Manual Bacter 2021

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
SECRETARIA ACADEMICA
DIRECCIÓN DE EDUCACIÓN MEDIA SUPERIOR
CENTRO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS Y TECNOLÓGICOS 15
” DIÓDORO ANTUNEZ EHEGARAY”
INSTRUCTIVO DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA
NOMBRE DEL TITULAR:
NOMBRE DEL PROFESOR DE LABORATORIO:
NOMBRE DEL PROESOR DE LABORATORIO:
NOMBRE DEL ESTUDIANTE:
G R U P O :________________ E Q U IP O :________________
CICLO ESCOLAR: 2021 II SEMESTRE: CUARTO
ELABORO: Q.B.P. ALEJANDRA FRAGOSO CAMACHO.

2021
1
COMPETENCIA GENERAL
Aplica métodos y técnicas para el estudio de la bacteriología clínica cumpliendo con la

normatividad vigente.
JUSTIFICACIÓN
El presente instructivo contiene actividades prácticas, que incluyen conceptos, técnicas,

procedimientos, que se realizan en un laboratorio de bacteriología clínica y que sirven de
apoyo para el estudiante en su formación como Técnicos Laboratoristas Clínicos, y para el
docente al coadyuvar en su ardua tarea de planear y formalizar los conceptos teóricos. El uso
de este instructivo va a permitir la sistematización de la impartición de esta asignatura a partir
de ordenar y explicitar mejor las actividades a realizar y que todos los alumnos reciban la
misma instrucción.
Es importante mencionar, que en los últimos años se han desarrollado nuevas tecnologías
que escapan al objetivo de este manual, pero que pueden ser consultadas en otras
bibliografías especializadas.
2
ÍNDICE
Práctica 1. Reglamento y bioseguridad en el laboratorio. 4

Práctica 2. Material de laboratorio de Bacteriología y Microscopía. 10
Práctica 3. Tinción Simple. 24
Práctica 4. Tinción diferencial de Gram. 29
Práctica 5. Tinción diferencial de Ziehl Neelsen. 33
Práctica 6 Tinciones especiales. 37
Examen práctico A.
Práctica 7. Esterilización por calor húmedo y por calor seco. 41
Práctica 8. Preparación de medios de cultivo. 46
Práctica 9 Medios de cultivo y su control de calidad. 52
Práctica 10. Siembra y aislamiento bacteriológico. 57
Práctica 11. Morfología colonial. 65
Examen práctico B.
Práctica 12. Exudado Faríngeo. 70
Práctica 13. Antibiograma del exudado faríngeo. 75

Práctica 14. Siembra de urocultivo. 79
Práctica 15. Pruebas bioquímicas para el urocultivo. 84
Práctica 16 Siembra de coprocultivo. 89
Práctica 17. Lectura del coprocultivo. 93
Examen práctico C
3
“DIÓDORO ANTÚNEZ ECHEGARAY “
ACADEMIA DE: TÉCNICO LABORATORISTA CLÍNICO
LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLÍNICA
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 1: REGLAMENTO Y
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO.
Clave: BC-P1 Revisión: 15/02/21 Fecha de emisión: 22/02/21 Página: 4 de 97
1. MARCO TEORICO
El reglamento de trabajo está conformado por una serie de normas que regirán la actitud, el
comportamiento y el desempeño del estudiante dentro del laboratorio de Bacteriología Clínica.
Tiene como finalidad evitar riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el
laboratorio es un área donde se manejan microorganismos patógenos y algunos compuestos
químicos peligrosos. Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso como los microscopios y
material delicado de cristalería.
La bioseguridad
Según la OMS (2005) es un conjunto de normas y medidas para proteger la salud del
personal, frente a riesgos biológicos, químicos y físicos a los que está expuesto en el
desempeño de sus funciones, también a los pacientes y al medio ambiente.
Principios de bioseguridad
La bioseguridad tiene tres pilares que sustentan y dan origen a las precauciones
universales:
a) Universalidad: de este principio nace el concepto de potencialidad, es decir, se asume que

toda persona es portadora de algún agente infeccioso hasta no demostrar lo contrario. Las
medidas de bioseguridad son universales, es decir deben ser observadas en todas las
personas que se atiende.
b) Uso de barreras protectoras: son elementos que protegen de la transmisión de infecciones

y se dividen en dos grandes grupos, la inmunización activa (vacunas) y el uso de barreras
químicas, físicas o mecánicas, para evitar el contacto directo entre personas y entre
personas y objetos potencialmente contaminados o nocivos.
c) Medidas de eliminación de residuos
La eliminación de los desechos peligrosos que se generan en las instituciones de salud

tiene riesgos y dificultades especiales, debido fundamentalmente a la presencia de
agentes biológicos. Estos riesgos involucran en primer término al personal que maneja los
desechos tanto dentro como fuera del establecimiento, que, si no dispone de capacitación
4
suficiente ni medios de protección personal, equipos y herramientas de trabajo apropiados
se expone al contacto directo con gérmenes patógenos o a la acción de objetos corto
punzantes como agujas, jeringas, trozos de vidrio, lancetas y otros. El manejo deficiente
de desechos peligrosos en centros de salud o específicamente en un laboratorio de
enseñanza como el nuestro involucra tanto al personal de intendencia como a los
estudiantes y profesores expuestos como a la comunidad y al medio ambiente
circundante.
Agentes biológicos
Son microorganismos incluyendo los genéticamente modificados, cultivos celulares y

endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad
en humanos, animales u otros seres vivos. Los agentes biológicos se clasifican en cuatro
grupos según su riesgo intrínseco, el cual se determina en función de su virulencia, su facilidad
de propagación, la gravedad de sus efectos sobre la salud y la existencia o no de medidas
profilácticas y terapéuticas eficaces.
2. COMPETENCIA A ALCANZAR
El alumno aplica el reglamento de laboratorio, con el fin de mantener la seguridad individual

y grupal, así como el cuidado y conservación de los instrumentos del laboratorio.
3. MATERIALES
Instructivo de prácticas.
Material bibliográfico relacionado con la práctica.
Presentación en PWP, Prezzi, etc. basadas en el contenido de la práctica.
4. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
1. Formación de equipos de trabajo.

2. - Lectura y firma de conformidad del reglamento de laboratorio.
3. - Explicación o presentación en PWP, Prezzi (por parte del docente titular) etc. que incluya
la siguiente información: que es bioseguridad, principios básicos de bioseguridad, niveles de
contención y sus características, que es agente un biológico y su clasificación según la OMS,
barreras primarias y secundarias.
5
REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA
CLINICA.
Ciudad de México, enero del 2021.
1. Entrar puntualmente al laboratorio. Eventualmente se permitirá una tolerancia de 5 minutos.

Después de la tolerancia no se permitirá al acceso.
2. Ingresar al laboratorio con la bata puesta, abotonada, limpia y planchada. Solo podrá
quitársela al salir de éste.
3. Permanecer con la bata abotonada en todo momento durante la estancia en el laboratorio.
4. Deben presentarse al laboratorio con el cabello recogido, uñas cortas y sin esmalte.
5. Queda prohibida la entrada a personas ajenas al laboratorio.
6. Mantener siempre cerrada la puerta del laboratorio.
7. Se prohíbe la salida, sin autorización de los profesores encargados.
8. Colocar las mochilas y objetos personales en los anaqueles que se encuentran en la entrada
del laboratorio. Dejar afuera solamente el material que se va a utilizar.
9. Evitar comer, aplicarse maquillaje o realizar alguna otra actividad que no se relacione con la
asignatura (recortes, cuestionarios, dibujos etc.).
10. Verificar que la mesa de trabajo este en óptimas condiciones para llevar a cabo la práctica
correspondiente, en caso de encontrarla sucia o con material, deberán reportarlo al profesor.
11. Atender la explicación para seguir correctamente las instrucciones del profesor. Si hay dudas
preguntar antes de iniciar la práctica para evitar errores y accidentes, (no habrá repeticiones,
por error del estudiante, ya que no se dispone del tiempo ni reactivos suficientes) asimismo
informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra.
12. Leer la práctica antes de entrar al laboratorio.
13. Verificar que al final de la práctica las mesas y tarjas queden limpias, para lo cual se asignará
un rol.
14. Para poder retirarse del laboratorio será necesario contar con la autorización del profesor.
15. Colocar los bancos bajo la mesa durante la práctica, para evitar obstáculos al caminar en el
laboratorio y evitar accidentes.
16. Durante la sesión quedan prohibidos los juegos y abrazos.
6
17. Solicitar el material de manera ordenada, para ello solamente podrán ir una o dos personas al
almacén y los demás integrantes del equipo deben permanecer en su mesa de trabajo, salvo
otra indicación del profesor (es).
18. Colocar los bancos en la parte de arriba de la mesa y hacia el centro de la misma al terminar
la sesión.
19. Reponer el material roto o extraviado (por equipo o grupo) en un lapso no mayor de 15 días.
20. Adquirir el manual, el cual será personal e identificarlo en el extremo inferior derecho con
nombre, grupo, equipo.
21. Todos los integrantes del equipo habrán de elaborar de manera individual su reporte práctico
sin embargo solo se entregará un solo reporte por equipo el mismo día al finalizar la práctica.
22. El reporte tendrá un valor del 10 % de un total del 50% y deberá contar con los siguientes
requisitos:
a. Título y número de lapráctica......................0.0%

b. Competencia...............................................0.0%
c. Introducción (organizadorgráfico)................1.0%
d. Diagrama de flujo......................................... 1.0%
e. Resultados................................................... 3.0%
f. Análisis de resultados o conclusiones...... 2.5.0%
g. Cuestionario............................................... 2.5%
h. Bibliografía...................................................0.0%
23. En caso de no asistir a la práctica debe presentar el justificante emitido por control escolar a
la brevedad posible, quedando justificada la inasistencia. La evaluación continua el trabajo en
el laboratorio y el reporte se evaluarán con cero.
24. Para tener derecho al examen “C” debe de cumplir con el 80% de asistencia y prácticas
aprobadas. Si cumple del 70% al 79% de asistencia y prácticas aprobadas tiene derecho al
EXAMEN EXTRAORDINARIO. Menos del 70% automáticamente se presenta al EXAMEN A
TITULO DE SUFICIENCIA.
El no cumplir con alguno de los puntos anteriores, será motivo de sanción (bajar puntos en la
calificación de laboratorio). En caso de indisciplina se le pedirá que salga del laboratorio,
anulándose la práctica correspondiente del departamental en curso.
Firma del estudiante Firma del padre o tutor
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5. RESULTADOS
a) Con base en la descripción que hace la OMS en cuanto a los niveles de contención o de
seguridad biológica y grupos de riesgo, completa la tabla con la información que se te
solicita:
Nivel de Tipo de Características de diseño Equipo de seguridad

bioseguridad laboratorio
b) Completa la tabla: referente a la clasificación de los microorganismos infecciosos por

grupos de riesgo.
Grupo de Riesgo Riesgo Medidas preventivas y terapéuticas

riesgo individual poblacional eficaces
8
6. Cuestionario
1. Define que es bioseguridad y cuáles son sus principios básicos.
2. Menciona dos riesgos a los que está expuesto un TLC en un laboratorio de bacteriología.
3. ¿Qué debe hacerse en caso de derrame de un cultivo bacteriano sobre la mesa?
4. ¿Qué debe hacerse cuando se derrama un cultivo bacteriano sobre la bata?
5. Menciona dos razones por las que tú pudieras ser causante de un accidente en el
laboratorio de bacteriología clínica.
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
9
ACADEMIA DE: TÉCNICO LABORATORISTA CLÍNICO
LABORATORIO DE: BACTERIOLOGÍA CLÍNICA
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 2: MATERIAL DE
LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICROSCOPÍA.
1. MARCO TEORICO
El personal que trabaja en el laboratorio utiliza materiales diversos, diseñados cada uno para
una función específica y poder alcanzar un objetivo concreto. El progreso de la técnica en
estos últimos años ha hecho que en los laboratorios existan nuevos recursos que hacen el
trabajo del químico más fácil y rápido.
Es necesario que antes de comenzar cualquier trabajo experimental, el alumno conozca el

material que se utiliza. Cada uno de los materiales tienen una función y su uso debe ser acorde
con la tarea a realizar. La utilización inadecuada de este material da lugar a errores en las
determinaciones realizadas y aumenta el riesgo en el laboratorio, por lo tanto, es importante
conocer su uso y cuidados en general.
Clasificación del material de bacteriología clínica según su uso
Material: es cualquier objeto que sirve para un trabajo o una operación manual, son de uso
frecuente y su manipulación es sencilla. La materia de la que están constituidos puede ser:
metal, vidrio, plástico, porcelana, madera u otros, se clasifica de la forma siguiente:
a) Material de Sostén: es todo material que se utiliza para sujetar y/o sostener a otro,
ejemplo:
• Gradilla: material que sirve para colocar tubos de ensaye facilitando su manejo.
#4) i 14UvJ
• Puente de tinción: material sobre el que se coloca el portaobjetos durante el proceso de

tinción bacteriana.
10
b) Materiales usados como recipientes: permiten contener sustancias.
• Frasco gotero: permite contener sustancias que se necesitan dosificar en pequeñas

cantidades y que por lo general son sensibles a la luz.
• Vaso de precipitados: se emplea para contener, calentar, enfriar, disolver,

mezclar, hacer reaccionar diferentes sustancias etc. Es importante mencionar
que la precisión de su graduación es muy baja por lo que no deben ser utilizados como
materiales de medición.
• Matraz de Erlenmeyer: por su forma es útil para realizar mezclas por agitación, además,
su abertura estrecha permite la utilización de tapones. Nunca debe ser utilizado como
material de medición.
• Tubo de ensayo: está hecho de un vidrio especial (Pyrex) que resiste las temperaturas
muy altas, sin embargo, los cambios de temperatura extremos pueden provocar el
rompimiento del tubo. Sirve para contener pequeñas cantidades de muestra y preparar
soluciones.
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c) Material Volumétrico: permiten medir volúmenes de sustancias líquidas.
• Pipetas: permiten la transferencia de un volumen generalmente no mayor a 20 mi de un

recipiente a otro de forma exacta, estas permiten medir alícuotas de líquido con bastante
precisión. Suelen ser de vidrio y están formadas por un tubo transparente que termina
en una de sus puntas de forma cónica, tienen una graduación (una serie de marcas
grabadas) indicando distintos volúmenes.
• Probeta: permite medir volúmenes superiores más rápidamente que las pipetas, aunque
con menor precisión.
• Matraz Volumétrico: material de vidrio que se utiliza para preparar soluciones valoradas.
d) Materiales de uso Específico: permiten realizar alguna operación específica.
• Portaobjetos: lamina de vidrio transparente, rectangular utilizada para fijar muestras u

objetos con el fin de observarlas bajo el microscopio.
12
• Espátula: es una lámina plana angosta que se encuentra adherida a un mango hecho
de madera, plástico o metal. Es utilizada principalmente para tomar pequeñas cantidades
de compuestos o sustancias sólidas, especialmente las granulares.
/
• Mechero Fisher: es un instrumento utilizado en laboratorios para calentar muestras y
sustancias químicas.
V
i»
Nota. Precauciones en el uso del Mechero Fisher:
Antes de utilizar el mechero, asegúrese cuál es la tubería que suministra el gas y que la
manguera de hule esté bien conectada.
El mechero deberá ser manipulado por una sola persona.
Encienda el cerillo antes de abrir la llave que suministra el gas.
• Pizeta: es un recipiente de plástico, cilindrico, sellado con tapa rosca, el cual posee un
pequeño tubo con una abertura capaz de dispensar cualquier líquido que se encuentre
contenido en su interior en pequeñas cantidades, por ejemplo: agua o de forma particular
en bacteriología soluciones desinfectantes.
• Caja Petri: recipiente redondo hecho de vidrio o de plástico, posee diferentes diámetros, es
de fondo bajo con una cubierta de la misma forma que la placa, pero un poco más grande
de diámetro ya que se puede colocar encima y cerrar el recipiente como una tapa. En
bacteriología es utilizado para el cultivo de bacterias.
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• Asa bacteriológica: Está formada de una base que puede estar hecha de platino, acero,
aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en
aro o en punta, este instrumento de laboratorio nos ayuda transportar o arrastrar
microorganismos de un medio a otro medio para su adecuado desarrollo, así como para
la realización de frotis.
• Pro pipeta: utensilio de goma, creada especialmente para asegurar la transferencia de

líquidos de todo tipo, especialmente los que poseen propiedades específicas
(infecciosos, corrosivos, tóxicos, radiactivos o estériles).
Aparatos utilizados en el laboratorio de bacteriología clínica
Aparato: objeto formado por una combinación de piezas y elementos que sirve para
desarrollar un trabajo o función determinados y que generalmente funciona mediante energía
eléctrica, su función es especifica.
• Refrigerador: su utilidad es la conservación de reactivos y medios de cultivos. La

temperatura de conservación es de 4°C.
• Balanza Granataria: Instrumento de precisión para pesar los medios de cultivos y

reactivos que se preparan en un laboratorio de microbiología.
14
• Autoclave: es un aparato de laboratorio que se utiliza para esterilizar. Por esterilizar se
entiende la destrucción o eliminación de toda forma de vida microbiana (incluyendo
esporas) presente en objetos inanimados mediante procedimientos físicos, químicos o
gaseosos.
La autoclave esteriliza diversos materiales empleados en actividades de diagnóstico,

tratamiento o investigación en instituciones de salud (hospitales y laboratorios), asimismo su
uso se extiende a la industria alimenticia y farmacéutica.
En el laboratorio clínico específicamente, la autoclave se utiliza con el fin de eliminar de forma

confiable, los microorganismos presentes en los medios de cultivo, material de vidrio y/o metal
inoxidable o en materiales utilizados para la toma de muestras como: agujas, hisopos,
abatelenguas, recipientes etc. (todos deben estar en condiciones estériles), también para la
destrucción de material contaminado con agentes biológico infecciosos.
• Campana de Flujo Laminar (CFL) o Cabina de Seguridad Biológica (CBS): es un

aparato diseñado para proteger al laboratorista de los aerosoles y micro partículas
asociados al manejo del material biológico potencialmente tóxico o infeccioso, que se
genera en actividades como el cultivo de bacterias al manipular el asa bacteriológica y
pipetas, evitar la contaminación externa de las muestras biológicas que se analizan en el
laboratorio. También son utilizadas para actividades en las que se requiere de un
ambiente aséptico como es la preparación de reactivos y vaciado de medios de cultivo.
• Incubadora: es un aparato diseñado para mantener una cámara a temperatura,

atmósfera y humedad controladas, con el fin de conservar organismos vivos en un entorno
que resulte adecuado para su crecimiento. Entre las aplicaciones más comunes,
se citan las siguientes: incubación de cultivos bacteriológicos, virales, micológicos, celulares
etc. Las incubadoras varían en complejidad y diseño, algunas únicamente controlan la
temperatura, mientras que otras, además, controlan la composición atmosférica.
15
Estufa de secado: se identifica también con el nombre de Horno de esterilización, es
utilizada para el secado y/o esterilización de material de vidrio y metal que proviene de la
sección de lavado, también se utiliza para secar sales químicas. La temperatura de operación
de este aparato oscila entre 60QC a 300QC.
Microscopio de luz visible.
Es un aparato que ya ha sido utilizado por los estudiantes en cursos previos. Se ha incluido
en esta práctica para familiarizarlos con su funcionamiento, manejo y cuidados, así como para
desarrollar su habilidad para trabajar con el objetivo de inmersión cuyo uso es indispensable
en la observación de microorganismos y sus estructuras. Las partes que lo constituyen se
indican en la siguiente figura.
ocular
brazo
objetivo
platina
desplazamiento
platina
tornillo
diafragma micrométrico
lámpara tornillo
micrométrico
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El microscopio está formado por tres tipos de lentes: el ocular, los objetivos “seco débil” (1OX),
“seco fuerte” (45X) e “inmersión” (100X) y el condensador. Los dos primeros intervienen en la
amplificación de la imagen mientras que el condensador forma parte del sistema de
iluminación.
Cada objetivo tiene grabada una inscripción su significado se explica en el siguiente ejemplo:
40/0.65
160/0.17(7-“, o 70”)
40 significa el número de aumentos, la apertura numérica es de 0.65, mientras que 160 mm

es la longitud desde el objetivo hasta el ocular y 0.17 + 0.01 son los mm de espesor que debe
tener el cubreobjetos, en lugar de este último puede tener la marca “/--“, que significa que es
insensible a fuertes diferencias de espesor del cubreobjetos, o la marca 70” que indica que
no necesita el empleo de cubreobjetos (ver imagen).
1 Numero de aumentos.
2. - Apertura numérica.
3. - Longitud del tubo.
4. - Grosor del cubreobjetos.
5. - Fuelle del objetivo.
El aumento primario del objeto se produce por el objetivo, esta imagen se transmite al ocular
donde se lleva a cabo el aumento final. La amplificación total es el producto de ambas lentes.
Una propiedad muy importante del microscopio, es su poder de resolución o sea su capacidad
para mostrar como distintos y separados dos puntos que se encuentran muy cercanos entre
sí. El poder de resolución a su vez depende de la longitud de onda de la luz empleada y de
una propiedad de la lente llamada apertura numérica (AN).
Las lentes con mayor poder de resolución tienen AN mayores permitiendo observar objetos
de menor tamaño. La AN está en función del índice de refracción del medio que se encuentra
entre el objetivo y la preparación, el ángulo que forman el eje óptico y los rayos más exteriores
captados por el objetivo. Cuando se utiliza el objetivo de inmersión, es indispensable colocar
sobre la preparación (que debe ser fija o permanente) una gota de aceite de cedro que tiene
un índice de refracción igual al del vidrio (1.515), este llena el espacio entre la lente y la
preparación, corrigiendo la trayectoria de los rayos de luz periféricos y de los que se pierden
por reflexión o refracción de tal forma que se consigue un notable incremento en la AN y por
lo tanto un mayor poder de resolución.
17
Cuidado y limpieza del microscopio
Como todo instrumento de precisión, para su manejo se debe tener especial cuidado por lo
que se sugiere lo siguiente:
• Sujetar el aparato firmemente con ambas manos y depositarlo con suavidad sobre la
mesa de trabajo.
• Verificar que todos los componentes del microscopio embonen perfectamente y su
movimiento sea suave y fácil, no hay que forzar la colocación de ninguna pieza ni su
movimiento.
• Evitar que el polvo, se deposite en las cremalleras y en las lentes cubriéndolo con una
funda de plástico al término de su uso.
• Guardar el aparato en un lugar fresco y seco.
• Conservar las lentes lo más limpias posibles evitando que se ensucien con las
preparaciones y con la grasa de las manos y rímel de pestañas.
• Limpiar las lentes con un hisopo embebido en solución alcohol-acetona 3:1 y papel
seda. También se puede utilizar éter puro, pero nunca disolvente, porque puede
disolver el pegamento de las lentes.
• Limpiar el sistema mecánico con un paño limpio y humedecido con agua destilada y
que no suelte pelusa, posteriormente secarlo con otro paño limpio y seco.
2. COMPETENCIA
Identifica el material y aparatos pertenecientes al laboratorio de bacteriología para brindarles

el uso correcto en la ejecución de las diferentes técnicas microbiológicas.
3. MATERIALES Y REACTIVOS
Instructivo de prácticas de prácticas.

Material bibliográfico relacionado con el contenido de la práctica.
Materiales de laboratorio de bacteriología (los mencionados en el marco teórico).
Aparatos de laboratorio de bacteriología (los mencionados en el marco teórico).
Preparaciones fijas o permanentes.
Hisopos.
Paño limpio de lino.
Aceite de inmersión.
Solución limpiadora.
4. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES
1. - El docente muestra los materiales y aparatos del laboratorio de bacteriología, explica su

uso y precauciones que hay que tener en su manejo.
2. - El estudiante identifica el material y aparatos mostrados.
3. - Enfoca las preparaciones fijas proporcionadas y realiza los esquemas correspondientes.
18
PROCEDIMIENTO PARA ENFOCAR LA PREPARACIÓN
1. Limpiar todas las lentes con papel seda.
2. Colocar el objetivo de menor aumento (10X) en posición de observación (centrado sobre

el sistema de iluminación), deberá escuchar un chasquido, que le indicará que quedó en
la posición correcta.
3. Conectar la fuente de luz y encenderla.
4. Separar completamente la platina del objetivo y colocar la preparación sobre la platina del
microscopio, asegurarla bajo las pinzas del mismo.
5. Centrar la preparación sobre la abertura de la platina, con los tornillos del vernier.
6. Observar por el costado del microscopio y accionar lentamente el tornillo micrométrico

para acercar el objetivo de menor aumento al preparado, sin llegar atocarlo.
7. Ajustar la distancia entre los dos oculares a la distancia de sus ojos.
8. Observar por los oculares, para realizar el enfoque aproximado haciendo descender la
platina mediante el tornillo macrométrico hasta hallar la imagen borrosa del objeto. Este
enfoque debe realizarse siempre haciendo descender la platina para evitar tocar la lente
frontal de los objetivos con el preparado.
9. Realizar el enfoque exacto mediante el tornillo micrométrico hasta obtener la imagen

nítida.
10. Pasar al siguiente aumento (40X o 45X) repitiendo los pasos anteriores.
11. Aumentar la intensidad de luz elevando el condensador al máximo mediante su respectivo

tornillo de ajuste y cerrar ligeramente el diafragma iris de tal modo que se mantenga el
campo iluminado. Esto se hace debido a que al utilizar aumentos mayores el campo visual
se reduce.
12. Girar el revólver ligeramente corrido de la posición de observación y colocar sobre la

preparación a observar una gota de aceite de inmersión.
13. Ubicar el objetivo de 100X en la posición de observación, sobre la gota de aceite.
14. Realizar el enfoque exacto con el tornillo micrométrico.
15. Regular la iluminación.
16. Limpiar cuidadosamente cuando finalice la observación las lentes de los objetivos con
papel seda.
19
5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES
a) Completa las tablas que se muestran a continuación con la información que se te solicita.
Nota: los dibujos pueden hechos a mano o impresos.
Tabla No.1
N o m b re d el m a te ria l e im a g e n C la s ific a c ió n U so
20
Tabla No. 2
N o m b re d el a p a ra to e im a g e n F u n d a m e n to de su fu n c io n a m ie n to U so
21
b) Realizar los esquemas de las preparaciones observadas
Observación: Observación:
Objetivo: Objetivo:
6.- CUESTIONARIO
1. Que funciones específicas tiene la estufa bacteriológica.
2. Para que se usa el baño María a 37 °C en el laboratorio de bacteriología clínica.
3. Que uso específico tiene el asa bacteriológica.
4. Escribe el concepto de apertura numérica
5. Escribe el concepto de poder de resolución de un microscopio

7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
23
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ACADEMICA DE: TÉCNICO LABORATORISTA CLÍNICO
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 3: TINCIÓN SIMPLE.
1. MARCO TEORICO
Las bacterias son casi incoloras, cuando se les observa a través de un microscopio óptico, no
presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente por lo que es necesario teñirlas de forma previa.
La tinción es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
Los colorantes aplicados a las preparaciones bacterianas tienen las siguientes funciones:
-Proporcionar un contraste que permite una mejor observación de las bacterias.
-Facilitar el estudio en detalle de su morfología.
-Permitir el estudio de las estructuras internas y externas de las bacterias (flagelos, esporas,
núcleo, cápsula, pared celular, etc.).
- Lograr un aumento mayor (lente de inmersión).
Antes de teñir las bacterias, hay que realizar primero una extensión de los microorganismos
provenientes de la muestra clínica o un cultivo sobre un portaobjetos, a dicha extensión se
denomina frotis, el cual previo a su tinción se debe secar a temperatura ambiente y fijarlo.
La fijación es un procedimiento que permite preservar estructuras celulares. Y se puede llevar
a cabo mediante diferentes tratamientos ya sean físicos (calor) o químicos (con etanol,
formaldehido o ácido acético).
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras,
etcétera. Específicamente en bacteriología el uso de colorantes facilita la observación de las
bacterias al aumentar notablemente el contraste y poder realizar la observación en
microscopio óptico.
Los colorantes son compuestos orgánicos que están constituidos por un grupo cromóforo y
un grupo auxocromo, unidos a un anillo bencénico. El grupo cromóforo es un solvente
orgánico que imparte color a los compuestos y el auxocromo es el grupo químico que se ioniza
con el cromógeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos.
Los colorantes empleados en bacteriología son colorantes sintéticos. En la práctica los
colorantes se dividen en dos grupos: ácidos y básicos.
Los colorantes básicos están formados por un catión coloreado y un anión incoloro, mientras
que en los colorantes ácidos es a la inversa. Las células bacterianas son ricas en ácidos
nucleídos que tienen cargas negativas en forma de fosfatos, estas cargas se combinan con
los colorantes básicos cargados positivamente, por lo cual la bacteria se tiñe uniformemente,
24
ya que existen ácidos nucleídos tanto en el núcleo (ADN), como en el citoplasma (ARN). Los
colorantes ácidos tienen mayor afinidad a combinarse con el citoplasma de las células de
organismos superiores. En bacteriología se usan casi exclusivamente los colorantes básicos
(cristal violeta, fucsina, azul de metileno, etc.).
Existen dos métodos de tinción principales:
1) Tinción Simple
2) Tinción diferencial
Tinción simple: consiste en hacer actuar sobre la preparación fijada un solo colorante (Azul
de Metileno, Safranina, Fucsina diluida al 10%, etc.). Se utiliza para ver el tamaño, la
morfología y el arreglo en el crecimiento de las bacterias.
DIVERSIDAD DE FORMA Y AGRUPACIÓN BACTERIANA
Cocos Bacilos Espiritas

O O
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0
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D iplococos
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E streptococos E streptobacilos
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Tetradas
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L e tra sch in a s
S arcinas
Y
Procedimiento para la realización del frotis.
1. Lavar perfectamente el portaobjetos con jabón y agua corriente, secarlo con un paño de
algodón y etiquetarlo.
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama (azul) del mechero hasta que se ponga
al rojo vivo.
3. Enfriar el asa. Después acercar al mechero el tubo de ensaye o bien la caja Petra
conteniendo el cultivo bacteriano y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Colocar en el caso de los cultivos líquidos, una gota del cultivo en el centro del portaobjetos
y extenderla suavemente en un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y
dejar secar a temperatura ambiente.
5. Esterilizar el asa nuevamente y repetir el paso anterior de 3 a 4 veces más.
6. Fijar con dos gotas de alcohol, dejando que estas se evaporen al aire.
7. Colocar previamente, si se trata de un cultivo sólido, una gota de agua destilada en el
25
centro del portaobjetos y mezclar en ella una pequeña muestra del cultivo que se toma
siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
8. Pasar el portaobjetos de 3 a 4 veces sobre la flama del mechero, evitar el
sobrecalentamiento de este.
Procedimiento para la tinción simple.
1. Cubrir solo el frotis con el colorante y dejarlos actuar durante un minuto.

2. Lavar la preparación con agua para eliminar el exceso de colorante. Esta operación se
realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de
manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues
podría arrastrar parte del frotis consigo.
3. Eliminar la máxima cantidad de agua del portaobjetos golpeándolo por su canto con
cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo y secarlo, pero en ningún caso se debe
frotar el portaobjetos.
4. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento usando el
aceite de inmersión.
1. Coloque 1 o 2 gotas de 2. Con ansa estéril tomar la 3. Extender la muestra en

agua sobre ei portaobjetos muestra y mezclarla con el
limpio y desengrasado agua
r * i
4. Dejar secar al aire 5. Rjar con calor 6. Adicionar el (los)coiorante(s)
7. Lavar con agua. Eliminare! exceso 8. Agregar una gota de aceite

de agua de Inmersión y observar en el
objetivo lOOx
2. COMPETENCIA:
Realiza la técnica de preparación de frotis y tinción simple para identificar las principales
formas y agrupaciones bacterianas.
Instructivo de prácticas
Mechero
Vaso de precipitados de 100mL
Asa bacteriológica
Puente de tinción
Gradilla
26
4 portaobjetos
Pizeta con agua destilada
Microscopio
Frasco gotero con colorantes (azul de metileno, safranina, cristal violeta)
Frasco gotero con alcohol etílico
Aceite de inmersión
Solución desinfectante
Cultivos bacterianos en medio sólido y líquido
1 El docente proporciona los cultivos bacterianos en medio sólido y líquido.

2. - El docente explica la técnica de preparación del frotis y tinción simple.
3. - El estudiante realiza las técnicas indicadas.
4. - El estudiante hace las anotaciones correspondientes.
5. - REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• Colorante utilizado:
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
27
6. CUESTIONARIO
1. Describe que es una tinción microbiológica:
2. ¿Cuáles son las características que debe tener un frotis bacteriano de buena calidad?
3. ¿Por qué se fija el frotis a temperatura ambiente?
4. ¿Por qué se fija el frotis a la flama del mechero?
5. ¿Con los resultados de la tinción simple se puede conocer si la muestra teñida es un

cultivo puro? Si o no y porqué.
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS
8. BIBLIOGRAFÍA.
28
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 4.: TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
1. MARCO TEORICO
Esta técnica fue desarrollada en 1884 por el danés Christian Gram y es un ejemplo de una
tinción diferencial. Con base en esta coloración se clasifica a la mayoría de las bacterias en
dos grupos, bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. En el desarrollo de la
técnica se usan 4 reactivos dos colorantes: cristal violeta (colorante primario); safranina
(colorante de contraste o secundario); lugol que actúa como mordiente y un agente
decolorante compuesto por alcohol-acetona.
En las bacterias Gram positivas el cristal violeta o colorante primario se une a la pared
bacteriana la cual es relativamente más gruesa (15 a 80 nm), con mayor contenido de
peptidoglicano y ácidos teicoicos que la pared de las bacterias Gram negativas, la cual incluye
tres componentes exteriores a la capa de peptidoglicano (2nm); una zona de lipoproteína, una
membrana externa y una capa de lipopolisacárido. El lugol que se adiciona actúa como
mordiente fijando el cristal violeta y forma un complejo cristal violeta- yodo- ribonucleato de
magnesio, en este momento todas las bacterias se tiñen de azul obscuro. El alcohol-acetona
es adicionado como agente decolorante así las bacterias Gram positivas no pierden el
complejo cristal violeta yodo y permanecen de color violeta en cambio las bacterias Gram
negativas cuya pared es más delgada (10 a 15 nm) y tiene 5 a 10% de peptidoglicano pierden
el complejo cristal violeta yodo y al adicionarles safranina llamado colorante de contraste
toman el color rojo.
Por esta razón las bacterias que retienen el colorante primario y no reaccionan con el
colorante de contraste son llamadas Gram positivas y se tiñen de violeta, las bacterias que
reaccionan con el colorante de contraste se denominan Gram negativas y estas se tiñen de
color rojo.
Procedimiento de la técnica de Gram
1. - Realizar el frotis a partir del cultivo bacteriano proporcionado.

2. - Fijar el frotis a temperatura ambiente y después a la flama directa o con alcohol.
3. - Cubrir el frotis con solución de cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto.
4. - Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua inclinando el portaobjetos, cuidando de
no incidir sobre el frotis.
5. - Cubrir el frotis con lugol durante un minuto, luego escurrir el exceso de la solución yodo-
yodurada. Lavar con agua.
29
6. - Agregar sobre el frotis alcohol-acetona, inclinándolo para que el decolorante resbale
lentamente por él, hasta no arrastrar más colorante violeta. Este es un paso crítico en el
procedimiento, el tiempo de decoloración requiere de unos 5 a 10 segundos, dependiendo
del grosor del frotis.
7. - Rápidamente lavar con agua para detener la acción del decolorante.
8. - Cubrir el frotis con safranina durante un minuto.
9. - Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua y dejar secar al aire.
10. - Observar el frotis al microscopio, con el objetivo de inmersión y esquematizar.
11 .-Las bacterias Gram positivas se tiñen de color morado y las bacterias Gram negativas de
color rojo.
2. COMPETENCIA
Aplica la técnica de coloración de Gram para la diferenciación de bacterias.
A g reg a r una gota de

a c e ite de in m ersió n y
o b se rv a r a 100 X
Mechero
Vaso de precipitados de 100mL
Asa bacteriológica
Puente de tinción
Gradilla
4 portaobjetos
30
Microscopio
Frasco gotero con colorantes (cristal violeta, safranina)
Frasco gotero con lugol
Frasco gotero con alcohol-cetona
Cultivos bacterianos
1 El docente proporciona los cultivos bacterianos.

2. - El docente explica la técnica de tinción de Gram.
3. - El estudiante realiza la técnica indicada.
4. - El estudiante hace las anotaciones correspondientes
5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• Gram:
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• Gram:
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• Gram:
31
6. CUESTIONARIO
1. Describe el fundamento de la tinción de Gram:
2. ¿Qué diferencias estructurales hay entre las bacterias Gram positivas y las Gram negativas
que hacen que se tiñan de morado o rojo respectivamente?
3. ¿Qué es un mordiente?
4. ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de Gram y por qué?
5. Anota el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram negativas y tres Gram
positivas.
Gram negativas Gram positivas
7.- CONCLUSIONES
8.- BIBLIOGRAFÍA
32
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 5: TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
1. MARCO TEORICO
La coloración de Ziehl-Neelsen es otro tipo de coloración diferencial que separa a los géneros
Mycobacterium y Nocardia del resto de las bacterias. Las paredes celulares de los géneros
mencionados presentan característicamente un alto contenido de lípidos (arriba de 60%)
unidos a polisacáridos, ácidos grasos de cadena muy larga como son los ácidos micólicos y
nocárdicos respectivamente y proteínas. Estos ácidos parecen jugar un papel muy importante
en esta coloración.
En esta técnica se utiliza la fucsina fenicada como colorante primario, esta solución se aplica
con calentamiento a emisión de vapores. Como agente decolorante se aplica una mezcla de
etanol y ácido sulfúrico o ácido clorhídrico. El azul de metileno es el colorante secundario.
La explicación que da respuesta a la coloración involucra varios factores, por un lado, se ha

postulado que el alto contenido de ácidos grasos interviene decisivamente y al calentar el
colorante primario a emisión de vapores, se favorece la disolución de los ácidos grasos y se
permite el paso del colorante al interior de la célula. Al suspender el calentamiento y lavar con
agua fría se provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que él colorante
se ve impedido totalmente de salir de las bacterias. Por otra parte, el calentamiento aumenta
la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las
bacterias. Por último, se ha postulado que el complejo colorante- fenol es más soluble en los
lípidos bacterianos, lo cual contribuye a su permanencia en el interior de las células.
Puesto que el proceso de decoloración es muy enérgico, cualquier bacteria que no contenga
abundantes lípidos como M ycobacterium y Nocardia perderá fácilmente el colorante primario
y fijará entonces el azul de metileno.
Las bacterias que resisten la decoloración son llamadas AAR (Acido Alcohol Resistentes)
positivas, y se observan de color rojo. Las restantes se ven de color azul.
Procedimiento de la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.
1. - Realizar el frotis a partir del cultivo bacteriano proporcionado.

2. - Fijar el frotis a temperatura ambiente y después a la flama directa.
3.- Cubrir todo el portaobjetos con solución de fucsina fenicada y calentar suavemente la
33
preparación a emisión de vapores. El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es
necesario. Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos.
4. - Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua inclinando el portaobjetos, cuidando de no
incidir sobre el frotis.
5. - Decolorar con alcohol-ácido hasta eliminar el exceso de colorante.
6. - Lavar con agua.
7. - Cubrir el frotis con azul de metileno durante un minuto.
8. - Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua, dejar secar al aire.
9. - Observar el frotis al microscopio, con el objetivo de inmersión y esquematizar.
10.-Las bacterias acido-alcohol resistentes se tiñen de color rojo; mientras que las bacterias no
resistentes a la decoloración con el alcohol-ácido toman el color del colorante de contraste
utilizado (azul).
Calentara emisión de con

vapores 5 min. agua
' i *
alcohol-ácido
Agregar una gota de

aceite de inmersión y
observar a 100 X
2. COMPETENCIA
Aplica la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen para la diferenciación de bacterias.
34
Mechero
Vaso de precipitados de 100ml_
Porta asa
Puente de tinción
Gradilla
5 portaobjetos
Microscopio
Frasco gotero con colorantes (fucsina fenicada, azul de metileno)
Frasco gotero con alcohol-ácido
Cultivos bacterianos.
Vacuna BCG
1. - El docente proporciona los cultivos bacterianos y/o la vacuna.

2. - El docente explica la técnica de Ziehl-Neelsen.
5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• AAR:•
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• AAR:
35
6. CUESTIONARIO
1. Describe el fundamento de la tinción de Ziehl-Neelsen:
2. ¿Por qué no debe hervir la muestra durante la tinción con la fucsina fenicada?
3. ¿Por qué la decoloración con alcohol-ácido es un paso crítico en la técnica de Ziehl-

Neelsen?
4. ¿Qué significa “BCG”, que es y cómo se prepara?
5. Anota tres nombres (género y especie) de micobacterias y de nocardias de interés clínico.
Micobacterias Nocardias
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
36
( INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL A
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 6 TINCIONES ESPECIALES
(TINCIÓN DE ESPORAS)
V________________________J
1. MARCO TEORICO
El principal valor de las técnicas de tinción “especial” radica en proporcionar información

específica de las estructuras de la célula o de las propiedades químicas de algunos
componentes celulares. Estas técnicas se basan en que la estructura que se desea poner de
manifiesto tiene un grado de afinidad mayor por los colorantes utilizados que el resto de la
célula, o por el uso de tratamientos especiales que hacen posible su diferenciación de tal
manera que puede ser utilizada una gran variedad de técnicas para demostrar la presencia
de estructuras tales como: cápsula, esporas, pared celular, flagelos, material nuclear etc.
Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su
interior formas de resistencia llamadas endoesporas. Las cuales se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.), formándose una espora por cada forma
vegetativa, al finalizar el proceso de esporogénesis la célula vegetativa se liza y libera la
espora al exterior, cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva
forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias
productoras de endoesporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y
observación son de interés clínico.
Las endoesporas bacterianas no pueden distinguirse en las preparaciones microscópicas sin

previa coloración debido a la gran refringencia de su protoplasma En las preparaciones
teñidas por técnicas como la de Gram las endoesporas no se colorean debido a la resistencia
que ofrece su gruesa cubierta a la impregnación de los colorantes utilizados, permaneciendo
incolora rodeada por la parte coloreada (vegetativa) de la bacteria. No obstante, es posible
lograr la tinción de las endoesporas por medio de técnicas especiales en las que se emplea
el calor como mordiente. Las endoesporas, debido a las características de sus envolturas no
se tiñen con procedimientos habituales.
La técnica más empleada es la de Schaeffer-Fulton donde la suspensión de microorganismos

se tiñe en caliente con el colorante verde de malaquita. El calor modifica la permeabilidad de
las endoesporas y permite la entrada del colorante a través de las capas externas. A
continuación, el lavado con abundante agua produce la decoloración de las formas
vegetativas, así como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen por último
con un colorante de contraste, la safranina
37
Procedimiento de la tinción de Schaeffer-Fulton.
1. Realizar el frotis a partir del cultivo bacteriano proporcionado.

2. Fijar el frotis a temperatura ambiente y después a la flama directa.
3. Cubrir todo el portaobjetos con solución de verde de malaquita al 5% y calentar suavemente
la preparación a emisión de vapores, manteniéndose así la preparación durante 5 minutos. El
colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es necesario. A partir del momento en que
se observa la emisión de vapores en la preparación se debe mantener así durante 5 minutos.
4. Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua inclinando el portaobjetos, cuidando de no
incidir sobre el frotis.
5. Cubrir la preparación con safranina y dejarla actuar durante 1 minuto.
6. Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua.
7. Quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.
8. Observar el frotis al microscopio, con objetivo de inmersión y esquematizar.
9. Las endoesporas se tiñen de verde y las células vegetativas de rojo a rosado.
Calentara em isión de
vapores 5 mín.
I>
ts
Agregar una gota de

aceite de inmersión y
observar a 100 X
2. COMPETENCIA
Aplica la técnica de coloración de Schaeffer -Fulton para la observación de esporas.
38
Mechero
Vaso de precipitados de 100ml_
Porta asa
Puente de tinción
Gradilla
5 portaobjetos
Microscopio
Frasco gotero con colorantes (verde de malaquita y safranina)
Cultivos bacterianos.
1. - El docente proporciona los cultivos bacterianos.

2. - El docente explica la técnica de Schaeffer-Fulton.
5. - REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
• Forma:
• Agrupación:
• Aumento total:
• Presencia de esporas:
• Ubicación de las esporas:
Forma:
Agrupación:
Aumento total:
Presencia de esporas:
Ubicación de las esporas:

6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué son las esporas y cuál es su naturaleza química?
2. ¿En qué posiciones pueden estar situadas las esporas dentro de la célula vegetativa?
3. ¿La posición de las esporas es igual en las bacterias del mismo género? Menciona sí o no
y da un ejemplo.
4. ¿Por qué se calienta el frotis suavemente a emisión de vapores durante 5 minutos?
5. Anota el nombre (género y especie) de tres clostridios y tres bacilos esporulados de

interés clínico.
Clostridios Bacilos esporulados
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
40
ACADEMICA DE: TÉCNICO LABORATORISTA CLÍNICO A
i
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.7 ESTERILIZACIÓN POR:
CALOR HÚMEDO Y POR CALOR SECO
V________________ _________________ J
1. MARCO TEORICO
El trabajo de laboratorio en microbiología requiere siempre ciertos mecanismos de control de

las poblaciones microbianas. La esterilización es uno de los mecanismos más utilizados y las
técnicas de esterilización aplicables dependen directamente de las características del material
de trabajo o de los medios que se vayan a tratar.
La esterilización es la eliminación completa de toda forma de vida microbiana de objetos

inanimados incluyendo esporas, puede conseguirse a través de métodos físicos, químicos o
gaseosos.
En el laboratorio de Microbiología la esterilización se puede utilizar como esterilización

preparativa o como esterilización final. La esterilización preparativa es la que se realiza para
mantener libre de microorganismos el material que vamos a utilizar antes de empezar el
trabajo en sí mismo o durante el proceso de trabajo (placas Petri, pipetas, medios de cultivo,
hisopos, etc.). La esterilización final sin embargo tiene como único fin destruir los
microorganismos con los que se ha estado trabajando.
En el laboratorio clínico el método físico por calor es el más utilizado para la esterilización
preparativa o final de los materiales. El calor puede ser húmedo o seco.
Autoclave (calor húmedo).
El calor húmedo por medio de la utilización de vapor de agua es el agente esterilizante más
frecuentemente utilizado. Este mecanismo destruye eficazmente los microorganismos por
desnaturalización de proteínas y enzimas, y desestabilización de membranas. Para esterilizar
material con calor húmedo, se emplea la autoclave.
La autoclave, desarrollado por Chamberland en 1884, es un aparato (Fig. 1) constituido por

una caldera, que se puede cerrar herméticamente con una tapa metálica y que presenta una
resistencia eléctrica en su interior que calienta el agua. Este aparato permite que en el interior
de la caldera se desplace el aire por una válvula de purga, dejando que se acumule
posteriormente vapor saturado a presión, que alcanza temperaturas superiores a los 100QC
sin que se produzca ebullición. El material a esterilizar se introduce en el interior de la cámara,
se somete al vapor de agua con sobrepresión (lo más común: 15 Ibs.), hasta alcanzar
temperaturas adecuadas para la eliminación de los microorganismos y todas las formas de
41
resistencia, sin que se produzca ebullición de los medios líquidos.
La autoclave se puede utilizar para la esterilización de medios de cultivo ya sean sólidos o
líquidos, soluciones, material de vidrio, goma, ciertos tipos de plásticos (policarbonato o
polipropileno), acero inoxidable, material de trabajo como ropa, algodón, gasas, etc. También
se utiliza para la esterilización final de medios de cultivo o materiales diversos contaminados
con agentes biológico infecciosos.
El proceso de esterilización con calor húmedo ofrece algunas desventajas como: causar
corrosión de algunos materiales, puede bajar el pH entre 0,3 y 0,5 unidades de los medios de
cultivo, caramelizar azúcares y volatilizar algunos compuestos. Los procesos de esterilización
largos pueden producir una precipitación de sales.
Técnica de manejo de la autoclave.
1. - Verificar que la autoclave esté limpia y que el nivel del agua en su interior cubra la
resistencia, de no ser así adicionar agua hasta el nivel de la parrilla que sirve como base.
2. - Acomodar el material a esterilizar dentro del cilindro metálico o en canastilla. 3.- Bajar la
tapa, debe quedar cerrada herméticamente.
4. - Abrir la válvula de salida de vapor, conectar la corriente eléctrica y encender la autoclave.
5. - Purgar la autoclave, es decir a medida que sube la presión en libras, empieza a salir una
mezcla de vapor-aire por la válvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta
que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado (empapando la uña del
dedo pulgar en la salida del vapor).
6. - Cerrar la válvula de salida de vapor una vez purgado la autoclave y dejar que la presión
suba aproximadamente a 20 libras para ello estar observando el manómetro, lo cual
proporciona una temperatura de 121 °C.
7. - Tomar un tiempo de 15 minutos.
8. - Apagar la fuente de calor una vez transcurridos los 15 minutos a 20 libras de presión y
dejar que la autoclave se enfríe sola (no abrir la válvula de salida de vapor), abrir hasta que la
presión haya bajado a 0.00 libras.
9. - Aflojar los tornillos de la tapa utilizando guantes de asbesto, y con el mango levantar la
tapa en tal forma que se proteja la cara y cuerpo del técnico y se permita salir al vapor evitando
así cualquier accidente.
10. - Sacar el material esterilizado con cuidado y depositarlo en la mesa de trabajo.
42
Homo Pasteur (calor seco).
La esterilización puede llevarse a cabo mediante calor seco y en este caso se realiza en una
estufa denominada horno Pasteur (Fig. 2), en cuyo interior se disponen los materiales que van
a ser esterilizados debidamente protegidos con papel satinado, o en contenedores especiales
para evitar la contaminación ambiental una vez finalizado el proceso y hasta su utilización. La
destrucción microbiana se produce por oxidación de los componentes celulares y
desnaturalización de proteínas. Este es un proceso menos eficaz por la ausencia de agua y
por lo tanto deben incrementarse tanto las temperaturas como los tiempos de exposición.
El horno de esterilización consta de una cabina metálica de doble pared, con resistencia
eléctrica; un termostato, un termómetro y parrillas para colocar el material a esterilizar. El aire
caliente circula por el espacio existente entre la doble pared transmitiendo el calor a los objetos
que se encuentran sobre las parrillas del horno. Generalmente, el tiempo y la temperatura del
tratamiento para lograr una correcta esterilización es: 180 a 160QC durante
1 h a 1 1/2 h, respectivamente. Los tiempos y la temperatura pueden variar según las
condiciones de trabajo, tales como cantidad y calidad del material.
El horno Pasteur se utiliza para esterilizar productos u objetos de porcelana o vidrio como
pipetas, probetas, embudos, y generalmente aquellos materiales metálicos que no se pueden
esterilizar en autoclave por problemas de corrosión y también fluidos oleaginosos.
Técnica de manejo del horno de esterilización.
1. - Introducir el material a esterilizar y cerrar la puerta del horno.

2. - Encender el horno con el botón de ON/OFF y mediante el termostato, elevar la temperatura
hasta que llegue a 160-170e C.
3. - Empezar a contar hora y media cuando se alcancen los 160QC.
4. - Transcurrido el tiempo, apagar el horno, esperar a que descienda la temperatura y abrir la
puerta con cuidado.
5. - Sacar el material, usar guantes de asbesto para evitar quemaduras.
Fig.2
2. COMPETENCIA
Aplica las técnicas de esterilización por calor húmedo y calor seco para la preparación
del material utilizado en bacteriología.
43
3. MATERIALES Y APARATOS
Matraces Erlenmeyer
Tubos de 13x 100 mm.
Pipetas
Cajas de Petri de vidrio
Algodón
Cinta testigo
Mechero
Hisopos
Abate lenguas
Gasa
Papel estraza
Pinzas
Tijeras
Horno
Autoclave
1 El docente explica de manera demostrativa la forma correcta de envolver: hisopos, abate

lenguas, cajas Petri, tubos, matraces, pipetas, pinzas, tijeras etc. utilizados en bacteriología y
el manejo y cuidados del autoclave y estufa de esterilización.
2.- El estudiante realiza la envoltura y esterilización del material proporcionado de acuerdo
con las instrucciones recibidas y hace las anotaciones correspondientes.
a) Completa la siguiente tabla anotando en el espacio correspondiente el nombre del método

más adecuado de esterilización con base en las características del material que se te indica.
MATERIAL MÉTODO DE ESTERILIZACIÓN

Asa de platino
Medios de cultivo adicionados de algún componente termolábil
Material oxidable y cristalería como pipetas o cajas Petri

Ropa limpia
Material contaminado como cajas Petri sembradas
Jeringas, guantes, catéteres, sondas, artículos
desechables de plástico etc.
Aire
El laboratorio de bacteriología
Hisopos, abate lenguas
Material quirúrgico de acero inoxidable
44
b) Elabora los esquemas con nombres de las partes que componen la autoclave y la estufa
de esterilización.
6. CUESTIONARIO
1. Menciona cual es mecanismo de acción del calor húmedo sobre los microorganismos.
2. Escribe el concepto de técnica aséptica.
3. ¿Qué características debe tener el papel utilizado en la envoltura del material a

esterilizar?
¿Cuál es la finalidad de esterilizar el material empleado en los análisis bacteriológicos?
5. ¿Por qué es conveniente que la estufa de esterilización cuente con un ventilador interno?
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
45
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 8 PREPARACIÓN DE MEDIOS
DE CULTIVO
1. MARCO TEORICO
Para realizar las siembras se requiere de los medios de cultivo, los cuales son una mezcla de
sustancias nutritivas, donde las bacterias obtienen su fuente de carbono, nitrógeno, fósforo,
potasio, sodio, magnesio y otros elementos para:
a) Fomentar su crecimiento
b) Facilitar algunas reacciones bioquímicas que pueden ser demostradas directa o
indirectamente para ayudar a su identificación.
Los constituyentes habituales de un medio de cultivo son:
• Agar. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
• Extractos. Son concentrados en polvo, deshidratados, obtenidos de órganos o tejidos

animales o vegetales para producir el medio adecuado.
• Peptonas. Se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o

vegetales, son ricas en péptidos y aminoácidos.
• Fluidos corporales, sangre o plasma. Se añaden a los medios de cultivo porque contienen
factores de crecimiento que facilitan el desarrollo de algunos microorganismos exigentes.
• Sistemas amortiguadores. Generalmente son fosfatos disódicos o dipotásicos que se

utilizan para mantener el pH del medio en un determinado valor.
• Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que nos ayudan a detectar cambios de
pH.
• Agentes reductores. Se añaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los
gérmenes microaerofílicos o anaerobios.
Agentes selectivos. Son sustancias que se adicionan al medio de cultivo para inhibir el
crecimiento de cierto grupo de microorganismos.
46
Los medios de cultivo se clasifican según su estado físico en:
a. Medios líquidos: es un material nutritivo elaborado a partir de carbohidratos, una infusión

de extracto de carne y peptona se conocen generalmente como caldos y se emplean
fundamentalmente para: cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de
los mismos o bien la producción de metabolitos específicos, estimular y promover la
selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen e
identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
b. Medios sólidos: se preparan a partir de medios líquidos a los que se añade agar en una
proporción entre 1.5 y 2 %. El agar es un elemento solidificante, se licúa completamente
a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 °C. Se considera un
material inerte pues no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias, tampoco es
degrado por aquellas que crecen en él. Se utilizan para obtener colonias aisladas de
microorganismos. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo
que se emplean en microbiología.
c. Medios semisólidos: se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos agar
en una proporción menor entre el 0.15 y 0.2 %. Se utilizan para identificaciones
bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen
una consistencia blanda.
Con base en su función se clasifican en:
a. Medios nutritivos básicos: favorecen el desarrollo de la mayoría de los microorganismos

sin requerimientos especiales y sin proporcionar ventaja alguna en el crecimiento de un
organismo en particular, solo contienen algún extracto de carne o infusión simple, peptona
y agua.
b. Medios enriquecidos: son aquellos medios básicos que han sido complementados con
líquidos corporales, vitaminas específicas, aminoácidos, proteínas u otros nutrientes
claramente definidos, por ejemplo, agar sangre y agar chocolate.
c. Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún

germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros.
d. Medios selectivos: son medios que favorecen el desarrollo de ciertas bacterias que nos
interesan y que están presentes en una población polimicrobiana, inhibiendo el desarrollo
de otras con ayuda de agentes inhibidores como colorantes, sales biliares, alcoholes,
ácidos y antibióticos.
e. Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia ciertas características

bioquímicas o metabólicas que permiten diferenciar entre varias especies o géneros que
crecen en la misma placa de agar.
f. Medios de identificación: son los que se destinan para realizar las pruebas bioquímicas en
47
donde se resalta alguna cualidad bioquímica que sirve para reconocer la identidad de un
microorganismo.
g. Medios de conservación o de transporte: se usan para el transporte de muestras clínicas
que no pueden sembrarse inmediatamente.
Procedimiento para la preparación de medios de cultivo.
1. - Calcular la cantidad de medio que se quiere preparar, siguiendo las instrucciones que se
anexan en cada frasco. Leer cuidadosamente las instrucciones que tiene el medio y aplicarlas
al pie de la letra. La mayoría de los medios de cultivo tienen indicaciones para preparar 1000
mi de medio de cultivo, pero si los requerimientos son diferentes, bastara con aplicar una regla
de tres.
2. - Disolver un medio de cultivo en la cantidad de agua destilada necesaria (se recomienda

disolver la totalidad del medio en una pequeña cantidad de agua, y después agregar el resto).
3. -Calentar a una temperatura cercana a la ebullición hasta disolverlo completamente,

agitando suavemente y teniendo mucho cuidado de quitarlo de la flama cuando empiece a
hervir.
4. - Esterilizar el medio de cultivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. - Dejar enfriar el medio a una temperatura aproximada de 45°C.
6. - Sanitizar el área dispuesta para el vaciado y encender el mechero.
7. - Vaciar en cajas de Petri estériles, procurando homogenizar constantemente. El mechero

deberá de permanecer encendido antes y durante el vaciado.
8. - Dejar enfriar las cajas para que el medio solidifique.
9. - Identificar las placas anotando en su base el nombre del medio, fecha de preparación,
grupo y equipo.
10. Envolver las placas y en posición invertida guardarlas en la incubadora a 35 °C durante

24-48 hrs.
Nota: Para preparar gelosa sangre u cualquier otro medio que lleve algún componente que no
se pueda esterilizar o sea termolábil, se prepara y esteriliza primeramente el medio base, en
la autoclave, se deja enfriar entre 45 y 509C y posteriormente se le agrega la sangre o el
componente.
Para esterilizar los medios de cultivo líquidos previamente se deben dosificar en los
contenedores en los que finalmente se van a utilizar.
48
2. COMPETENCIA
Aplica las técnicas bacteriológicas para la preparación, esterilización y vaciado de los medios
de cultivo.
Balanza granataria
Espátula
Mechero
Probeta
Algodón, gasa papel estraza, masking tape
Matraz Erlenmeyer
Tubos de ensaye Cajas de Petri estériles Autoclave
Agua destilada
Medios de cultivo deshidratados ( A S M = A g a r S a l M a n ito l, A S T = A g a r S o y a T rip tic a s e ín a , A V B = A g a r V e rd e B rilla n te ,
M IO = M o v ilid a d , In d o l O rn itin a , T S I= A g a r H ie rro T rip le A z ú c a r, C M = C a ld o M a lo n a to , C L = C a ld o L a c to s a d o , C M H = C a ld o
M ü e lle r- H in to n )
1 El docente asigna a cada equipo un medio de cultivo determinado para su preparación. 2.-
El docente explica de manera demostrativa el procedimiento correcto para preparar un medio
de cultivo.
3. - El estudiante realiza los cálculos y la preparación del medio asignado previamente, de
acuerdo a las instrucciones indicadas en el marbete del medio e indicaciones del docente.
4. - El estudiante identifica y esteriliza los medios preparados.
5. - El estudiante selecciona el 5% del lote del medio preparado para someterlo a las pruebas
de control de calidad correspondientes y guarda el medio de cultivo restante.
6. - El estudiante hace las anotaciones pertinentes.
Nota: en caso de no cumplir con el pH correcto durante su preparación ajustarlo con una
solución de NaOH o HCI 1 N, según se requiera.
1. Anota lo que se te solicita con base en el medio de cultivo que te fue asignado:
a) Nombre del medio de cultivo:
b) Formulación del medio, condiciones de esterilización y pH que debe tener al término de su

preparación
c) Cálculo del peso de medio con base en el volumen solicitado.
49
2. Completar la siguiente tabla.
M e d io d e C a ra c te rís tic a s C a ra c te rís tic a

F u n c ió n pH S u s tra to In h ib id o r In d ic a d o r
c u ltiv o del d e la s c o lo n ia s
m e d io
G e lo s a
S a n g re
A ga r sal y
m a n ito l
Agar
e o s in a
azul de
m e tile n o
(E M B )
A ga r M ac
C onkey
Agar
S a lm o n e lla
-S h ig e lla
(S S )
Agar
V e rd e
B rilla n te
(A V B )
A g a r B ig g y
6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es el agar-agar y cuál es su función?
2. Menciona 3 precauciones al preparar un medio de cultivo.
50
3 ¿Qué es un medio de transporte?
4. ¿Qué son las pruebas bioquímicas?
5. Escribe el ejemplo de 3 medios selectivos, 3 diferenciales y tres de ensaye o pruebas

bioquímicas
a) Medios selectivos b) Medios diferenciales c) Medios de ensaye
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
51
CENTRO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS Y TECNOLÓGICOS NO. 15
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.9 MEDIOS DE CULTIVO Y SU
CONTROL DE CALIDAD
1. MARCO TEORICO
Los medios de cultivo juegan un papel importante en las investigaciones microbiológicas por
lo que es necesario tomar todas las medidas que garanticen su correcta preparación y
esterilización. Se debe controlar su calidad con el fin de comprobar si estos cumplen con sus
especificaciones y si la metodología empleada en su preparación es satisfactoria.
Los medios de cultivo deben de cumplir con una serie de requisitos que marca la norma
ISO/TS 11133 parte 1 y 2 en la que se menciona que al adquirir un medio se debe solicitar las
especificaciones de calidad, el nombre del medio, la lista de componentes con las cantidades,
la fecha de caducidad, el número de lote y las condiciones de almacenamiento. La calidad de
los medios de cultivo preparados en el laboratorio depende de su formulación correcta, de los
procedimientos de preparación, de la eliminación de los agentes microbianos contaminantes,
y de las condiciones adecuadas de envasado y almacenamiento (ISO/ TS 11132-1: 2009; ISO/
TS 11132-2:2003).
Control de calidad de los medios de cultivo
Se debe verificar que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el laboratorio tengan
las características adecuadas con respecto a:•
• Esterilidad
• Propiedades físicas: pH, color
• Productividad o promoción de crecimiento: recuperación o supervivencia de los
microorganismos de interés.
•Selectividad: Inhibición de los microorganismos no deseados.
• Porcentaje de recuperación bacteriana. Es el rendimiento o recuperación de un
microorganismo que se espera que se desarrolle en el medio de cultivo.
Control de esterilidad de los medios de cultivo.
Este procedimiento se lleva a cabo cada vez que se prepara un lote de medio de cultivo o
diluyente. Los medios de cultivo preparados se incuban en estufa a 35 °C durante 24h. Esta
prueba se realiza sobre el 5% del lote preparado. El criterio de aceptación es que no debe
haber crecimiento, sí se presenta desarrollo se rechaza el lote.
52
Prueba de promoción de crecimiento.
Para los medios de cultivo líquidos se realiza la prueba de promoción de crecimiento para
evaluar su productividad
Para realizar esta prueba se selecciona la cepa de referencia recomendada de acuerdo al

medio de cultivo a probar, se prepara una suspensión de esta (en fase estacionaria) y se
inoculan por separado 100, 10, 1, UFC/ mL en el medio a probar, se incuba a la temperatura
y tiempo correspondiente. Transcurrido el tiempo se observa el desarrollo en cada uno de los
tubos inoculados. Si el desarrollo del microorganismo en el medio de cultivo de prueba es
positivo en todos los tubos inoculados, el lote de medio se acepta.
Selectividad.
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad se emplean dos microorganismos uno cuyo
crecimiento es inhibido y otro favorecido.
El criterio de aceptación es observar la inhibición o crecimiento del microorganismo probados.
Porcentaje de recuperación bacteriana.
Es el rendimiento o recuperación de un microorganismo que se espera que se desarrolle en

el medio de cultivo. Este parámetro aplica únicamente para agares empleados en la técnica
de cuenta en placa.
Almacenamiento de los medios de cultivo Se debe determinar y verificar el período de validez

de los medios preparados en las condiciones de conservación especificadas. Observar el
cambio de color, la evaporación, la deshidratación, y si ocurre crecimiento microbiano. En
general los medios preparados se guardan a 4o C, no más de tres meses (ISO/ TS 11132-1:
2009; ISO/ TS 11132-2:2003).
2. COMPETENCIA
Realizar las pruebas de control de calidad a los medios de cultivo para que se garantice que
los proceso de su preparación, esterilización y vaciado cumplen con las especificaciones.
Balanza
Granataria
Espátula
Mechero
Probeta
Algodón, gasa, papel estraza, masking tape
53
Matraz Erlenmeyer
Tubos de ensaye
Cajas de Petri estériles
Agua destilada
Medios de cultivo deshidratados (Agar soya tripticaseína, caldo lactosado, agar sal y
manitol, agar EMB)
Asa bacteriológica
Cepas de diferentes microorganismos
Gradilla
Pipetas estériles de 1 mL
Pipeta semiautomática de 1000 pL
Puntas estériles para pipeta semiautomática de 1000pL
Vaso de precipitado con solución desinfectante
Solución desinfectante.
Incubadora
Autoclave
El profesor da las indicaciones para realizar las pruebas de control de calidad a los medios de
cultivo preparados y proporciona los cultivos bacterianos necesarios para la realización de las
siguientes pruebas:
• Prueba de esterilidad.
Incubar los medios de cultivo preparados en la incubadora a 35 °C durante 24h. Esta
prueba se realiza sobre el 5% del lote preparado. Se espera que no haya desarrollo en
ningún medio de lo contrario el lote se rechaza.
• Prueba de promoción de crecimiento.
Separar 3 tubos con medio líquido e inocular cada uno de ellos con una suspensión
bacteriana de 100, 10 y 1 UFC/ mL, e incubar a 35 °C durante 24-48 h. Si hay desarrollo
bacteriano en todos los tubos inoculados, el lote de medio se acepta, de lo contado se
rechaza.
• Porcentaje de recuperación bacteriana.
Tomar 3 cajas Petri estériles vacías y depositar en cada un 1 mL de una suspensión

bacteriana con una concentración aproximada de 100 UFC/ mL, enseguida agregar 15 mL
aproximadamente del medio a probar y mezclar con movimientos circulares. Dejar
solidificar el medio, invertir las placas e incubar a 35 ± 2o C durante 24-48 h.
Cuantificar las UFC/ mL para calcular el porcentaje de recuperación (RP) del medio de
cultivo mediante la fórmula siguiente:
UFC/mL= No x Fd x Vo
No=número de colonias contables del promedio de las diluciones.
Fd= factor de dilución
Vo= Volumen sembrado
RP = (UFC/mL en el medio de prueba / UFC/mL en el medio de referencia) 100
El criterio de aceptación de porcentaje de recuperación bacteriana en cada lote preparado
debe ser > 70 %. De no ser así el lote se rechaza.
54
Prueba de selectividad.
Para esta prueba se seleccionan dos cepas de referencia de acuerdo al medio de cultivo a
probar. La apariencia, tamaño y morfología de las colonias de una de las cepas (cepa target)
debe ser la reportada en el certificado del proveedor y el crecimiento de la otra cepa (no target)
debe estar en parte o completamente inhibida. El lote se acepta si el desarrollo de la cepa
target es de acuerdo con lo indicado por el proveedor, la cepa no target es inhibida parcial o
totalmente. Cualquier resultado diferente a lo mencionado anteriormente el lote se rechaza.
Hacer las observaciones y/o cálculos correspondientes para elaborar el informe de control
de calidad del medio preparado. Llenar el siguiente cuadro.
REPORTE DE CALIDAD
Nombre del medio de cultivo evaluado
Número de lote de medio evaluado
Fecha de realización del análisis
CRITERIO
PRUEBAS DE CONTROL DE CALIDAD
ACEPTADO RECHAZADO
PBAS. FÍSICAS
PH
Color
Aspecto
Consistencia
BACTERIOLÓGICAS.
Esterilidad
Promoción de crecimiento
PBAS.
Porcentaje de recuperación
Prueba de selectividad
Nombre del analista:
55
6. CUESTIONARIO
1. Menciona cuáles son los parámetros de calidad con los que debe cumplir el agua
destilada utilizada en la preparación de los medios de cultivo.
2. ¿Por qué es importante hacer el ajuste de pH al preparar el medio de cultivo?
3. Menciona tres fuentes de error en la preparación de los medios de cultivo.
4. ¿Qué parámetros de calidad se pueden afectar al utilizar material mal lavado?
5. ¿Qué efectos se observan cuando un medio de cultivo deshidratado no se cierra

herméticamente?
7. CONCLUSIONES
8.BIBLIOGRAFÍA
56
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 10 SIEMBRA Y AISLAMIENTO
BACTERIOLÓGICO.
V_______________ __________________ J
1.- MARCO TEORICO
La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de

microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Una vez que el medio
de cultivo está debidamente preparado se procede a inocular la muestra deseada. Para aislar
o separar los diferentes tipos microbianos que se encuentran en una muestra (agua, materias
primas, alimentos, etc.) se pueden utilizar distintas técnicas de siembra. Sembrar o inocular
es introducir artificialmente una porción de la muestra (inoculo) en un medio de cultivo
adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo
se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Dependiendo del estado físico del
medio de cultivo (líquido, sólido o semisólido) la siembra se puede realizar con asa
bacteriológica en anillo, asa en punta, varilla de vidrio (espátula de Drigalsky), hisopo o pipeta
estéril.
A s a en an illo
A s a recta
Siembra en medio de cultivo sólido en caja Petri.
Siembra por estría simple.
1 Esterilizar el asa bacteriológica para evitar contaminaciones; para ello se le incinera a la llama del
mechero, hasta que todo el filamento esté incandescente
2. Dejar enfriar el asa cerca de la llama y luego tomar la muestra con el asa y descargar el inoculo en el
cultivo haciendo estrías continúas abarcando el ancho de la caja.
3. -Esterilizar el asa e incubar las placas a 35° C.
4. -Marcar las cajas con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembró,
grupo y equipo.
5. -Invertir las cajas sembradas para evitar que el agua de condensación caiga sobre lo
sembrado e incubarlas a 35°C., por 24 a 48 horas.
57
I
Siembra por agotamiento en estrías o estría cruzada.
1 Esterilizar el asa bacteriológica en el mechero y dejar enfriar.

2. -Tomar la muestra con el asa y descargar el inoculo en el cultivo haciendo estrías continuas
hacia el centro de la placa.
3. - Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla en el agar.
4. -Hacer una segunda serie de estrías tocando la porción final de la estría anterior.
5. - Esterilizar el asa nuevamente y enfriar en el agar.
6. -Repetir los pasos 4 y 5 hasta efectuar 4 áreas de estrías sobre la superficie de la placa.
7. -Esterilizar el asa e incubar las placas a 35° C., o a la temperatura indicada por los
profesores.
grupo y equipo.
58
Siembra masiva (con hisopo).
1.-Embeber el hisopo de algodón estéril en un tubo que contiene un cultivo líquido

previamente homogeneizado.
2. - Eliminar el exceso de inoculo presionando el hisopo contra las paredes internas del tubo.
3. - Diseminar el inoculo por toda la superficie de la placa conteniendo el medio de cultivo
sólido.
4. - Incinerar el hisopo.
grupo y equipo.
Esta técnica permite sembrar inóculos abundantes sobre superficies grandes (cajas de Petri,
botellas de Roux, etc.) a fin de obtener un crecimiento confluente.
Inocula* kV> pnmjru CtftU m Angulo w c » £yrU m Angulo wcto

PAU produci* uru
tom ar <*c ¿cvirroUo
Siembra en placa vertida.
1. - Tomar con una pipeta estéril un volumen de inoculo (generalmente 1 mi) y colocarlo en el
tubo que contiene agar fundido y se homogeneiza.
2. - Verter el contenido en una placa de Petri vacía y estéril.
3. - Homogeneizar el contenido de la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas
direcciones y se dejar solidificar.
grupo y equipo.
59
Transcurrido el tiempo de incubación se observarán colonias en profundidad (inmersas en el
medio) y en la superficie. Esta técnica permite el desarrollo de microorganismos aerobios,
aerobios facultativos y microaerofílicos.
colonias
É
_,
c
)co
lo
ni
asai
sla
das
Siembra del medio de cultivo en tubo.
Siembra en picadura o punción en medio de cultivo semisólido.
1 Esterilizar el asa bacteriológica en punta en el mechero y dejar enfriar.

2. - Quitar el tapón al tubo que contiene la muestra y flamear la boca del tubo.
3. - Tomar con el asa el inoculo.
4. - Introducir el asa con la muestra en el tubo conteniendo agar a inocular, sin tocar las
paredes de este y en forma paralela asegurándose que el inoculo quede distribuido a lo largo
de toda la punción.
5. - Retirar el asa e incinerarla.
6. - Flamear la boca del tubo y taparlo.
7. -Marcar los tubos con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembró,
grupo y equipo.
8. - Incubar a 35°C., por 24 a 48 horas.
Esta técnica permite conocer el comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno y

su movilidad.
Siembra por picadura y estría en medio de cultivo sólido inclinado.
1. - Esterilizar el asa bacteriológica en punta en el mechero y dejar enfriar.

2. - Quitar el tapón al tubo que contiene la muestra y flamear la boca del tubo. 3.- Tomar con
el asa el inoculo.
4. - Introducir el asa con la muestra en el tubo conteniendo agar a inocular, sin tocar las paredes
de este y en forma paralela asegurándose que el inoculo quede distribuido a lo largo de toda
la punción.
5. - Deslizar suavemente el asa en zigzag sobre la superficie del pico de flauta. 6.- Retirar el
asa e incinerarla.
grupo y equipo.
Esta técnica constituye un medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y

aerobios facultativos.
60
Siembra en medios de cultivo líquidos.
1 Esterilizar el asa bacteriológica en el mechero y dejar enfriar.

2.- Quitar el tapón al tubo que contiene la muestra y flamear la boca del tubo. 3.- Tomar la
muestra con el asa en anillo.
4. - Inclinar ligeramente el tubo a inocular e Introducir el asa descargando el inoculo en la pared
del tubo.
6. - Homogeneizar el inoculo en el medio de cultivo colocando el tubo entre las manos y
haciendo suaves movimientos rotatorios.
8. - Retirar el asa e incinerarla.
grupo y equipo
10. - Incubar a 35°C., por 24 a 48 horas.
Generalmente este tipo de siembra se utiliza para aumentar el número de microorganismos.
61
F la m e a r e l asa d e siem bra S u j e t a r e l t a p ó n d e l t u b o c o n los
e n la f l a m a d e l m e c h e r o d e d o s a n u l a r y m e n i q u e . , a b r i r el
tubo
I n t r o d u c i r e l a s a e n el interior del
F la m e a rla b o c a del tubo c o n
tu b o y p ro c e d e rá sem brar
la l l a m a d e l m e c h e r o
A P unoón
hmpu
A sa en
anillo
Ansa recia
Muestra Medio liquido
Á M uestra M edio (a g a r en co lu m n a )
M uestra MckJjo (agar indinado
o pico de flat*a)
Siembra en m edio de cultivo
Siembra en m edio de cultivo Siem braen m edio de cultivo sólido líquido
sem isólido
2.-C0M PETENCIA
Aplica las diferentes técnicas de siembra para el aislamiento de microorganismos provenientes

de las muestras médicas.
Mechero
Asa bacteriológica Hisopos estériles
Tubos con medio de cultivo líquido
Tubos con medio de cultivo sólido en columna e inclinados Cajas Petri con medio de cultivo
Cajas con cultivos bacterianos Marcador, masking tape.
62
El profesor da las indicaciones y proporciona los cultivos bacterianos necesarios para la

realización de las diferentes técnicas de siembra.
El estudiante realiza las técnicas de siembra en placa por estría simple, estría cruzada y
masiva, en tubo por picadura y estría, picadura o pase.
El estudiante identifica e incuba el material sembrado.
Completa la siguiente tabla.
Instrumento
Consistencia del Técnica de utilizado para
Finalidad
medio de cultivo aislamiento inocular los medios
de cultivo
Líquido
Semisólido
Sólido en tubo
Sólido en tubo
inclinado
Sólido en placa
Sólido en placa
Sólido en placa
63
6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es aislar?
2. ¿Por qué es necesario el aislamiento como paso previo a la caracterización de las

bacterias presentes en las muestras clínicas?
3.- ¿Por qué se incubar las cajas de Petri con la tapa hacia abajo?
4.- ¿Qué sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente?
5.- ¿Por qué debemos trabajar cerca del mechero?
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
64
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 11 MORFOLOGÍA COLONIAL
1. MARCO TEORICO
Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente
es visible a simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una
misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como
los estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas suelen ser de características constantes para el medio de cultivo
usado, la temperatura de incubación y el microorganismo que se trate, por lo que su estudio
es de gran utilidad tanto en la clasificación como en la identificación. No obstante, se requiere
también estudiar la fisiología y propiedades inmunológicas de las bacterias para poder realizar
una identificación completa.
Las características consideradas para la descripción de la morfología colonial de las bacterias

son:
1. Tamaño: Se describe en milímetros, cuando miden menos de 1 mm son puntiformes;

medianas hasta 4 mm de diámetro; grandes, cuando miden más de 4 mm de diámetro.
Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja.
2. Color: pueden tener varios colores debido a pigmentos propios o por absorción de algunas
sustancias del medio.
3. Forma: circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme; las colonias puntiformes son tan
pequeñas que no es posible distinguir sus características morfológicas.
4. Borde o margen: el contorno de la colonia se observa al hacer un corte en un plano
perpendicular a la base esta. Puede ser entero o mostrar irregularidades como ondas,
lóbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra o enrollado.
5. Elevación: inclinando la caja y observando de lado, la colonia puede ser plana o elevada;
esta última, a su vez, puede ser convexa, pulvinada, umbonada.
6. Superficie: apariencia externa o superficial de la colonia: lisa, rugosa o granular.
7. Aspecto: húmedo o seco.
8. Luz transmitida: transparente, traslucida y opaca.
9. Luz reflejada: brillante o mate.
10. Consistencia: dura o suave; esta última a la vez puede ser cremosa, mucoide, friable.
65
Dicha característica se determina tocando la colonia con el asa estéril y por tanto debe ser
la última característica en describirse.
11. Producción d pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en el agua, que
puede difundir al medio de cultivo.
Con experiencia en la observación de cultivos, las características de morfología colonial

vienen a constituir una guía muy útil en el reconocimiento de los principales grupos de
microorganismos por lo que el estudiante de esta asignatura debe prestar atención a estas
características que son información importante en el estudio d los cultivos en el laboratorio.
Crecimiento en medio de cultivo sólido en caja Petri.
MORFOLOGIA COLONIAL
FORMA
Puntlform e C ircular Filam entosa G ra nular R izoide Fusiform e
ELEVACION
Plana E le va d a Convexa Pulvlnada Um bilicada
BORDE
E n le ra O n d u la d a Lobulada Dentada Filam entosa Arrissada
Crecimiento en medio de cultivo líquido
En el laboratorio es frecuente el uso de medios de cultivo líquidos y los microorganismos

presentan un tipo característico de crecimiento en dichos medios propiedad que se utiliza para
facilitar su estudio. Los diferentes tipos de crecimiento en medio líquido se ilustra en el
siguiente esquema.
A N IL L A D A M EM BR A N O SA fE U C U L A D A F L O C lfU T N T O
66
2. COMPETENCIA
Describe las características de la morfología colonial de las bacterias, así como su crecimiento
en medio líquido como parte de las pruebas de identificación presuntiva.
Mechero
Asa bacteriológica
Cultivos bacterianos en medio sólido.
Cultivos bacterianos en tubos con medio de cultivos semisólidos, agar inclinado, caldo etc.
1. - El docente da las indicaciones y proporciona los diferentes cultivos bacterianos en medios

sólidos de cultivo sólidos en placa y tubo, medios líquidos y semisólidos.
2. - El estudiante selecciona tres colonias bacterianas aisladas en el medio de cultivo sólido en
placa para hacer su descripción morfológica, basándose en las instrucciones del profesor y
las descritas en el manual. Describe además el tipo de crecimiento observado en los medios
de cultivo líquidos y semisólidos en tubo.
a) Describir la morfología de tres colonias seleccionadas en la tabla siguiente
Nombre del medio

de cultivo
Características Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
Tamaño (mm)
Color
Forma
Bordes
Elevación
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz Transmitida
Consistencia
Pigmento
67
b) Describe y esquematiza el tipo de crecimiento que se presenta en los tubos con caldo
nutritivo.
Tubo No.1 Tubo No.2 Tubo No.3
6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es una UFC?
2. ¿Qué es el fenómeno de “swarming”? Menciona el nombre de un microorganismo que lo

presente.
3.- ¿Cuál es el objetivo e importancia de la técnica de aislamiento de siembra por

agotamiento en estrías?
4.- ¿Existe alguna relación entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio líquido
con la tensión superficial del medio y los requerimientos de oxígeno del microorganismo?
68
5.- Cómo se observa el crecimiento de los microorganismos en medio líquido dependiendo
de su requerimiento de oxígeno:
Aerobio estricto:
Microaerofílicos:
Aerobio facultativo:
Anaerobio estricto:
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
69
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.12 EXUDADO FARÍNGEO
1. MARCO TEORICO
Generalidades.
El exudado faríngeo es uno de los estudios más solicitados dentro de los laboratorios clínicos,
debido a que las infecciones en el tracto respiratorio superior son de las más frecuentes. Los
cultivos de la garganta se obtienen principalmente para la detección de estreptococos beta-
hemolíticos del grupo A.
Esta prueba de laboratorio se hace para aislar e identificar organismos que puedan causar
una infección en la garganta tales como:
C andida a lb ica n s. Esta levadura causa aftas, una infección de la boca y de lengua y en
ocasiones de la garganta.
Estreptococos del Grupo A. Causan faringitis estreptocócica, escarlatina y fiebre

reumática.
N e isse ria m e n in g itid is . Agente causal de la meningitis.
El diagnóstico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se realice la
toma y manejo de la muestra siguiendo a detalle las instrucciones al respecto.
La interpretación del resultado del laboratorio debe estar apoyado por un buen diagnóstico
clínico y los antecedentes epidemiológicos del caso.
La muestra para aislamiento de agentes infecciosos debe ser tomada ANTES de instaurar la
terapia con antimicrobianos. Una vez tomada la muestra ésta debe identificarse incluyendo
todos los datos relevantes del paciente como son: nombre completo o clave, diagnóstico
presuntivo, fecha de toma y tipo de muestra.
Casos en los que se solicita el exudado faríngeo.
El médico solicitará esta prueba cuando el paciente presente dolor de garganta y fiebre que
pueda ser debida a una infección respiratoria de vías altas. Los síntomas varían y pueden
incluir:
• Dolor de garganta.
• Fiebre.
• Dolor de cabeza.
• Amígdalas rojas con puntitos blancos o amarillos en la parte posterior de la garganta.
• Cuello hinchado y blando.
• Debilidad.
• Pérdida de apetito.
70
Indicaciones para el paciente previo a la toma de muestra.
• No tomar antimicrobianos o suspender el tratamiento entre cinco a diez días previos a la

realización del examen.
• Presentarse en ayuno total.
• Sin aseo bucal. No se deben usar enjuagues bucales antisépticos antes del examen.
Procedimiento para la toma de muestra.
1. Humedecer dos hisopos con solución salina. (0.85%), uno será utilizado para realizar un
frotis y teñirlo por la técnica de Gram y el otro para la siembra de la muestra en los medios
selectivos y/o diferenciales.
2. Solicitar al paciente se siente cómodamente, decline la cabeza hacia atrás, que inspire
profundo, que abra la boca y emita un sonido “aah” (la emisión de un “aah” por parte del
paciente sirve para elevar la úvula y ayuda a reducir el reflejo de la náusea).
3. Emplear un abatelenguas estéril para hacer descender la lengua suavemente e introducir

un hisopo por detrás de la úvula, cuidando de no tocar las paredes laterales de la cavidad
bucal. El hisopo se frota firmemente sobre las paredes de la faringe y ambas amígdalas y
en cualquier área de inflamación, ulceración y exudación, se debe evitar tocar la lengua,
dientes o los labios para no diluir o contaminar la muestra.
Procedimiento para el aislamiento y la identificación de microorganismos patógenos.
1. Descargar la muestra de uno de los hisopos haciendo un frotis sobre la superficie de un

portaobjetos, fijarlo a la flama del mechero y teñirlo por la técnica de Gram.
2. Frotar con el segundo hisopo el borde de una placa de Agar Sangre, Agar Sal y Manitol,
Agar Me Conkey y Agar Biggy. Cubriendo solo un sexto de la superficie; posteriormente
con el asa bacteriológica extender la muestra en la superficie de la placa con una estría
masiva.
3. Incubar las placas a una temperatura de 35 a 37° C durante 18 a 24 horas. Posteriormente

se seleccionan las colonias sospechosas de microorganismos patógenos de cada uno de
los medios.
La garganta puede doler al momento del examen e igualmente se puede experimentar una
sensación de náuseas cuando se toca la parte posterior de la garganta con el aplicador de
algodón, pero el examen sólo dura unos cuantos segundos.
Palillo de
algodón
Se roza e l arca
de las amígdalas
con e i p a lillo
de algodón
71
2. COMPETENCIA
Aplica la técnica de toma de muestra de exudado faríngeo para el aislamiento de patógenos

relacionados con infecciones de las vías respiratorias altas.
3. MATERIALES, APARATOS Y REACTIVOS
Hisopos estériles
Abate lenguas estériles
Mechero
Asa bacteriológica
Puente de tinción
Portaobjetos
Estufa bacteriológica
Autoclave
Microscopio
Agar sangre
Agar de Sal y Manitol
Agar Biggy
Agar Me Conkey
Cristal violeta
Lugol
Alcohol- Acetona
Safranina
Solución salina estéril (0.85%)
El docente da las instrucciones para la toma de muestra del exudado faríngeo.

El estudiante realiza la toma de muestra, siembra en medios selectivos y/o diferenciales y
tinción del frotis.
Transcurrido el tiempo de incubación de los medios inoculados guardarlos en refrigeración
para realizar el antibiograma.
a) Anotar las observaciones del frotis.
Forma:
Agrupación
Tinción de Gram:
72
b) Observar en los medios inoculados y si hay crecimiento seleccionar las colonias
sospechosas de microorganismos patógenos de cada uno de los medios. Describir su
morfología colonial en la tabla siguiente:
Medio de cultivo Agar Sangre Agar sal y Manitol Agar Biggy/ Agar
Me C.
Características
Tamaño (mm)
Color
Forma
Bordes
Elevación
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz Transmitida
Consistencia
Cambios en la coloración del
medio:
Pigmento/hemólisis/variación
de pH)
6. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué el Agar Sal y Manitol es un medio selectivo y diferencial?
2. ¿Qué tipos de hemolisis podemos observar en el Agar gelosa sangre? Explica.
73
3. ¿Cuál es la finalidad de hacer un frotis al inicio de la toma de muestra del exudado?
4. ¿Qué microorganismos no patógenos podemos encontrar en la faringe?
5. ¿Qué microorganismos patógenos se aíslan de la faringe?
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
74
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No. 13 ANTIBIOGRAMA DEL
EXUDADO FARÍNGEO
Clave: BC-P13 Revisión: 15/02/21 Fecha de emisión: 22/02/21 J Página: 75 de 97
1.- MARCO TEORICO
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las

funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se
desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es
evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos,
traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia
clínica. El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo
determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población
bacteriana.
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de

los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El
antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de Petri
previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los
diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con
la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El
antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un
gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen
rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre
bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se
aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución. Sin
embargo, los métodos disco-placa no permiten una lectura directa del valor de la CMI por lo
que hay que convertir el diámetro del área de inhibición alrededor del disco a las categorías
de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a la tabla publicada por los
organismos encargados del control de tales métodos, por ejemplo, el Comité Nacional de
Estándar de Laboratorios Clínicos de los estados unidos de Norteamérica (National Committee
for Clinical Laboratorios Standards).
Método de Bauer - Kirby
1. Preparar previamente suficientes cajas de Petri con medio agar de Müeller-Hinton, es

importante que el medio tenga un grosor de 4mm y sea uniforme Para lo cual adicionar 20
mi del medio.
75
2. Seleccionar las colonias de interés, con el asa tocar de 4 a 5 colonias de morfología
semejante e inocular en un tubo que tiene 1 mi de solución salina 0.85%.de tal forma que
la turbiedad observada en ese tubo sea comparable con el tubo No. 0.5 del estándar del
nefelómetro de McFarland. Esto equivale a una concentración de aproximadamente 1x10"
8 UFC/mL Bacterias/mL.
3. Retirar el contenedor de discos del refrigerador. Antes de abrir el contenedor, permita que
los discos se equilibren a la temperatura ambiente durante una a dos horas para minimizar
la condensación y reducir la posibilidad de que la humedad afecte la concentración de los
agentes antimicrobianos.
4. Colocar las placas con el agar Müeller-Hinton dentro de la incubadora de 10 a 15 minutos
con la finalidad de que estas se calienten a la temperatura ambiente y favorecer la
absorción del exceso de humedad dentro del medio.
5. Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana, y antes de retirarlo eliminar el
exceso de líquido haciendo girar el hisopo contra la pared interna del tubo.
6. Inocular en toda la superficie del medio, en por lo menos en tres direcciones (estría
masiva), dando rotación a la placa.
7. Secar el inoculo incubando la placa 15 minutos a 35°C.
8. Sacar la placa de la incubadora y colocar los discos con los agentes antimicrobianos con
ayuda de una pinza estéril, sobre la superficie del medio de Müeller-Hinton. Los
sensidiscos deben presionarse suavemente contra la superficie con la misma pinza para
asegurar un contacto firme con el medio. Evitar mover los discos una vez colocados.
9. Incubar las cajas de Petri a 35°C durante 18 horas en posición invertida.
10. Medir los halos de inhibición con una regla marcada en milímetros por la parte posterior
de la caja. La lectura se reporta en milímetros.
2. COMPETENCIA
Realiza el antibiograma para determinar la sensibilidad bacteriana de las colonias aisladas a

partir del exudado faríngeo.
3. MATERIALES, APARATOS Y REACTIVOS
Manual de procedimientos
Asa bacteriológica
Hisopos estériles
Tubos de ensaye con solución salina 0.85%.
Cajas de Petri con Agar de Müeller- Hinton
Sensidiscos con antibióticos para Gram negativos y Gram positivos.
Estándar 0.5 del nefelómetro de McFarland (1x10'8 UFC/mL)
1. El docente da las instrucciones para efectuar el antibiograma de las colonias

potencialmente patógenas que se aislaron del exudado faríngeo.
2. El estudiante realiza el antibiograma de acuerdo a las instrucciones. Mide el diámetro del
halo de inhibición y lo anota en la tabla siguiente. Compara los resultados con lo reportado
76
en la tabla anterior y anota sí el microorganismo es sensible (S), intermedio (I) o resistente
(R) al antibiótico.
5.REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES
a) Resultados del antibiograma

N o m b re d el a n tib ió tic o S ig la s C o n c e n tra c ió n D iá m e tro del h alo S I R
De in h ib ic ió n (m m )
6. CUESTIONARIO
1. ¿Cuándo se indica la realización de un antibiograma?
2. ¿Menciona dos limitaciones de este método? Explica.
3. ¿Qué otros métodos a parte del visto en la práctica existen para determinar la sensibilidad
microbiana?
77
4.- ¿Qué ocurre si se excede el tiempo de incubación indicado en este método?
5. ¿Qué ocurre si el agar de Müeller-Hinton en las cajas de Petri es demasiado profundo?
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
78
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.14 SIEMBRA DE UROCULTIVO
1. MARCO TEORICO
Generalidades.
La infección del tracto urinario (ITU) es la enfermedad más frecuente del aparato urinario. En
el ámbito hospitalario es la infección más usual y en el comunitario sigue a las infecciones
respiratorias.
La ITU se define como la presencia y proliferación de gérmenes en el tracto urinario.

Habitualmente es bacteriana y excepcionalmente, micótica o vírica. Se pone en evidencia
mediante el cultivo de la orina (urocultivo) en medios de crecimiento apropiados. Si hay
bacterias, crecerán formando colonias que pueden ser contadas como unidades formadoras
de colonias por mililitro (UFC/ml). En la mayor parte de los casos, el crecimiento de más de
105 UFC/ml en una muestra de orina adecuadamente recogida puede significar infección.
En los años 50, Kass definió el recuento de 100.000 o más colonias por mL de orina (105
UFC/mL) como criterio de bacteriuria (presencia de bacterias en la orina) significativa, Los
criterios de Kass se refieren a la orina obtenida por micción media directa, tras la limpieza
cuidadosa con agua y jabón de los genitales externos, lo cual involucra la existencia de una
contaminación con flora bacteriana existente en los genitales externos, en este caso lleva
implícito la existencia de una contaminación con flora bacteriana a nivel de uretra, vulva, o
prepucio, de esta forma recuentos inferiores a 10 000 UFC/ mL se consideran contaminación
fisiológica, es decir negativos, y los recuentos intermedios más de 10 000 y menor de 100 000
son considerados como sospechosos de infección y obliga a nuevas determinaciones,
teniendo en cuenta que la infección urinaria es mono bacteriana por lo que cultivos con dos o
más gérmenes no deben de ser considerados significativos aunque el recuento sea superior
a 100 000 UFC/mL.
Ecológicamente, Escherichia coli causa el 80% de las ITU no complicadas, Proteus mirabilis,
Klebsiella spp. y Staphylococcus saprophyticus (en mujeres menores de 50 años) son
responsables de la gran mayoría de los episodios restantes. El espectro de bacterias que
causan ITU complicadas es mucho más amplio, aunque E. co//sigue siendo el principal agente
causal En los niños varones es particularmente frecuente la infección por Proteus mirabilis.
Casos en los que se solicita el urocultivo.
• A todas las mujeres embarazadas entre la semana 12 a la 16.

• En personas con insuficiencia renal, hipertensión, sospecha de infección sistémica, con
fiebre de origen desconocido y/o ardor al orinar.
• En pacientes diabéticos y de edad avanzada.
• Problemas para vaciar completamente la vejiga.
• Cálculos renales.
• Tras una cirugía u otro procedimiento en las vías urinarias.
Indicaciones para el paciente para la toma de muestra.
• Con objeto de obtener resultados confiables, no deben olvidarse algunas precauciones

básicas en la toma de la muestra, tales como:
• No tomar antimicrobianos o suspender el tratamiento entre cinco a diez días previos a la

realización del examen.
• Debe ser la primera orina de la mañana.
• Recoger la muestra y llevarla al laboratorio máximo en las dos horas después de su
recolección. Si no fuera posible debe conservarse en refrigeración hasta un máximo de 24
horas, pero nunca se debe congelar.
• Colectar la muestra de orina a partir de la porción media de la micción con objeto de
desechar los microorganismos estacionados en la uretra.
• Colectar las muestras en recipientes estériles y sembrarlas lo más pronto posible, para
evitar la reproducción o muerte de las bacterias.
• Recoger la primera orina de la mañana.
• Previo aseo (con agua y jabón) de las áreas genitourinarias.
• Llevar la muestra al laboratorio lo antes posible. Si no puede ser enviada al laboratorio en
las 2 horas después de su recolección debe conservarse en el refrigerador hasta un
máximo de 24 horas, pero nunca se debe congelar.
• Recolectar la orina en un recipiente de plástico estéril, de boca ancha, el paciente debe
cerrar correctamente después de la micción, evitando tocar el interior del recipiente.
• Mujeres: deben mantener los labios mayores separados mientras se recoge la orina. Se
desecha la primera parte de la micción y, sin interrumpir el flujo de la orina, se recoge la
micción media, y se desecha también la micción terminal. La recogida de la orina por
micción media debe evitarse durante la menstruación.
• Hombres: deben mantener el prepucio retraído mientras comienzan la micción. Al igual
que las mujeres, deben recoger sólo la micción media, sin interrumpir el flujo de laorina.
Procedimiento para el aislamiento e identificación de microorganismos patógenos.
1. Homogenizar la muestra y tomar una porción con el asa calibrada. En caso de no contar
con calibrador, tomar un asa y hacer un círculo de 4 mm de diámetro, esto equivale a
tomar 0.01 mL de muestra. Sembrar haciendo una estría sobre el diámetro de la placa y
luego pasar el asa perpendicularmente a esta línea cubriendo el resto del campo. Hacer
80
esto en cada una de las placas con medio de agar comenzando por el de gelosa sangre,
después EMB y finalmente agar sal y manitol, excepto Biggy.
2. Incubar a 35° C de 24 a 48 horas. En el caso del agar gelosa sangre conviene incubarlo
en atmósfera húmeda y CO2 (técnica de la vela) a fin de lograr un buen desarrollo de
estreptococos beta hemolíticos, en caso de estar presentes.
3. Colocar en condiciones asépticas, en un tubo vacío y estéril de 8 a 10 mL de orina.
4. Centrifugar a 3,000 rpm, 10-15 minutos, decantar, resuspender el sedimento y sembrar
en el medio de Biggy. Incubar hasta 72 horas a 35° C.
5. Realizar el examen en fresco, colocar con una pipeta Pasteur una gota del sedimento en
un portaobjetos, y encima de la gota un cubreobjetos, observar a 40 X.
6. Efectuar con el sedimento urinario un frotis y teñir con la técnica de Gram. En caso de
investigar M. tuberculosis realizar la técnica de Ziehl-Neelsen.
7. Realizar el examen físico de la muestra. Considerar el color, olor, aspecto densidad y pH
8.- Si es necesario realizar pruebas bioquímicas o antibiograma.
Protocolo de rutina
Examen en fresco Observar leucocitos, hematíes, b a cte ria s, levaduras...

O
RI
N A
Estudio o rie n ta tiv o
Tinción de Gram Observar m orfología, Gram g número aproximado de bacterias
\
No s ig n ific a tiv o : < 10 3 UFC/ml (excepto en punción suprapúbica)
Agar sangre
3 4
o ------- Recuento Dudoso: de 10 a 10 UFC/ml (S ig n ific a tiv o en ocasiones)
C
uan
ti
tat
ivo Agar CLED * 35- 37*0 _ 5
♦ aerobiosis S ig n ific a tiv o : ¿ 10 UFC/ml
o ♦24h
>
4 »
9
8
o > Catalasa ♦ —> S tjp h y focáceos, M tcro co ccas
oc
3
o
r ^ Catalasa - S tr*p toeo€cas
Cocos Ge
A. MacConkeg V' -> Lactosa ♦ E
NTE
ROB
ACT
ERA
S
o
Agar EMB # 35. 37^
> ------» Oxidasa - __í
Bacilos G ■» Lactosa -
C
ual
ita
ti
v o
♦ aerobiosis » Oxidasa + —» Fseudom onjs
♦ 24h
V Levaduras *I
D E
NTI
F I
C A
CI
O N
Al hacer el recuento de colonias en placa, es importante utilizar los datos obtenidos de placas
en que haya entre 30 y 300 UFC, si se desea lograr una estimación aproximada del número
de bacterias en la muestra original de orina. Sin embargo, en caso de obtener números
mayores de este límite, esto nos puede indicar una cuenta elevada que concuerda con una
infección activa.
2. COMPETENCIA
Realiza la técnica de urocultivo para el aislamiento de patógenos causantes de infecciones

de las vías urinarias.
81
Instructivo de procedimientos
Mechero
Asa bacteriológica
Asa calibrada de 4 mm (0.01 mi)
Portaobjetos
Puente de tinción
Tubo de ensayo con tapa de rosca
Gradilla metálica
Microscopio
Incubadora
Autoclave
Centrífuga
Agar gelosa sangre
Agar Eosina Azul de Metileno
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
Cristal violeta
Lugol Alcohol-cetona
Safranina
Recipiente cilindrico con tapa hermética
Vela
1. El docente da las instrucciones para la siembra del urocultivo.

2. El estudiante realiza la siembra de la muestra en medios selectivos y/o diferenciales,
preparación en fresco, tinción de Gram del frotis y examen físico.
3. Transcurrido el tiempo de incubación de los medios inoculados guardarlos en refrigeración
para la realización de las pruebas bioquímicas de las colonias que resulten sospechosas.
a) Anotar las observaciones del frotis y del examen en fresco.
Tinción de Gram: Examen en fresco:

Forma:
Agrupación:
82
6. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué el Agar EMB es un medio selectivo y diferencial?
2. ¿Cuál el microorganismo más frecuente en las infecciones urinarias y cuál es su

morfología colonial en el agar EMB?
¿En qué pacientes con infecciones urinarias es más frecuente aislar Candida albicans ?
4. Menciona el nombre de dos bacterias patógenas Gram positivas y dos Gram negativas
detectadas en orina.
5.- ¿Qué otros microorganismos diferentes a las bacterias pueden también causar
infecciones urinarias?
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
83
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.15 PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PARA EL UROCULTIVO
1. MARCO TEÓRICO
La clasificación, nomenclatura e identificación son áreas separadas, pero interrelacionadas de

la taxonomía. La clasificación se puede definir como el ordenamiento de microorganismos en
grupos taxonómicos con base en semejanzas o interrelaciones. La clasificación de las
bacterias, requiere de un conocimiento obtenido por técnicas experimentales, de la
observación, de propiedades bioquímicas, fisiológicas, genéticas y morfológicas, para lograr
una descripción correcta de una especie bacteriana. La identificación se refiere al uso práctico
de un esquema de clasificación: a) para aislar e identificar una bacteria de interés de aquellos
que no lo tienen b) para verificar la autenticidad o propiedades especiales de un cultivo 3) en
un problema clínico, para aislar e identificar al agente causal de una enfermedad. Esto último
permite la selección de un tratamiento farmacológico dirigido de modo específico a su
erradicación. Hay que considerar que los esquemas de identificación no son esquemas de
clasificación.
Criterios para la clasificación de las bacterias
1 Técnica de Gram. Es una de las técnicas más importantes para los microbiólogos clínicos,
es básica en la identificación presuntiva de bacterias. La morfología bacteriana, el
agrupamiento y las características tintoriales son a menudo suficientes para permitir una
identificación presuntiva usando la técnica de Gram.
2.- Morfología colonial, los microbiólogos utilizan diversas características de las colonias
bacterianas que desarrollan en la superficie de los medios de cultivo con dos finalidades:
efectuar la identificación presuntiva y como guía en la selección de pruebas a fin de determinar
las características diferenciales para la identificación final. Los criterios utilizados son: tamaño,
forma, consistencia, color y producción de pigmento por las colonias, así como la presencia o
ausencia de reacciones hemolíticas en agar gelosa sangre.
3.- Identificación basada en pruebas bioquímicas, en este tipo de pruebas la identificación de

las bacterias está relacionado en determinar la presencia o ausencia de diferentes enzimas,
las cuales pueden detectarse a través de medios especiales usados en las técnicas de cultivo
in vitro. Los sustratos sobre los cuales estas enzimas pueden actuar se incorporan al medio
de cultivo, junto con un sistema indicador que puede detectar ya sea la hidrólisis del sustrato
o la presencia de productos metabólicos específicos.
4.- Pruebas serológicas, cuando es necesario se debe tipificar a la bacteria en cuestión.
84
2. COMPETENCIA
Realiza la identificación confirmativa del microorganismo presente en la muestra de orina,

mediante la utilización de pruebas bioquímicas.
Mechero
Asa bacteriológica
Gradilla metálica
Pruebas bioquímicas:
Agar de hierro triple azúcar (Agar TSI)
Medio MR-VP
Caldo Urea
Medio de SIM
Medio MIO
Medio LIA
Citrato de Simmons
Reactivo de la catalasa
Reactivo de la coagulasa
REACTIVOS
P-dimetilaminobenzaldehido
HCL Concentrado
Alcohol Amílico o Isoamílico
Rojo de metilo
Alfa Naftol
Alcohol etílico
Hidróxido de potasio
Cloruro férrico
Plasma deshidratado
Diclorhidrato de dimetil p-fenilendiamina
Alfa naftil amina
Ácido acético
Ácido sulfanílico
Autoclave
Refrigerador
1. El docente da las indicaciones para hacer el recuento de las UFC/mL, en los medios
inoculados y el procedimiento para la siembra de las pruebas bioquímicas.
2. El estudiante observa si hay crecimiento en las placas y procede al recuento de las
colonias aisladas. El recuento es significativo si el valor obtenido es > 100,000 UFC/ml. En
este caso proceder a la identificación de la bacteria.
3. Describe la morfología de las colonias desarrolladas en los medios sembrados.
4. Siembra las pruebas bioquímicas para la identificación confirmativa del posible patógeno
aislado y las Incuba de 24-48 hrs. a 35 °C.
5. Hace la lectura de las pruebas bioquímicas para determinar la actividad metabólica o
bioquímica de las bacterias.
85
a) Hacer el recuento de las colonias aisladas y el cálculo correspondiente. Considerar que el

número de colonias obtenido corresponde a la cifra de bacterias presentes en 1.0 pL de orina
debido a que utilizaron un asa calibrada para hacer la siembra, por tanto, aplicar una regla de
tres para obtener el número de UFC/ml.
b) Observar en los medios inoculados, si hay crecimiento y seleccionar las colonias

morfología colonial en la tabla siguiente
Medio de cultivo Agar gelosa Agar EMB Agar sal y Agar Biggy
sangre manitol
Características
Tamaño (mm)
Color
Forma
Bordes
Elevación
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz Transmitida
Consistencia
Cambio de pH/
hemolisis, coloración
86
b) Con base en los resultados de las pruebas bioquímicas anota el nombre probable del
microorganismo patógeno aislado:__________________________________
NOMBRE DEL IN T E R P R E T A C IÓ N D E LO S R E S U L T A D O S
M E D IO D E C U L T IV O
PARA LA PRUEBA
(+) (-)
B IO Q U IM IC A
TSI
LIA
MIO
CURATO DE
SIMONS
ROJO DE METILO
ROJO DE METILO
PARA REACCIÓN
DE VOGES-
PROSKAUER
CALDO UREA
AGAR
FENILALANINA
SIM
6. CUESTIONARIO
1. ¿Para qué sirve el indicador de pH contenido en las pruebas bioquímicas?
2. ¿Qué grupo de bacterias perteneciente a la familia de las enterobacterias producen urea?
87
3. Género y especie de bacteria Gram positiva coagulasa positivo, asociada en infecciones
del tracto urinario.
4. ¿Qué ocurre si excedemos el tiempo de incubación de las pruebas bioquímicas?
5. Menciona tres causas de falsos negativos en la prueba del urocultivo.
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
88
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.16 SIEMBRA DE
COPROCULTIVO
1. MARCO TEORICO
Generalidades.
El coprocultivo es el cultivo de heces, es un estudio cuyo propósito es buscar bacterias

patógenas que causan afecciones gastrointestinales.
En el tracto intestinal se encuentran bacterias formando parte de la flora normal, pero a veces
se detectan bacterias patógenas, aquí es donde el laboratorio de bacteriología clínica tiene
un papel importante cuando se presenta una infección intestinal bacteriana. Las muestras
obtenidas se deben de colectar en recipientes estériles adecuados. A veces puede ser
necesario usar hisopo para tomar muestra del recto principalmente para aislar especies de
como Shigella.
La mayoría de las gastroenteritis agudas aparecen como procesos auto limitados y de curso
benigno, en las que la única actitud recomendada es la de tratamiento sintomático y
observación. Será en las enteritis graves en las que esté indicado un estudio microbiológico,
tanto para tratar con antimicrobianos específicos contra el agente causal como para evitar o
bloquear la difusión del microorganismo.
Los medios a utilizar en un estudio básico de heces varían de unos laboratorios a otros, pero
es necesaria la utilización de medios selectivos, como Hectoen (dirigido a Shigella, Yersinia o
Salmonellá) o Agar Yersinia, y otros menos selectivos como McConkey (E. coli, Shigella,
Aeromonas, Yersinia), XLD ( Shigella) o Agar Salmonella ( Salm onella, Shigella). Cualquier
crecimiento de estos enteropatógenos se valorará como positivo y se informará de la especie,
así como de su antibiograma.
Casos en los que se solicita el coprocultivo.
• Malestar gastrointestinal
• Diarrea severa, persistente (que no desaparece) o recurrente (que sigue reapareciendo)
sin una causa conocida.
• En caso de diarrea y recientemente el paciente ha estado tomando antibióticos, para
observar si bacterias como la C. difficile (que puede ocasionar diarrea después de que las
personas toman antibióticos) están ahora presentes en el intestino
• Deshidratación, fiebre elevada, pus o moco en las heces
• Brotes epidémicos (banquetes, guarderías, hospitales)
• Diarrea del viajero
• Sospecha de posibles agentes con potencial epidémico como el cólera.
89
Indicaciones para el paciente previo a la toma de muestra.
• No es necesario el ayuno
• No se requiere dieta especial
• No estar bajo tratamiento con antibióticos o tener más de 72 horas de haber concluido el
tratamiento. En caso de no ser posible ninguna de estas dos opciones informar al TLC
para que este especifique en la solicitud del estudio el nombre del antibiótico y cuantos
días lleva con el tratamiento.
Indicaciones para la toma y condiciones de la muestra.
• La toma de muestra se deberá realizar lo antes posible luego del comienzo de la

enfermedad, el coprocultivo se realiza en los tres primeros días de la diarrea, ya que
muchos organismos entéricos mueren si no se cultivan con rapidez, y porque es en este
período en el que se encuentran en número significativo en las heces.
• La recolección de la muestra se efectúa en un recipiente de boca ancha y con tapa de
rosca.
• La muestra consistente deberá ser de aproximadamente del tamaño de una nuez, en caso
de ser líquida entre 5 y 10 mi.
• Debe evitarse la contaminación con orina o agua del inodoro y para ello se recomienda
utilizar un recipiente de cama bien lavado con agua, jabón y seco. Evitar también la
contaminación con papel higiénico.
• Una vez recolectada la muestra debe enviarse al laboratorio en menos de dos horas a
temperatura ambiente, sí no se puede enviar de manera inmediata se puede refrigerar sin
que exceda 4 horas ya que a medida que la muestra fecal se enfría la caída de pH llega
ser suficiente para inhibir el crecimiento de muchas especies de Shigella y algunas de
Salmonella.
• Las muestras deben examinarse y cultivarse loa antes posible después de la recolección,
sí el cultivo se hace dentro de las dos horas después de tomada la muestra no se requiere
medio de transporte, pasado este periodo se recomienda usar el medio Cari-Blair.
• En neonatos o incluso adultos mayores se recomienda la técnica de hisopado rectal.
• En pacientes de edad pediátrica que usan pañales se recomienda tomar la muestra de los
glúteos y no del pañal, en especial aquellas partes mucosas o sanguinolentas.
Procedimiento para el aislamiento e identificación de microorganismos patógenos.
El aislamiento comprende la siembra directa y la siembra previo enriquecimiento:
Siembra directa.
1. Tomar aproximadamente 0.5 g de la muestra con el asa bacteriológica y preparar una

suspensión en tubo con aproximadamente 3 mL de solución salina 0.85% estéril,
homogenizar.
2. Sumergir el asa en la suspensión, tomar una gota y extenderla sobre la superficie la placa
de Agar Eosina Azul de Metileno y McConkey. El aislamiento de las colonias se hace por
estría cruzada, esterilizándola en cada sección de aislamiento de la placa y separando la
estría. Incubar de 24-48 hrs. a 37°C
90
Siembra previo enriquecimiento.
1. Preparar una emulsión tomando aproximadamente 1 gr de heces y suspenderla en un tubo

que contenga unos 3 mL de caldo tetrationato; y se lleva a la incubadora por 18-24 horas
a 37°C.
2. Inocular el medio de enriquecimiento con un inoculo pesado o bien dejando el

hisopo dentro del medio durante la incubación. Durante 12 a 18 hrs. a 37°C. Una
vez transcurrido el tiempo de incubación resembrar por estría cruzada con el asa
en Agar Sulfito de Bismuto y agar Salm onella-Shigella e se incubar de 24-48 hrs. a37°C.
2. COMPETENCIA
Realiza la técnica de coprocultivo para el aislamiento de patógenos causantes de

infecciones gastrointestinales.
Mechero
Asa bacteriológica
Gradilla metálica
Incubadora
Autoclave
Agar Eosina Azul de Metileno
Agar McConkey
Agar Sulfito de Bismuto
Agar Salm onella-Shigella
Caldo tetrationato o caldo selenito
1. El docente da las instrucciones para la siembra del coprocultivo.

2. El estudiante siembra de la muestra en medios selectivos y/o diferenciales.
3. Almacena los medios inoculados en refrigeración una vez transcurrido el tiempo de
incubación para realizar posteriormente las pruebas bioquímicas de las colonias que
resulten sospechosas.
Nota: Los resultados y observaciones se registrarán en la próxima sesión una vez que se
tenga y desarrollo en los medios selectivos y diferenciales inoculados.
91
6. CUESTIONARIO
1. Describe la morfología colonial característica de Escherichia c o lie n agar EMB
2. Describe la morfología colonial característica de Salmonella en agar S-S
3. ¿Qué tipo de medio es el caldo tetrationato y cuál es su utilidad?
4. Menciona el nombre de dos medios de transporte utilizados en esta técnica:
3. ¿Por qué el agar McConkey se considera un medio selectivo y diferencial?
7.- CONCLUSIONES
8.- BIBLIOGRAFÍA
NOMBRE DE LA PRÁCTICA No.17 LECTURA DE
COPROCULTIVO
1. MARCO TEORICO
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias
objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas ya que evalúan la
presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas
horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una
incubación previa de 18 a 48 horas; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que
detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un
microorganismo a una substancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen
el sustrato a metabolizar.
Existen en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas con el fin de conseguir

una mayor rapidez en la identificación de algunas bacterias todas exigen unas condiciones
precisas en cuanto al inoculo, modo de inoculación, incubación y lectura, que de no seguirse
pueden dar lugar a errores estos sistemas pueden ser manuales o estar automatizados.
Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas.
Se trata de celdillas aisladas con un sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que
permiten realizar simultáneamente entre 10 y 50 pruebas bioquímicas. Los resultados de la
prueba se expresan de forma numérica (los resultados de las pruebas se agrupan de tres en
tres, de manera que el resultado de cada trío de pruebas queda reducido a un dígito). Cada
especie está definida por un código numérico resultado de la codificación de las reacciones a
las pruebas que se hubieran utilizado. Algunos de los sistemas comerciales disponibles en el
mercado son: API (Biomeriux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), Rap ID systems y
Micro ID (Remel), Biochemical ID systems (Microgen), etc.
2. COMPETENCIA
Realiza la identificación confirmativa del microorganismo presente en la muestra de copro,

mediante la siembra de pruebas bioquímicas.
93
Mechero
Asa bacteriológica
Pruebas bioquímicas:
Agar de hierro triple azúcar (Agar TSI)
Medio MR-VP
Medio MIO
Medio LIA
Citrato de Simmons
REACTIVOS
P-dimetilaminobenzaldehido
HCL Concentrado
Alcohol Amílico o Isoamílico
Rojo de metilo
Alfa Naftol
Alcohol etílico
Hidróxido de potasio
Cloruro férrico
Diclorhidrato de dimetil p-fenilendiamina
Alfa naftil amina
Ácido acético
Ácido sulfanílico
Autoclave
Refrigerador
4.- DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES
1. El docente da las indicaciones para hacer la lectura de los medios selectivos y

diferenciales sembrados y el procedimiento para la siembra de las pruebas bioquímicas.
2. El estudiante observa si hay crecimiento en las placas y procede hacer la identificación
de los posibles patógenos con base en la morfología colonial característica.
3. Describe la morfología de las colonias desarrolladas en los medios sembrados.
4. Siembra las pruebas bioquímicas para la identificación confirmativa del posible patógeno
aislado y las Incuba de 24-48 hrs. a 35 °C.
5. El docente da las indicaciones para realizar la lectura e interpretación de las pruebas
bioquímicas.
6. Hace la lectura de las pruebas bioquímicas para determinar la actividad metabólica o
bioquímica de las bacterias.
94
a) Observar en los medios inoculados, si hay crecimiento y seleccionar las colonias

morfología colonial en la tabla siguiente
Agar
Agar sulfito de
Medio de cultivo Agar EMB Agar McConkey Salmonella-
bismuto
Shigella
Características
Tamaño (mm)
Color
Forma
Bordes
Elevación
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz Transmitida
Consistencia
Cambio de pH/
hemolisis, coloración
95
b) Con base en los resultados de las pruebas bioquímicas anota el nombre probable del
microorganismo patógeno aislado:__________________________________
NOM BRE DEL IN T E R P R E T A C IO N D E L O S R E S U L T A D O S

M E D IO D E C U L T IV O
PARA LA PRUEBA
(+> (-)
B IO Q U IM IC A
TSI
LIA
MIO
CURATO DE
SIMONS
ROJO DE METILO
ROJO DE METILO
PARA REACCIÓN
DE VOGES-
PROSKAUER
6. CUESTIONARIO
1. Investiga el nombre de una prueba preliminar que se realiza para separar a las
enterobacterias del resto de las Gram negativas:
2. ¿Qué significa el acrónimo IMVIC?
3.- Anota el resultado de las pruebas Indicó para E. coli
4.- Anota dos técnicas de identificación confirmativa diferentes a la utilizada en la práctica:
96
5.- Cuando se recomienda efectuar un coprocultivo.
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
97
BIBLIOGRAFÍA
1. Fernández Espina Camilo, Mazziota Daniel. Gestión de Calidad en el Laboratorio Clínico.

2005. Buenos Aires Argentina. Editorial Médica Panamericana, S.A. deC.V.
2. Monema W. Elmer. Diagnóstico microbiológico, Texto y atlas a color. 2006. México.

Editorial Médica Panamericana, S.A. de C.V.
3. MacFaddin F. Jean. Pruebas bioquím icas para la identificación de bacterias de

im portancia médica. 2003. Buenos Aires Argentina. Editorial Médica Panamericana, S.A.
de C.V.
4. Organización Mundial de la Salud. MANUAL DE BIO SEGURIDAD EN EL LABORATORIO.

2005. Ginebra Suiza. OMS.
5. Romero Cabello Raúl. Microbiología y parasitología humana. 2007. México. Editorial

Médica Panamericana, S.A. de C.V.
6. Tortora J. Gerard. Introducción a la Microbiología. 2017. Buenos Aires Argentina. Editorial

Médica Panamericana, S.A. deC.V.
7. Jawetz, Mellnick y Aldberg. Microbiología Médica. 2014. México. McGraw-Hill

Interamericana editores S.A. de C.V.
8. López Martínez R., Molina López J. Sánchez Vega J. Microbiología y Parasitología

Médicas de Tay. 2019. México. Méndez Editores, S.A. de C.V
9. Murray R. Patrick, Rex S. Rosenthal. Microbiología Médica. 2017. Barcelona

España. Editorial Elsevier.
10. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-065-SSA1-1993, QUE ESTABLECE LAS

ESPECIFICACIONES SANITARIAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. GENERALIDADES.
www.salud.qob.mx/unidades/cdi/nom/065ssa13.htm
11. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIÓN AMBIENTAL

- SALUD AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO- INFECCIOSOS -
CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO.
www.salud.qob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html
98

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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

DIRECCIÓN DE EDUCACIÓN MEDIA SUPERIOR

CENTRO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS Y TECNOLÓGICOS 15

” DIÓDORO ANTUNEZ EHEGARAY”

INSTRUCTIVO DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA

NOMBRE DEL TITULAR:

NOMBRE DEL PROFESOR DE LABORATORIO:

NOMBRE DEL PROESOR DE LABORATORIO:

NOMBRE DEL ESTUDIANTE:

CICLO ESCOLAR: 2021 II SEMESTRE: CUARTO

ELABORO: Q.B.P. ALEJANDRA FRAGOSO CAMACHO.

Aplica métodos y técnicas para el estudio de la bacteriología clínica cumpliendo con la

El presente instructivo contiene actividades prácticas, que incluyen conceptos, técnicas,

Práctica 1. Reglamento y bioseguridad en el laboratorio. 4

Práctica 12. Exudado Faríngeo. 70

Práctica 13. Antibiograma del exudado faríngeo. 75

Clave: BC-P1 Revisión: 15/02/21 Fecha de emisión: 22/02/21 Página: 4 de 97

a) Universalidad: de este principio nace el concepto de potencialidad, es decir, se asume que

b) Uso de barreras protectoras: son elementos que protegen de la transmisión de infecciones

c) Medidas de eliminación de residuos

La eliminación de los desechos peligrosos que se generan en las instituciones de salud

Son microorganismos incluyendo los genéticamente modificados, cultivos celulares y

El alumno aplica el reglamento de laboratorio, con el fin de mantener la seguridad individual

1. Formación de equipos de trabajo.

1. Entrar puntualmente al laboratorio. Eventualmente se permitirá una tolerancia de 5 minutos.

3. Permanecer con la bata abotonada en todo momento durante la estancia en el laboratorio.

5. Queda prohibida la entrada a personas ajenas al laboratorio.

6. Mantener siempre cerrada la puerta del laboratorio.

7. Se prohíbe la salida, sin autorización de los profesores encargados.

12. Leer la práctica antes de entrar al laboratorio.

16. Durante la sesión quedan prohibidos los juegos y abrazos.

a. Título y número de lapráctica......................0.0%

Firma del estudiante Firma del padre o tutor

Nivel de Tipo de Características de diseño Equipo de seguridad

b) Completa la tabla: referente a la clasificación de los microorganismos infecciosos por

Grupo de Riesgo Riesgo Medidas preventivas y terapéuticas

1. Define que es bioseguridad y cuáles son sus principios básicos.

3. ¿Qué debe hacerse en caso de derrame de un cultivo bacteriano sobre la mesa?

4. ¿Qué debe hacerse cuando se derrama un cultivo bacteriano sobre la bata?

Clave: BC-P2 Revisión: 15/02/21 Fecha de emisión: 22/02/21 Página: 10 de 97

Es necesario que antes de comenzar cualquier trabajo experimental, el alumno conozca el

Clasificación del material de bacteriología clínica según su uso

• Puente de tinción: material sobre el que se coloca el portaobjetos durante el proceso de

• Frasco gotero: permite contener sustancias que se necesitan dosificar en pequeñas

• Vaso de precipitados: se emplea para contener, calentar, enfriar, disolver,

• Pipetas: permiten la transferencia de un volumen generalmente no mayor a 20 mi de un

d) Materiales de uso Específico: permiten realizar alguna operación específica.

• Portaobjetos: lamina de vidrio transparente, rectangular utilizada para fijar muestras u

• Pro pipeta: utensilio de goma, creada especialmente para asegurar la transferencia de

Aparatos utilizados en el laboratorio de bacteriología clínica

• Refrigerador: su utilidad es la conservación de reactivos y medios de cultivos. La

• Balanza Granataria: Instrumento de precisión para pesar los medios de cultivos y

La autoclave esteriliza diversos materiales empleados en actividades de diagnóstico,

En el laboratorio clínico específicamente, la autoclave se utiliza con el fin de eliminar de forma

• Campana de Flujo Laminar (CFL) o Cabina de Seguridad Biológica (CBS): es un

• Incubadora: es un aparato diseñado para mantener una cámara a temperatura,

Microscopio de luz visible.

40 significa el número de aumentos, la apertura numérica es de 0.65, mientras que 160 mm

Identifica el material y aparatos pertenecientes al laboratorio de bacteriología para brindarles