peptonada

b) Se homogenizó los frascos que contienen las muestras de la leche cruda, leche con tratamiento
térmico de la quesera y tratamiento in vitro.
c) Se tomó 1mL de leche cruda, leche pasterizada en la quesera y leche pasterizada en el laboratorio
utilizando una micro pipeta automática para posteriormente agregar en los tubos con 9mL de agua
peptonada estéril.
d) Se mezcló con movimientos suaves cada uno de los tubos; obteniendo la primera dilución (10-1).
37
e) Se transfirió 1 mL del a primera dilución con la micro pipeta automática a otro tubo con 90mL
de agua peptonada estéril, se homogenizó y se obtuvo la segunda dilución (10-2).
f) Se repitió este proceso hasta conseguir el número de diluciones requerido para cada tipo de
muestra.
Tabla 2-2: Diluciones para Recuento de Bacterias Termodúricas

Muestra Dilución
Leche cruda 10-6 , 10-7
Leche con tratamiento térmico de la quesera Directo, 10-1
Leche con tratamiento in vitro en el laboratorio Directo, 10-2
Realizado por: Gisela Ramos, 2018.
2.10. Preparación de medios
2.10.1. Medio MRS
1) Se realizó los cálculos correspondientes dependiendo de los mL de medio a preparar, utilizando

las indicaciones del envase.
2) Se pesó y se diluyó en agua destilada hasta conseguir una disolución completa.
3) Se llevó a ebullición hasta que el medio este totalmente clarificado.
4) Se acidificó el medio con Ácido acético hasta un pH de 5.4.
5) Se esterilizó en autoclave a 121°C (30 min) y 1 atm de presión.
2.10.2. Caldo MRS
1) Se realizó los cálculos correspondientes utilizando las indicaciones del envase.

2) Se pesó y se diluyó en agua destilada el caldo.
3) Se llevó a ebullición hasta obtener un caldo clarificado
4) Se distribuyó 3mL de caldo en cada tubo de ensayo de tapa rosca
5) Se esterilizó en autoclave a 121°C (30 min) y 1atm de presión. (Anexo C)
38
2.10.3. Agar PCA, SIM, Müeller-Hinton
1) Se realizó los cálculos correspondientes dependiendo del volumen del medio a preparar,
utilizando las indicaciones del envase.
2) Se pesó los gramos de cada medio y se diluyo completamente en agua destilada.
3) Se llevó a ebullición hasta lograr una clarificación completa del medio.
4) Se esterilizó en la autoclave a 121°C (30 min) y 1atm de presión.
2.11. Métodos de siembra
2.11.1. Siembra por inmersión o vertido en placa
Una vez preparado el agar y las diluciones necesarias se procede de la siguiente manera a la siembra
por triplicado de la muestra a analizar bajo cámara de flujo:
1) Se tomó 1mL de la dilución correspondiente y se depositó en una caja petri previamente rotulada.
2) Se añadió 15 mL aproximadamente de estéril sobre la muestra.
3) Se dio ligeros movimientos circulares y de vaivén hasta que el inóculo y el agar se encuentren
completamente homogéneos.
4) Se dejó secar y se añade una capa sellante de medio para garantizar el crecimiento de bacterias
anaerobias como lo describe (Bianchi y Ii 2010: p.2)
5) Se invirtió las cajas petri y se incubó a 30°C durante 5días (medio MRS), durante 2 días (medio
PCA).
2.11.2. Siembra por punción
A continuación, se describe el método de siembra por punción (Aquiahuatl, 2004: p.38)
1) Se preparó el medio utilizar y se colocó en tubos de ensayo tapa rosca.

2) Con ayuda de una aguja de inoculación se toma la muestra a sembrar y se inoculó en el medio
antes preparado.
3) Se incubó los tubos y se reportó los resultados.
39
2.11.3. Siembra por estriamiento
Este método es utilizado para el aislamiento de microrganismos. A continuación, se describe su

proceso: (Aquiahuatl, 2004: p.40)
1. Se preparó el medio a utilizar y se rotuló previamente las cajas petri.

2. Se procedió a tomar la muestra con un asa de inoculación.
3. Se rozó con el aza la superficie del agar y se empezó a realizar movimientos en forma de
estría.
4. Se rozó nuevamente la estría original y se hizo el segundo estriado.
5. Se repitió el proceso durante 4 o 5 veces, sin olvidar que la última estría debe ser más abierta
en comparación con las anteriores.
2.12. Recuento de colonias (método de Recuento en placa)
Finalizado el tiempo de incubación se llevó a cabo el recuento de microorganismos termodúricos

(Anexo B), por el conteo de colonias visibles en los medios de cultivo, para lo cual se anotó el número
de colonias contadas y la dilución correspondiente. En el reporte de las mismas se consideró tanto la
dilución de la muestra como el número de colonias contadas. (Camacho et al. 2009: p.9)
2.13. Aislamiento de cepas bacterianas
Las cepas obtenidas en medio MRS fueron aisladas de acuerdo a criterios de selección como forma,
color, tamaño, elevación, bordes (Delgadillo, González y Hernández, 2002: p.9); a continuación, con ayuda
de un asa de siembra se tomó una colonia y se realizó siembras sucesivas por el método de
estriamiento, para luego ser incubadas en jarras GasPak durante 5 días a 30°C; finiquitado el tiempo
de incubación se eligió la colonia más aislada y se procedió a realizar la caracterización fenotípica.
Este proceso se ejecutó tres veces hasta obtener aislados puros de bacterias ácido lácticas
termodúricas mediante resiembras sucesivas en medio MRS por estriado (Anexo D).
40
2.14. Características fenotípicas
2.14.1. Caracterización macroscópica
La caracterización macroscópica de las cepas aisladas se realizó mediante la observación directa de

las colonias considerando características como el borde, color, elevación, forma y tamaño. (Delgadillo,
González y Hernández, 2002: p.9)
2.14.2. Caracterización microscópica
La caracterización microscópica se realizó mediante la observación en microscopio utilizando la

tinción diferencial de Gram, para lo cual se realizó un frotis de la colonia bacteriana previamente
aislada. A continuación, se describe la metodología utilizada en la Tinción diferencial Gram. (Anexo
F)
1) Se colocó una gota de azul de metileno sobre la placa portaobjetos y se dejó actuar durante 1
minuto.
2) Se lavó con agua destilada y se colocó una gota de Lugol durante 1 minuto.
3) Se lavó nuevamente con agua destilada y se colocó una gota de alcohol acetona y se dejó actuar
por 30 minutos.
4) Se lavó con lagua destilada y se agregó una gota de safranina y se dejó actuar por 1 minutos
5) Se lavó y se dejó secar la placa portaobjetos.
6) En el portaobjetos seco se colocó una gota de aceite de inmersión y se observó al microscopio
óptico con lente de 100X.
2.14.3. Caracterización bioquímica
Prueba de Catalasa
Para la determinación de catalasa se colocó una gota de peróxido de hidrógeno al 3% sobre la colonia
previamente aislada e inmediatamente se observó si existe o no el desprendimiento de burbujas.
41
La prueba se reporta como positiva cuando se evidencia la presencia de burbujas; caso contrario el
resultado es negativo. (Anexo E)
Prueba de Oxidasa
Utilizando un asa de siembra se tomó una colonia previamente aislada y fresca para colocarla sobre
la tira reactiva de oxidasa. Si se observa una coloración morada dentro de los 30 segundos se reporta
como positivo; sin embargo, si la tira reactiva mantiene su color blanco original su resultado es
negativo. (Anexo E)
Prueba Sulfuro Indol Motilidad (SIM)
Una vez preparado el medio SIM y correctamente rotulados los tubos de ensayo tapa rosca, con ayuda
de una aguja de inoculación se tomó una colonia aislada y se procedió a inocular en un tubo; para
luego ser incubado a 35°C durante 48 horas. Una prueba SIM se considera positiva cuando el
crecimiento no se limita a la zona de inoculación, sino que tiende a crecer en todo el medio.
A su vez, la producción de indol se evidenció mediante la adición de algunas gotas del reactivo de
Kovacs sobre el cultivo. (Anexo G)
2.14.4. Prueba de hidrólisis de gelatina
Se preparó agar gelatina utilizando las indicaciones de preparación; con ayuda de una aguja de
inoculación se tomó una muestra de la cepa aislada y se inoculó en los tubos con agar gelatina
utilizando el método de punción. A continuación, se incubó a 35°C durante el lapso de 2 días.
Para realizar la lectura de las pruebas se sometieron los tubos a una temperatura de 4°C durante dos
horas y se observó si evidencia o no la hidrólisis del medio.
42
2.14.5. Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana
La prueba de susceptibilidad antimicrobiana se realizó con un cultivo fresco y puro de cada cepa
bacteriana previamente aislada; en donde se preparó un cultivo overnight hasta que la turbidez llegue
a la escala de 0,5 MacFarland. Con ayuda de un hisopo estéril se sembró en las cajas petri con medio
MRS utilizando la técnica de Kirby-Buaer. Posterior a la siembra se colocó los discos de sensibilidad
de los diferentes antibióticos y se incubó a 37°C (48 horas). Finalmente, para el reporte de resultados
se midió el halo de inhibición (Anexo 10).
2.15. Conservación de cepas bacterianas
La técnica de conservación de las bacterias aisladas en la leche se detalla a continuación: (Anexo I)
Se preparó por cada cepa aislada un erlenmeyer con caldo MRS y una solución de glicerol al 30%,
los mismos que fueron esterilizados a 121°C (15min) y a 1 atm de presión en autoclave de vapor
húmedo. Posterior a esto se inoculó una colonia bacteriana aislada en el caldo para realizar un cultivo
overnight a 33°C.
El cultivo overnight se agregó sobre la solución estéril de glicerol al 30% y con movimientos leves
se agitó hasta lograr una completa homogenización; finalmente se distribuyó en tubos eppendorf
previamente rotulados y se conservó en un ultracongelador a -20°C para su mantenimiento.
2.16. Reactivación de cepas bacterianas mantenidas por el método de congelación ordinaria

a -20°C
Para corroborar la viabilidad de las bacterias ácido lácticas termodúricas preservadas se reactivó las
cepas con el procedimiento que se detalla a continuación:
Los tubos eppendorf completamente sellados fueron retirados del ultracongelador, antes de proceder
a la recuperación de las cepas se esperó que los tubos estén completamente descongelados. Posterior
a y esto con ayuda de un asa de siembra se inoculó cada cepa en tubos con caldo MRS previamente
43
preparado y esterilizado. Finalmente se incubó a 33°C (dos días) para su posterior siembra en medio
MRS para su recuento.
2.17. Prueba de Viabilidad
Para llevar a cabo la prueba de viabilidad se siguió el siguiente procedimiento que se detalla a
continuación: (Anexo H)
Se preparó 900µL de agua peptonada en viales eppendorf y se esterilizó a 121°C (15min) a 1 atm de
presión. Se realizó además las diluciones necesarias de las bacterias reactivadas utilizando agua
peptonada. La siembra se realizó de las diluciones 10-1, 10-3, 10-5 y 10-7, se sembró 100 µL de muestra
en medio MRS por el método de vertido en placa. Se incubó a 30°C por 3 días; por último, se realizó
el recuento y el correspondiente reporte de los resultados.
44
CAPITULO III
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Recuentos bacterianos
En la tabla 1-3 se observa los resultados del recuento de aerobios mesófilos en medio PCA de la leche
cruda, pasteriza en la quesera y pasterizada en el laboratorio de las muestras obtenidas en las queseras
Q1 y Q2.
Tabla 1-3: Recuento de Aerobios mesófilos en medio PCA

Quesera MUESTRAS
Leche cruda Leche con Leche con
Tratamiento realizado Tratamiento realizado
en la quesera en el laboratorio*
MUESTREO MAX** MUESTREO MAX*** MUESTREO MAX***
1 2 3 1 2 3 1 2 3
Q1 9,19 7,80 8,02 0,00 2,12 2,88 1,56 3,87 3,79
± ± ± ± ± ± ± ± ±
0,01 0,28 0,06 6,17 log 0,00 0,23 0,17 4,69 log 0,31 0,18 0,30 4,69 log
Q2 9,21 7,83 7,89 UFC/mL 1,05 2,19 0,00 UFC/mL 1,43 3,30 4,64 UFC/mL
± ± ± ± ± ± ± ± ±
0,16 0,25 0,05 0,07 0,22 0,00 0,05 0,37 0,51
Leche pasterizada (laboratorio)*: 63°C durante 30min, enfriamiento a 4°C en baño de hielo
** NTE INEN 009:2015
*** NTE INEN 10:2012
El recuento de este grupo de microorganismos da a conocer la calidad higiénica de un alimento por

lo que son utilizados como indicadores de calidad higiénico – sanitaria (Campuzano F. et al. 2015 p.3), de
acuerdo a los recuentos encontrados en la leche cruda de los tres muestreos se evidencia claramente
como sobrepasan el limite permisible (6,17 log UFC/mL) establecido por la Norma NTE INEN
009:2015
45
El recuento elevado de aerobios mesófilos podría deberse a las deficientes prácticas de higiene en la
manipulación del ganado durante el ordeño, además una refrigeración y almacenamiento inadecuado
después de que esta ha sido obtenida. (Marcela et al. 2016, p. 81)
De acuerdo a la investigación realizada y los resultados obtenidos por (A. Díaz et al. 2016, p. 3) se puede
afirmar que una leche cruda con un alto recuento de microrganismos afecta directamente la inocuidad
de la leche pasteurizada, desencadenando un problema de salud pública puesto que mediante
tratamientos de pasteurización los recuentos de estos microorganismos disminuyen pero no en su
totalidad, por lo que es imprescindible mejorar los protocolos de limpieza dentro de las instalaciones
de estas queseras.
La leche pasterizada en el laboratorio (tratamiento de 63°C durante 30min y luego enfriamiento hasta
los 4°C en baño de hielo) y la leche pasterizada en quesera mostraron recuentos que se encuentran
dentro de los límites permisibles establecidos por la norma NTE INEN 10:2012. Sin embargo, hay
que considerar que esta última recibe un tratamiento más drástico que va desde los 90°C y desciende
hasta los 65°C.
Cabe mencionar que un tratamiento térmico aplicado a la leche con temperaturas y tiempos
prolongados puede modificar el color, sabor, nutrientes, estabilidad de la solución coloidal y la
emulsión de la grasa, afectando no solo su valor nutricional sino también su aspecto físico. (Sarriá 2008,
p. 19)
3.1.1. Recuento de bacterias ácido lácticas en medio MRS
Las bacterias ácido lácticas constituyen la microbiota natural de la leche y son importantes en el
proceso de elaboración del queso por su capacidad acidificante y por sus atributos de sabor y aroma.
De ahí que consideramos interesante el estudiar su capacidad de sobrevivir al tratamiento térmico que
se aplica en la elaboración de quesos artesanales.
Para la recuperación de bacterias ácido lácticas a partir de la leche usada para la elaboración de quesos
artesanales se empleó el medio Man Rogosa Sharpe como medio selectivo para Lactobacillus y otras
bacterias ácido lácticas. Este medio posee cofactores que fortalece a estas bacterias, pero por su pH e
46
inhibidores añadidos puede afectar negativamente el crecimiento de otros microorganismos.
(Laboratories 2015, p1). En la tabla 2-3 se presentan los resultados de los recuentos de bacterias ácido
lácticas termodúricas en medio MRS de las muestras obtenidas en las queseras Q1 y Q2, y el
porcentaje de reducción alcanzado.
Tabla 2-3: Recuento de bacterias ácido lácticas en medio MRS
MUESTRAS
Leche con Leche con % %
Tratamiento Tratamiento reducción reducción
Quesera Leche cruda
realizado en la realizado en el LPQ**** LPL*****
quesera laboratorio*
MUESTREO MUESTREO MUESTREO
1 2 3 1 2 3 1 2 3
0,845 0,871 0,865 0,250 0,230 0,629 0,52 0,670 0,417
Q1 ± ± ± ± ± ± ± ± ±
1,41 0,62 0,21 0,14 0,43 2,09 0,00 0,46 0,83 57% 38%
0,845 0,870 0,854 0,18 0,107 0,000 0,30 0,427 0,377
Q2 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 89% 57%
1,41 0,57 0,20 0,71 0,14 0,00 3,54 0,47 1,21
Tratamiento realizado en el laboratorio*: (63°C durante 30 min, enfriamiento a 4°C en baño de hielo)
LPQ**** Leche pasterizada en quesera
LPL***** Leche pasterizada en laboratorio
Las bacterias termodúricas son utilizadas en la industria como marcadores de calidad higiénico-
sanitaria, por lo que su presencia en leche es producto de una inadecuada higiene durante el ordeño
(Marcela et al. 2016). Al existir factores favorables como: tiempo de generación corto y temperatura de
reproducción óptima una bacteria puede convertirse en un millón de bacterias en 0.5h, dando como
resultado alimentos altamente perecederos, por lo que es necesario detener este proceso. (Zavala 2013,
p 2).
También existen géneros de microorganismos termodúricos de gran importancia dentro de la industria

alimentaria tales como Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, y
Pediococcus; entre algunos de ellos los géneros Lactobacillus, Saccharomyces, Lactococcus y
Bifidobacterium (Ogueke, 2010), pueden ser utilizados como probióticos debido a los beneficios que
47
brinda en el ser humano y animales. (Sánchez et al. 2011, p 1); además contribuyen significativamente en
las características sensoriales (Ramírez et al. 2011, p. 3), valor nutricional y propiedades terapéuticas. (Parra
Huertas 2010; p.93).
En cuanto al porcentaje de reducción de los microrganismos termodúricos en la tabla 2-3 se aprecia

que el mayor porcentaje correspondió a las muestras Q1 (57%) y Q2 (89%); pudiendo atribuirse a
que el tratamiento recibido en las queseras sobrepasa la temperatura de 63°C y por un tiempo que
supera al de tratamiento en el laboratorio. Además, el tratamiento en las queseras no aplica choque
térmico, tratamiento drástico que reduce de manera considerable la carga microbiana nativa patógena
y benéfica (Victoria-León et al. 2006, p.135), reduciendo tanto las características nutritivas y sensoriales
del producto final.
Estos resultados no son alentadores considerando que las bacterias ácido lácticas son utilizadas en la
industria de alimentos no solamente por su habilidad para acidificar sino también por su implicación
en la textura, sabor, olor y desarrollo de aroma de alimentos fermentados.
3.2. Caracterización morfológica de bacterias ácido lácticas termodúricas
En general las características de las colonias bacterianas ocurren en diversos grados y combinaciones
debido a que poseen medida, forma, textura y color característico dependiendo del medio en el que
se encuentran, de la especie bacteriana y bajo las condiciones a las que se encuentran sometidas; es
por esto que son utilizadas para la identificación bacteriana. En la tabla 3-3 se muestran los resultados
de las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de los aislados obtenidos a partir
de leche cruda que se utiliza en la elaboración de queso.
48
Tabla 3-3: Morfología macro y microscópica de los aislados de BAL
N° de aislado Código Morfología macroscópica Morfología Microscópica

Forma Color Elevación Tamaño Superfici Borde Tinción Gram
e
1 2M Circular blanca Convexa 2 mm Lisa Regular COCOS (+) no esporulados
2 3M Circular blanca Convexa 2 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
3 LCFC1 Circular blanca Convexa 3 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
4 LCFC3 Circular blanca Convexa 3,5 mm Lisa Regular BACILOS (-) no esporulados
5 LCT1 Circular blanca Convexa 3 mm Lisa Regular BACILOS (-) no esporulados
6 LCT3 Circular blanca Convexa 3 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
7 UM1 Irregular blanca Plana 6 mm Lisa Irregular COCOS (+) no esporulados
8 UM14 Circular blanca Convexa 1,5 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
10 UM17 Circular blanca Convexa 3,5mm Lisa Regular COCOS (+) no esporulados
11 UM18 Circular blanca Convexa 2 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
13 UM20 Circular blanca Convexa 3 mm Lisa Regular COCOS (+) no esporulados
16 UM23 Circular Blanca Convexa 2 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
17 UM5 Circular Blanca Convexa 1,5 mm Lisa Regular COCOS (+) no esporulados
18 UM6 Circular Blanca Convexa 2 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
19 UM8 Circular Blanca Convexa 1,5 mm Lisa Regular COCOS (+) no esporulados
20 UM9 Circular Blanca Convexa 2,5 mm Lisa Regular BACILOS (+) no esporulados
49
De acuerdo a la evaluación realizada se encontró que el 95% (19/20) de aislados posee características
típicas pertenecientes a las bacterias ácido lácticas como lo describe (Samaniego Fernandez Luz M. 2010;
p.4). Estas colonias presentaron bordes enteros, regulares con superficie lisa y forma convexa (Figura
1-3), mientras que el 5% (1/20) de los aislados no poseen estas características (Figura 2-3).
Figura 1-3: Colonias de borde regular Figura 2-3: Colonias de borde irregular
Realizado por: Gisela Ramos. 2018 Realizado por: Gisela Ramos. 2018
La taxonomía de la mayoría de estos microrganismos los describe como cocos y bacilos Gram
positivos (Ortíz, 2006. p. 13); de acuerdo a la tinción Gram se realizada en cada una de los aislados, se
evidenció la presencia (Figura 4-3) del 60% (12/20) de bacilos Gram positivos, (Figura 5-3) del 10%
(2/20) de bacilos Gram negativos y (Figura 3-3) un 30% (6/20) de cocos Gram positivos.
Figura 3-3: Cocos Gram positivos. Figura 4-3: Bacilos Gram positivos
(Aumento 100x) (Aumento 100x)
Realizado por: Gisela Ramos. 2018 Realizado por: Gisela Ramos. 2018
50
Figura 5-3: Bacilos Gram negativos
(Aumento 100x)
3.3. Caracterización Fenotípica
Ensayos metabólicos tales como catalasa, oxidasa, SIM, hidrólisis de gelatina contribuyen a la
caracterización de los microorganismos. A continuación, en la Tabla 4-3 se encuentran los resultados
de estas pruebas.
Tabla 4-3: Pruebas Fenotípicas de Bacterias Ácido Lácticas Termodúricas
N° CÓDIGO CATALASA OXIDASA SIM INDOL H. GELATINA

1 2M4 (-) (-) (+) (-) (-)
2 3M4 (-) (-) (-) (-) (-)
3 LCFC1 (-) (-) (-) (-) (-)
4 LCFC3 (-) (-) (-) (-) (-)
5 LCT1 (-) (-) (-) (-) (-)
6 LCT3 (-) (-) (-) (-) (-)
7 UM1 (-) (-) (-) (-) (-)
8 UM14 (-) (-) (-) (-) (-)
9 UM15 (-) (-) (-) (-) (-)
10 UM17 (-) (-) (-) (-) (-)
11 UM18 (-) (-) (-) (-) (-)
12 UM19 (-) (-) (-) (-) (-)
13 UM20 (-) (-) (-) (-) (-)
51
14 UM21 (-) (-) (-) (-) (-)
15 UM22 (-) (-) (-) (-) (-)
16 UM23 (-) (-) (-) (-) (-)
17 UM5 (-) (-) (-) (-) (-)
18 UM6 (-) (-) (-) (-) (-)
19 UM8 (-) (-) (-) (-) (-)
20 UM9 (-) (-) (-) (-) (-)
El 100% (20/20) de los aislados fueron catalasa y oxidasa negativas, característica típica de las
bacterias ácido lácticas, no obstante existen algunas cepas atípicas capaces de descomponer el
peróxido de hidrógeno (Samaniego Fernandez Luz M. 2010 p.4).
A su vez estas bacterias pueden ser móviles o muy poco móviles debido a la presencia de flagelos en
su estructura (Ortíz, 2006 p. 12); el 95% (19/20) de los aislados de este estudio no presentaron movilidad
mientras que el 5% (1 fueron móviles.
Ningún aislados produjo indol ni hidrolizó la gelatina, coincidiendo con lo mencionado por (Samaniego
Fernandez Luz M. 2010; p.4).
3.4. Susceptibilidad antibiótica
El uso de antibióticos dentro de la medicina veterinaria y humana supone gran importancia en el

tratamiento de infecciones de origen bacteriano; sin embargo, existe preocupación por el rastro que
estos dejan debido a su excreción a través de leche y carne; generando problemas en procesos
tecnológicos y en salud pública. (Mora y García 2007; p. 44)
Los alimentos como el queso elaborados con leche que contiene rastros de antibióticos muestran un
sabor ligeramente amargo y una consistencia esponjosa (Mora y García 2007; p. 49); provocando que este
se convierta en un producto desagradable para el consumidor, al ser el queso un producto
agroindustrial es susceptible de la contaminación con antibióticos. De ahí el interés de realizar este
ensayo en el presente estudio. Adicionalmente muchas bacterias pueden presentar una resistencia
intrínseca a determinados antibióticos, lo cual puede ser un rasgo característico.
52
Para el ensayo de susceptibilidad antimicrobiana no se utilizó e Agar Müeller Hinton especificado
por el CLSI debido a que no sustentó el crecimiento de BAL, en su lugar se empleó el Agar MRS.
En la tabla 5-3 se aprecian los resultados de la prueba de susceptibilidad a antibióticos utilizada como
una prueba de caracterización, en la misma se puede visualizar que la reacción ante los antibióticos
expuestos es diferente.
53
Tabla 5-3: Prueba de susceptibilidad antimicrobiana en medio MRS
Eritromicina
Amoxicilina
Vancomicina
Gentamicina
Tetraciclina
15mcg
25mcg
30mcg
10mcg
30mcg
CÓDIGO
N°
ZONA DE INHIBICIÓN (mm)

1 2M4 S 40 ± 0,58 R 10 ± 0,71 R 0 ± 0,00 S 30 ± 1,00 S 32 ± 0,58
2 3M4 S 40 ± 0,58 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 40 ± 0,58 S 30 ± 0,00
3 LCFC1 S 38 ± 1,00 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 46 ± 0,58 S 32 ± 0,58
4 LCFC3 S 40 ± 0,58 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 30 ± 0,58 S 35 ± 0,58
5 LCT1 S 38 ± 0,58 I 13 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 40 ± 0,00 S 32 ± 0,00
6 LCT3 S 40 ± 0,00 R 8 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 36 ± 0,58 S 26 ± 0,58
7 UM1 S 36 ± 1,00 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 36 ± 0,58 S 30 ± 0,58
8 UM14 S 40 ± 0,58 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 44 ± 0,58 R 0 ± 0,00
9 UM15 S 34 ± 1,00 S 30 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 46 ± 0,58 S 32 ± 0,00
10 UM17 S 44 ± 1,53 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 48 ± 0,58 S 40 ± 0,58
11 UM18 S 32 ± 1,53 R 10 ± 0,44 R 0 ± 0,00 S 46 ± 0,00 S 34 ± 0,58
12 UM19 S 36 ±1,00 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 44 ± 0,00 S 30 ± 0,00
13 UM20 S 36 ± 1,00 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 46 ± 1,53 S 33 ± 0,58
14 UM21 S 37 ± 1,15 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 44 ± 0,58 S 32 ± 0,58
15 UM22 S 40 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 14 ± 1,15 S 50 ± 0,58 S 36 ± 1,15
16 UM23 S 34 ± 0,58 R 10 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 44 ± 0,58 S 32 ± 0,58
17 UM5 S 34 ± 1,00 R 12 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 46 ± 0,00 S 36 ± 0,58
18 UM6 S 30 ± 1,00 R 0 ± 0,00 R 0 ± 0,00 S 46 ± 0,00 S 34 ± 0,58
19 UM8 S 30 ± 1,00 R 12 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 30 ± 0,58 S 28 ± 1,00
54
20 UM9 S 32 ± 0,58 R 7 ± 0,58 R 0 ± 0,00 S 43 ± 0,58 S 24 ± 0,58
S: Sensible
I: Intermedia sensibilidad
R: Resistente
De acuerdo a los resultados obtenidos; el 100% (20/20) de los aislados presentaron alta sensibilidad a eritromicina, amoxicilina y solo un
aislado (19/20) es resistente a tetraciclina; lo que coincide con los estudios realizados por (Zhou et al. 2005; p.214), evidenciándose que a pesar de
ser antibióticos muy utilizados en veterinaria y de su presencia residual en leche y carne, el ganado de esta zona no posee una resistencia a
estos antibióticos.
Estas bacterias también mostraron el 90% (18/20) de resistencia a gentamicina. Sin embargo, el 10% (2/20) de aislados aún son sensibles,
resultados similares se a lo mencionado por (Blandino, Milazzo y Fazio 2008; p.6) que encontraron una resistencia del 100% a este antibiótico en
ganado bovino.
Otros estudios realizados por (Blandino, Milazzo y Fazio 2008; p.6) y (Ma et al. 2017; p. 11) revelan una resistencia de bacterias ácido lácticas a
vancomicina en un 79 y 63% respectivamente. En este estudio se evidenció una resistencia del 99% (19/20); indicando una resistencia
intrínseca a este antibiótico.
Todos los resultados de susceptibilidad frente a estos dos últimos antibióticos se explicarían por el hecho de la transferencia horizontal de
genes que pude ocurrir entre diferentes especies e inclusive diferentes géneros de bacterias.
55
3.5. Conservación bacteriana
Con la finalidad de realizar estudios posteriores de las bacterias ácido lácticas aisladas se realizó el
proceso de conservación bacteriana de 20 aislados (10 viales por cada aislado), los mismos que fueron
sometidos a un proceso de conservación ordinaria por congelación a -20°C. Estos aislados fueron
caracterizados morfológica y fenotípicamente. El agente crioprotector utilizado fue el glicerol debido
a que su efector protector resulta en la disminución de la concentración de solutos por competencia.
(Instituto de Biotecnología.2016)
A continuación, en la Tabla 6-3 se dan a conocer los resultados de pureza y viabilidad realizados,
posteriores al proceso de conservación bacteriana.
Tabla 6-3: Prueba de Viabilidad y Pureza
N° FECHA ORIGEN CÓDIGO VIABILIDAD UFC/mL TINCIÓN GRAM

1 12/07/2017 QUESERA 2 BALT11C+ 2,83 x106 COCOS (+)
2 12/07/2017 QUESERA 2 BALT11B+ 4,086x1012 BACILOS (+)
3 09/06/2017 QUESERA 2 BALT11B- 3,23x1012 BACIOS (-)
4 12/06/2017 QUESERA 1 BALT11B+PE 8,91x1012 BACILOS (+)
5 05/07/2017 QUESERA 1 BALT11B+3M 2,67x1012 BACILOS (+)
6 12/07/2017 QUESERA 1 BALT11C+UM5 102,2x106 COCOS (+)
7 12/07/2017 QUESERA 2 BALT11C+UM 22,7,x106 COCOS (+)
9 23/06/2017 QUESERA 2 BALT11C+2M 4,54x1011 COCOS (+)
10 12/07/2017 QUESERA 2 BALT11B+UM22 1,19x1012 BACILOS (+)
12 09/07/2017 QUESERA 2 BALT11B-PE 2,27x1012 BACILOS (-)
14 09/07/2017 QUESERA 1 BALT11B+PE1 3,405x1011 BACILOS (+)
56
17 12/07/2017 QUESERA 1 BALT11B+UM6 1,362x1012 BACIOS (+)
Para demostrar que el método aplicado se llevó a cabo de manera adecuada se realizó la recuperación
de las bacterias en donde se demostró que a los ocho días de finalizada la conservación a una dilución
de 10-7 el número de UFC/mL supera una concentración de 105 UFC/mL (Leal y Ramírez, 2005: p.5). Sin
embargo, el éxito de una conservación depende de la especie bacteriana, es así que se estima que las
BAL termodúricas conservadas puedan permanecer viables un período comprendido entre seis meses
a un año.
También se elaboró una base de datos bajo un código de identificación en formato físico y digital que
permita un adecuado manejo de la información de cada aislado mantenido desde el momento de su
conservación.
57
CONCLUSIONES
1. No fue posible realizar la identificación de bacterias ácido lácticas termodúricas por limitaciones
de recursos económicos asociadas al proyecto; sin embargo, se elaboró el banco de cepas que a
futuro permitirá el cumplimiento de este objetivo.
2. El incumplimiento de los criterios microbiológicos de la norma NTE INEN 009: 2015 sobre el
recuento de aerobios mesófilos en leche cruda sugiere deficiencias en la higiene y en la aplicación
de protocolos de limpieza dentro de las queseras Q1 y Q2, en contraste, los niveles de aerobios
mesófilos en la leche con tratamiento térmico en las queseras y en el laboratorio si cumplen con
la normativa nacional debido a que los tratamientos térmicos empleados disminuyen la carga
microbiana corroborando que la pasteurización es un tratamiento higienizante de la leche que
asegura su inocuidad aunque disminuya las características sensoriales de un queso.
De otro lado el tratamiento térmico en las queseras pese a la falta de choque térmico redujo más
la carga microbiana de BAL en leche respecto a la pasteurización en el laboratorio, lo cual
explicaría las características (sabor, aroma) menos acentuados en quesos elaborados con este tipo
de leche.
3. Los aislados puros revelaron características macro y microscópicas con alta similitud a cepas
típicas de bacterias ácido lácticas, por lo cual se procedió a la preservación para posteriores
estudios.
4. En el mismo sentido los ensayos fenotípicos aplicados revelaron algunas capacidades metabólicas
que puede concordar con sus características genéticas.
5. La preservación ordinaria en ultracongelador a -20°C de los aislados de BAL y el control del

procedimiento garantiza la viabilidad y pureza del banco, así como su integridad durante un año.
58
RECOMENDACIONES
Se recomienda continuar con el estudio y realizar una secuenciación molecular del gen 16S rRNA o
el Analytical Profile Index (API) para poder identificar los aislados que no pudieron ser identificadas
en este trabajo de investigación.
Se debe tener precaución con el ácido acético utilizado para acidificar el medio MRS, puesto que el
mismo tiene una vida útil de 15 días luego de preparada la solución.
Se sugiere realizar pruebas que confirmen que las bacterias ácido lácticas termodúricas aisladas
poseen una susceptibilidad intrínseca a antibióticos como gentamicina y vancomicina.
Debido a que el mantenimiento que se llevó a cabo es una conservación bacteriana a corto plazo
(congelación ordinaria -20°C) es necesario que se realice un oportuno mantenimiento de las cepas
bacterianas cada cierto tiempo para garantizar su viabilidad para posteriores investigaciones.
Para una mayor estabilidad de los aislados se sugiere emplear la liofilización como método de
conservación.
59
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
ANEXO A. MUESTREO DE LA QUESERA Q1 y Q2
MUESTREO DE LA QUESERA Q2
ANEXO B. RECUENTOS BACTERIANOS
A. Siembra de Bacterias Ácido Lácticas Termodúricas en Agar PCA
B. Siembra de Bacterias Ácido Lácticas Termodúricas en Agar MRS

ANEXO C. CULTIVO BACTERIANO EN CALDO MRS
A. Inóculo en Tubos de Bacterias Ácido Lácticas Termodúricas
B. Inóculo en viales eppendorf de Bacterias Ácido Lácticas Termodúricas

ANEXO D. AISLAMIENTO DE BACTERIAS TERMODÚRICAS
A. Bacterias ácido lácticas aisladas en agar MRS (siembra por estriamiento)

ANEXO E. PRUEBAS BIOQUÍMICAS RÁPIDAS
PRUEBA DE OXIDASA
A. Colonias oxidasa Negativo
PRUEBA DE CATALASA
B. Colonias catalasa negativo

ANEXO F. TINCIÓN GRAM
A. Bacilos Gram Positivos (Aumento 100x)
B. Cocos Gram Positivos (Aumento 100x)
C. Bacilos Gram Negativos (Aumento 100x)

ANEXO G. PRUEBA DE MOTILIDAD (SIM)
A. Tubos con medio SIM
B. Aislado de BAL con motilidad negativa C. Aislado de BAL con motilidad positiva
ANEXO H. VIABILIDAD DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS TERMODÚRICAS
A. Dilución 10-1 B. Dilución 10-3
C. Dilución 10-5 D. Dilución 10-7

ANEXO I. ELABORACIÓN DEL CEPARIO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
TERMODÚRICAS
A. Aislado de un cultivo puro de BAL a ñas solución de glicerol 30%
B. Llenado de viales eppendorf de 1.5mL
C. Aislados de BAL en MRS y glicerol al 15% en viales sellados y rotulados

D. Banco de Bacterias ácido lácticas
ANEXO J. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA EN MEDIO MRS
A. Alta sensibilidad a amoxicilina, B. Alta sensibilidad amoxicilina,

eritromicina y moderada sensibilidad a eritromicina y tetraciclina
tetraciclina
C. Alta Sensibilidad a eritromicina, D. Resistencia a amoxicilina, eritrocina,

amoxicilina y tetraciclina gentamicina, vancomicina, tetraciclina
ANEXO K.
Fichas técnicas de Conservación Bacteriana
(Congelación ordinaria a -20°C)
Ubicación:
Laboratorio de Microbología de Recursos Naturales

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“IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS TERMODÚRICAS EN

Presentado para obtener al grado académico de:

AUTORA: GISELA PAULINA RAMOS ILVIS

El Tribunal de Trabajo de titulación experimental certifica que: El trabajo de investigación:

Paola Arguello MSc.

Janneth Gallegos PhD.

De manera especial dedico este trabajo al Programa de Becas estudiantiles de Austria en la

A Dios y María Inmaculada

A la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo

A la MSc. Paola Arguello H.

A la PhD. Janneth Gallegos

1. Marco teórico referencial ............................................................................................. 18

2. Marco metodológico .................................................................................................... 34

Tabla 1-1: Composición nutritiva de la leche...…………………………………………....20

Anexo A: Muestreo de la Quesera Q1 Y Q2

KEYWORDS: <BIOCHEMESTRY>, <MICROBIOLOGY>, <THERMODURIC>, <RAW

Se considera a la leche como el único producto procedente de la naturaleza capaz de actuar de

Según un informe expedido por la OMS y el Grupo de Referencia sobre Epidemiología de la

Específicamente microorganismos del género Bacillus y Clostridium causan deterioro de la leche

Identificar bacterias termodúricas presentes en la leche pasterizada utilizada en la elaboración de

Obtener aislados puros y caracterizarlos mediante examen macro y microscópico.

1. MARCO TEÓRICO REFERENCIAL

1.1. Antecedentes de la investigación

La microbiología estudia un heterogéneo grupo de microorganismos microscópicos que pueden vivir

1.3.1. Leche cruda

1.3.2. Leche pasterizada

1.4. Derivados de la leche

1.4.1.1. Queso artesanal

Se obtiene mediante fermentación láctica de la leche o mezcla de estas, gracias a la acción de

1.5. Propiedades nutritivas

Tabla 1-1: Composición Nutritiva de la Leche

Fuente: Agudelo y Bedoya, 2008. (Composición Nutricional de

1.6. Microorganismos en alimentos

1.6.1. Microorganismos patógenos contaminantes de la leche

1.6.1.1. Bacterias termodúricas

1.7. Fuentes de bacterias termodúricas y defectos en la producción quesera.

Particularmente en la producción quesera la presencia de éstas bacterias se encuentra asociada al

1.8. Clasificación de Bacterias Termodúricas

1.8.1.1. Género Bacillus

El género Bacillus es de especial importancia debido a su consideración como potencial patógeno de

1.8.1.2. Género Lactobacillus

1.9. Tinción Gram

Esta técnica permite la diferenciación taxonómica de bacterias en función de su capacidad para

 Gram-positivas (color violeta azulado)

Figura 1-1: Apariencia de bacterias Gram positivas

Un medio de cultivo contiene un conjunto de componentes (macronutrientes, micronutrientes,

1.10.1. Tipos de medios de cultivo

A continuación, se detalla en tablas la composición química de los medios de cultivo a utilizarse

Tabla 3-1: Medio de cultivo Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe)

Extracto de carne 8,0

Extracto de levadura 4,0

D (+)- Glucosa 20,0

Magnesio Sulfato 0,2

Manganeso (II) Sulfato 0,05

Peptona Bacteriológica 10,0

di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0

Sodio Acetato 5,0

Fuente: Panreac Quimica SA, 2000. (Manual Básico de Microbiología) p.86