03/06/2022

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES FECALES, TOTALES Y

BACTERIA ECHERICHIA COLI

Jhon Jairo Loaiza1 Valentina Londoño2

Yesica Cardona Ospina3

Instituto técnico de educación

profesional (INTEP) Roldanillo Valle

Dirigido a: Luisa Fernanda Arias

lfarias_docente@intep.edu.co

RESUMEN

La determinación de coliformes fecales, totales y echerichia coli es toda practica

que se realiza para identificar microorganismos presentes en los alimentos, ya sea
en el agua o alimentos que estén en contacto con el agua o con operarios que no
usen medidas de higiene necesarias a la hora de manipular alimentos; en primer
lugar enfatizamos en la determinación de coliformes fecales, totales y E.Coli en
negocios aledaños del municipio de Roldanillo Valle donde se obtuvo la muestra
(arepa) de un negocio anónimo y se trasladó tal y como se obtuvo hasta el
laboratorio de Microbiología del INTEP y allí se procedió a realizarse todas pruebas
correspondientes en las cuales se tuvo un proceso y unos tiempos establecidos
para su correcta realización utilizando métodos de enriquecimiento de
microorganismos como los caldos billis verde brillante, caldo triptófano, y el agar
EMB para facilitar la determinación de estos, donde luego de haberse cumplido los
plazos determinados en el manual de prácticas microbiológicas se logró obtener un
resultado positivo de coliformes fecales, totales y E.Coli realizadas dando a
entender que este negocio de arepas debe de mejorar sus procesos de limpieza,
desinfección e higiene de sus equipos, manipuladores y materia prima a la hora de
elaborar sus productos.

1
vlondono_ucaya@intep.edu.co
2
jloaiza_ucaya@intep.edu.co
3
ycardona_ucaya@intep.edu.co
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OBJETIVOS lugar pueden estar siendo mal usadas o

pueden estar contaminadas.
OBJETIVO PRINCIPAL
La Escherichia coli es un coliformes fecal
Desarrollar un análisis microbiológico en y estos son un grupo de microorganismos
un alimento determinado con el fin los cuales se evidencian por medio de
de identificar la presencia de estos
incubación en caldo triptófano, estos
microorganismos alterantes (coliformes).
producen un tipo de gas que es el
OBJETIVOS ESPECÍFICOS indicador principal de que la muestra está
contaminada. La Escherichia es
Obtener las herramientas necesarias para resistente en agua y suelo, aunque si la
identificar el verdadero estado temperatura de ambiente es igual o
de salubridad de un alimento en superior a 60°C puede morir alrededor de
particular. los 15 minutos
Reconocer la posible presencia de
agentes patógenos (E. Coli) en dichos
alimentos. MARCO TEORICO

Familiarizarse con los métodos de Los coliformes son un tipo de

aislamientos de bacterias anaeróbicas microorganismo Gram negativas
en alimentos. anaerobias que no crecen a altas
temperaturas, que se encuentran en el
INTRODUCCIÓN medio ambiente y son utilizadas como un
Los coliformes es un tipo de indicador higiénico en las industrias
microorganismo Gram negativa alimenticias, si en los resultados da
encontrado principalmente en el agua y positivo la presencia de esta bacteria en
en alimentos no desinfectado. Al consumir los alimentos no significa que siempre
el agua o un alimento infectado por causen enfermedades. Existen dos
coliformes, transmitirá una bacteria grupos de coliformes, están lo coliformes
llamada Escherichia coli a nuestro fecales que son los que se encuentran en
intestino, la cual es la indicadora de el tracto intestinal en los animales de
contaminación fecal o en algunas sangre caliente o en los humanos, y por lo
ocasiones puede causar enfermedades tanto requiere de una prueba más
de gravedad al realiza pruebas de específica para detectar la contaminación
microbiología su procedimiento es de ya sea por el agua residual o por
mayor facilidad y la diferenciación de desechos animales y está la Escherichia
cultivos o resultados hace que sea más coli (E. Coli),que se puede encontrar en
evidente el tipo de contaminación instalaciones de fabricación de alimentos
presentada. o en fuentes de agua potable, algunas de
estas bacterias pueden ser inofensivas
En las industrias alimentarias, este tipo de pero otras pueden causar intoxicación, los
microorganismo es utilizado como un síntomas más comunes son: malestar
indicador de higiene y controladores de la gastrointestinal y síntomas generales
calidad del agua, también se encuentra en como la fiebre, la gripe, calambres
el intestino del hombre y de animales, en abdominales y la diarrea.
el suelo, plantas, etc. Los coliformes son
indicadores de que las prácticas o El caldo brilla es utilizado para la
procesos que se están realizando en este detención de microorganismos tales como
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los coliformes en alimentos, como el otros desinfección del área, protección personal
materiales de importancia sanitaria, para y la adecuación de nuestros materiales de
detectar la presencia de microorganismos trabajo para la esterilización, desinfección
con este caldo se debe actuar por 48 y su posterior eliminación de
horas ya con la muestra, y si al destapar microorganismos existentes en su interior
suelta un gas sería un resultado positivo. y entorno; para la esterilización de
nuestros materiales destinados a la
El caldo triptona es utilizado para preparación y sellado del cultivo se deben
detención de la E. Coli y otros coliformes. de envolver en papel Kraft luego de
Este caldo debe ser preparado con agua
haberse desinfectado con alcohol al 70%
destilada, debe ser calentado y auto
y haberse secado muy bien para evitar
clavado para realizar las pruebas de los
contaminación cruzada y de la misma
microorganismos.
forma luego de haber completado el
El EMB es un medio de cultivo que proceso anterior llevar cuidadosamente
contiene un colorante para la detención los materiales al autoclave para
de microorganismos en los alimentos y en esterilizarlos a 121°c pero con una
el agua. Este medio de cultivo expresa los vigilancia excesiva del autoclave para
resultados de diferentes colores tales evitar una presión alta que cause un
como el verde metálico para detección de accidente; finalizado todo el proceso de
la E. Coli y para los coliformes un negro esterilización y desinfección de nuestros
azulado. implementos para el cultivo de colonias,
se debe de emplear una desinfección
En la prueba coliformes se debe tener en constante del ambiente con alcohol al
cuenta que existe una tabla que indica los 70% y tener encendido un mechero o
NMP (números más probables) donde se algún medio de calor que actué como un
realiza el reconteo con la siguiente aislante a microorganismos del ambiente
formula: para evitar cualquier tipo de
𝑁𝑀𝑃 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎∗𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 contaminación y por consiguiente
=
100 nuestros resultados no sean alterados y
NMP/g o ml sean fiables.

Ilustración 1 fuente propia

PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL

En primer lugar, debemos tener en

cuenta todos los procedimientos que se
deben de llevar a cabo en todas las
practicas microbiológicas como lo son la
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Ilustración 2 fuente propia tubos debe ser de 9 tubos (3 por cada

dilución) y así pasar a tomar 1 ml por cada
dilución para los tres tubos sumando así 3
ml de dilución y así proceder a la
aplicación en cada uno de los tres tubos
(repetir el procedimiento con las otras dos
diluciones restantes)

 Incubación de las muestras en

el caldo bilis brillante.

Después de realizar el cultivo

procedemos a incubar la muestra a las
IMPORTANTE: Todo proceso de siguientes condiciones, 35°C por 24
esterilización y homogenización que se horas.
lleva a cabo debe ser vigilado desde el
manómetro para evitar cualquier exceso Importante: por cuestiones del horario
de presión dentro del autoclave (cuando académico la muestra se dejó en el
llegue a la coloración verde se debe dejar proceso de incubación por 8 días por 8
escapar el vapor y dejar reposar un días
mínimo de 15 min para así retirar los Ilustración 3 fuente propia
implementos que anteriormente se
introdujeron.)

 Determinación de coliformes
fecales

Probable NMP: (forma en que se

prepara Caldo lactosado bilis verde
brillante al 2%)
Para la preparación del caldo bilis verde
brillante se deben de tener la cantidad de
40 gr de caldo y 1000 ml de caldo
triptófano según es determinado, pero
después del cálculo realizado por la
ingeniera Luisa Fernanda determino la
cantidad de caldo para 4 pruebas
microbiológicas, 6.1 gr de caldo y 153 ml
de agua destilada (el calo no se solidifica  Preparación del caldo triptófano
por lo cual solo hay que homogenizar)
Para la preparación del caldo triptófano se
 Aplicación del caldo bilis necesita la cantidad exacta de los
brillante siguientes componentes, 15 gr de caldo
triptófano y 1000 ml de agua destilada
Para la aplicación de este caldo se según lo que se determina, pero después
determina que por tubo se le agregaran 17 de la formulación realizada por la
ml de caldo, teniendo cada uno la misma ingeniera Luisa Fernanda se determinó
medida de caldo donde el número de las cantidades para las 4 pruebas
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microbiológicas, 9.1 gr de caldo y 612 ml de 8 días por cuestiones de horario

de agua destilada (homogenizar el caldo académico
triptófano con calor
Ilustración 4 fuente propia  Aplicación de las gotas del
reactivo de Kovac´s al caldo
triptófano

Luego de finalizar el procedimiento de

incubación en el caldo triptófano con
muestra se realiza la adición del reactivo
de Kovac´s para que así procedamos a
observar los resultados arrojados por el
reactivo donde morado es positivo
 Preparación del agar EMB

Para la preparación del agar EMB se

necesitan las cantidades generales
necesarias de 37,5 gr de agar y 1000 ml
de agua destilada para proceder con la
homogenización del agar, pero después
de la formulación realizada por la
 Aplicación del caldo triptófano ingeniera Luisa Fernanda se determinó
las cantidades para las 4 pruebas
Luego de que se haya cumplido el tiempo microbiológicas, se solicitan las
establecido del cultivo microbiológico en cantidades de 2,8 gr de agar y 75 ml de
el caldo bilis verde brillante procedemos a agua destilada.
realizar la siembra de los tubos que
Ilustración 5 fuente: laboquimia
mostraron unos resultados positivos,
donde se realiza la adición de 17 ml por
tubo teniendo todos la misma medida y
así luego de tener los nueve tubos con 17
ml de caldo triptófano procedemos a
pipetear 1 ml de muestra del caldo bilis
verde brillante a cada tubo teniendo en
cuenta la división de muestras
determinadas ya sea en números o letras
para su fácil identificación, véase la
ilustración… para mayor ejemplificación

 Incubación de las muestras en

caldo triptófano

Las muestras se deben de incubar a una

temperatura de 35°C por 24 horas para la
obtención de resultados
Importante: las muestras microbiológicas
se sometieron a incubación por un tiempo
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 Método de cultivación en el agar

EMB Ilustración 7 fuente propia

Para finalizar todo el procedimiento

procedemos a identificar E. Coli por medio
del agar EMB donde luego de obtener los
resultados en el caldo bilis brillante, solo
realizaremos la prueba en los resultados
positivos arrojados después de la prueba
con este caldo donde, por medio de 3
cajas añadiremos 25 ml de agar EMB,
dividiremos la caja de Petri en 3 partes
determinando por medio de números o
letras para la correcta identificación de las
muestras y dejaremos solidificar para así Ilustración 8 fuente propia
proceder con el cultivo por medio de una
asa, esterilizándola con calor y así
introducir la asada en la muestra con
caldo bilis verde brillante y finalmente
realizar el cultivo por medio de estría.

 Incubación de las muestras en

agar EMB

Para finalizar se realiza la incubación de

las muestras en 35°C por 24 horas para la
obtención de resultados
Importante: Por cuestiones de horario ANALISIS Y DISCUSIÓN DE
académico las muestras se sometieron a RESULTADOS
incubación por 8 días.
En los resultados de las pruebas con el
Ilustración 6 fuente propia caldo brilla se observó que cambio de
color a uno más claro lo normal, al ser
destapado soltó un gas lo, que significa
que dio positivo. En este caldo se pudo
observar un líquido muy espeso, esto es
debido al algodón. Es las siguientes
imágenes se podrá observar el cambio de
color y la espuma que provoca el gas.
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Ilustración 9 fuente propia

Ilustración 12 fuente propia

Ilustración 10 fuente propia

Ilustración 13 fuente propia

Después de la siembra se dejó actuar el

tiempo necesario para que se pudiera
observar los microorganismos. Se obtuvo
como resultado positivo para Escherichia
coli ya que se pudo observar los colores
verde, fucsia y negro azulado en todas las
cajas.

Ilustración 11 fuente propia

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Prueba confirmativa
Fundamento Estos fueron los resultados de coliformes (E. Coli)
Imagen

Reporte >1100∗100
=> 1100NMP/g o ml
100

Análisis según la tabla de NMP se encuentran más de 1100 coliformes (E. Coli)

CONCLUSIONES

 La presencia de coliformes fecales y totales en la muestra de arepa analizada, es

un gran indicador de que en el lugar de producción no se están llevando a cabo unas
buenas prácticas o una buena manipulación de alimentos.
 Se debe tener en cuenta que no necesariamente puede estar contaminada la
muestra, ya que pudo haber sido contaminada en el transporte hacia el laboratorio,
las materias primas también puede contener la bacteria o al momento de realizar el
muestreo pudo ser contaminada.
 El material debe estar completamente desinfectado y la persona que vaya a realizar
la siembra debe tener puestos todos los elementos de protección personal.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
3M Ciencia aplicada a la vida: https://www.3m.com.co/3M/es_CO/food-safety-la/biblioteca-
de-
documentos/microorganismos/coliformes/#:~:text=Las%20bacterias%20Coliformes%2C%
20un%20grupo,durante%20m%C3%A1s%20de%20un%20siglo.
PennState extensión: bacterias coliformes: Bryan R. Swistock, Asociado de Extensión,
Stephanie Clemens, Asistente de Investigación y William Sharpe, Profesor de hidrología
forestal: https://extension.psu.edu/bacterias-
coliformes#:~:text=Efectos%20de%20las%20bacterias%20coliformes%20sobre%20la%20
salud&text=La%20mayor%C3%ADa%20de%20estas%20bacterias,fiebre%2C%20calamb
res%20abdominales%20y%20diarrea.
Condalab: caldo de cultivo triptófano ISO:
https://www.condalab.com/int/en/index.php?controller=attachment&id_attachment=8545
Novachem del ecuador: https://www.novachem.com.ec/producto/caldo-bilis-verde-brillante/
BD EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar), Modified: INSTRUCCIONES DE USO: MEDIO
EN PLACAS LISTO PARA SU USO:
https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8765#:~:text=BD%20EMB%20Agar%2C%20Mod
ified%20(f%C3%B3rmula,a%20partir%20de%20muestras%20cl%C3%ADnicas.