DETERMINACIÒN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ENZIMA

SOLUBLE E INMOVILIZADA

I. OBJETIVO ESPECÍFICO

Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble (2,1-β-D-

fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) e inmovilizada.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

El objeto de la cinética enzimática es el estudio de las enzimas en su

funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones
que existen entre la velocidad de la reacción enzimática y las
concentraciones del substrato (S) y de la enzima, así como la
influencia de algunos factores como: pH, temperatura, presencia de
efectores y eventualmente actividad del agua.

Curiosamente, este máximo no depende del tamaño del sustrato o

de la enzima. La proporción de las constantes de especificidad para
dos sustratos es una comparación cuantitativa de la eficiencia de la
enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente
de la ecuación de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de
sustrato (cuando [S] <<Km) también proporciona la constante de
especificidad.

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la

velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una
gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad
inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de
sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción
(representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la
[S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando
aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su
velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso,
independientemente de la [S].

Mecanismo
de unión de único sustrato para una reacción enzimática. k1, k-1 y
k2 son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la
reacción.

El modelo de cinética michaeliana para una reacción de único

sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente,
tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el
sustrato S, formándose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el
mecanismo enzimático para una reacción unimolecular
puede ser bastante complejo, existe una etapa
enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado
como una etapa cinética única cuya constante es k2.

k2 también llamado kcat o número de recambio, hace referencia al

máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un

equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-
sustrato ES. Aumentando la [S] también aumentamos la [ES] a
expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reacción hacia la
derecha. Puesto que la velocidad de reacción depende de la [ES], la
velocidad es sensible a pequeños cambios en la [S]. Sin embargo, a
altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato
ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reacción (v ≈ k2[E]tot
= Vmax) deja de ser sensible a pequeños cambios en la [S]. En este
 caso, la concentración total de enzima ([E]tot) es aproximadamente
igual a la concentración del complejo ES:

Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima

donde se puede observar cómo evoluciona la relación entre la
concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.

La ecuación de Michaelis-Menten describe como la velocidad de la

reacción depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor
Michaelis y MaudMenten demostraron que si k2 es mucho menor
que k1 (aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente
ecuación:

     

Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas

enzimáticas de sustrato único.

La constante de MichaelisKm se define como la concentración a la

que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la Vmax.
Esto puede verificarse sustituyendo la concentración de sustrato por
dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la
reacción es lenta comparada con la disociación de sustrato
(k2<<<k1), la constante de MichaelisKm será aproximadamente la
constante de disociación del complejo ES, aunque sea una situación
relativamente rara.

La situación más común, donde k2>k1, es denominada cinética de

Briggs-Haldane. La ecuación de Michaelis-Menten aún se mantiene
bajo estas condiciones más generales, como puede derivarse de la
aproximación del estado estacionario. Durante el período inicial, la
velocidad de la reacción es más o menos constante, indicando que
la [ES] también se mantendrá constante:

De esta forma, la concentración de ES viene dada por la siguiente

expresión:

Donde la constante de Michaelis Km se define así:

Con lo cual, después de operar todos los factores, obtenemos una

fórmula general para la velocidad de la reacción que coincide con la
ecuación de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que

una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la
definición de la constante de MichaelisKm, la ecuación de Michaelis-
Menten podría escribirse de la siguiente forma:
Donde [E] es la concentración de enzima libre. Así, la constante de
especificidad se convierte en una constante bimolecular efectiva de
la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar
producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que
el sustrato y la enzima se encuentran en una solución, y ronda
aproximadamente un valor de 1010 M-1 s-1 a 25º C. Curiosamente,
este máximo no depende del tamaño del sustrato o de la enzima. La
proporción de las constantes de especificidad para dos sustratos es
una comparación cuantitativa de la eficiencia de la enzima para
convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuación
de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando
[S] <<Km) también proporciona la constante de especificidad.

Representación de la ecuación de Michaelis-Menten

La gráfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es

lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga
lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentración de
sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten
ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, podía llegar a ser
realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmax en las
gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores
concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la
ecuación de Michaelis-Menten, dando como resultado la gráfica de
Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente
tutorial de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la
Universidad de Virginia, se puede simular el comportamiento de una
enzima variando las constantes cinéticas.

La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco

es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se
toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de
Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la
derecha, el resultado de este tipo de representación es una línea
recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la
recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de
corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco

es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se
toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de
Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la
derecha, el resultado de este tipo de representación es una línea
recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la
recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/V max, y el punto de corte
entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

La gráfica de Lineweaver-Burke o del doble recíproco muestra el

significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de
coordenadas, y el gradiente de la velocidad.
Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el
mínimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondería a una
concentración infinita de sustrato, donde 1/v = 1/V max. El valor del
punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolación de datos
experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las gráficas
de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas
concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones
no muy exactas de la Vmax y de la Km. Un modelo lineal mucho más
exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones
científicas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado
obsoletos y han sido sustituidos por métodos más fiables basados
en análisis de regresión no lineal. Para analizar los datos es
conveniente la normalización de los mismos, ya que esto puede
ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e
incrementando la fiabilidad del análisis.

Significado de las constantes cinéticas

La importancia del estudio de la cinética enzimática reside en dos

principios básicos. En primer lugar, permite explicar cómo funciona
una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cómo se
comportará esa enzima in vivo. Las constantes cinéticas definidas
anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la hora
de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el
control del metabolismo. Así, Vm se define como la velocidad
máxima de una reacción con una concentración de enzima
determinada (Vm=E0k2) y Km como la concentración de sustrato
necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima de la
reacción.
III. Materiales

 Pipetas
 Tubo de ensayo
 Tubos de ensayo con tapa
 Micropipeta
 Pinzas

3.1. Instrumentos e Equipos

 Cubos de hielo
 Agitador magnético
 Mini reactor
 Olla
 Mechero bunsen
 Espectrofotómetro
 Termómetro
 Cronometro

3.2 Reactivos

 Buffer acetato 0.05 M, pH 4.7

 Extracto crudo de inulinasa
 Solución de Sacarosa 20 gr/l
 DNS
IV. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Diluir Dilución de la enzima 1:4

Minireactor
Armar

Tampón y Sacarosa
Agregar según la guía

Contenido en mini reactor a

Calentar
55⁰C en baño maría

Agregar 1 ml de Extracto crudo de

inulinasa

Sacar 1020 µL de muestra del mini reactor

cada cierto tiempo según tabla 02

Agregar Tubo de ensayo con

tapa

Ebullición 3 min en olla con agua

hirviendo

Enfriar
3 min en hielo

Agregar
 200 µL de muestra
anterior en otro tubo

Agregar 600 µL de agua destilada

Agregar 500 µL de DNS

5 min en olla con agua

Ebullir
hirviendo

Enfriar 3 min en hielo

Agregar 5 ml de agua destilada

Reposar 15 min

Agitar Agitador maxi max

Absorbancia en
Medir
espectrofotómetro a 540nm
 V. RESULTADOS

Los datos se obtuvieron de cada experiencia en laboratorio realizada por cada

grupo y sus respectivos subgrupos, se tomó como referencia las tablas de
nuestra guía de laboratorio del curso, la cual son exactas a las que estamos
presentando en estos resultados.

Sol. A: Buffer citrato-fosfato 0,05 M, pH 5.0

Sol. B: Extracto crudo de inulinasa
Sol. C: Solución de sacarosa 20 g/l

Tabla 01. Detalle técnica experimental para determinación de

parámetros cinéticos

20
Buffer Enzima Sacarosa (g/L)
Conc
Nº Muestra Sol (A) Sol (B) Sol (C)
Sacarosa
  ml ml ml gr/ml
1 26 1 3 2
GRUPO A1 23 1 6 4
GRUPO B1 20 1 9 6
GRUPO C1 18 1 11 7.333333333
GRUPO A2 15 1 14 9.333333333
GRUPO B2 12 1 17 11.33333333
GRUPO C2 9 1 20 13.33333333
GRUPO A3 6 1 23 15.33333333
GRUPO B3 3 1 26 17.33333333
GRUPO C3 0 1 29 19.33333333
 Tabla 02. Datos experimentales azúcares DNS

P (g/L)

GRUPO
t (min) A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3
0 0.014 0.146 0.112 0.130 0.126 0.104 0.064 0.523 0.203

2 0.806 0.870 0.750 1.138 1.142 0.578 0.769 0.929 1.372

6 1.837 2.273 2.206 2.618 2.499 1.576 2.948 2.642 3.833

10 2.609 3.278 3.636 4.132 3.670 2.374 4.628 4.272 6.744

15 3.607 4.642 5.466 6.411 5.626 3.372 6.724 6.684 9.871

 Cada subgrupo obtuvo sus velocidades iniciales

GRUPO A - 1 Martes 07 Julio 2015

E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0   0.079 0.138 0.014
2 01:04 0.136 0.232 0.806
6 01:04 0.291 0.490 1.837
10 01:04 0.407 0.683 2.609
15 01:04 0.557 0.933 3.607
 
Blanco Sustrato 0.041 0.074
Blanco Enzima 0.026 0.049

4.000
3.500 f(x) = 0.25 x
R² = 0.99
Azucares Redcutores (g/L)

3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min)

GRUPO A - 2 Martes 07 Julio 2015

E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0 01:01 0.149 0.254 0.130
2 01:05 0.148 0.252 1.138
6 01:05 0.326 0.548 2.618
10 01:05 0.508 0.851 4.132
15 01:05 0.782 1.307 6.411
 
Blanco Sustrato 0.041 0.074
Blanco Enzima 0.026 0.049

7.000

6.000 f(x) = 0.43 x

Azucares Redcutores (g/L)

5.000
R² = 1
4.000

3.000

2.000

1.000

0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min)

GRUPO A - 3 Martes 07 Julio 2015

E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0 01:01 0.109 0.187 0.064
2 01:10 0.05 0.089 0.769
6 01:10 0.181 0.307 2.948
10 01:10 0.282 0.475 4.628
15 01:10 0.408 0.685 6.724
 
Blanco Sustrato 0.041 0.074
Blanco Enzima 0.026 0.049
 8

7
f(x) = 0.45 x + 0.05
6 R² = 1
Azucares Reductores (g/L)

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
TIEMPO (min)

GRUPO B - 1 MIERCOLES 08 Julio 2015

E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0   0.098 0.169 0.146
2 01:04 0.141 0.241 0.870
6 01:04 0.352 0.592 2.273
10 01:04 0.503 0.843 3.278
15 01:04 0.708 1.184 4.642
 
Blanco Sustrato 0.0066 0.017
Blanco Enzima 0 0.006
0.023
5.000
4.500 f(x) = 0.3 x + 0.28
R² = 0.99
4.000
3.500
3.000
2.500
2.000 Linear ()
1.500
1.000
0.500
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
GRUPO MIERCOLES 08
B-2 Julio 2015

E 1:4
t Dilución Abs 540nm P (g/L) P (g/L)
0   0.092 0.159 0.126
2 01:08 0.102 0.176 1.142
6 01:08 0.204 0.345 2.499
10 01:08 0.292 0.492 3.670
15 01:08 0.439 0.736 5.626
 
Blanco Sustrato 0.0125 0.027
Blanco Enzima 0 0.006
0.033

P (g/L)
6.000
5.000 f(x) = 0.35 x + 0.27
R² = 1
4.000
3.000 P (g/L)
Linear (P (g/L))
2.000
1.000
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
TIEMPO

GRUPO B - 3 MIERCOLES 08 Julio 2015

E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0   0.369 0.620 0.523
2 01:10 0.058 0.103 0.929
6 01:10 0.161 0.274 2.642
10 01:10 0.259 0.437 4.272
15 01:10 0.404 0.678 6.684
 
Blanco Sustrato 0.0254 0.048
 Blanco Enzima 0 0.006
0.055

Chart Title
8.000
7.000
6.000 f(x) = 0.42 x + 0.26
5.000 R² = 0.99
4.000
Axis Title Linear ()
3.000
2.000
1.000
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Axis Title

Grupo C1
E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0 1\1 0.146 0.249 0.112
2 1\5 0.103 0.177 0.750
6 1\5 0.278 0.469 2.206
10 1\5 0.450 0.755 3.636
15 1\5 0.670 1.121 5.466

Blanco Enzima 0.025 0.0477

Blanco Sustrato 0.05 0.0893

6.000

5.000 f(x) = 0.36 x + 0.07

R² = 1
Azucares Reductores

4.000

3.000

2.000 Linear ()
1.000

0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo
Grupo C2
E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0 1\1 0.141 0.241 0.104
2 1\8 0.050 0.089 0.578
6 1\8 0.125 0.214 1.576
10 1\8 0.185 0.314 2.374
15 1\8 0.260 0.439 3.372

Blanco Enzima 0.025 0.0477

Blanco Sustrato 0.05 0.0893

4.000

3.500
f(x) = 0.22 x + 0.16
3.000 R² = 1

2.500

2.000
Linear ()
1.500

1.000

0.500

0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16

Grupo C3
E 1:4
Abs
t Dilución P (g/L) P (g/L)
540nm
0 1\1 0.201 0.340 0.203
2 1\10 0.087 0.151 1.372
6 1\10 0.235 0.397 3.833
10 1\10 0.410 0.688 6.744
15 1\10 0.598 1.001 9.871
Blanco Enzima 0.025 0.0477
Blanco Sustrato 0.05 0.0893

12.000

10.000
f(x) = 0.65 x + 0.11
R² = 1
8.000

6.000
Linear ()
4.000

2.000

0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16

CUADRO DE RESUMEN DE

GRUPO [ ] Sacarosa   1/Sacarosa  

A1 4 0.2543 0.25 3.93236335
0.1666666
6
B1 0.2976 7 3.36021505
0.1363636
7.3333333
C1 0.3584 4 2.79017857
0.1071428
9.3333333
A2 0.4259 6 2.34796901
0.0882352
11.333333
B2 0.3543 9 2.82246684
C2 13.333333 0.2181 0.075 4.58505273
0.0652173
15.333333
A3 0.4517 9 2.21385876
0.0576923
17.333333
B3 0.4169 1 2.39865675
 0.0517241
19.333333
C3 0.6515 4 1.53491942

5
4.5
4
3.5 f(x) = 7.46 x + 2.06
R² = 0.26
3
2.5
1/V

2
1.5
1
0.5
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
1/S

trabajaremos con los siguientes datos, por criterio :

1/Sacarosa
 
0.25 3.93236335
0.16666667 3.36021505
0.13636364 2.79017857
0.10714286 2.34796901
0.05172414 1.53491942
 4.5
4 f(x) = 12.28 x + 1.04
3.5 R² = 0.96

3
2.5
1/v

2
1.5
1
0.5
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
1/S

y = 120283x + 1.0443

Decim
os:
1
=1.0443
V

0.95757 g/L
v= 924 min

K
=12.283
V
 11.7619
Km = 458 g/ L

VI. DISCUSIONES

Por otra parte se han evaluado los parámetros cinéticos de inulinasas

provenientes de diferentes fuentes de microorganismos en torno a
solo un valor de temperatura óptima. Kushi et al. (2000)
determinaron los valores de los parámetros cinéticos aparentes K m y
Vmax de la inulinasa purificada por HPLC de Kluyveromyces
marxianus var. bulgaricus ATCC 16045 en presencia de inulina y
sacarosa siendo 86.9 mg/ml y 53.7 U/mg de proteína y 4.58 mg/ml y
441.0 U/mg de proteína a 55 ºC y pH 4.4 óptimos, respectivamente,
demostrando que la enzima producida es una exo-inulinasa con más
alta afinidad y reactividad por la sacarosa que por la inulina. De
Paula et al. (2008) también determinaron los valores de los
parámetros cinéticos de un caldo crudo exento de células
conteniendo inulinasa de Kluyveromyces marxianus var.
bulgaricus ATCC 16045 siendo de Km igual a 61.83 mM y Vmax igual a
37.60 U/mg de proteína a 55 ºC y pH 3.5 óptimos.

Un medio crudo libre de células de un cultivo de Kluyveromyces

marxianus var. bulgaricus ATCC 16045 fue inmovilizado en gelatina
tratado con glutaraldehído resultando con una actividad de inulinasa
del 82.20 %. Sus parámetros cinéticos fueron de Km igual a 149.28
mM y Vmax igual a 31.45 U/mg de proteína a 55 ºC y pH 3.5
óptimos. La inulinasa inmovilizada actuó con una eficiencia de
conversión de sacarosa del 58.12 % en un reactor continuo de lecho
fijo operando por 33 días (de Paula et al., 2008).
Células de Kluyveromyces marxianus con actividad de inulinasa,
fueron inmovilizados en alginato de bario tratado con glutaraldehído,
manteniéndose una actividad residual del 85 % y una eficiencia del
sistema (η) de 0.79 para un diámetro de partícula de 1.43 mm. El
coeficiente de difusión (DE) de la inulina hacia el interior del soporte
fue de  2.5x10-6 cm2s-1mientras que el módulo de Thiele (ф) fue
cercano a 1, confirmándose que el factor limitante del sistema fue la
resistencia difusional del sustrato. Sus parámetros cinéticos fueron
de Km igual a 0.522 mM y Vmax igual a 113.7 µmolmin-1 de proteína
(Barranco-Florido et al., 2001).

La determinación de los anteriores parámetros cinéticos (Vmax y

km) se puede realizar utilizando las representaciones de
Lineweaver-Burke (1/v: 1/ [S]).
Los valores de Km de las enzimas varían ampliamente. Para la
mayoría de las enzimas Km varía entre 10-1 y 10-6 M. El valor de
Km para una enzima depende de cada sustrato particular y también
de las condiciones ambientales como la temperatura y la fuerza
iónica. Km es la concentración de sustrato a la cual la mitad de los
centros activos están ocupados, Km se relaciona con la constante de
velocidad de las etapas individuales. Un km alto indica una unión
débil, un Km bajo indica una unión fuerte. Km indica la afinidad del
complejo ES. La Vmax revela además el número de recambio de
una enzima, si se conoce la concentración de los centros activos.
Los números de recambio de la mayoría de las enzimas para
sustratos fisiológicos oscilan entre 1 y 104 por segundo.

Según: [ CITATION Bio05 \l 2058 ]

En muchos casos es de vital importancia conocer estos parámetros
cinéticos. En principio, podrían obtenerse de forma poco rigurosa a
partir de la curva de Michaelis Menten, pero existen métodos
gráficos más fiables que facilitan el cálculo preciso de Km y Vmax.
Los cálculos se hacen en base a transformaciones matemáticas de
la ecuación de Michaelis; una de las expresiones más utilizadas es
la representación de Lineweaver-Burk. En esta forma de cálculo se
representa 1/V frente a 1/S, esto es la inversa de la velocidad frente
a la inversa de la concentración (de ahí que también la
representación sea conocida como de dobles inversos), así se
obtiene una recta cuya intersección con el eje X es –1/Km y con el
eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax. 

Se ha visto que hay necesidad de investigar la actividad y estabilidad

de la inulinasa frente a la temperatura, modelando y simulando la
cinética de desactivación. Los parámetros cinéticos de la inulinasa
están en función al tipo de microorganismo, las condiciones
ambientales de la fermentación y del modo de acción de la enzima.

Se ha determinado que las inulinasas pueden ejercer dos modos de

acción diferentes sobre la molécula de inulina, una acción extrema y
una acción interna, correspondiendo dos clases de inulinasas
llamadas exo-inulinasas y endo-inulinasas respectivamente. Las
exo-inulinasas (74 KDa, pH 5.1 – 7.0) empiezan con la separación
de la primera molécula de D-fructosa y va hasta el último enlace
para liberar glucosa de la unidad de sacarosa y la endo-inulinasa (64
KDa) actúa sobre enlaces internos y rinde un conjunto de inulo-
oligosacáridos (inulotriosa, inulotetrosa y inulopentosa) pero sin
actividad invertasa. Estas propiedades dependen del origen
microbiano de la enzima. De este punto de vista la mejor cepa sería
la que tenga ambas propiedades, como el caso del  A.
ficuum (Pandey et al., 1999), dado que una mezcla de endo y exo
inulinasa puede resultar en una mejor conversión de inulina a
fructosa que solo utilizar enzimas puras aisladas, dado que las endo-
inulinasas romperían las moléculas de inulina en muchos
oligosacáridos, aumentando así los puntos de ataque para las exo-
inulinasas, con el consecuente incremento de la velocidad de
reacción de inulina a fructosa.
 Por tanto queda probado que las exo-inulinasas también ejercen
actividad catalítica sobre la sacarosa, desdoblándola en glucosa y
fructosa, es decir tienen actividad de invertasa. Se afirma que la
actividad invertasa es mayor en enzimas producidas por levaduras
que en aquellas obtenidas a partir de mohos (Ricca  et al., 2007).
Notoriamente una actividad invertasa de inulinasa es deseable.
Laloux et al. (1991) sostienen que las inulinasas poseen sitios
catalíticos comunes, pero diferentes sitios de enlace para la hidrólisis
de inulina y sacarosa.

La actividad y estabilidad depende de la respuesta de la enzima a

los cambios de temperatura y pH. Los valores de temperatura y pH
dependen del tipo de microorganismo usado como fuente,
generalmente se da valores más altos para bacterias y levaduras
que mohos. Así se tienen los rango de valores de pH, para mohos
4.5 – 7.0, para levaduras 4.4- 6.5 y para las bacterias 4.8 – 7.0
(Ricca et al., 2007). Singh et al. (2007b), determinaron que la exo-
inulinasa de Kluyveromyces marxianus YS-1 exhibió considerable
actividad a un valor de pH óptimo de 5.5 en que mantuvo estable su
actividad catalítica al 100% durante 3 h a la temperatura óptima de
50 ºC. Se observa que todavía existe la necesidad de investigar la
actividad y estabilidad de la inulinasa contra la temperatura, así
como los modelamientos y simulación de procesos o cinética de
desactivación de la enzima.

VII. CONCLUSIONES

Se determinó los parámetros cinéticos Km y V, obteniendo los

valores de V = 0.95757924 g/ L min y Km=11.7619458 g/L.
Los parámetros cinéticos de la inulinasa están en función al tipo de
microorganismo, las condiciones ambientales de la fermentación y
del modo de acción de la enzima.
VIII. RECOMENDACIONES

La preparación de diluciones y tomas de muestra deben ser en lo

posible realizado por una sola persona que cuente con la suficiente
capacidad para realizar un buen manejo de las mismas, debido a que
el método con el que se trabaja se basa en pocos cálculos y más en
manejo de diluciones y medidas.

IX. ANEXOS

Diagrama de Lineweaver-Burk

En bioquímica, el diagrama de Lineweaver-Burk se emplea como

herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una
enzima.

Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de Michaelis-

Menten es fácilmente representable y que de él emanan mucha
información de interés.

Cuyo recíproco es:

donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de
Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la
concentración de sustrato.

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el

Km y Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el
equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de
-1/Km.

Diagrama de Eadie-Hofstee

El diagrama de Eadie-Hofstee, también llamado de Woolf-Eadie-

Augustinsson-Hofstee o de Eadie-Augustinsson, es una
representación gráfica de la función matemática utilizada
en bioquímica en el estudio de la cinética de las reacciones enzimáticas,
por la que se relaciona la velocidad de una reacción con la
concentración del sustrato:
donde 'v' representa la velocidad de la reacción, 'Km' es la constante
de Michaelis-Menten, [S] es la concentración del sustrato y 'vmax' es el
máximo de la velocidad de la reacción.
El diagrama puede deducirse de la ecuación de Michaelis-Menten
como sigue:

si se invierte y multiplica por  , se obtiene:

que reordenando:

al aislar v se obtiene:
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Barreiro-Palma, José Manuel. 1998. Comprobación de la

selectividad de la tecnica de precipitacibn por acetona de la
inulinasa extracelular (E.C.3.2.1.7) de Kíuyueromyces marxianus
CDBB-L-278.
2. Castillo-Calderón, A.; Chamy-Maggi, R. 2010. Producción de
inulinasa por levaduras de Kluyveromyces marxianus. Scientia
Agropecuaria 1(2010) 235 – 245.
3. Chi, Z.; Chi, Z.; Zhang, T.; Liu, G. 2009. Inulinase-expressing
microorganisms and applications of inulinases. J Appl Glycosci,
51: 247-254.
4. Corona-González, R.; Pelayo-Ortiz, C.; González-Álvarez, V.;
Zuñiga-Partida, V. 2005. Otimización de la producción de
inulinasas por saccharomyces sp. a partir de agave tequilana
weber variedad azul. E-Gnosis , Vol. 3, Art. 8.
5. De Paula, F.; Cazetta, M.; Monti, R.; Contiero, J. 2008. Sucrose
hydrolysis by gelatin-immobilized inulinase from Kluyveromyces
marxianus var. Bulgaricus. Food Chemistry, 111: 691-695.
6. Kushi, R.; Monti, R.; Contiero, J. 2000. Production, purification
and characterization of an extracellular inulinase from
Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus. Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, 25: 63-69.
7. Laloux, O.; Cassart, J.; Delcour, J.; Van Beeumen, J.;
Vandenhaute, J. 1991. Clonig and sequencing of the inulinase
gene of Kluyvemomyces marxianus var. Marxianus ATCC 12424.
FEBS LETTERS, 289: 64 – 68.
8. Pandey, A.; Soccol, C.; Selvakumar, P.; Soccol, V.; Krieger, N.;
Fontana, J. 1999. Recent Developments in Microbial Inulinases.
Appl Biochem Biotechnol, 81: 35-52.
9. Ricca, E.; Calabró, V.; Curcio, S.; Dorio, G. 2007. The State of the
Art in the Production of Fructose from inulin Enzymatic Hydrolysis.
Crit Rev Biotechnol, 27: 129-145.
10. Rouwenhorst, R.; Hensing, M.; Verbakel, J.; Scheffers, W.; Van
Dijken, J. 1990. Structure and Properties of the Extracellular
Inulinase of Kluyveromyces marxianus CBS 6556. Applied and
Environmental Microbiology, 56: 3337-3345.
11. Singh, R.; Bhermi, H. 2008. Production of extracellular
exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-I using root
tubers of Asparagus officinalis. Bioresource Technology, 99: 7418
– 7423.