INMUNODIAGNÓSTICO

TÉCNICAS Y MÉTODOS SEROLÓGICOS

 Introducción
El organismo dispone de un sistema de defensa inespecífico que le permite defenderse de los
patógenos externos en ausencia de un contacto previo con ellos (en ausencia de
reconocimiento), y de un sistema de defensa específico, más desarrollado y sofisticado, que le
permite defenderse con eficacia frente a los microorganismos y que exige para su desarrollo de
un reconocimiento previo del agente. Este segundo mecanismo de defensa puede adquirirse por
contacto con el agente o sus antígenos a través de una infección, por inoculación voluntaria
(vacunación) o por administración de anticuerpos preformados en otro organismo (anticuerpos
maternos transferidos a través de la placenta o por administración de sueros hiperinmunes). Esta
respuesta es específica y con capacidad de distinguir entre lo propio y extraño; en las ocasiones
en las que existe conflicto en este reconocimiento aparece la enfermedad autoinmune. La
respuesta es mas o menos persistente y capaz, además, de dejar recuerdo de este su primer
contacto con el antígeno (memoria inmunológica) que le permitirá reaccionar de forma más
eficaz y violenta en las exposiciones posteriores al mismo antígeno.

El hecho de que el organismo disponga de una respuesta inmune específica no solo capacitará
para defenderse de esos agentes sino que nos permitirá conocer en muchos casos la presencia
de una enfermedad infecciosa; esta es la base del diagnóstico microbiológico indirecto. La
denominación de indirecto se refiere a que el diagnóstico no se hace por aislamiento e
identificación del microorganismo causante de la infección, sino a través de la respuesta del
huésped, es decir, de forma indirecta.
 Bases del diagnóstico indirecto
Para comprender mejor las bases del diagnóstico indirecto conviene recordar las bases fundamentales
de la respuesta inmune: Distinción entre propio y extraño, especificidad y memoria. Mientras que la
primera hace mención a que el sistema inmune no debiera responder en condiciones normales frente a
sus propias sustancias, las otras dos propiedades son de la mayor importancia para comprender el
diagnóstico indirecto.
• La especificidad es la propiedad que permite al sistema inmune responder frente al agente externo
que la provocó y que esa respuesta no afecte a otros antígenos, incluso a aquellos que pudiesen tener
un parecido molecular (reacción cruzada). Cuanto más específica y afin sea esa respuesta más
efectiva será su unión al agente provocador. La persistencia de esos anticuerpos varia en el tiempo y
ello depende de muchos factores: Estímulo inicial, reinfecciones subclínicas repetidas etc.; por ello
encontrar anticuerpos frente a un determinado antígeno nos harásuponer de forma indirecta que el
organismo tiene o ha tenido contacto con él o con antígenos de su procedencia.
• La memoria inmunológica permite que el sistema inmune recuerde haber tenido contacto previo
con un antígeno y responda frente a él de forma anamnésica. Esta respuesta será más rápida y
violenta, uniéndose al organismo una gran concentración de anticuerpos en muy poco tiempo. Esta
propiedad es la base fundamental de la eficacia de las vacunas.
La memoria inmunológica supone, sin embargo, un serio inconveniente a la hora de utilizar la
respuesta inmune para el diagnóstico indirecto de una infección. En efecto, el mantenimiento de una
cierta concentración de anticuerpos durante largo tiempo nos dificulta, con algunas técnicas, conocer
si esos anticuerpos específicos que encontramos en el suero del enfermo han sido provocados por una
infección actual y/o reciente, o son restos persistentes de una infección antigua y curada. Actualmente
se disponen de mecanismos para poder discriminar entre estas dos tipos de situaciones, como veremos
a continuación.
 La respuesta inmune y el diagnóstico serológico
Cuando un individuo se pone en contacto con un antígeno por primera vez ocurren los siguientes
fenómenos que se relacionan con el diagnóstico serológico.
1. Aparición precoz de anticuerpo específico de clase IgM . La concentración de este anticuerpo
no es muy alta y su persistencia es generalmente corta. Su detección se identifica habitualmente
con infección aguda, aunque en algunas infecciones se correlaciona no solo con la fase temprana
de la enfermedad sino también con la actividad de la misma en estadíos crónicos (Hepatitis B,
delta). Este marcador no es siempre detectable en la fase aguda de la infección.

2. Aparición algo más tardía de anticuerpo específico de clase IgG. La concentración de este
anticuerpo va creciendo hasta alcanzar, en 3-6 semanas, una meseta que muy lentamente
desciende. Su persistencia suele ser muy prolongada, mucho mas allá de la curación del enfermo y
en ocasiones es detectable durante toda la vida. Este hecho de mantenerse positiva después de la
curación limita su interpretación cuando se detecta aisladamente. Estos dos datos relativos a la
respuesta inmune nos permiten un uso más apropiado para el diagnóstico. Efectivamente, la
detección de IgM específica a unas concentraciones determinadas y dada la brevedad de su
duración nos faculta para realizar un probable diagnóstico de la infección aguda. Por otra parte, la
observación de un incremento en la concentración de IgG específica en dos muestras separadas en
el tiempo - una en fase aguda y otra convaleciente (habitualmente dos semanas) - nos indica la
presencia de un estímulo antigénico en ese momento, o lo que es lo mismo, la existencia de una
infección aguda. Este incremento en la concentración de anticuerpos específicos cuando
comparamos dos muestras de suero en un paciente recibe el nombre de seroconversión, y para
buscarla, el estudio se realizar&aacte; con dos muestras de suero del mismo enfermo con objeto
de comprobar el aumento de la concentración de anticuerpos.
 Necesidad del diagnóstico indirecto
Existen situaciones en las que el diagnóstico indirecto se hace indispensable.
Estas son:
1) Los cultivos, en ocasiones, pueden ser negativos si las muestras se obtienen
después del tratamiento o porque el virus no es cultivable.
2) El aislamiento del patógeno puede ser imposible si la muestra se tomó tarde
cuando el agente ya no se elimina.
3) En algunas fases subagudas de la enfermedad los microorganismos son
difícilmente recuperables.
4) La interpretación de un aislamiento puede ser conflictiva cuando existe el estado
de portador sano que puede eliminarlo durante bastante tiempo después de la
fase aguda.
5) En casos atípicos o asintomáticos
6) En los aislamientos mixtos en los que es difícil predecir cuál es el agente
etiológico causal.
 Utilidad de los estudios serológicos
Los estudios serológicos pueden emplearse fundamentalmente para:
1.- Estudios de diagnóstico
Aunque el diagnóstico directo tiene muchas ventajas, existen situaciones
en las cuales éste no es posible o es muy caro. En general se trata de
infecciones víricas de aislamiento difícil o no víricas pero de patógeno
difícilmente cultivable o no cultivable. En estos casos, el diagnóstico
indirecto puede darnos a conocer la etiología de la infección.
2.- Estudios epidemiológicos
La demostración del estado inmunitario de una población con respecto a
uno o varios patógenos puede hacerse fácilmente mediante este tipo de
diagnóstico. El estudio retrospectivo de los anticuerpos presentes nos
indicará la prevalencia de este microorganismo/s en dicha población y
dependiendo de su distribución etaria la conveniencia o no de establecer
campañas de vacunación
 Elección de una prueba serológica.
Sensibilidad-especificidad
La incorporación de una técnica nueva a un laboratorio clínico debe de estar precedida de
estudios de evaluación. Una prueba serológica se evalúa, fundamentalmente, por los
parámetros de sensibilidad , especificidad y valor predictivo. Del conocimiento de estos tres
valores intrínsecos de la misma se deducirá su aplicación o no en determinadas circunstancias
y como deberá interpretarse su resultado ya sea positivo o negativo.

La medida de la sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que

están en la situación que queremos diagnosticar. Cuantos más resultados positivos produzca
en este grupo de enfermos mas sensibilidad tendrá la prueba y menos resultados falsos
negativos (FN) obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos
positivos (VP) que son detectados en individuos con esa enfermedad y esa técnica. En
serología es difícil tener pruebas con el 100% de sensibilidad y casi todas producen algún
resultado negativo falso.
La especificidad se mide, por el contrario, realizando la prueba en colectivos de personas que
no padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La especificidad por tanto se
define como el porcentaje de verdaderos negativos que serán detectados en pacientes sanos
con esa prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de
resultados negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serológicas
con especificidades casi del 100%. Estos dos parámetros son propiedades intrínsecas del test
y no varían nunca con relación a la población estudiada.
 Técnicas rápidas y automatización
El laboratorio de serología, encuadrado en el Servicio de Microbiología Clínica, es el encargado de realizar el
diagnóstico indirecto a través de una tecnología que ha evolucionado en el estudio y diagnóstico de las enfermedades
infecciosas muy rápidamente; la aparición de los anticuerpos monoclonales fue el eje sobre el que este cambio
comenzó a producirse. La producción controlada de anticuerpos más específicos y de mayor afinidad hicieron posible,
por una parte la mejoría de las técnicas ya existentes (IFI, Latex, Hemaglutinación etc) y por otra la aparición de
microtécnicas, (RIA, ELISA, etc.), que utilizan pequeños volúmenes de muestra para su realización. La unidad de
volumen pasóde ser el mililitro (ml) al microlitro (µl), La disminución de los tamaños de todos los utensilios
de trabajo del laboratorio, ( pipetas, baños, aparición de placas de microtécnica, etc, etc.) ha precipitado igualmente
un cambio radical en las formas de trabajar en los mismos de tal manera que las técnicas de realización manual han
sido sustituidas, en su mayoría, por aparatos automáticos que permiten en priemr lugar el manejo de gran cantidad de
muestras y en segundo lugar la realización simultánea de gran número de pruebas y técnicas quedando los
procedimientos manuales relegados para realizar o pruebas individualizadas muy rápidas o aquellas de las que existe
poca demanda.
Desde siempre el inconveniente más importante que ha tenido el diagnóstico indirecto ha sido su falta de rapidez. Al
tiempo que tarda el organismo en formar los anticuerpos se le sumaba la tediosidad en tiempo de la realización
técnica. La llegada de la biología molecular ha puesto a nuestra disposición la posibilidad de producir antígenos
nativos lo que ha permitido una gran expansión del catálogo de pruebas diagnósticas disponibles en los últimos años y
por otro se ha mejorado mucho las pruebas permitiendo acortar sustancialmente los tiempos de realización de las
mismas. En la actualidad es muy rara la metodología que no pueda realizarse a lo largo de unas pocas horas o incluso
minutos y todas ellas con una calidad excelente. Todas pueden por tanto considerarse como técnicas cortas y aunque
es muy difícil de precisar en cuánto disminuye el coste de la enfermedad la celeridad y el significado diagnóstico de
un resultado serológico, sí es cierto que en muchas ocasiones elimina la práctica de otras exploraciones
complementarias y la aplicación más dirigida de los tratamientos. Esto hace del mismo un método nada despreciable,y
a veces único, a la hora de plantearse en clínica el diagnóstico etiológico de algunas enfermedades infecciosas.
 Técnicas rápidas y automatización
• Los laboratorios actuales orientan las técnicas manuales a la realización de pruebas
con poca demanda y por tanto no rentables para la automatización o aquellas que son
de muy corta realización. Entre estas encontramos las comúnmente conocidas como
pruebas de Látex, aglutinación en tubo o porta, inmunofluorescencia y algunas
pruebas enzimáticas con soporte de micropartículas en las que el resultado de la
reacción adopta formas significativas cuando la reacción es positiva.En general estas
pruebas tienen una sensibilidad excelente cuando las comparamos con las de
referencia lo que ha permitido incorporarlas a las pequeñas unidades de Diagnóstico
Rápido de los Servicios de Microbiología. Las pruebas que pueden automatizarse se
realizan mediante máquinas robots. El ideal de estas máquinas es el evitar cualquier
trabajo manual, ganar en seguridad y disminuir la penosidad en el trabajo. La
seguridad se obtiene al evitar en lo posible los errores humanos ya que por lo general
estas máquinas identifican las muestras mediante códigos de barras, la diluyen si es
necesario, la dispensan y realizan la incubación y lectura con interpretación de los
resultados si han sido programadas por el facultativo. Pueden trabajar con un número
ilimitado de sueros si el diseño es de carga continua. La mayoría de ellas están
programadas para realizar simultáneamente diferentes determinaciones a una sola
muestra. Esta capacidad multiparamétrica capacita a los laboratorios para la
realización diaria de una gran cantidad de determinaciones en corto intervalo de
tiempo, con el inconveniente de que en muchos casos las pruebas no pueden
personalizarse.
 Interpretación de los resultados
• La expresión del resultado serológico puede ser de diferente forma dependiendo del fin para el que va a ser
utilizado. Si es epidemiológico bastará, casi siempre, una expresión cualitativa indicando si existen o no
anticuerpos.
• Métodos cuantitativos: Concepto de "título de un suero"
• En muchas ocasiones interesa conocer no sólo si el paciente tiene o no anticuerpos frente a un/unos patógenos
determinados sino qué concentración o tasa de ellos tiene. Esto es útil ya que para muchas infecciones es posible
correlacionar la concentración con la situación clínica o decidir si aquella ha sido una respuesta eficiente como
resultado de una vacunación.
• Para ello, realizamos diluciones seriadas del suero que irán sucesivamente disminuyendo la concentración de
anticuerpos; el título del suero será la última dilución del suero que da una reacción positiva. Según esto, un suero
con un título 1/32 tendrá menos anticuerpos que un suero con un título 1/256.
• Se dice que un título es significativo cuando estadísticamente esa concentración, o una superior, se asocia con el
estado de enfermedad.
• Este método de expresión del resultado serológico ha sido empleado durante muchos años y es el método más
inteligible ya que la cifra se correlaciona rápidamente con su significado. Existe además mucha experiencia clínica
acumulada y definidos bastantes títulos significativos para muchas infecciones. En nuestra opinión, y siempre que
se pueda, los resultados de una prueba serológica deben ser expresados así ya que es, probablemente, la valoración
mejor interpretada en la clínica.
• Aún hoy se realizan pruebas cuantitativas cuyo sistema de medida es el título del suero. En general todas son
técnicas que se emplean en el diagnóstico desde hace mucho tiempo y que tienen ya una solvencia clínica más que
comprobada (fijación de complemento, aglutinación en tubo y porta, inmunofluorescencia, etc.). En otras ocasiones
el resultado se expresa en función de una curva que se construye cada vez y que tiene unos valores conocidos por
nosotros. Los resultados de cada muestra son obtenidos por comparación con los valores de la curva.
 Unidades e índices
• La aparición de técnicas con la ventaja de su muy alta sensibilidad (ELISA, RIA), ha introducido algún problema en la
expresión y cuantificación del resultado y, por tanto, en su interpretación. La medida del resultado se realiza mediante
Unidades Internacionales o Unidades Arbitrarias. Estos unidades se calculan comparando el valor obtenido con la muestra
problema con la de un patrón o muestra calibradora realizadas simultáneamente. Por definición el suero calibrador marca el
límite entre los valores positivos, clínicamente significativos, y los resultados negativos de tal manera que los valores
superiores al calibrador se consideran positivas y las inferiores al mismo negativas.
• Este sistema es criticable por varias razones: en primer lugar sólo existen definidas en la O.M.S. la unidad internacional de
anticuerpos IgG para Toxoplasma y Rubeola. En segundo lugar, la muestra calibradora se define de forma estadística en el
país fabricante de la prueba y los valores predeterminados pueden no ajustarse bien en la población que va a estudiarse;
esto supone en algunas ocasiones un reajuste de la calibración que no siempre es posible. En tercer lugar, el valor de la
muestra calibradora tiene un valor diferente dependiendo del fabricante. Estas variables hacen difícil el cambio de
metodologías ya que introducen factores de confusión para el clínico al cambiar los valores significativos.
• Para obviar este problema se ha propuesto expresar los resultados en forma de Indice. Se define este como la relación entre
el valor de la muestra problema y el del calibrador. De esta forma toda muestra con índice superior a 1 será clasificada
como positiva y si inferior como negativa. La ventaja de este método, una vez ajustado el calibrador, es que el valor
significativo siempre será el superior a la unidad y tanto mas positivo cuanto más elevado sea. La utilización del índice
como forma de expresión unificaría los resultados haciendo comparables las diferentes marcas entre sí.
• Sea cual sea el método seleccionado por el laboratorio para la expresión de los resultados nunca deberemos perder el
concepto de que el diagnóstico indirecto de certeza se basa en la demostración de la seroconversión mediante el estudio de
dos muestras seriadas (obtención de un aumento entre las dos muestras de al menos cuatro veces el título de anticuerpos o
un cociente entre 1,4 y 2 si se trata de unidades o índices). Otro método que avala la infección aguda es la demostración de
IgM específica siempre que estédemostrada la ausencia de persistencia de este marcador y la carencia de reacciones
cruzadas.
• Como norma general los anticuerpos de clase IgM se miden actualmente mediante técnicas de E.L.I.S.A. o técnicas de
alguna manera relacionadas con la Inmunofluorescencia. Los anticuerpos de clase IgG se miden mediante E.L.I.S.A e
igualmente por inmunofluorescencia. Cuando se trata de medir anticuerpos totales en general se realiza mediante técnicas
de aglutinación (en porta, tubo o placas de microtitulación) o mediante la Fijación del Complemento
 Perfiles serológicos
En la práctica diaria el diagnóstico indirecto se ha decantado, en los últimos años, por el
estudio de las muestras mediante perfiles serológicos. La lógica de estas agrupaciones,
similar a lo que realiza en el diagnóstico directo, descansa en que generalmente el
problema clínico requiere investigar varios patógenos como posibles agentes etiológicos,
como responsables de la patología del paciente. Las alternativas son pues explorarlos uno
a uno o simultáneamente. Obviamente la primera fórmula es más lenta y, probablemente,
más económica. La segunda es lo contrario y probablemente más eficaz desde el punto de
vista clínico. En ocasiones el perfil se divide en dos o tres niveles que se ejecutan
progresivamente según los resultados obtenidos en el nivel anterior. Este método de
perfiles no es nuevo, pero en la actualidad la disponibilidad comercial de muchos
antígenos y la automatización ha impulsado su utilización y a nosotros nos parece un
sistema bueno y eficaz para el diagnóstico dada la excelente relación entre coste, eficacia y
tiempo de respuesta diagnóstica. Esta filosofía de trabajo supone una organización
especial del laboratorio de tal suerte que la mayoría de las técnicas se realicen con una
frecuencia mayor a la requerida si se buscan patógenos de manera independiente.
Utilización clínica de los perfiles serológicos
Dependiendo de la clase de anticuerpos que ponga en evidencia la técnica empleada (IgG,
IgM o ambos) será necesario, como ya se citó en otra parte, el estudio de una o dos
muestras de suero realizadas, en este último supuesto, simultáneamente. En el caso de
detección de IgM una muestra extraída en la fase aguda será suficiente. En el supuesto de
que midan IgG o ambas clases es mandatorio el estudio seriado.
 ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ensayo por inmunoabsorción ligado a
enzimas)
Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se
detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar
un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en
ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos
con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su
vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la
enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite
medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la
muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular
está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el
procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de
variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de
volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los
pasos sucesivos y el resultado de la prueba.
• Dispositivos empleados en ELISA
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de
los orígenes hasta las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico
tratado, para aumentar su capacidad de adsorción (en su superficie) de
moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente claros que permitan
realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,
espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de
lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de
mayor capacidad —por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos—, adecuados
para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados
• Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas
seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de
un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las
longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los
lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la
lectura de una o pocas longitudes de onda; son la que se corresponden
con las necesarias para determinar la densidad óptica de los
cromógenos más comúnmente utilizados.
 Fases de un ensayo ELISA
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo
conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en
ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un
determinado período de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o
cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el
tiempo adecuado para que se dé la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un
falso negativo y disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la
superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los
pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario,
si se usa poco antígeno, esto dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa, se puede detectar
mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un
secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse
unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa, se incuba
con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una
cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar
los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es
inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando
un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-
anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y
anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos
negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en
forma de inmunocomplejos, se añade el sustrato enzimático, se incuba durante un tiempo estandarizado por cada casa
comercial, en el cual se producirá una reacción enzimática, luego se frena esta reacción mediante el uso de una solución
stop y se lee la densidad óptica mediante espectrofotometría.
 Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificación de un antígeno en solución,
la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la
determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.1​

• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las
soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del
mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).2​
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos
son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno
secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de
señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como
lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático
permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se
pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que
contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener en cuenta
para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida, no saldrá positiva si la titulación
de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la
concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es
suficiente como para dar una señal detectable.). El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la
presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el
núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen
anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar
anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.3​
• ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se
trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de
antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
• ELISPot. ELISpot es un método altamente sensible en la inmunología para enumerar las células
que producen una citoquina dada. Las células se estimularon en una placa de microtitulación
per-recubierta con un anticuerpo específico anti-analito. En respuesta a la estimulación, las
células liberan citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Después de una etapa de
lavado, que elimina las células de los pozos, la ubicación de citoquinas secretadas se visualiza
mediante un anticuerpo de detección marcado con enzima y su sustrato cromogénico
correspondiente. El resultado final es un conjunto de manchas de color, cada uno de los cuales
representa un área donde se había localizado una célula que secreta la citoquina. Existe un
método de ELISpot estándar y una variación denominada de células dendríticas DC-ELISpot
para la detección de las células tras la estimulación con oligopéptidos y antígenos de proteína,
respectivamente.
 Quimioluminiscencia
• Durante determinadas reacciones químicas, la luz generada por este
fenómeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las
mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a
la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del
sustrato cromógeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los
casos de la oxidación del compuesto luminol por peróxido de hidrógeno y
la enzima peroxidasa de rábano (HRP), que producen luz. La luz que se
genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de
sensibilizar una película fotográfica. La medición cuantitativa de la emisión
de luz puede hacerse mediante el uso de un luminómetro.
• La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromógenas
es la mejoría de la sensibilidad. En general, el límite de detección puede
aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromógeno por
uno que emita luz, y más de doscientas veces cuando se adicionan
agentes potenciadores.