2019

Programa Higiene I
8. HIGIENE ANALÍTICA. TÉCNICAS INSTRUMENTALES.
LUCIANO SILVA MORALES
Contenido
8. Higiene Analítica. Técnicas instrumentales. ............................................................................................................. 1
8.1. Técnicas instrumentales en Higiene Analítica. Clasificación............................................................................. 1
8.2. Técnicas cromatográficas. Clasificación. Cromatografía en papel. Cromatografía en capa fina. Cromatografía
de gases y cromatografía líquido-líquido. ......................................................................................................................... 2
8.2.1. Cromatografía de gases. Tipos de separación cromatografica. Instrumentación. Cromato gramas.
Columnas cromatográficas (con relleno, sin relleno). Detectores cromatográficos (de conductividad térmica, de
ionización de llamas, de captura electrónica, fotométrico de llama). Análisis cualitativo. Análisis cuantitativo. ........... 4
8.2.2. Cromatografía líquida. Instrumentación (sistema de bombeo, inyectores, columnas, detectores). ........... 8
8.3. Técnicas espectrométricas. Tipos de espectros. Clasificación. Instrumentación. Relaciones entre absorbancia
y concentración. ................................................................................................................................................................ 9
8.3.1. Espectrofotometría ultravioleta visible. Instrumentación (fuente de radiación, Monocromador, Elemento
fotométrico).Análisis cualitativo. Análisis cuantitativo...................................................... ¡Error! Marcador no definido.
8.3.2. Espectrofluorimetría. Relación intensidad/concentración. Instrumentación. La fuente de excitación, las
células de muestra, el detector, el monocromador). ........................................................ ¡Error! Marcador no definido.
8.3.3. Espectrofotometría infrarroja. Instrumentación (fuente de radiación, monocromador, detectores).
Preparación de la muestra (gases, líquidos ysólidos). ....................................................... ¡Error! Marcador no definido.
8.3.4. Espectrofotometría de absorción atómica. Atomización (Atomización en llama. En cámara de grafito).
Instrumentación. Fuentes de radiación (Lámparas de cátodo hueco, lámparas de descarga sin electrodos).
Monocromador. Fuentes de atomización (sistema de llama, cámara de grafito). Detector. Metodología (Métodos de
calibración).¡Error! Marcador no definido.
8.3.5. Espectrometría de Resonancia magnética nuclear. ....................................... ¡Error! Marcador no definido.
8.3.6. Espectrometría de masas. .............................................................................. ¡Error! Marcador no definido.
8.3.7. Espectrometría de difracción de Rayos X. ..................................................... ¡Error! Marcador no definido.
8.4. Técnicas microscópicas. Clasificación: Óptica y Electrónica. Instrumentación. Preparación de las muestras.
Área útil del filtro. Área del campo de recuento. Recuento de fibras. ........................................................................... 11

8. Higiene Analítica. Técnicas instrumentales.

El procedimiento empleado para la obtención de la muestra debe ser adecuado para la técnica analítica a aplicar.
Evidentemente, cuando se dispone de un método analítico normalizado no existe posibilidad de cometer errores en
este sentido.

Sí, en cambio, la hay cuando se deben emplear procedimientos indagatorios o estrictamente experimentales de los
que no se conoce a priori cual va a ser el procedimiento de análisis instrumental a aplicar. Las técnicas analíticas
dependen, fundamentalmente, de la naturaleza del contaminante, pero también de las restantes circunstancias de la
medida.

8.1. Técnicas instrumentales en Higiene Analítica. Clasificación.

La gran variedad de substancias que pueden estar presentes en los ambientes laborales es causa de la utilización en
higiene industrial de bastantes técnicas analíticas diferentes. El higienista debe conocer, aunque sea de manera
somera, las características básicas de la técnica analítica que se va a aplicar.

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

• Cromatografía de gases (disolventes, compuestos orgánicos)

• Cromatografía líquida (compuestos orgánicos)
• Cromatografía iónica (aniones)
• TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS
 • Absorción atómica (metales)
• UV-VIS (gases, pesticidas)
• Fluorimetría (aceites) RAYOS X (difracción y fluorescencia) (minerales, metales)
• MICROSCOPIO ÓPTICA (fibras de amianto)
• TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS
• Electrodos específicos (cianuros, fluoruros)
• Voltametría de Redisolución Anódica (metales)
• Polarografía (metales, compuestos iónicos) TÉCNICAS GRAVIMÉTRICAS (polvo, algodón)

8.2. Técnicas cromatográficas.

Clasificación. Cromatografía en papel. Cromatografía en capa fina. Cromatografía de gases y cromatografía líquido-
líquido.
Cromatografía en columna: la fase estacionaria se introduce en un tobo estrecho a través del cual se hace pasar la
fase móvil. Esta se desplaza por capilaridad, gravedad o presión. Pueden emplearse fases móviles líquidas, gaseosa o
fluidos supercríticos.
Cromatografía plana: la fase estacionaria se coloca en un soporte plano. En cromatografía plana el flujo de fase móvil
se consigue por capilaridad o por capilaridad y gravedad. Sólo pueden emplearse líquidos como fases móviles. Existen:
- cromatografía en papel: la fase estacionaria está constituida por el agua retenida en la celulosa. también existen
papeles cambiadores de iones.
- cromatografía en capa fina: la fase estacionaria es un sólido adsorbente finamente dividido o un líquido inmovilizado
sobre un sólido colocado sobre una placa plana.
En este tema nos centraremos en la cromatografía en columna y consideraremos
únicamente cromatografía de líquidos y de gases.
1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes
6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance

Separación cromatográfica: separación en la cual, los componentes de la muestra, se distribuyen entre dos fases de
diferente naturaleza, como consecuencia de la variación de velocidad que se establece al ser arrastrados por una
fase móvil, líquida o gaseosa, a través de una fase estacionaria, sólida o líquida.
Las fases cromatográficas son dos:
La fase móvil: que fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los compuestos de la mezcla.
La fase estacionaria: en la cual están retenidos los componentes de la muestra, y a través de la cual fluye la fase
móvil arrastrando a los mismos.

Cromatografía de gases: la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de la columna cromatográfica. La elución se

produce por el flujo de una fase móvil gaseosa. La fase móvil en cromatografía de gases es un gas inerte, es decir, no
interacciona con las moléculas de analito, sólo las transporta a través de la fase estacionaria.

La fase estacionaria en cromatografía de gases puede ser un sólido (cromatografía gas-sólido), produciéndose
entonces la retención de las moléculas de analito por adsorción. Este tipo de cromatografía es poco frecuente. Lo más
habitual es que la fase estacionaria sea un líquido (cromatografía gas-líquido). En este caso la fase móvil es un líquido
no volátil inmovilizado sobre la superficie de un sólido inerte. Se trata entonces de una cromatografía de partición. Los
analitos se distribuyen entre las fases móvil (gaseosa) y estacionaria (líquida).

Cromatografía líquido-líquido (fase móvil líquida)

Fase estacionaria líquida:
- Cromatografía de reparto: la fase estacionaria es un líquido inmovilizado sobre
un material inerte sólido que sólo actúa de soporte.
- Cromatografía de afinidad o de fases enlazadas: la fase estacionaria es generalmente un polímero de tipo líquido
inmovilizado sobre un sólido inerte por enlaces covalentes.
En ambos casos la separación se debe a equilibrios de distribución de los solutos entre las fases móvil y estacionaria
controlados por la diferente solubilidad de los mismos en las distintas fases.
8.2.1. Cromatografía de gases.
Tipos de separación cromatografica. Cromato gramas. Columnas cromatográficas (con relleno, sin relleno). Detectores
cromatográficos (de conductividad térmica, de ionización de llamas, de captura electrónica, fotométrico de llama).
Análisis cualitativo. Análisis cuantitativo.

El cromatograma es un registro gráfico bidimensional obtenido en un medio absorbente, que muestra la separación
de sustancias mediante una cromatografía. En el cromatograma se forma un patrón visible, picos o manchas, que
reflejan la separación física de los componentes de una mezcla.
La figura inferior es un cromatograma con tres picos, A, B y C, de tres componentes de la muestra separada por
cromatografía. Se observa que cada uno de los tres picos tiene diferente altura y ubicación en el eje del tiempo del
cromatograma.

Cromatografía en columna: La fase estacionaría se sitúa dentro de una columna. Según la naturaleza de la fase móvil
se clasifican en:
Técnica de Cromatografía de líquidos.

T. de Cromatografía de gases.
T. de Cromatografía de fluídos supercríticos.

Tipos de detectores en la cromatografía gas-líquido

El detector es el sistema encargado de poner de manifiesto la presencia de soluto o de componentes de la muestra
que abandonan la columna. Para ello convierte la medida de una magnitud física, comparándola con la del propio gas
portador puro, en una señal amplificada que indicará el momento en el que salen los componentes de la columna.
Describiremos los tipos de detectores más utilizados:
Detector de conductividad térmica (TCD)
Consiste en un dispositivo denominado catatómetro, cuyo funcionamiento se basa en los cambios en la conductividad
térmica de gas ocasionados por la presencia de moléculas de analito. Posee un sensor formado por un filamento de
Pt o Au calentado eléctricamente, cuya temperatura y, por lo tanto, su resistencia eléctrica, dependen de la
conductividad térmica del gas que lo rodea. Los gases portadores más adecuados son el hidrógeno o el helio, pues su
conductividad térmica es mayor (los analitos al mezclarse con estos gases disminuyen su conductividad térmica).
Características:
Respuesta universal
Respuesta lineal en un amplio intervalo
Fácil de utilizar
No destructivo
Baja sensibilidad
Detector de captura electrónica (ECD)
Es uno de los detectores más empleados en análisis medioambiental, debido a su selectividad para detectar
compuestos que contienen halógenos (como los pesticidas). En él, el gas que abandona la columna atraviesa un emisor
de electrones (Ni-63), los cuales provocan su ionización. Al aplicar una diferencia de potencial se crea una corriente
eléctrica que constituye la señal. En presencia de compuestos orgánicos la corriente disminuye por su tendencia a
captar electrones. Se emplea nitrógeno o argón como gas portador, con un 5 % de metano.

Características:
Detector selectivo (moléculas con grupos electronegativos)
Elevada sensibilidad
No destructivo (no altera la muestra de manera significativa)
Pequeño intervalo de respuesta lineal
Detectores de ionización de llama (FID)
Es el detector más popular en cromatografía de gases. En él la respuesta se produce como resultado de la combustión
de los compuestos orgánicos en una pequeña llama de aire-hidrógeno, con desprendimiento de iones (CHO+) y
electrones. Si aplicamos una diferencia de potencial entre entre el extremo del quemador y el cátodo colector se
genera una corriente eléctrica que, amplificada, constituye la señal analítica. Ésta será proporcional al número de
átomos de carbono por unidad de tiempo. La fase móvil que se emplea con este detector es el nitrógeno, ya que es
el que proporciona mejor límite de detección.

Características:
Sensible a compuestos orgánicos (excepto carbonílicos y carboxílicos)
Elevada sensibilidad
Respuesta lineal en un gran intervalo
Estabilidad y resistencia
Fácil manejo
Bajo ruido
Es destructivo
Detector de ionización termoiónica (TID)
Es un detector selectivo para los compuestos orgánicos que contienen fósforo y nitrógeno, que deriva del anterior.
El gas procedente de la columna se quema en presencia de hidrógeno y fluye alrededor de una bola de silicato de
rubidio calentada eléctricamente (600-800 ºC), y se forma un plasma de electrones que generan una corriente bajo
una diferencia de potencial aplicado (unos 180 V). La intensidad de la corriente será proporcional al número de iones
formados, es decir, a la cantidad de analito. No se puede usar nitrógeno como gas portador. Es destructivo y tiene una
elevada sensibilidad.
Detector de fotoionización (PID)
En este detector el eluato de la columna se irradia con un haz intenso de radiación ultravioleta, que provoca la
ionización de las moléculas. Al aplicar un potencial a través de la celda que contiene los iones producidos se origina
una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada.
DETECTOR fotométrico de llama (FPD)
Se trata de un detector que mide la emisión óptica procedente, principalmente, del fósforo y del azufre. Cuando el
eluato pasa por una llama mezclado con hidrógeno y aire, de manera análoga al detector FID, los átomos excitados
emiten una radiación característica (536 nm y 394 nm) que se puede aislar con un filtro y detectar con un tubo
fotomultiplicador.

Características:
Es un detector selectivo (P y S; también Pb, Sn, halogenos)
Es destructivo
Menos sensible al azufre que otros detectores
Menor intervalo lineal para el azufre que otros detectores
DETECTOR de emisión atómica (AED)
El gas eluido procedente de la columna se introduce en un plasma de helio obtenido por microondas, que atomiza y
excita los elementos de la muestra, obteniéndose sus espectros de emisión atómica característicos. Los espectros
son recogidos en un espectrómetro provisto de dos diodos en serie.
DETECTOR Quimioluminiscente de azufre
Permite detectar compuestos que contienen sulfuro (alimentos, bebidas, petróleo). Primero se oxida a SO2, luego en
presencia de H2 se transforma en SO, que reacciona con ozono formando SO3 excitado, que emite luz al volver a su
estado basal. Permite detectar bajas concentraciones, de hasta picogramos.
detector acoplado a espectrometría de masas
Existen instrumentos híbridos que combinan la cromatografía de gases con otras técnicas, como puede ser un
espectrómetro de masas.
En el caso de las columnas capilares el acoplamiento de las dos técnicas puede realizarse de forma directa, pero en las
columnas de relleno ha de emplearse un separador de chorro para eliminar la mayor parte del gas portador que
acompaña al analito.
Las características más importantes de este método son:
Detección universal
Elevada sensibilidad
Buenos resultados en mezclas orgánicas complejas
Elevado coste
Complejidad de uso
DETECTOR ACOPLADO A Espectroscopía de infrarrojo
El acoplamiento de cromatógrafos de gases con columnas capilares con espectrómetros de infrarrojo de transformada
de Fourier proporciona un potente medio para la separación y la identificación de los componentes de mezclas
complejas.

8.2.2. Cromatografía líquida. Instrumentación (sistema de bombeo, inyectores, columnas, detectores).

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra
en ambas fases, móvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-
performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y
una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro
parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones
selectivas y más posibilidades para la separación.
HPLC preparativa
Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias químicas y farmacéuticas
así como en la biotecnología y la bioquímica. La cromatografía preparativa comprende un amplio rango de
aplicaciones, desde el aislamiento de 1µg de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un
compuesto puro de una mezcla de 100 g.
Aplicaciones
Campos de Aplicación de HPLC
Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
Separación y purificación de metabolitos
Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de orina
Purificación y separación de enantiómeros
Purificación de compuestos naturales
Purificación y caracterización de enzimas y proteínas
Funcionamiento del servicio
Las muestras deben ir acompañadas de la hoja de solicitud de servicios generada en esta página web una vez realizado
el registro en la misma. El ususario debe rellenar todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin
de obtener el mejor resultado posible.
Equipos
HPLC analítico 1200 Series de Agilent Technologies
Bomba cuaternaria G1311
Detector de longitud de onda variable G1314B
Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D
Detector de índice de refracción G1362A
Detector de fluorescencia G1321A
HPLC preparativo 1200 Series de Agilent Technologies
Dos Bombas preparativas G1361A
Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D
Muestreador automático G1329A
Colector de fracciones G1364B

8.3. Técnicas espectrométricas. Tipos de espectros. Clasificación. Instrumentación. Relaciones entre

absorbancia y concentración.
Las técnicas espectrométricas se basan en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia.

La radiación electromagnética es una forma de energía radiante; se representa como un campo eléctrico y otros
magnéticos situados en fase y con oscilaciones sinusoidales en ángulo recto un campo respecto al otro y, a su vez,
con la dirección de propagación; se propaga por lo tanto en forma de ondas. Longitud de onda:
Se define como la distancia entre los picos de onda esta distancia se expresa, según el sistema internacional de
unidades‘(SI) (en nanómetros nm)

Frecuencia:

Es el numero de oscilaciones (ciclo) que una partícula realiza en una unidad de tiempo, generalmente un segundo
(ciclos por segundo) es la inversa de la longitud de onda.

Las principales técnicas espectrometrícas empleadas en la actualidad en los laboratorios de bioquímica clínica son:

• La espectrometría de absorción molecular en el ultravioleta y en el visible

• La fluorimetría
• La turbidimetría
• La nefelometría
• La luminometría
• La espectrometría de absorción atómica
• La espectrometría de emisión atómica
• La espectrometría de emisión atómica

Es un método de análisis químico que utiliza la intensidad de la luz emitida desde una llama, plasma, arco o chispa
en una longitud de onda particular para determinar la cantidad de un elemento en una muestra.

La longitud de onda de la línea espectral atómica da la identidad del elemento, mientras que la intensidad de la luz
emitida es proporcional a la cantidad de átomos del elemento

La espectrometría de absorción molecular.

Se refiere a una variedad de técnicas que emplean la interacción de la radiación electromagnética con la materia.

En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad de un haz de luz medida antes y después de la

interacción con una muestra. Las palabras transmisión y remisión se refieren a la dirección de viaje de los haces de
luz medidos antes y después de la absorción.

La ley de Beer-Lambert

La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de
que en dicho medio se produzca absorción.

La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la
concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.

Espectrofotómetro

Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en función de la longitud
de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la
concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.

También se utiliza en laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.

Componentes de un Espectrofotómetro

• Fuente de luz
• Monocromador
• Compartimento de Muestra
• Detector
• Foto detectores
• Celdas

Fluorimetria
Se le denomina Fluorimetria a la emisión de radiación por electrones excitados de compuestos que previamente han
absorbido radiación y que de esta forma vuelven a su estado fundamental.

Las medidas de fluorescencia se realizan, con instrumentos denominados fluorimetros, que consta de:

• Fuente de luz excitación.

• Filtro o monocromador primario.
• Cubeta con espécimen.
• Detector.
• registro

La Turbidimetría y Nefelometría

Turbidimetría

Es un método en el que se mide la disminución de la potencia de la radiación transmitida debido a la dispersión. Se

mide en un espectrofotómetro UV/Vis

Nefelometría

Es un método para medir la intensidad de una radiación dispersa en un ángulo de 90 °C con respecto a la fuente. Se
mide en un espectrofluorímetro.

Para determinar la concentración de analito en este método aplicamos.

La luminometría.

La luminometría es una técnica utilizada para la determinación de un compuesto químico mediante la cuantificación
de energía lumínica que el mismo emite en determinadas condiciones. Esta energía generalmente es emitida como
luz visible o UV.

La espectrometría de absorción atómica.

Es un método instrumental de la química analítica que permite medir las concentraciones específicas de un material
en una mezcla y determinar una gran variedad de elementos.

Esta técnica se utiliza para determinar la concentración de un elemento particular (el analito) en una muestra y
puede determinar más de 70 elementos diferentes en solución o directamente en muestras sólidas utilizadas en
farmacología, biofísica o investigación toxicológica.

8.4. Técnicas microscópicas. Clasificación: Óptica y Electrónica. Instrumentación. Preparación de las muestras.
Área útil del filtro. Área del campo de recuento. Recuento de fibras.

Microscópia Electrónica
Esta técnica permite la obtención de imágenes de la superficie y/o de una serie de cortes transversales y/o
longitudinales de la membrana. Dichas imágenes se obtienen bombardeando el sólido con electrones altamente
energéticos; esto produce una gran cantidad de interacciones entre el material y el rayo electrónico las cuales
permiten identificar los materiales presentes en la muestra, así como una caracterización física de los poros y orificios
de la superficie. A partir de esas imágenes se puede determinar estadísticamente el tamaño de poro medio y la
distribución de tamaños de poro, la porosidad superficial y volumétrica, la forma y estructura del poro, el espesor de
la membrana o de sus diversas capas constitutivas, etc. Esta técnica fue usada por primera vez dentro del campo de
caracterización de materiales porosos en 1949 por Hansmann y Pietsch (30).

Clásicamente se han utilizado dos modos de operación en la microscopía electrónica que se usan habitualmente en el
estudio de membranas: microscopía electrónica de transmisión (TEM, Transmission Electron Microscopy) y
microscopía electrónica de barrido (SEM, Scanning Electron Microscopy). Actualmente hay otro nuevo modo
denominado microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM, Field Emission Scanning Electron
Microscopy).

Microscopía óptica
Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos
que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera.
Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian
detalles que estén naturalmente coloreados. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de
un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del
cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como
un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo.
Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminación normal.
Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y
oscuras de las células sin colorear. Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase
ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el
microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un
dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud
de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen
transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que
se utiliza con frecuencia en biología y medicina
Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las
imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para
observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-
vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases.