UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS

INSTITUTO DE SERVICIOS Y LABORATORIO EN DIAGNOSTICO E
INVESTIGACIÓN EN SALUD

LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
INSTITUTO SELADIS

EVALUACIÓN “In vitro” DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO Y ANTIOXIDANTE

DE EXTRACTOS DE HOJAS DE Piper peltatum (Sipusipu) EN CÉLULAS
MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA Y MACROFAGOS RAW-
264.7

Tesis de Grado para obtener el Título de Especialidad

ELABORADO POR: Lic. ROSALIA LIMACHI VASQUEZ

ASESORA: Dra.: JACQUELINE CALLA DE MAGARIÑOS MSc, PhD.

LA PAZ-BOLIVIA
2021
En memoria a mi querida hermana
Viviana, por ser mi motivación, eterna
compañía, a mis hijos quienes hacen
que el sacrificio tengan el mejor
significado.
 AGRADECIMIENTO

Gracias Señor, porque cada día caminas con nosotros, por tu eterno amor.

A mi amado esposo Pablo, por brindarme su apoyo en todo momento, su comprensión

y su admirable amor durante esta etapa de mi vida, por ser mi compañero de vida y
llevar de la mano a nuestros preciosos hijos Vivian y Pablito.

A mi querida mamá Martha, por estar siempre a mi lado cuidando de mi a pesar de los
años y la distancia, por ser el mejor ejemplo de superación, dedicación y fortaleza.
Gracias mama, te amo eternamente.

A mi querdio papá Valentin, por ser siempre esa chispa de alegria, por enseñarme a
vivir y ser feliz con solo unos minutos.

A mi hermana Marleni, por sus cuidados de siempre, por ser parte de mis experiencias
más gratas de mi infancia, gracias por cuidar a tus pequeñas hermanas, por darme los
mejores sobrinos, Milan y Luisito.

A mi asesora, Dra. Jacqueline Calla de Magariños, por guiarme y compartir sus

conocimientos en el transcurso de mi investigación. Gracias por todos los años de
enseñanza, formación y paciencia que me tuvo, porque sus consejos y palabras de
aliento en momentos difíciles fueron la base en la conclusión del presente trabajo.

A la Dra, Karina Delgado, gracias por su apoyo y recomendaciones en la conclusión

del presente trabajo, por su apoyo y palabras de aliento en momentos dificiles, gracias
por su amistad.

A la Dra. Wendy Villarreal, por su gran colaboración en la conclusión de este trabajo.

Al Dr. Teddy Quispe, por su valiosa orientaciones y tiempo dedicado en la revisión de
este trabajo.

Al instituto SELADIS, por ser el principio de una gran historia, con grades formadores
profesionales en las diferentes áreas. Al laboratorio de Inmunología, por brindarme la
oportunidad de un gran logro, por ser el significado de experiencias llena de gratitud,
alegrías y compañerismo, lo mas parecido a un hogar. A mis amigos y compañeros
del laboratorio, por su apoyo incondicional y brindarme palabras de aliento y cariño
fraternal para continuar, gracias por todo!!!
 INDICE GENERAL
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
2 MARCO TEORICO ................................................................................................ 3
2.1 Plantas medicinales ......................................................................................... 3
2.2 Generalidades de la Familia Pipereceae ...................................................... 4
2.3 Características del género Piper ................................................................... 4
2.4 Distribución geográfica del genero Piper .................................................... 4
2.5 Piper peltatum (P. peltatum) “Sipusipu” ...................................................... 5
2.5.1 Características Botánicas .......................................................................... 5
2.5.2 Hábitat ...................................................................................................... 7
2.5.3 Clasificación taxonómica de la especie P. peltatum .................................. 7
2.5.4 Usos medicinales ...................................................................................... 7
2.6 Metabolitos secundarios aislados en el género Piper ............................... 8
2.6.1 4-nerolidilcatecol (4-NC)............................................................................ 8
2.6.2 Compuestos fenólicos ............................................................................... 9
2.6.3 Flavonoides............................................................................................. 10
2.6.4 Fitoesteroles ........................................................................................... 12
2.7 EL SISTEMA INMUNITARIO .......................................................................... 12
2.7.1 La respuesta inmunitaria ......................................................................... 13
2.8 LA INFLAMACIÓN .......................................................................................... 22
2.8.1 Tipos de inflamación ............................................................................... 24
2.8.2 Inflamación aguda ................................................................................... 24
2.8.3 Inflamación crónica ................................................................................. 28
2.9 Células y mediadores implicados en el proceso inflamatorio ................ 28
2.9.1 Polimorfonucleares (PMNs) .................................................................... 28
2.9.2 Fagocitos mononucleares ....................................................................... 29
2.10 Mediadores químicos de la inflamación ..................................................... 32
2.11 Citoquinas ....................................................................................................... 37
2.12 Actividad antioxidante ................................................................................... 39
2.12 Especies reactivas de oxigeno (ERO) ...................................................... 40
2.12.2 Daño o estrés oxidativo .......................................................................... 40
2.12.3 Relación entre el estrés oxidativo y la inflamación. ................................ 42
3 ANTECEDENTES ............................................................................................... 43
4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................... 46
5 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 47
5.1 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ................................................................. 48
 6 OBJETIVOS ........................................................................................................ 48
6.1 Objetivo general ............................................................................................. 48
6.2 Objetivos específicos .................................................................................... 48
7 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................... 49
7.1 Diseño de la investigación............................................................................ 49
7.1.1 Lugar de estudio ..................................................................................... 49
7.1.2 Tipo del estudio ....................................................................................... 49
7.1.3 Tamaño de la muestra ............................................................................ 49
7.1.4 Comprobación e Identificación taxonómica del material vegetal ............. 49
7.1.5 Reactivo biológico: .................................................................................. 49
7.2 Materiales, reactivos y equipos ................................................................... 49
7.2.1 Materiales ............................................................................................... 49
7.2.2 Reactivos ................................................................................................ 50
7.2.3 Equipos ................................................................................................... 50
7.1. PROCEDIMIENTO ........................................................................................... 51
7.1.1. Recolección del material vegetal ............................................................. 51
7.1.2. Limpieza y desinfección del material vegetal........................................... 51
7.2. Preparación de los extractos ....................................................................... 52
7.2.1. Extracto etanólico de P. peltatum (EEP) ................................................. 52
7.2.2. Extracto acuoso de P. peltatum (EAP) .................................................... 52
7.3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana
(PBMC-humana) ........................................................................................................ 54
7.4. Ajuste de la densidad celular ....................................................................... 55
7.5. Viabilidad celular ............................................................................................ 56
7.6. Test de Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil tetrazol MTT 57
7.7. Evaluación de citoquinas en sobrenadantes de PBMC-humana ........... 58
7.8. Determinación de la actividad antioxidante ............................................... 59
7.9. Producción de óxido nítrico en la línea celular RAW 264.7 .................... 59
7.10. Ensayo de decoloración del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH*) 60
8. RESULTADOS .................................................................................................... 63
8.1. Ensayo de citotoxicidad ................................................................................ 63
8.2. Efecto del EEP y EAP sobre la proliferación en PBMC-humana ............ 66
8.3. Efecto del EEP y EAP en la producción del IFN-γ en PBMC-humana bajo el
estímulo de fitohemaglutinina (FHA) ..................................................................... 67
8.4. Efecto del EEP y EAP en la producción del IFN-γ en PBMC-humana sin
estimulo...................................................................................................................... 68
8.5. Efecto del EEP y EAP en la producción de la IL-10 en PBMC-humana bajo
el estímulo de FHA. .................................................................................................. 69
8.6. Efecto del EEP y EAP en la producción de la IL-10 en PBMC-humana sin
estimulo...................................................................................................................... 70
8.7. Efecto de los extractos sobre la producción del óxido nítrico (NO)...... 71
8.8. Actividad antioxidante ................................................................................... 73
9. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 79
10. CONCLUSIONES ............................................................................................ 84
11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 86
ANEXOS ..................................................................................................................... 97
 INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución geográfica del género Piper.................................................... 5
FIgura 2. Estructura de Piper peltatum ....................................................................... 6
Figura 3. hojas de Piper. peltatum .............................................................................. 6
Figura 5. Estructura básica del 4-Nerolidilcatecol ..................................................... 9
Figura 6. Compuesto fenólico ..................................................................................... 9
Figura 7. Acción de los compuestos fenólicos frente a los radicales libres .......... 10
Figura8 . Estructura básica de los flavonoides (fenilbenzopirano) ......................... 11
Figura 9. Componentes celulares del sistema inmunitario innato y adaptativo ..... 14
Figura 10. Los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) ......................... 15
Figura 11. Las células T vírgenes pueden sufrir activación y polarización hacia
distintas subpoblaciones de células Th ..................................................................... 19
Figura 12. El proceso inflamatorio ............................................................................ 23
Figura 13. Los neutrófilos migran desde los vasos sanguíneos a los sitios de infección
..................................................................................................................................... 27
Figura 14. Estructura básica de la prostaglandina E2 ............................................. 33
Figura 15. Estructura básica del leucotrieno LTB4................................................... 34
Figura 16: Estructura básica de la lipoxina B4......................................................... 34
Figura 17. Síntesis del óxido nítrico .......................................................................... 35
Figura 18. Los mecanismos moleculares y celulares de la inmunidad innata y
adquirida...................................................................................................................... 36
Figura 19. Recolección de las hojas de Piper. peltatum ......................................... 51
Figura 20. Diagrama de estado del agua ................................................................. 53
Figura 21. Muestra diluida sobre ficoll Hypaque. ..................................................... 54
Figura 22. Muestra centrifugada con ficoll Hypaque ............................................... 55
Figura 23. Cámara de neubauer ............................................................................... 55
Figura 24. Reacción química de MTT (aguilar 1996) .............................................. 57
Figura 25. estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante
..................................................................................................................................... 61
 INDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Representación gráfica de la actividad citotóxica del extracto etanólico en

PBMC-humana. .......................................................................................................... 64
Gráfica 2. Representación gráfica de la actividad citotóxica del extracto acuoso en
PBMC -humana .......................................................................................................... 65
Gráfica 3. Efecto del EAP. y EEP. Sobre la proliferación en PBMC -humana ....... 66
Gráfica 4. Producción del IFN-γ en PBMC -humana estimuladas con FHA y tratada
con EA y EE de P. peltatum ....................................................................................... 67
Grafica 5. La producción de IFN-γ sólo en PBMC -humana y tratadas con EA y EE de
P. peltatum .................................................................................................................. 68
Grafica 6. Producción de la IL-10 en PBMC -humana estimuladas con FHA tratadas
con EA y EE de P. peltatum ....................................................................................... 69
Grafica 7. Producción de la IL-10 en PBMC -humana sin estímulo y tratadas con EA y
EE de P. peltatum ....................................................................................................... 70
Grafica 8. Efecto de los extractos sobre la producción de nitritos totales por
macrófagos murinos raw 264.7 ................................................................................. 72
Gráfica 9. Curva de la concentración inhibitoria media del ácido ascórbico en la
actividad antioxidante. ................................................................................................ 74
Gráfica 10. Porcentaje de captación de radicales a diferentes concentraciones del EE
liofilizado de hojas de P. peltatum. ............................................................................ 75
Gráfica 11. Curva de la concentración inhibitoria media del EE de hojas de P peltatum
en la actividad antioxidante. ....................................................................................... 76
Gráfica 12. Porcentaje de captación de radicales a diferentes concentraciones del EA
de hojas de P. peltatum.............................................................................................. 77
Gráfica 13. Curva de la concentración inhibitoria media del EA de hojas de P.
peltatum en la actividad antioxidante. ....................................................................... 78
 LISTA DE ABREVIATURAS

EEP Extracto etanólico de Piper peltatum.

EAP Extracto acuoso de Piper peltatum.
FHA Fitohemaglutitina
4-NC 4- Nerolidilcatecol
ROS Especies Reactivas de Oxigeno
NF-kB Factor Nuclear Kappa
LTB4 Leucotrieno B4
NK Natural killer
NO Óxido nítrico
PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos
DAMPs Señales endógenas asociadas al daño tisular
PRRs Receptores de reconocimiento de patrones
PBMC Células mononucleares de sangre periférica humana
TLR Receptores de Tipo Toll
CD Células dendríticas
APC Células presentadoras de antígenos
MHC Moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
LT Linfocitos T
LB Linfocitos B
IL-2 Interleucina 2
IL-12 Interleucina 12
IL-10 Interleuquina 10
IFN-γ Interferón gamma
TGF-β Factor de necrosis transformador β
LPS Lipopolisacarido
IgM Inmunoglobulina M
PMN Polimorfonucleares
SIRS Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido
OH Radical oxhidrilo
H2O2 peróxido de hidrogeno
FNLP Formil neoleucil-leucil-fenilalanina
AA Acido araquidónico
LTA leucotrieno A
NOS2 Óxido nítrico sintetasa
nNOS Óxido nítrico neuronal
eNOS Óxido nítrico endotelial
NO2¯ Nitrito
NO3¯ Nitrato
O∙2¯ Radical anión superóxido
O2 Oxígeno singlete
FLA2 Fosfolipasa A2
COX2 Ciclooxigenasa tipo 2
NK Células asesinas naturales
TGF-β Factor β de crecimiento tumoral
TNF-α Factor α de necrosis tumoral
NFκB Factor de transcripción nuclear kappa B
iNOS Enzima óxido nítrico sintasa inducida
PG Prostaglandina
TX Tromboxano
DL50 Dosis letal 50
DPPH Radical 1,1-Difenil-2-picril hidrazilo
EDTA Acido etilendiaminotetracetico
OMS Organización Mundial de la Salud
IL-13 Interleucinas 13
Ig E Inmunoglobulina E
FMLP Formil-metionil-leucil-fenilalanina
FNLP Formil neoleucil-leucil-fenilalanina
PMN Polimorfonucleares
ADP Adenosin difosfato
COX Ciclooxigenasa
DMSO Dimetil Sulfoxido
MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
PBS Solución Amortiguadora de Sales de Fosfato
RAW264.7 Línea celular de Macrófagos Murinos
SFB Suero Fetal Bovino
Th: Células T Colaboradoras (del inglés T-Helper).
RESUMEN
La especie de Piper peltatum conocido popularmente como “Sipusipu” en el norte del
departamento de La Paz-Bolivia, es utilizado de forma empírica para disminuir la
inflamación, por lo que es considerada como una fuente potencial de compuestos
bioactivos con actividad antiinflamatoria, antioxidante y antimicrobiana. El género
Piper ha sido ampliamente estudiado a nivel mundial y en tanto la medicina tradicional
ofrece ciertas ventajas relacionadas con su efectividad, baja toxicidad, costo reducido
y sea de fácil accesibilidad es importante profundizar dichos estudios. Es por eso que
el objetivo de la presente investigación fue verificar el efecto de los extractos de Piper
peltatum sobre la producción de IFN-γ e IL-10, citoquinas clave en los procesos
inflamatorios, así también se evaluó la actividad antioxidante y la actividad sobre el
óxido nítrico (NO) en macrófagos Raw 264.7.
Para esto, se preparó extracto etanólico de Piper peltatum (EEP) y extracto acuoso
Piper peltatum (EAP). Se realizaron pruebas de citotoxicidad, a través del Test de
Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil tetrazol (MTT). El IFN-γ y la IL-10 se
evaluaron en los sobrenadantes del cultivo de células mononucleares por un análisis
cuantitativo, Elisa tipo sándwich. El NO fue medido utilizando la reacción de Peter
Griess y la actividad antioxidante mediante el ensayo radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH*), método de captación de radicales libres.
Los resultados mostraron que el EEP y EAP no presentan actividad citotóxica a
concentración menor o igual a 10 μg/ml, concentración que no afectó la viabilidad
celular, pero estimuló significativamente la producción de
IFN-γ con una relación dosis-dependiente de la concentración del extracto, así mismo
inhibió la producción de la IL-10 en células previamente estimuladas con
fitohemaglutinina (FHA). Los extractos no presentan actividad antioxidante a dosis de
10 μg/ml o menor. Sin embargo, se observó una reducción de la producción de NO.
Los hallazgos sugieren que los metabolitos secundarios presentes en la especie Piper
peltatum modulan la respuesta inmunitaria innata a través del estímulo de la
producción de IFN-γ y la inhibición de la producción de la IL-10. Por tanto, son
necesarias futuras investigaciones de cada metabolito presente en la especie Piper
peltatum y definir sus funciones específicas en la inflamación.
ABSTRACT
The Piper peltatum species popularly known as "Sipusipu" in the north of the
department of La Paz-Bolivia is used empirically to reduce inflammation, so it is
considered a potential source of bioactive compounds with anti-inflammatory,
antioxidant and antimicrobial. The Piper genus has been widely studied worldwide and
while traditional medicine offers certain advantages related to its effectiveness, low
toxicity, low cost and easy accessibility, it is important to deepen these studies. That is
why the objective of this research was to verify the effect of Piper peltatum leaf
extracts on the production of IFN-γ and IL-10, key cytokines in inflammatory
processes, as well as the antioxidant activity and the activity on nitric oxide (NO) in
macrophages Raw 264.7.
For this, ethanolic extract (EEP) and aqueous extract (EAP) were prepared.
Cytotoxicity tests were performed, through the reduction of MTT. IFN-γ and IL-10 were
evaluated in mononuclear cell culture supernatants by quantitative sandwich ELISA
analysis. Nitric oxide (NO) was measured using the Peter Griess reaction and
antioxidant activity using the free radical scavenging method (DPPH).
The results showed that EEP and EAP do not present cytotoxic activity at a
concentration less than or equal to 10 μg/ml, a concentration that did not affect cell
viability, but significantly stimulated the production of IFN-γ with a dose-dependent
relationship of the concentration of the extract, likewise inhibited the production of IL-
10 in cells previously stimulated with FHA. The extracts do not show antioxidant
activity at doses of 10 μg/ml or less. However, a reduction in NO production was
observed.
The findings suggest that the secondary metabolites present in the Piper peltatum
species modulate the innate immune response through stimulation of IFN-γ production
and inhibition of IL-10 production. Therefore, future investigations of each metabolite
present in the Piper peltatum species and defining their specific functions in
inflammation are necessary.
1 INTRODUCCIÓN

El uso empírico de las plantas medicinales como agente antiinflamatorio, antiviral,

antibiótico y antioxidante se ha incrementado en las últimas décadas (WHO, 2004). El
interés de utilizar las plantas en la medicina tradicional ha permitido el descubrimiento
de tratamientos terapéuticos a partir de compuestos bioactivos que sirven también
como precursores sintéticos de medicamentos.

En la actualidad, Bolivia utiliza diferentes plantas medicinales para la atención primaria

de salud en comunidades rurales y urbanas, donde los conocimientos tradicionales se
han transmitido por generaciones de forma empírica. Bolivia es uno de los 11 países
con mayor biodiversidad vegetal, incluye aproximadamente unas 5.000 especies con
propiedades medicinales (De Oca, 2005), de las cuales solo un porcentaje reducido
cuenta con estudios farmacológicos.

Dentro de esta amplia gama de especies vegetales, existe una gran variedad de
plantas pertenecientes a la familia Piperaceae tanto en número de especies como en
su diversa actividad biológica caracterizada por sus propiedades insecticida,
antibacteriana, antiinflamatoria, antioxidante, antiparasitaria y anticancerígeno (Parmar
& Jain, 1997). La especie Piper peltatum, conocida popularmente como “Sipusipu” en
algunas regiones de la amazonia boliviana, es utilizada como antiinflamatorio, también
se le atribuye la actividad diurética, antirreumática, antipirética y como un importante
antioxidante por la presencia de alcaloides (Parmar & Jain, 1997)

Diferentes enfermedades, donde la respuesta inmunológica es ineficaz, exagerada o

que actúa contra el propio organismo, han dirigido la búsqueda de plantas naturales
con actividad inmunomoduladora, que puedan estimular, inhibir o intensificar la
participación de factores celulares y humorales en la respuesta inmunitaria.

Se ha reportado que plantas con propiedades antiinflamatoria y citotóxica, con

compuestos activos tienen la capacidad de regular la respuesta inmunitaria en
ensayos in vitro e in vivo modulando la actividad de los linfocitos, incrementando o

1
disminuyendo la liberación de moléculas inflamatorias como la interleuquina 10 (IL-10)
y el interferón gamma (IFN-γ) (Peris & Gómez, 2011).

El estrés oxidativo y los fenómenos inflamatorios se relacionan fisiopatológicamente

en varias afecciones, entre las cuales se incluye el cáncer, la aterosclerosis y la
diabetes, así como en condiciones fisiológicas como el envejecimiento, durante el
curso del estrés oxidativo se liberan múltiples especies reactivas de oxígeno y de
nitrógeno que son importantes en el papel de la patogénesis de las enfermedades
inflamatorias (Mahendran & Narmatha, 2013).

El objeto de estudio de la presente investigación es evaluar la actividad

antiinflamatoria in vitro y el efecto antioxidante del extracto acuoso y etanólico de la
especie Piper peltatum. Los resultados permitirán verificar su potencial medicinal con
un soporte científico, con el fin de respaldar el uso tradicional de la planta en nuestro
medio y plantearla como una alternativa de tratamiento de fácil accesibilidad.

2
2 MARCO TEORICO

2.1 Plantas medicinales

El uso de las plantas medicinales es tan viejo como la humanidad, sin embargo, es
hacia el año 1865, cuando el doctor Auguste Soins define con el termino fitoterapia la
terapia que utiliza las plantas medicinales (Berdonces, 2003). La medicina tradicional
fue el único recurso del que disponían los médicos, esto hizo que las primeras culturas
en su afán de bienestar y prosperidad empezaran a adquirir conocimientos empíricos
sobre la utilización de plantas para curar sus enfermedades (Oliveira, Vásquez, &
Bermudez, 2005).

Con el desarrollo de las primeras civilizaciones, el uso de la medicina tradicional

empieza a trasmitirse de generación en generación (Oliveira, Vásquez, & Bermudez,
2005). Es así que la Organización Mundial de la Salud (OMS) dentro del Programa de
Enfermedades Tropicales ha considerado la investigación de plantas utilizadas para el
tratamiento de diferentes enfermedades, como esencial y de alta prioridad (Geneva,
2000).

Si bien en la actualidad la medicina moderna está desarrollada en la mayor parte del

mundo, las plantas medicinales constituyen un recurso valioso en los sistemas de
salud principalmente en los países en desarrollo. Aunque no existen datos precisos
para evaluar la extensión del uso global de plantas medicinales, la OMS ha estimado
que aproximadamente el 60-80% de la población mundial todavía depende de la
medicina tradicional para la atención primaria de la salud (Farnsworth 1985, Akerelo
1993, & WHO 2002).

En Bolivia, la biodiversidad de las plantas está ampliamente distribuida en los bosques

amazónicos (Rojas, 2013), enmarca aproximadamente 5.000 especies vegetales
propias del país, muchas de ellas han sido aprovechadas y utilizadas tradicionalmente
por los pueblos originarios y cumplen una importante función en la salud de los
mismos (De Oca, 2005).

3
2.2 Generalidades de la Familia Pipereceae

El nombre de la familia Pipereceae corresponde con el del genero Piper, descrito por
Carolus Linnaeus en 1753. Constituye una de las familias más grandes y antiguas en
la historia de la humanidad (Soto, 2015).

La familia Piperaceae se caracteriza principalmente por ser arbustos y rara vez como
árboles, lianas o epifitos de hojas alternas, enteras, simples a menudo con glándulas
de aceites aromáticos, en ocasiones algo carnosas. Presentan flores pequeñas,
bisexuales o unisexuales, dispuestas en espádices o espigas opuestas a las hojas,
presentan de 1-10 estambres y carecen de pétalos, con fruto en baya carnosa con
una sola semilla (Soto, 2015).

2.3 Características del género Piper

La familia Piperaceae comprende 14 géneros y aproximadamente entre 1950 a 2000

especies, los especímenes de Piper son esporádicos en su ambiente natural,
numerosas especies son arbustos, hierbas o bejucos, a veces epifitas, las partes
vegetativas a menudo presentan aroma cuando son estrujadas (Quijano, Callejas, &
Miranda, 2006).

La escasa generación natural y la perdida rápida de la viabilidad de las semillas de

Piper la hacen una especie de flora muy particular, de importancia creciente por sus
propiedades biológicas para realizar estudios de investigación aplicada (Delgado,
Garcia, Ybarra, Luna, & Martinez, 2012).

2.4 Distribución geográfica del genero Piper

Los patrones de distribución de las especies de Piper varían desde especies

endémicas hasta aquellas que presentan una amplia distribución geográfica
(Jaramillo, 2006). El género Piper se encuentra en regiones tropicales y subtropicales
del mundo, la gran mayoría de las cuales se encuentran en los trópicos de América (>
700 especies), seguido por las del Sur de Asia (> 300 especies).

4
Entre las especies correspondiente a la familia Piperaceae: Piper y Peromia son los
géneros más abundantes con 700 y 600 especies, respectivamente (Danelutte A. ,
Lago, Young, & Katto, 2003).

Figura 1. Distribución geográfica del género Piper.

http://www.thecompositaehut.com/www_tch/webcurso_spv/familias_pv/piperaceae.

2.5 Piper peltatum (P. peltatum) “Sipusipu”

2.5.1 Características Botánicas

La especie de P. peltatum conocida popularmente con el nombre de “Sipusipu” en el

norte de La Paz- Bolivia, habita principalmente en bosques de tierras bajas o
matorrales húmedos y tropicales (De la Torre, Navarrete, Muriel, & Marcia, 2008).

P. peltatum se caracteriza por ser erecta y rígida, de 0.5 m. a 2 m. de altura,

escasamente ramificadas, los tallos diminutamente puberulentos y sus hojas son
enteras, suborbiculares, flácidas de 16 a 35 cm. de largo y de 14 a 34 cm. de ancho a
menudo peltadas, acorazonadas en la base con nervios en ambas caras, exhibe finos
puntos traslucidos con la venas palmeadas y el nervio central con uno o dos nervios
pennados a cada lado como se observa en la figura 2 (Mejia & Renfijo, 2000).

5
 Figura 2. Estructura de Piper. peltatum

Fuente: (Mejia & Renfijo, 2000)

Las flores de P. peltatum presentan la característica de encontrarse en espigas de

color blanco umbeladas sobre pedúnculos axilares, el pedúnculo más corto que el
pecíolo, de 1 a 7 cm. de largo y 4 mm de grosor, y el fruto es sub-globuloso en un
tamaño aproximado de 0.5 a 0.8 mm. (Mejia & Renfijo, 2000).

Figura 3: Hojas de Piper peltatum Figura 4: Flores de Piper peltatum

Fuente: Recolección propia. Fuente: Recolección propia.

6
2.5.2 Hábitat

En Bolivia se encuentran alrededor de 35 especies del género Piper. P. peltatum es

una de las especies más común en los bosques húmedos y en matorrales de tierras
bajas, especialmente en regiones tropicales desde 600 hasta los 1600 metros de
altitud (Tebbs, 1993). Es nativa de México, Centro América, las Antillas y Sudamérica
(Pinto, 2006).

2.5.3 Clasificación taxonómica de la especie P. peltatum

Reino Plantae

División: Magnoliophyta (Angiospermas)

Clase: Magnoliopsida (Dicotiledoneas)

Subclase: Magnoliidae

Orden: Piperales

Familia: Piperaceae

Género: Piper

Fuente: (Heywood, 1978).

2.5.4 Usos medicinales

La especie de P. peltatum tiene diferentes aplicaciones terapéuticas, es requerida por

su actividad antiinflamatoria, diurética y antipirética (Soto, 2015), analgésica y
antioxidante (Perazzo, y otros, 2005).

La parte más utilizada son las hojas y en ocasiones toda la planta. La planta actúa
como tónico estomacal, como remedio para edemas y escorbuto. Las hojas son
utilizadas para tratar enfermedades de la piel, para aliviar el dolor de cabeza, fiebre y
contusiones. Cuando es aplicada en forma de cataplasmas es utilizada como
emoliente madurativa del puchichi (Gupta, Santana, & Alex, 2000). El cocimiento de

7
las hojas alivia la inflamación de los testículos y otras inflamaciones como
hinchazones o forúnculos de la piel (Rivera, 2008).

Las hojas frescas de P. peltatum son aplicadas como emolientes para tratar
enfermedades del hígado, se dice que disuelve cálculos renales. Las hojas estrujadas
calentadas son aplicadas en tumores y úlceras, cura espasmos musculares, dolor de
estómago y baños de té de las hojas se usan como galactagogos (Cleaves, 2002).

En la medicina tradicional boliviana, peruana y brasileña las hojas de P. peltatum son

maceradas en agua y aplicadas en la zona inflamada o también en casos de cefalea y
fiebre. La cocción de la raíz es muy estimada como diurético, estimulante del sistema
linfático, tratamiento de ulceras y quemaduras de la piel (Breitbach, 2013).

2.6 Metabolitos secundarios aislados en el género Piper

Los estudios fitoquímicos de las especies del género Piper han conducido al
aislamiento de una amplia variedad de metabolitos secundarios, entre las que
destacan: los flavonoides, kavapirona, lignanos, neolignanos, piperolidos,
propenilfenoles, terpenos, fitoesteroles, amidas y el 4-nerolidilcatecol ubicados
parcialmente en semillas, hojas, corteza del tallos y raíz (Soto, 2015).

2.6.1 4-nerolidilcatecol (4-NC)

4-NC es un valioso producto natural que tiene importantes propiedades

antiinflamatoria, antipalúdica y antioxidante. 4-NC es el principal metabolito secundario
de los extractos de P. peltatum y P. umbellatum (Silva & Oliveira, 2013) .

La estructura química del 4-NC se describió por primera vez en un extracto de hexano
(Kijoa y col.1980), se encuentra en las raíces, hojas e inflorescencia, tiene importante
actividad antioxidante y antiparasitaria in vitro e in vivo (Silva & Oliveira, 2013). 4-NC
contiene derivados de catecol con propiedades antivirales denominados peltatol A, B y
C (Gustafson K. , 1992).

8
 Figura 5. Estructura básica del 4-nerolidilcatecol

Fuente: (Silva & Oliveira, 2013)

2.6.2 Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos presentan un anillo aromático, unido por lo menos a un

grupo oxhidrilo, relativamente polares, varían ampliamente en su estructura, se
encuentran en las plantas y se clasifican en diferentes tipos de grupos funcionales,
tales como: fenoles simples, fenoles ácidos, ácidos hidroxibenzoicos, cumarinas,
quinonas, lignanos y ligninas (Peñarrieta & Tejada, 2014).

Figura 6. Compuesto fenólico

Fuente: (Peñarrieta & Tejada, 2014)

Se han identificado más de 4000 compuestos polifenólicos, los cuales se han dividido
en dos grandes grupos los flavonoides y los no flavonoides, estos últimos incluyen a
las moléculas más sencillas como los ácidos fenólicos con esqueletos químicos de
seis carbonos. Los ácidos fenólicos presentan numerosas propiedades farmacológicas
como bactericidas, fungicidas, antivirales, protectores cardiovasculares, antioxidantes,

9
antiestrogénicos, antiinflamatorios, anticarcinógenos y antimutagénicos in vitro como
in vivo (Peñarrieta & Tejada, 2014).

Los polifenoles ejercen acciones de carácter antiinflamatorio sobre varios tipos

celulares, poseen un efecto modulador sobre la proliferación de linfocitos T y B
activadas, y normalmente este efecto es de tipo inhibidor (Peñarrieta & Tejada, 2014).
También afectan a otras células de la inflamación, como los macrófagos y neutrófilos
(Kim, 2004).

Una de las principales funciones de estos compuestos fenólicos es secuestrar

radicales libres, debido a la facilidad con la que el átomo de hidrógeno del grupo
hidroxilo aromático puede ser donado a la especie radical (Figura 7).

Figura 7. Acción de los compuestos fenólicos frente a los radicales libres

Fuente: (Kim, 2004).

2.6.3 Flavonoides

Los flavonoides tienen un esqueleto químico que consta de tres porciones, dos anillos
aromáticos (A y B) ligado a través de un anillo C de pirano (heterocíclico) oxigenado,
comparten un esqueleto común de difenil pirano (C6-C3-C6) los átomos de carbono
en los anillos C y A se enumeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2ʹ al 6.

10
 Figura 8. Estructura básica de los flavonoides (fenilbenzopirano)

Fuente: (Peñarrieta & Tejada, 2014)

Los flavonoides conforman el grupo más variado estructuralmente y están

ampliamente distribuidos en el género Piper. Dentro los principales tipos de los
flavonoides se aislaron las flavonas, flavanonas, chalconas y dihidrochalconas Las
diferentes clases de flavonoides difieren en el nivel de oxidación y la sustitución de
grupos en el anillo C, mientras los componentes individuales dentro de una clase
difieren en la sustitución en los anillos A y B (Moreira & Spitzer, 2000).

Entre los mecanismos propuestos para explicar los beneficios de los flavonoides para
la salud se encuentra la actividad antioxidante y el efecto antiinflamatorio (Moreira &
Spitzer, 2000). También, se determinaron otras aplicaciones farmacológicas como
actividad hepatoprotectora, antialérgica, antitrombótica, anticancerígena,
antibacteriana y antifúngica (Benavente & Castillo, 2008).

La actividad antioxidante de los flavonoides resulta de una combinación de sus

propiedades quelantes de hierro y secuestradoras de radicales libres por su bajo
potencial redox, son capaces de reducir las especies reactivas de oxigeno (ROS)
(Halliwell, Rafter, & Jenner., 2005).

Los flavonoides tienen una poderosa acción antioxidante “in vitro”, son capaces de
barrer un amplio rango de ROS, nitrógeno, y cloro, tales como el superóxido, el radical
hidroxilo, el radical peroxilo, el ácido hipocloroso, actuando como agentes reductores
(Moreira & Spitzer, 2000).

11
Los flavonoides en la inflamación: Regulan la actividad de enzimas inflamatorias e
inhibe la producción de oxidasas: lipooxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa y la
xantina oxidasa; evitando así la formación de especies reactivas de oxígeno y de
hidroxiperóxidos orgánicos y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Reduce los
niveles de producción y expresión de citoquinas y modula a los factores de
transcripción, tales como el factor nuclear kappa (NF-kB) y activación de las proteínas.
También Inhibe el metabolismo del ácido araquidónico por tanto, evita el incremento
de la prostaglandina E2 (PGE2) y en menor medida el del leucotrieno B4 (LTB4)
(Fernandez, Saenz, & Garcia, 1998).

2.6.4 Fitoesteroles

A los fitoesteroles se les atribuye funciones como antiinflamatorio aunque limitada,

poseen propiedades antioxidantes, incrementan la producción de córticoesteroides y
retardan su degradación (Rios Cañavate, 1994-1995). También juegan papeles
importantes en enfermedades cardiovasculares gracias a su influencia en el nivel de
colesterol en la sangre, ayudan a prevenir ateroesclerosis y enfermedades coronarias
(Moreno, 2003).

Se ha demostrado que el β sitosterol reduce la producción de anión radical

superóxido, peróxido de hidrógeno, óxido nítrico (NO), PGE2 y LTB4 inducidos con
ésteres del forbol en macrófagos y se plantea que estos efectos pudieran estar
relacionados con la modulación de NF-kB. Los fitoesteroles también pueden estar
relacionados con el crecimiento y proliferación de las células, aunque se desconoce la
forma en que se lleve a cabo (Moreno, 2003).

2.7 EL SISTEMA INMUNITARIO

El sistema inmunitario de los vertebrados está compuesto de células y moléculas con

funciones especializadas cuyo propósito final es el de preservar y proteger al
organismo, y también proporciona un sistema de vigilancia para monitorizar la
integridad de los tejidos del huésped.

12
2.7.1 La respuesta inmunitaria

Entre las funciones básicas de la respuesta inmunitaria se encuentra el

reconocimiento de sustancias y organismos extraños que han ingresado en el cuerpo
y la eliminación de estos agentes por células y moléculas que actúan manteniendo la
tolerancia a antígenos propios y extraños que no tienen potencial patogénico (Delves,
Roitt, & Burton, 2011).

Se sabe cada vez mejor que además de las infecciones, los daños en los tejidos por
traumatismo, quemaduras y ciertas toxinas, conducen a la muerte celular no
fisiológica que puede provocar la activación del sistema inmunitario. En esta situación
las moléculas que activan el sistema inmunitario derivan de lo propio, moléculas que
no se encuentran normalmente en el espacio extracelular. Polly Matzinger llamo a
estas moléculas “señales de peligro”, escapan cuando una célula muere a través de
un modo no controlado de muerte celular llamado necrosis (Delves, Roitt, & Burton,
2011).

El sistema inmunitario en los vertebrados está constituido por diferentes niveles de

defensa, en primer lugar hay una barrera física contra las infecciones que es
proporcionada por la piel, superficie externa del cuerpo. El segundo nivel de defensa
es proporcionado por el sistema inmunitario innato de acción relativamente amplia
muy eficaz y poco específica, las células que participan son las NK (natural killer),
fagocitos mononucleares (monocitos, macrófagos, células dendríticas), y fagocitos
polimorfonucleares (mastocitos, eosinófilos, neutrófilos, basófilos), los cuales liberan
factores humorales, interferones, citoquinas y sistema del complemento (Delves, Roitt,
& Burton, 2011).

El sistema inmunitario adaptativo lanza un ataque específicamente adaptado cuando

la respuesta inmunitaria innata es superada ante la infección de determinados
patógenos. Por lo cual, la respuesta inmunitaria adaptativa es un mecanismo mucho
más evolucionado, presenta alta especificidad a distintos tipos de agentes infecciosos
y con capacidad de responder con más intensidad a exposiciones repetidas.

13
Los componentes son linfocitos B, T y sus productos de secreción (Delves, Roitt, &
Burton, 2011).

Figura 9. Componentes celulares del sistema inmunitario innato y adaptativo.

Principales características en función del tipo de respuesta realizada, su mecanismo
efector y los mediadores secretados. IFN: interferón; NK: natural killer; NO: óxido
nítrico; ROS: especies reactivas de oxígeno (Monserrat Sanz, 2017).

2.7.1.1 La respuesta inmunitaria innata

Ante la entrada de un agente extraño en el cuerpo, la respuesta inmunitaria innata es

la primera barrera de defensa basada en mecanismos inespecíficos y de acción
inmediata, carente de memoria, no requiere sensibilización previa ya que existe en el
individuo desde el nacimiento y no mejora con el encuentro frecuente con el mismo
agente infeccioso.

14
El sistema inmunitario innato reconoce componentes ampliamente conservados de
agentes infecciosos, como los patrones moleculares asociados a patógenos
(Pathogen-Associated Molecular Patterns PAMPs) y señales endógenas asociadas al
daño tisular (Damage associted colecular patterns DAMPs) mediante receptores de
reconocimiento de patrones (PRRs). Al detectar un PAMP, el sistema inmunitario
innato monta un ataque inmediato sobre cualquier elemento que muestre estas
moléculas (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Figura 10. Los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) detectan patrones

moleculares asociados con patógenos (PAMP) e inician la respuesta inmunitaria
(Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Las principales células encargadas de la primera línea de defensa son las células
epiteliales, los monocitos, los macrófagos, los neutrófilos, las células dendríticas (CD)
y una población linfocitaria con actividad lítica pero que carece de receptores
específicos, además, presenta una gran variedad de proteínas solubles bactericidas
(destructora de bacterias) como componentes del sistema del complemento y
lisozimas (Delves, Roitt, & Burton, 2011).
15
Las células presentadoras de antígenos (APC), en especial las células dendríticas y
los macrófagos juegan un papel fundamental en la conexión entre la respuesta
inmunitaria innata y la respuesta inmunitaria adaptativa ya que son las responsables
de procesar y presentar antígenos a los linfocitos T en contexto de moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) presente en su superficie celulares
(Medzhitov, 2007).

2.7.1.2 La respuesta inmunitaria adaptativa

La respuesta inmunitaria adaptativa tarda más en alcanzar una importancia funcional,

en general 4 a 5 días después de la respuesta inmunitaria innata, pero están
específicamente adaptadas a la naturaleza del antígeno y mejora en cada encuentro
con un agente infeccioso determinado, debido a una característica denominada
memoria inmunitaria.

La respuesta inmunitaria específica esta mediada por los linfocitos T y linfocitos B que
muestran receptores específicos en sus membranas citoplasmáticas capaces de
reconocer una gama casi ilimitada de estructuras antigénicas, el reconocimiento del
antígeno por un linfocito induce la proliferación y la diferenciación de estas células.
Esto engrosa rápidamente las filas de los linfocitos capaces de enfrentar al agente
infeccioso que posee el antígeno especifico y produce una respuesta de memoria si
se encuentra con el mismo antígeno (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Linfocitos T (LT)

Los LT se caracterizan por poseer receptores específicos para los antígenos,

denominados receptores de células T o TCR (con cadenas αβ), los cuales reconocen
péptidos antigénicos unidos a proteínas codificadas por los genes del MHC
(Medzhitov, 2007).

Los LT se originan en la medula ósea y llegan al timo como células inmaduras

incapaces de realizar su función inmunológica; son doble negativas, es decir, carecen
de los marcadores CD4 y CD8. Estas células T inmaduras luego se diferencian a

16
linfocitos T doble positivos, para finalmente madurar a linfocitos T simples con un solo
marcador. Los LT CD3 se dividen en: células T cooperadoras (Th, de T helper), las
cuales además del CD3, expresan CD4; y las células T citotóxicas (Tc, de T cytotoxic),
que expresan CD3 y CD8 (Salinas M. , 2011).

Las subpoblaciones de linfocitos Th CD3/CD4, se caracterizan por su capacidad de

participar en el desarrollo de la respuesta inmunitaria adquirida, las moléculas CD4
actúan como correceptores para las moléculas de clase II del MHC, se subdividen en
linfocitos Th1, Th2, T reguladoras (Treg) y Th17, de acuerdo con el patrón de
citoquinas que secretan y sus funciones efectoras.

Los linfocitos Th1 producen interleucina 2, interleucina 12 (IL-2, IL-12) e interferón

gamma (IFN-γ). Los Th2 promueven la respuesta inmunitaria humoral, que se
caracteriza principalmente por la presencia de la interleucina 4 e interleucina 5 (IL-4,
IL-5), que inducen la activación y diferenciación de células B. Por otro lado, las células
T reguladores secretan factor de necrosis transformador beta (TGF-β) e interleucina
10 (IL-10), los cuales modulan o inhiben la respuesta inmune celular o humoral.
Mientras tanto las células Th17, caracterizadas por la secreción de la IL-17 (Salinas
M. , 2011).

Actividades biológicas de los Linfocitos T CD3/CD4

Las células Th1 secretan perfiles de citoquinas orientadas a coordinar respuesta

contra infecciones bacterianas y virales intracelulares a través de la activación de
macrófagos y LT citotóxicos productoras de IFN-γ (figura.11). La presentación de un
antígeno específico mediante las moléculas de clase II del CMH en el macrófago
conduce a la secreción de IFN-γ por las células Th1. Sin embargo, los macrófagos no
son muy sensibles al IFN-γ por lo cual las células Th1 estimulan funciones efectoras y
la activación de los macrófagos mediante el receptor CD40 que aumenta su
sensibilidad al IFN-γ. Los macrófagos estimulados también producen IL-12, que
conducen al refuerzo del fenotipo Th1.

17
Las células Th1 también secretan concentraciones de IL-2 que sostienen la expansión
de las células T citotóxicas, la generación de la interleucina IL-3 (IL-3) y el factor
estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) tienen efectos más
distantes sobre los precursores de la medula ósea e inducen la producción de
neutrófilos y macrófagos durante una infección (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

La subpoblación Th2 producen las interleucinas 4, 5, 6 (IL-4, IL-5, IL-6) e interleucinas

13 (IL-13) las cuales activan y ayudan a la proliferación de las células B para
transformarlas en células de memoria y células plasmáticas. Los linfocitos Th2 son
muy buenos colaboradores de las células B y parece que están adaptados para la
defensa contra parásitos y otros patógenos extracelulares que son vulnerables a la
inmunoglobulina E (IgE) activada por la IL- 4, a la eosinofília inducida por la IL-5 y a la
proliferación de las células cebadas estimuladas por la IL-3 e IL-4.

Las células Th17 se caracterizan por la secreción de la interleucina 17 (IL-17), la cual

juega un papel importante en la inflamación crónica característica de enfermedades
autoinmune o alérgicas. Las células Th17 producen IL-17A y también secretan IL-17F,
IL-21 e IL-22. Estas células parecen estar especializadas en montar respuestas
inflamatorias masivas contra infecciones bacterianas extracelulares bacterianas y
micóticas, sobre todo en la interface de las mucosas (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Las células T también se diferencian en células que ejercen una función supresora o
reguladora en la respuesta inmunitaria. Estas células se denominan, células T
reguladoras o Treg, de las que hay dos categorías de células reguladores; naturales e
inducible. Estas células suprimen la respuesta contra antígeno propio, así como la
respuesta inapropiada contra antígenos no propios.

Las células T reguladores derivadas del timo o naturales expresan CD4,

CD25+FOXP3+ que pueden suprimir respuestas inmunitarias de células T
autorreactivas que se desarrollan en el timo y se liberan como células funcionalmente
maduras. Las células T reguladores inducibles se generan a partir de las células T
vírgenes en la periferia después del contacto con el antígeno, presentado por las
células dendríticas. Las células Th3 representa una población, encontradas en las
18
mucosas que secretan IL-4, IL-10 y TGF-β, importantes para la tolerancia hacia
microorganismos comensales que habitan el tracto intestinal (Delves, Roitt, & Burton,
2011).

La producción de citoquinas inmunosupresoras como la IL-10, TGF-β o la IL-35 ejerce

sus funciones por varios mecanismos. La IL-10 suprime la respuesta de células T al
inhibir la producción de la IL-2, IL-5, inhibe la sobreexpresión de moléculas de clase I
del MHC y ligando B7 coestimuladores de las células dendríticas y macrófagos. El
TGF-β bloquea la producción de citoquinas por las células T, así como la citotoxicidad
y la proliferación (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Figura 11. Las células T vírgenes pueden sufrir activación y polarización hacia
distintas subpoblaciones de células Th, las citoquinas producidas por las células
dendríticas u otras células de la inmunidad innata (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Los linfocitos T CD3/CD8, están restringidos al reconocimiento de péptidos en el

contexto de MHC-I, una vez activados, los LT pueden convertirse en células efectoras
citotóxicas o células de memoria. Las células CD8 citotóxicas tienen actividad lítica,
poseen un papel crítico en el reconocimiento y eliminación de células propias
alteradas (células infectadas por virus o bacterias intracelulares y células tumorales).
19
Las moléculas de clase I del MHC se expresa en todas las células nucleadas, por lo
tanto, los linfocitos T CD8 pueden reconocer y eliminar cualquier célula que presente
el antígeno a través de la clase I del MHC. Los linfocitos T CD8 activados eliminan a
sus células diana a través de dos mecanismos. El primero consiste en la liberación de
granzimas y perforinas relacionados con la lisis celular, secretan citoquinas como
factor de necrosis tumoral- β (TNF-β) e IFN-γ y activan macrófagos. El segundo
consiste en el contacto directo vía ligando Fas. Dicho ligando causa la muerte celular
por apoptosis (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Linfocitos B (LB)

Normalmente, los LB requieren de los LT para generar anticuerpos de alta afinidad y

sufrir un cambio de clase. Sin embargo, ciertos tipos de antígenos (llamados
antígenos timoindependiente) pueden promover la activación de células B sin la
colaboración de las células T, los anticuerpos así formados suelen ser de baja
afinidad, pero proporcionan protección rápida frente a ciertos microorganismos
mientras se forme la respuesta de las células B que dependen de las células T
(Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Antígenos timoindependiente de tipo 1: ciertos antígenos como el lipopolisacarido

(LPS) de bacterias, en una concentración elevada, activan en forma policlonal una
proporción importante de la dotación de células B, esto se produce mediante la unión
a moléculas de superficie como los receptores de tipo toll (TLR).

Antígenos timoindependiente de tipo 2: algunos antígenos lineales que tienen una

determinante muy repetida por ejemplo, polisacáridos de Pneumococo, polímeros de
D-aminoácidos y polivinilpirrolidona con dificultad en su degradación en el organismo,
también son timoindependiente en su capacidad para estimular las células B por las
inmunoglobulinas de membrana inmunoglobulina M (IgM) e induce la generación de
células plasmáticas responsables de la síntesis de anticuerpos (Delves, Roitt, &
Burton, 2011).

20
Muchos antígenos son timodependientes, estos antígenos no pueden satisfacer los
requerimientos moleculares para la estimulación directa, las células B se comporta
como una célula presentadora de antígeno. A través de la IgM, las células B
reconocen los antígenos para después endocitarlos, procesarlos y presentarlos en el
contexto clase II del MHC a las células T CD4. La interacción entre ambos linfocitos es
estabilizada por moléculas accesorias. El linfocito Th libera citoquinas que inducen la
proliferación y diferenciación de células B a células plasmáticas productoras de
anticuerpos o de células B de memoria (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Células natural killer (NK)

Las células natural killer son una población de leucocitos que, como los LT y LB,
emplean receptores que pueden provocar su activación capaces de secretar
citoquinas, notablemente el IFN-γ. Los macrófagos responden al IFN-γ con el
incremento de sus actividades microbicidas y el aumento de citoquinas como la IL-12
que tienen efectos sobre las células del sistema inmunitario adaptativo. Otro efecto del
IFN-γ es mejorar la presentación de antígeno en las células dendríticas, importantes
para la activación del sistema inmunitario adaptativo (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

Las células NK expresan ciertos cúmulos de diferenciación encontrados en los LT,

pero expresan además CD16 y CD56. Participan en la respuesta inmunitaria innata
contra virus y células tumorales mediante mecanismos de lisis celular similares a los
mecanismos efectuados por los LT citotóxicos. Los gránulos contienen perforinas, que
inducen la muerte celular por lisis osmótica, y granzimas, que inducen señales
intracelulares para promover la muerte celular programada (apoptosis).

También las NK pueden llevar efectores citotóxicos mediante la citotoxicidad

dependiente de anticuerpos, debido a que estas células cuentan con receptores para
la región Fc, el mecanismo ocurre cuando el anticuerpo se encuentra unido a la
superficie de una célula blanco infectada por el patógeno, esto es reconocido por la
célula NK a través de los receptores liberándose citoquinas y los gránulos citotóxicos
que contiene perforinas y granzimas (Salinas M. , 2011).

21
2.8 LA INFLAMACIÓN

La inflamación es considerado un proceso biológico que se presenta solamente en los

tejidos vascularizados, es un mecanismo de defensa donde involucra una serie de
fenómenos moleculares, celulares y vasculares en respuesta a una agresión física
(calor, radiación, traumatismo), químicos (corrosivos), biológica (microorganismos) e
inmunológicos (enfermedades autoinmunes y reacciones de hipersensibilidad), es
necesaria para la supervivencia, pero está involucrada en el daño y es responsable de
molestias generales o locales (Salinas M. , 2011).

Factores de la inflamación

El daño producido en los tejidos mediado por estímulos endógenos y/o exógenos son
inductores que inicia el proceso inflamatorio y activa la respuesta inflamatoria, se
activa la producción de mediadores, esto a su vez altera los estados funcionales,
sensoriales de las células del sistema inmunitario innato y adaptativo, tejidos y
órganos, que son los efectores de la inflamación.

22
Figura 12. El proceso inflamatorio incluye: inductores, sensores, mediadores y
efectores. Los inductores se clasifican en exógenos y endógenos, y ellos a su vez, en
otras clases. Los diferentes inductores operan a través de distintas vías. AGE:
Productos finales de glicación avanzada, NALP: Miembro de la familia NLR (García,
2008).

23
2.8.1 Tipos de inflamación

La inflamación también puede ser clasificada como aguda y crónica, según el tiempo
de duración y las células que predominan en el tejido inflamado:

2.8.2 Inflamación aguda

Se considera aguda cuando el tiempo transcurrido entre la aparición de las

manifestaciones anatómica, sistémicas o celulares dura desde horas hasta algunos
días y predominan los leucocitos polimorfonucleares (PMN) en el tejido afectado, se
caracteriza por presentar vasodilatación local transitoria, aumento de la permeabilidad
vascular, la extravasación de líquido y proteínas plasmáticas, así como el
desplazamiento de leucocitos especialmente neutrófilos al foco inflamatorio, donde
ayudan a eliminar las bacterias invasoras e inician el proceso de degradación de los
tejidos necróticos (Aristil, 2010).

Manifestaciones clínicas visibles de la inflamación aguda

La inflamación aguda localizada, inicia con participación de efectores dependiente o

independiente del sistema inmunitario y produce evidencia visible de su existencia.
Celso, un autor romano del siglo I después de Cristo, describió a estas evidencias
como los cuatro signos cardinales de la inflamación.

- Rubor: se refiere al color rojo del área involucrada en el proceso inflamatorio, y

se debe al aumento de la circulación sanguínea y a la congestión vascular
local.
- Calor: existe un aumento de la temperatura en el sitio de la inflamación como
consecuencia de la irrigación sanguínea y aumento del metabolismo.
- Tumor: esto significa que hay un aumento de volumen o edema local por la
congestión vascular y el aumento de las células que llegan al sitio de la
inflamación.

24
 - Dolor: el tejido inflamado edematoso ocasiona dolor localizado al sitio afectado
por la irritación local de terminaciones nerviosas. Galeno añadió un quinto
signo: pérdida de función (Salinas M. , 2011).

Manifestaciones sistémicas de la inflamación aguda

Además del aumento local de la temperatura, puede ocurrir el aumento de la

temperatura corporal, mediante la liberación de pirógenos endógenos (IL-1, el TNF-α y
la IL-6) producidos por los macrófagos. La leucocitosis es otro efecto sistémico de la
inflamación aguda, que varía según la edad del enfermo y la extensión de la infección
(Salinas M. , 2011).

Cuando existe una inflamación aguda se produce el aumento de proteínas que

normalmente se encuentran en la sangre, pero en concentraciones muy bajas,
conocidas como reactantes de fase aguda, como es en el caso de proteína C reactiva,
el fibrinógeno y el componente C3 del sistema del complemento.

Proceso de la inflamación

Quimiotaxis: A través de este proceso los leucocitos alcanzan la zona de lesión. Las
células se desplazan a lo largo de un gradiente de concentración de moléculas
atrayentes como IL-8, C5a, histamina, leucotrieno, LPS, restos de fibrina o de
colágena. Inicialmente se captan neutrófilos y posteriormente en un lapso de 24 a 72
horas, participan monocitos, fagocitos y linfocitos. Las células tisulares (cebadas,
fibroblastos, queratinocitos, etc.) adyacentes a la zona infectada o lesionada son las
primeras en llegar, en ser activadas y en promover la inflamación (Vega, 2008).

Aumento del diámetro vascular: Los cambios en el calibre de los vasos sanguíneos
son inducidos por sustancias inflamatorias como la histamina, bradicinina,
eicosanoides y la triptasa secretadas desde los primeros segundos de la inflamación
por los mastocitos locales, basófilos y las células endoteliales activadas. Como
consecuencia aumenta el flujo de sangre hacia el área inflamada, lo que genera la
elevación de temperatura y enrojecimiento (calor y rubor) (Vega, 2008).

25
Aumento de la permeabilidad vascular: El efecto primario de la dilatación capilar es
permitir el paso y la acumulación de líquido rico en proteínas (exudado) al tejido
intersticial generando edema (tumor). En la zona afectada el estímulo que todo lo
anterior ejerce y la acción de la bradiquinina sobre las terminaciones nerviosas,
originan dolor. (Vega, 2008).

Adherencia y rodamiento celular: Los neutrófilos se unen a las células endoteliales

a través de las moléculas de adherencia denominadas selectinas de baja afinidad. Los
leucocitos se desplazan sobre las células endoteliales de las vénulas post-capilares
mediante un mecanismo denominado rodamiento, la quimioquina IL-8 se adhieren a la
superficie de los leucocitos en rodamiento, generando en ellas la adherencia y
expresión de integrinas de alta afinidad; a su vez la IL-1 y el TNF-α actúan sobre las
células endoteliales generando un aumento de la expresión de ligando (moléculas
unidoras) e integrinas de los leucocitos con el propósito de lograr una unión firme
entre ambas células (Vega, 2008).

Estimulación de la vía extrínseca de la coagulación: Los eventos señalados

activan la vía extrínseca de la coagulación, de forma paralela se inicia la formación de
fibrina y un estado pro-coagulante que impide la proliferación de gérmenes mediante
la circulación sanguínea (Vega, 2008).

Transmigración o diapédesis celular: Mediante el proceso de rodamiento sobre las

células endoteliales a través de las uniones intercelulares, los leucocitos llegan al
tejido lesionado. En el proceso están implicadas ciertas moléculas de adhesión. Otro
mecanismo de los leucocitos para llegar al tejido inflamado es pasar de manera trans-
celular y para lograrlo, los neutrófilos extienden pseudópodos al interior de la célula
endotelial y migran a través de sus poros; esta vía es guiada predominantemente por
quimioquinas y señales quimioatractantes (Vega, 2008).

26
Las células en el sitio de la inflamación, fagocitan y endocitan al antígeno, lo procesan
y lo convierten en péptidos pequeños, para luego enlazarlos a moléculas de MHC y
ser presentados a los linfocitos T. De esta manera inician la participación de la
inmunidad específica, que potencializa notablemente la repuesta inmune ante los
agresores o causantes de la inflamación (Vega, 2008).

Figura 13. Los neutrófilos migran desde los vasos sanguíneos a los sitios de infección
inducidos por los productos de los macrófagos y mastocitos activados, como IL-1,
TNF, IL-8, e histamina. Los neutrófilos inicialmente se adhieren y ruedan a lo largo del
endotelio a través de la P- y E- selectina. Los neutrófilos se activan, lo que lleva a la
activación de integrinas de la superficie celular (LFA-1, CR3) que proporcionan una
unión más firme a sus receptores afines (ICAMs) en el endotelio. Las últimas
interacciones permiten a los neutrófilos detenerse en la pared endotelial y
extravasarse a través de la membrana basal del endotelio y migran hacia el tejido
dañado (Delves, Roitt, & Burton, 2011).

27
2.8.3 Inflamación crónica

La inflamación crónica es un tipo de inflamación de larga duración, semanas a meses

que ocurre en el mismo tejido u órgano, puede llegar incluso a la destrucción de dicho
tejido y la pérdida de su función. Las causas de la inflamación crónica son infecciones
por agentes como las bacterias intracelulares, la presencia de enfermedades
autoinmune, como artritis reumatoide o el Lupus Eritematoso Sistémico. En los tejidos
con un proceso inflamatorio crónico, aunque puede ocurrir congestión vascular y
edema, casi nunca son de la magnitud que presenta la inflamación aguda (Aristil,
2010).

La característica más significativa en la inflamación crónica es el predominio de

leucocitos PMN, así como monocitos, macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. La
reacción inflamatoria es más productiva que exudativa, es decir, que la formación de
tejido fibroso prevalece sobre el exudado de líquidos (Aristil, 2010).

Por lo general es una respuesta protectora que trata de restaurar los tejidos
lesionados. Sin embargo, en ciertas circunstancias, la intensidad o la repetición de la
agresión provoca la pérdida del control local o la activación de mecanismos de la
respuesta que están habitualmente quiescentes y que sobrepasan los sistemas de
control, con una reacción sistémica exagerada que se denomina síndrome de
respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) (Davies & toward, 1997).

2.9 Células y mediadores implicados en el proceso inflamatorio

2.9.1 Polimorfonucleares (PMNs)

En un proceso inflamatorio agudo y en respuesta a un estímulo quimiotáctico, el

primer cambio observado es la llegada de los neutrófilos. Sus receptores de
membrana le permiten unirse al endotelio vascular rodar y extravasarse por
diapédesis al sitio de la inflamación. Los neutrófilos tienen funciones fagocíticas y
microbicidas que permite el control de infecciones por diversos patógenos (Salinas M.
, 2011).

28
La fagocitosis en el neutrófilo esta mediado por un gran número de receptores de
superficie que reconocen PAMPs y la actividad microbicida está asociada a la
presencia de gránulos que contienen enzimas proteolíticas como la elastasa,
lisozimas, lactoferrina y la catepsina G. Los neutrófilos al igual que los macrófagos
también pueden llevar a cabo los mecanismos microbicidas dependiente de oxigeno
(estallido respiratorio) o del óxido nítrico para eliminar la infección (Salinas M. , 2011).

Las enzimas presentes en los gránulos de los PMNs actúan independiente del
oxígeno, permitiendo así la digestión directa de las bacterias, se produce una
licuefacción formada por células necróticas del individuo y PMN muertos que
constituye el pus. Por otro lado, la liberación de especies reactivas de oxígeno,
hidrolasas acidas y otros productos lisosómicos provenientes de los PMN producen
daño endotelial y estimulan la microcirculación lo que conduce a una activación
adicional de la cascada inflamatoria (Salvill, Wyllie, Henson, Walport, & Henson,
1989).

2.9.2 Fagocitos mononucleares

Los monocitos constituyen la segunda población que participa en la inflamación, son

atraídos por mecanismos similares a los de los PMN. Debido a su mayor tamaño,
tienen más difícil y lenta su diapédesis a través de las paredes de los vasos, los
monocitos pueden madurar a macrófagos en diferentes tejidos y recibir una variedad
de nombres.

Los macrófagos maduros se caracterizan por expresar en su superficie celular el

receptor para la porción Fc-γ de las inmunoglobulinas (Fc-γR o CD16) y receptores de
complemento (CR1, CR3). Además los macrófagos tienen receptores que reconocen
patrones moleculares asociados a patógenos (PRRs, pattern recognition receptors).
Entre estos se encuentran los receptores de manosa y los TLRs (toll-like receptors).
Cuando dichos receptores reconocen los PAMPs, se inicia una cascada de señales
intracelulares que favorecen la internalización del patógeno por el macrófago hacia el
citoplasma (Davies & Hagen, 1997).

29
Los macrófagos activados por los linfocitos Th2 para combatir patógenos
extracelulares y parásitos desempeñan una función en la remodelación tisular así
como funciones inmunoreguladoras en concordancia con el paradigma Th1 y Th2.

Con relación a los macrófagos tisulares, se diferencian dos tipos, macrófagos

residentes y activados o inflamatorios: Los macrófagos residentes son aquellos que
están presentes en un tejido determinado en condiciones de normalidad, los
macrófagos inflamatorios están presentes en un tejido en respuesta a un estímulo
exógeno. La diferencia entre ambos se basa en sus patrones de emigración bajo
condiciones de inflamación (Bargallo, 2015).

Los macrófagos estimulados por mediadores producidos en los focos de inflamación,

dejan de proliferar y pasan a activarse, para desarrollar sus funciones especializadas.
En condiciones fisiológicas, el IFN-γ secretado por los linfocitos Th1 activados, es el
principal agente activador de los macrófagos. Sin embargo, en condiciones
patológicas tales como una infección bacteriana, el LPS también puede activar
muchas de las funciones de los macrófagos. Por el contrario, en ausencia de
estímulos, los macrófagos morirán por apoptosis. De esta forma se establece un
balance entre la producción de precursores celulares en la médula ósea y la
eliminación de la mayoría a nivel tisular (Bargallo, 2015).

Una vez que los macrófagos son atraídos al foco de la lesión, el microorganismo es
endocitado, formando un fagosoma, el cual se fusiona con el lisosoma (que contiene
enzimas hidrolíticas) para formar el fagolisosoma, es en este sitio donde se elimina al
microorganismo ingerido por el ambiente extremo del pH.

También los macrófagos presentan mecanismos microbicidas dependiente de oxigeno

(estallido respiratorio) donde se produce especies reactivas de oxígeno, y del óxido
nítrico. Además, los macrófagos activados con LPS o citoquinas como IFN-γ, la IL-1 y
el factor activador del complemento C5a sintetizan y liberan citoquinas
proinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-12 y TNF-α) que favorecen el reclutamiento de PMN y
amplifican el proceso inflamatorio. Además de la fagocitosis y la muerte intracelular los
macrófagos actúan como CPA para las células B y T (Davies & Hagen, 1997).
30
Destrucción por especies reactivas de oxigeno (ERO): en la fagocitosis se produce un
notable incremento en la actividad de la hexosa monofosfato, que genera menor
cantidad del nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH). Los
electrones pasan desde NADPH a una flavoproteína de membrana que contiene
flavina adenina dinucleótido (FAD) y luego a un citocromo (cit. b558) de la membrana
citoplasmática, este tiene un potencial de óxido-reducción de punto medio, lo cual le
permite reducir al oxígeno molecular a anión superóxido, por tanto la NADPH oxidasa
que inicia la formación de ERO es la siguiente:

NADPH +O2 NADP+ O2-(anión superóxido).

El anión superóxido se convierte en peróxido de hidrogeno bajo la influencia de la

superóxido dismutasa y posteriormente en radical oxhidrilo (OH). Cada uno de estos
productos tiene notable reactividad química, por lo cual son agentes antimicrobianos
extraordinarios; en particular, el OH es uno de los radicales libres más reactivos. Si
bien el peróxido de hidrogeno (H2O2) y los compuestos halogenados no son tan
activos como los radicales libres, tienen más estabilidad y por ello se difunden mejor y
en consecuencia, son tóxicos para los microorganismos en espacios extracelulares.

Destrucción por especies reactivas del nitrógeno: el NO surgió como un mediador

fisiológico destacado cuando se demostró que era idéntico al factor de relajación
derivado del endotelio formado por una óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) en la
mayoría de las células, pero sobre todo en macrófagos y neutrófilos, por lo cual crea
un grandioso sistema antimicrobiano.

El NO puede actuar contra agentes que invaden el citosol; por lo tanto no sorprende
que las células no fagocíticas, capaces de ser infectadas por virus y ciertos parásitos
estén dotada de capacidad iNOS. El mecanismo de acción puede ser a través de la
degradación de los grupos prostéticos Fe-S de determinadas enzimas transportadoras
de electrones (Davies & Hagen, 1997).

31
2.10 Mediadores químicos de la inflamación

La activación de los PMN y macrófagos proporciona un ambiente de citoquinas

(especialmente TNF-α e IL-1) y moléculas quimioatrayentes como los factores
activadores del complemento (C3a y C5a), formil péptidos (como la formil-metionil-
leucil-fenilalanina: FMLP y formil neoleucil-leucil-fenilalanina: FNLP) que actúan sobre
el endotelio, el cual se activa y comienza la expresión de diversas moléculas y
receptores en su superficie necesarias para que se produzca la adhesión y el paso de
los leucocitos a través del endotelio vascular, así como la síntesis y secreción de
citoquinas y mediadores inflamatorios.

Histamina

La histamina es mediador de la fase aguda y se encuentra almacenada en gránulos

de células cebadas, basófilos y plaquetas, su liberación estimula la bradiquinina y las
fracciones del complemento C3a y C5a, proteínas lisosomales y citoquinas como la IL-
1, IL-8 (Alfonso, 2000).

Serotonina

La serotonina es un mediador vasoactivo preformado en el interior de las plaquetas.

Su liberación es estimulada cuando estas se agregan tras el contacto con el colágeno,
la trombina, el Adenosin Difosfato (ADP) y el complejo antígeno-anticuerpo (Alfonso,
2000).

Metabolitos del ácido araquidónico (AA)

El ácido araquidónico es un ácido graso poliinsaturado de 20 átomos de carbono, se

obtiene a partir del l ácido linoléico, el AA se encuentra esterificado en los fosfolípidos
de la membrana celular y se libera por medio de fosfolipasas celulares que se activan
mediante estímulos proinflamatorios, es el precursor más abundante de
prostaglandinas, su liberación de esta estructura se produce como respuesta a un
número diverso de estímulos físico, químico o mecánico (Garcia, 2008).

32
Prostaglandinas (PG)

La producción de PG comienza con la liberación del AA por acción de la fosfolipasa

A2, la expresión de esta enzima se incrementa con la activación del NF-kB (Garcia,
2008). Las PG y los tromboxanos intervienen en la patogenia del dolor y la fiebre y se
encuentran involucrados en el desarrollo del proceso inflamatorio.

Las prostaglandinas PGI2 PGD2 y PGE2 son mediadores que generan un aumento
del efecto vasodilatador de la histamina y la bradiquinina con lo cual potencian el
edema. El leucotrieno B4 provoca la agregación de PMN e induce su adhesión a
células del endotelio vascular, comportándose como un potente quimiotáctico y el
tromboxano A2 promueve la agregación plaquetaria. (Garcia, 2008)

Figura 14. Estructura básica de la Prostaglandina E2

Fuente: (Martinez & Selva Rivas, 2005)

Leucotrienos

Los leucotrienos son eicosanoides derivados de lípidos de membrana, sintetizados a

partir del AA por acción de la enzima 5 lipoxigenasa. Hay cuatro leucotrienos
importantes: LTC4, LTD4, LTE4 y LTB4. El leucotrieno B4 (LTB4) se obtiene por
hidrólisis enzimática del leucotrieno A (LTA) en neutrófilos, eosinófilos, monocitos,
macrófagos, células cebadas y queratinocitos. Los leucotrienos actúan como potente
quimiotactico activador de neutrófilos, estimula la adhesión de las células fagocíticas
al endotelio (Fernandez L. , 2008). El LTC4 y el LTD4 son potentes agentes
quimiotácticos para los eosinófilos e inician la formación de radicales libres de
oxígeno.

33
 Figura 15. Estructura básica del Leucotrieno LTB4
Fuente: (Martinez & Selva Rivas, 2005)

Lipoxinas

A diferencia de las prostaglandinas y leucotrienos, las lipoxinas presenta un efecto

inhibidor de la inflamación mediante la reducción e incorporación de los leucocitos al
foco inflamatorio, así como la reducción de la quimiotaxis de los neutrófilos y la
adherencia al endotelio (Fernandez L. , 2008).

Figura 16: estructura básica de la Lipoxina B4

Fuente: (Martinez & Selva Rivas, 2005)

El factor activador de plaquetas (PAF)

Es un mediador proveniente de los fosfolípidos derivado de las células endoteliales,

plaquetas, mastocitos, basófilos y neutrófilos. Sus efectos en la inflamación: induce la
agregación plaquetaria, es un potente vasodilatador, aumenta la permeabilidad por
contracción de las células endoteliales y es mil veces más potente que la histamina y
la bradiquinina, estimula la adhesión leucocitaria y la síntesis de derivados del AA, PG
y leucotrienos (Garcia, 2008).

34
El óxido nítrico (NO)

El NO es un mediador que desempeña importantes funciones biológicas en procesos

fisiológicos y patológicos en humanos, es producido por las células endoteliales,
macrófagos y grupos neuronales específicos del cerebro, se origina a partir del grupo
guanidino que se encuentra en la L-arginina por tres isoformas, de la enzima óxido
nítrico sintasa (NOS): NOS neuronal (nNOS), NOS endotelial (eNOS) y NOS inducible
(iNOS).

Las isoformas nNOS y eNOS producen de un modo constante bajos niveles de NO

imprescindibles para numerosas funciones biológicas como la neurotransimisión,
relajación de la musculatura lisa o mantenimiento de la homeostasis vascular. En
cambio, iNOS se expresa como respuesta a varios estímulos inflamatorios (Moncada
& Palmer 1992).

Figura 17. Síntesis del Óxido Nítrico. Se produce a partir de la L-arginina por la acción
del NO sintetasa y algunos cofactores como el NADPH, FAD, FMN y tetrabiopterina.
En el caso de la NOS se requiere, además, la participación de la calmodulina y calcio
para activarse (Gorocica, 1999).

35
La súper producción de NO por la sobreactividad de la enzima inducible iNOS, puede
originar efectos indeseables en la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias.
La vida media y su acción biológica son muy cortas, ya que es rápidamente oxidado a
nitrito (NO2-) y nitrato (NO3-). La acumulación de esta molécula está estrechamente
relacionada a algunos eventos biológicos como el choque séptico, aterosclerosis,
artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y cáncer
(Garcia, 2008).

El NO que producen los macrófagos a través de la óxido nítrico sintetasa (NOS2) es

activada por la inducción de citoquinas (IFN-γ y TNF-α), citoquinas inhibidoras de la
(IL-4, IL-10, IL-13) producto de células Th1 o Th2, componentes microbianos y otros
estímulos inmunológicos. El NO ingresa a las células e inactiva proteínas que
participan en la producción de energía, transducción de señales y síntesis de ácidos
nucleicos induciendo la muerte celular (Garcia, 2008).

Figura 18. Los mecanismos moleculares y celulares de la inmunidad innata y

adquirida participan para mantener la homeostasis y protección del huésped. Los LT y
LB se caracterizan por su especificidad en reconocer determinados antígenos (A). Los
linfocitos NK reconocen células tumorales y células infectadas con virus (B). Los
macrófagos participan en la defensa antimicrobial por medio de la liberación de
moléculas altamente toxicas, su principal función efectora en la inmunidad innata es
36
fagocitar y sintetizar citoquinas que activan y reclutan a otras células inflamatorias (C)
(Juarez, 2013).

2.11 Citoquinas

Las citoquinas son proteínas secretadas por diversos tipos de células durante la fase
de iniciación o en la fase efectora de la respuesta inmune/inflamatoria, actúan como
mediadores intercelulares y ejerce su efecto mediante la activación de receptores
específicos de membrana. Regulan la transcripción génica e inducen de esa manera
el crecimiento celular, participan en el desarrollo de los procesos inflamatorios y su
resolución, estimula la proliferación y apoptosis celular (Hamblin, 1993).

Diferentes citoquinas comparten o inducen los mismos cambios o acciones biológicas

y en otros casos una misma citoquina actúa en diferentes tipos celulares o la misma
citoquina es segregada por varios tipos de células, este fenómeno característico se
denomina pleiotropía.

Las citoquinas tienen acciones proinflamatorias (Th1) y antiinflamatorias (Th2). Entre

las proinflamatorias están las interleucinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18,
INF-α, INF β (interferón alfa y beta) y TNFα (factor de necrosis tumoral alfa). Las
citoquinas con acción antiinflamatorias son IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF-β. (Hamblin,
1993)

IL-1

La IL-1 es un miembro importante del grupo de las citoquinas proinflamatorio, regula la

expresión de moléculas de adhesión, promueve la quimiotaxis y activa a los PMN, al
igual que TNF-α, es importante en la reparación de las lesiones y es esencial para
mantener una correcta inmunidad. Pertenece a una súper familia de citoquinas
relacionadas que lleva su nombre, de las cuales se conocen tres agonistas (IL-1α, IL-
1β e IL-18) y un antagonista del receptor (IL-1Ra). Las acciones biológicas de la IL-1
se basan en la inducción de genes que codifican para la ciclooxigenasa tipo 2 (COX2),
la fosfolipasa A2 (PLA2) y la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) (Santiago, 1995).

37
IL-6

Se trata de una citoquina que participa en múltiples procesos, por lo que se dice que
es multifactorial o pleiotrópica. Entre sus funciones, se ha encontrado que actúa en la
hematopoyesis, donde incrementa la proliferación del progenitor hematopoyético
pluripotencial, participa en la respuesta de fase aguda de la inmunidad celular y en la
regulación de los LT y LB. Además es considerada como una citoquina proinflamatoria
inducida por LPS junto con TNF-α, IL-1, IL-6 y a menudo se utiliza como marcador de
la activación sistémica de las citoquinas proinflamatorias (Barton, E 1997).

TNF-α

El TNF-α es una citoquina pleotrópica que posee propiedades reguladoras,

inmunitarias, inflamatorias, antitumorales y que actúa en estrecha coordinación con
otras citoquinas como la IL-1 y el IFN-γ. Además de su función inflamatoria y
antitumoral se conoce su influencia en la mitogénesis, diferenciación e
inmunorregulación de diferentes tipos celulares. (Tizard, 2002).

IL-10

La IL-10 una citoquina tardía, producida después de la liberación de los mediadores

proinflamatorios, presenta propiedades antiinflamatorias, es secretada por la mayoría
de leucocitos tras la estimulación celular con agonistas endógenos o exógenos, como
el LPS o las catecolaminas (Tizard, 2002).

La IL-10 actúa en forma de homodímeros a través de un complejo de receptores

transmembrana que se compone por IL10R1 e IL-10R2 y, en general, actúa mediante
la activación de la quinasa Janus (Jak) 1 y la tirosina quinasa (TyK) 2, que activan los
factores de transcripción de la familia STAT. En monocitos y macrófagos la IL-10
afecta tres funciones importantes: la presentación antigénica, inhibe la expresión del
MHC II y de las moléculas coestimuladoras, como CD80 y CD86 y la liberación de
mediadores inflamatorios en las células diana que han sido estimuladas por algunas
citoquinas proinflamatorias, o la síntesis de COX-2, por otro lado potencia la liberación

38
de mediadores antiinflamatorios, como el antagonista del receptor de IL-1β o de TNF-
α (Waal Malefyt,199).

Interferón-gamma (IFN-γ)

Los interferones (IFN) son una clase importante de citoquinas inducidas por la
infección viral o bacteriana. Los interferones de tipo 1 (IFNα e IFNβ) son una familia
de agentes antivirales. El grupo de IFN tipo II incluye al IFN-γ.

Función del IFN-γ

Actualmente se sabe que esta citoquina juega un papel crítico como modulador de la
respuesta inmunitaria. Todas las células del organismo poseen receptores específicos
para el IFN-γ lo que condiciona que esta citoquina tiene un efecto pleiotrópico sobre
distintos tipos celulares. En los LT CD4+, estimula la proliferación de las células con
subtipo Th1 y bloquea la de las Th2 favoreciendo aquellos procesos asociados a la
respuesta inmunológica específica mediada por células. En los LB, promueve la
diferenciación y el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas, además promueve la
expresión de las moléculas de clase II del MHC (Boehm y col., 1997).

Los macrófagos responden al IFN-γ con el incremento de sus actividades microbicidas

y la producción de otras citoquinas como la IL-12, que tiene efecto sobre las células
del sistema inmunitario adaptativo.La inducción de la síntesis de IL-2 representa un
mecanismo de retroalimentación (feedback) positivo en el contexto de la inmunidad
especifica mediada por células, ya que esta citoquina actúa como un potente inductor
de la generación y proliferación de linfocitos T CD4+ del subtipo Th1 (Boehm y col.,
1997).

2.12 Actividad antioxidante

Los radicales libres son átomos o grupos de átomos independientes que contienen
uno o más electrones desapareados en los orbitales atómicos. Este electrón
desapareado confiere a la molécula una alta reactividad con otras moléculas para
aparear dicho electrón esto es la base de su toxicidad.
39
La vida media biológica del radical libre es de microsegundos, pero tiene la capacidad
de reaccionar con todo lo que esté a su alrededor provocando un gran daño a
moléculas, membranas celulares y tejidos. Los radicales libres no son intrínsecamente
deletéreos; de hecho, nuestro propio cuerpo los produce en cantidades moderadas
para luchar contra bacterias y virus (Halliwell & Gutteridge, 1989).

2.12.1 Especies reactivas de oxigeno (ERO)

Las ERO, hace referencia a aquellos radicales libres como: radical anión superóxido
(O2¯), radical hidroxilo (OH) y las especies no radicales: peróxido de hidrógeno
(H2O2), oxígeno molecular (O2) y NO (Servais & Koubi, 2003)

La oxidación es fundamental en el ser humano para la producción de energía, tanto en

individuos sanos en etapas de crecimiento donde existe una mayor actividad
metabólica o en situaciones en las que existe procesos inflamatorios donde se genera
una demanda tisular de O2 generando un desequilibrio por una producción excesiva
de radicales libres o por una disminución de la capacidad antioxidante del organismo,
produciendo daños oxidativos, este proceso es conocido como “estrés oxidativo”
(Servais & Koubi, 2003).

2.12.2 Daño o estrés oxidativo

El oxígeno molecular (O2) se encuentra en su forma más estable como estado tripleta
(unión de dos átomos de oxígeno por medio de un enlace covalente triple) que le
confiere menor reactividad. El "estrés oxidativo" puede provenir de una deficiencia del
sistema de defensa antioxidante. Un incremento de la formación de ERO cuya alta
reactividad puede generar: daño de la membrana celular, alteraciones en la estructura
y función de células (González, 2009).

El estrés oxidativo se presenta en diversos estados patológicos en los cuales se altera

la funcionalidad celular, contribuyendo o retroalimentando el desarrollo de
enfermedades degenerativas como la aterosclerosis, cardiomiopatías, enfermedades
neurológicas y cáncer (Servais & Koubi, 2003).

40
Las principales fuentes de ERO son los leucocitos y las células endoteliales que
liberan dicha sustancia al espacio extracelular tras la exposición a agentes
quimiotácticos, inmunocomplejos o estimulación fagocitaria, el proceso se lleva a
través de la acción enzimática de NADPH oxidasa durante el estallido respiratorio, la
cadena de transporte electrónico, la descarga respiratoria de los fagocitos, la reacción
de la xantina oxidasa y el sistema enzimático del citocromo P450 (Servais & Koubi,
2003).

Efectos nocivos de las ERO

Se ha relacionado el incremento de las ERO con la alteración de diferentes

macromoléculas como los lípidos (ácidos grasos poliinsaturados). Destrucción de las
proteínas de la membrana ocasionando muerte celular con el aumento de la
permeabilidad vascular, oxidan aminoácidos como la fenilalanina, tirosina, triptófano,
histidina y metionina consecuentemente se forma entrecruzamiento de cadenas
peptídicas que impiden el desarrollo normal de sus funciones (transportadores iónicos
de membrana, receptores y mensajeros celulares, enzimas que regulan el
metabolismo celular, etc. (Halliwell & Gutteridge, 1989).

El incremento de las ERO eleva la activación del NF-κB el cual es muy importante en
la inflamación, debido al control que ejerce en la transcripción de genes que codifican
la expresión de IL-1, TNF-α, citoquinas, proteínas de la fase aguda, factores de
crecimiento, y la expresión Cox–2, iNOS y la FLA2 e intervienen como mediadores a
través de la generación de sustancias quimiotacticas y la inducción de la expresión de
moléculas de adhesión (Fan, 2002).

Sistemas de defensa antioxidante

Todos los seres vivos que utilizan el oxígeno para obtener energía, liberan ERO, por
lo tanto se requieren mecanismos de defensa que las neutralicen, a esta defensa se la
denomina antioxidante y se considera como tal a cualquier sustancia que en
concentraciones normales posea una afinidad mayor que cualquier otra molécula para
interaccionar con un radical libre, el antioxidante, al reaccionar con un ERO le cede un

41
electrón, el cual anula la reactividad e inhibe la generación de radicales libres o se
oxida a su vez y se transforma en ERO débil no toxico (Valko, Leibfritz, & Moncola,
2007). En general, los sistemas antioxidantes se pueden clasificar en: hidrofílicos,
hidrofóbicos, antioxidantes endógenos, antioxidantes exógeno y antioxidante
hidrosoluble (Valko, Leibfritz, & Moncola, 2007).

2.12.3 Relación entre el estrés oxidativo y la inflamación.

Es conocida la relación que existe entre el estrés oxidativo y las enfermedades

inflamatorias (Herencia et al., 2001). La reacción inflamatoria se caracteriza por la
híper producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, agentes oxidantes que
pueden desencadenar por sí solos una respuesta inflamatoria. Los antioxidantes como
los polifenoles en muchas ocasiones presentan a su vez un efecto antiinflamatorio
(Yoshimoto, 1983).

Es posible que los efectos farmacológicos de los antioxidantes estén relacionados con
el metabolismo del NO. En primer lugar, los antioxidantes pueden preservar las
funciones beneficiosas del NO, al captar directamente aniones superóxidos (Sichel,
1991) y por tanto impedir la interacción con el NO generado; en segundo lugar, los
antioxidantes son capaces de inhibir la expresión de la iNOS (Camuesco, 2004); y por
último, actúan como potentes captadores de radicales peroxinitrito (Flaenen, 1997).
En consecuencia, los antioxidantes pueden prevenir los efectos perjudiciales
generados por el NO en situaciones de inflamación.

42
3 ANTECEDENTES

El empleo de las plantas medicinales como una alternativa de tratamiento medicinal y

farmacológico ha conllevado a un marcado y ascendente desarrollo de diversos
estudios de plantas para el uso medicinal y se ha dado un enfoque particular a sus
metabolitos secundarios que pueden presentar un alto potencial inmunomodulador.

Las plantas medicinales son consideradas como una de las formas más antiguas de
tratamiento de diferentes dolencias. Algunas especies del genero Piper de la familia
Pipereceae fueron estudiadas ampliamente, de las cuales varias son utilizadas en la
medicina tradicional como antiinflamatorio (Feio, Desmarchelier, & Gurni, 1996).

La especie P. peltatum es utilizada con diversos fines terapéuticos en regiones de la

Amazonía peruana y boliviana. En el norte de La Paz, se la conoce popularmente
como “sipusipu” y es utilizado como diurético, antipirético y como agente
antiinflamatorio, (Alzamora & Et al, 2007).

En América Latina existen pocos estudios sobre la actividad antioxidante del género
Piper. De 15 especies vegetales provenientes del Ecuador, en seis extractos se
demostró actividad antiinflamatoria en un modelo in vivo inducido por carragenina y en
tres extractos se determinó actividad antioxidante en modelos in vitro.

En Bolivia, algunas etnias utilizan plantas del genero Piper como antiparasitario
contra la malaria. Las especies P. aduncum, P. leavilimbum y P. rusbyi presentan
actividad leishmanicida y tripanocida contra especies como L. amazonensis,
Leishmania sp y Trypanosoma cruzi. Otras especies son P. lanceolatum y P.
callosum, se usan en casos de Viruela y las hojas de P. peltatum se aplican en forma
de cataplasma para ayudar en la inflamación (Flores, E., 2006)

Los diversos compuestos aislados de plantas del género Piper, compuestos fenólicos,
alcaloides y flavonoides reportan actividad leishmanicida significativa. El extracto
etanólico de P. peltatum presentó mayor actividad anti-leishmania con respecto a la
fracción de hexano, IC50 de 27,1 µg/ml (Quiñones Dextre, 2018).

43
En las especies del género Piper también se identificaron aceites esenciales con
actividad antimicrobiana, (hongos y bacterias) y antiprotozoarios, (Leishmania spp.
Plasmodium spp. y Trypanosoma spp.), también se lo reporta como inhibidora de
acetilcolinesterasa, como antiinflamatorio y con actividad citotóxica frente a diferentes
líneas celulares melanómicas, gástricas y de mama, (Quiñones Dextre, 2018).

Bermúdez y col, el año 2017 demostraron estadísticamente que el extracto de hojas

de P. peltatum, presenta una actividad antiinflamatoria moderada a 200 ppm con un
porcentaje de inhibición inflamatoria de 67.56 +/- 0.46%; aunque inferior con la
sustancia de referencia (ácido acetilsalicílico, 200 ppm) que presentó un porcentaje de
inhibición inflamatorio de 73.13 +/- 0.35% y un IC50 = 27.7 μg/ml y una actividad
antioxidante no significativa, IC50 de 3891.67 μg/ml.

También se evaluó la actividad antiinflamatoria del extracto de P. peltatum a dosis de

1, 2 y 3 mg/kg de peso, mediante la técnica de inducción de edema plantar por
carragenina al 0.05%, en ratas. Los datos fueron evaluados mediante una
comparación de medias y análisis de varianza, del cual se determinó diferencia
estadísticamente significativa entre el grupo tratado y el grupo control (Muñoz M. A.,
2014).

Emerson Silva y col. (2013) en un estudio sobre la actividad antioxidante y citotóxica

del compuesto 4-nerolidilcatecol (4-NC) de P. peltatum, mostraron actividad
antioxidante significativa mediante la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
(DPPH), sin embargo, el 4-NC mostro una mejor actividad citotóxico (IC50= 31.4 µM).
El 4-NC resulto ser más inestable que sus derivados perdiendo más del 80% de su
actividad antioxidante tras el almacenamiento a -20 °C durante 30 días.

Se ha descrito la actividad citotóxica de la 4-NC mediante la inhibición del crecimiento

in vitro de líneas celulares de melanoma y células de fibroblastos normales IC50= 20-
40 µM e IC50= 50 µM, respectivamente. El 4-NC indujo la acumulación de proteínas
ubiquitinas como Mcl-1 y actuó como inhibidor del proteasoma en las células de
melanoma e inhibe a la topoisomerasa I humana, que se ha sugerido que es el
mecanismo de la acción citotóxica de 4-NC en las células tumorales (Arroyo 2016)
44
Puertas y Benjamin el año (2009), respaldan el uso de P. peltatum en la medicina
tradicional de Colombia y las regiones subtropicales de América del Sur; demostrando
un potencial antioxidante de las fracciones que fue considerablemente más alto que el
extracto crudo. Aunque todas las muestras evaluadas mostraron buena capacidad
antioxidante frente a los métodos aplicados, la identificada como fracción 1 fue la más
promisoria, inclusive más eficiente que el ácido ascórbico (inhibición radical DPPH: 75
y 68 %, respectivamente). Lo anterior permite proponer a P. peltatum como una fuente
natural de fenoles con un alto uso potencial en la industria farmacéutica y de
alimentos.

En un estudio realizado en las sustancias peltatol A, B, C a partir de extracto

metanólico de hojas de P. peltatum de concentración 1 y 10 μg/ml, observaron la
inhibición de la muerte celular inducida por VIH- (Moreira & Spitzer, 2000).

Las especies P. tricuspe, P peltatum, P gorgonillense, P. multiplinervium, P.

tuberculatum y P. Hispidum fueron evaluadas como antibacterianos a partir de
extracto etanólico de hojas mediante los métodos de dilución en placa de agar y
difusión. Los resultados muestran que todas las especies presentan algún tipo de
actividad en concentraciones de 40 mg/ml, excepto P. tuberculatum. (Pino, 2008)

45
4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las enfermedades inflamatorias en la actualidad representan uno de los problemas

médicos más importante, muchas de estas son causadas por una activación
descontrolada y continua de la respuesta inflamatoria que causa daño en los tejidos.
Modular el sistema inmunitario mediante su estimulación o supresión puede contribuir
al mantenimiento de un buen estado de salud. La medicina tradicional se constituye
en un hallazgo de moléculas (metabolitos secundarios) con capacidad de activar y
controlar los mecanismos de defensa del huésped como una herramienta terapéutica
adicional a los actuales tratamientos.

Otra característica de las enfermedades inflamatorias es la activación de oxidantes

que son radicales que conducen a reacciones no controladas, resultando en daños
oxidativos importantes en macromoléculas biológicas como ácidos nucleicos,
proteínas y lípidos (Halliwell, 1994). Los metabolitos secundarios presente en muchas
especies vegetale con actividad antioxidante pueden disminuir el daño producido por
los radicales libres.

La especie P. peltatum, continua siendo utilizado prácticamente como tratamiento

para una variedad de enfermedades con procesos inflamatorios. Para determinar el
papel de la planta en estudio como antiinflamatorio y antioxidante, en el presente
estudio trabajamos con los EEP y EAP y evaluamos la capacidad de estimulación o
supresión de mediadores inflamatorios que regulan el sistema inmunitario. Los
resultados permitirán generar un respaldo científico sobre el uso tradicional de la
planta.

46
5 JUSTIFICACIÓN

La inflamación se inicia como un mecanismo de defensa del organismo y se produce

ante estimulos perjudiciales como factores mecánicos, físicos, químicos e
inmunologico necesaria para la supervivencia (Salinas M. , 2011). Estudiar a la
especie P. peltatum como una alternativa natural de tratamiento representaría una
opción para el alivio de estos sintomas en diferentes enfermedades con proceso
inflamatorio, la medicina tradicional desde tiempos ancestrales se caracteriza por
presentar menor cantidad de efectos adversos contra algunos fármacos sintéticos
comerciales, los cuales poseen una amplia gama de efectos colaterales que causan
daño en la salud del paciente. Asi mismo, la planta en estudio utilizada
tradicionalmente como antiinflamatorio es de fácil accesibilidad principalemente para
la población rural de escasos recursos.

Dentro de la familia Piperaceae se encuentran un abúndante número de especies,

algunos de ellos, como el género Piper han sido reportados con actividad
antiinflamatoria, antioxidante, antitumoral e insecticida (Soto, 2015). Estudios
realizados con moléculas como los flavonoides, fenoles, piperina, fitoesteroles, amidas
y el 4-nerolidilcatecol (4-NC) (Soto, 2015) han demostrado tener resultado importante
combatiendo la inflamación y/o como inmunomoduladores de algunas enfermedades.
Al describir las propiedades curativa de la planta, se debe considerar que las
propiedades dependen de la región de cultivo, las condiciones del clima, fase
vegetativa, entre otros factores, lo que conlleva a considerar un estudio en nuestro
medio (Townsend, 2003).

En Bolivia la medicina tradicional representa una alternativa de tratamiento para

diferentes enfermedades, la especie P. peltatum es utilizada tradiconalmente como
antiinlfamatorio. Sin embargo, existen escasas investigaciones de su efecto sobre el
sistema inmunitario. Por tanto, es importante contribuir con investigaciones que
permitan dilucidar si las propiedades curativas atribuidas por los pobladores son
ciertas.

47
5.1 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

 ¿Cual es el papel de extractos de P. peltatum sobre la expresión de citoquinas

inflamatorias en células mononucleares de sangre periférica humana y
macrofagos murinos Raw-264.7?

6 OBJETIVOS

6.1 Objetivo general

 Evaluar el efecto antiinflamatorio y antioxidante de extractos de hojas de P.

peltatum (sipusipu), “in vitro” en células mononucleares de sangre periférica
humana y macrofagos murinos Raw-264.7

6.2 Objetivos específicos

 Determinar la concentración de extractos de P. peltatum a la cual presenta

citotoxicidad en células mononucleares de sangre periférica humana.
 Evaluar el efecto de extractos de P. peltatum sobre la proliferación celular.
 Determinar el efecto de extractos de P. peltatum sobre la producción de la
citoquina IFN-γ en células mononucleares de sangre periférica humana.
 Determinar el efecto de extractos de P. peltatum sobre la producción de la
citoquina IL-10 en células mononucleares de sangre periférica humana.
 Determinar la actividad captadora de radicales libres del extracto de hojas de P.
peltatum, mediante el ensayo de decoloración del radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH*).
 Evaluar el efecto de extractos de P. peltatum en la producción óxido nítrico en
la línea celular RAW 264.7.

48
7 MATERIAL Y MÉTODOS

7.1 Diseño de la investigación

7.1.1 Lugar de estudio

El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Inmunología del

Instituto Seladis de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la UMSA.

7.1.2 Tipo del estudio

Experimental comparativo “in vitro”.

7.1.3 Muestra

Hojas de la especie de Piper peltatum (sipusipu).

7.1.4 Comprobación e identificación taxonómica del material vegetal

La comprobación e identificación taxonómica de las hojas de P. peltatum (Sipusipu),

fue realizado en el herbario de la facultad de Biología de la UMSA, ver anexos.

7.1.5 Reactivo biológico:

En el estudio “in vitro” de la actividad antiinflamatoria y antioxidante se utilizaron

células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC-humana) y la línea
celular RAW 264.7. (Macrófagos murinos).

7.2 Materiales, reactivos y equipos

7.2.1 Materiales

- Jeringas 3, 5, 10 y 20 ml
- Tubos Falcón estériles de 5 y 50 ml (Becton Dickinson)
- Pipetas de plástico estériles de 5 y 10 ml (greiner bio-one)
- Pipetas Pasteur de vidrio 9¨ autoclavadas (WWR internacional)
- Placas de cultivo de 96 pozos, estériles (Becton Dickinson)
- Placas de ELISA de 96 pozos (Becton Dickinson)

49
 - Micropipetas
- Propipeta automática
- Gradilla
- Filtros estériles de 20 mm de espesor

7.2.2 Reactivos

- Ficoll hipaque, densidad=1,077

- Medio de cultivo RPMI suplementado (SIGMA-ALDRICH)
- Medio de cultivo RPMI suplementado, sin rojo fenol (SIGMA-ALDRICH)
- Medio de cultivo DMEM suplementado (SIGMA-ALDRICH)
- Suero fetal bovino (GIBCO)
- Kit de MTT (Invitrogen)
- PBS celular, estéril
- PBS- tween
- Alcohol al 70 %
- Azul tripán 0,2 % (SIGMA)
- Fitohemaglutinina - FHA
- Lipopolisacarido LPS
- Kit de interferón-γ humano IFN-γ (Becton Dickinson)
- Kit de Interleuquina – 10 (IL-10) (Becton Dickinson)
- Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH*) SIGMA
- Reactivo de Griess, SIGMA

7.2.3 Equipos

- Campana de flujo laminar (NUAIRE CLASS II)

- Microscopio (OLYMPUS)
- Microscopio invertido (OLYMPUS)
- Estufa de dióxido de carbono CO2 (NUAIRE)
- Lector de ELISA
- Balanza analítica
50
7.1. PROCEDIMIENTO

7.1.1. Recolección del material vegetal

Las hojas de P. peltatum fue recolectada a una altitud que oscila entre 500 y los 1500
metros sobre el nivel del mar a temperatura promedio de 27°C en la provincia Sud
Yungas - Municipio de Palos Blancos del Departamento de La Paz - Bolivia.

Figura 19. Recolección de las hojas de Piper. peltatum

Fuente: recolección propia

7.1.2. Limpieza y desinfección del material vegetal

El material vegetal recolectado se limpió y se descartaron aquellas hojas de aspecto

físico deteriorado y que presentaban una coloración amarillenta. Las hojas fueron
lavadas y secadas durante dos días bajo sombra a temperatura ambiente 25 ± 10 °C.
Una vez seco, se molió en un mortero limpio para obtener partículas finas, el producto
fue almacenado en frascos de vidrio en oscuridad hasta que se sometieran a
extracción con etanol y agua.

51
7.2. Preparación de los extractos

7.2.1. Extracto etanólico de P. peltatum (EEP)

Por cada 25 gramos de material vegetal molido, se adicionó 250 ml de etanol al 96%.
Se cubrió completamente de la luz y se dejó macerar por 48 horas a temperatura
ambiente.

Concentración mediante rotavapor

Este procedimiento consiste en evaporar mediante una combinación de temperatura

provista por un baño calefactor y la generación de presión de vacío. Se produce una
rotación que aminora el peligro de ebullición y se acelera la evaporación mediante el
aumento de la superficie de la solución.

Procedimiento

Después de la maceración se filtró y se colocó en un balón hasta la mitad de su

capacidad. Una vez evaporado todo el solvente llegando a sequedad del extracto se
retiró el balón del baño calefactor. El extracto contenido en el balón fue retirado en un
frasco ámbar y conservado a -20°C para evitar la degradación de sus compuestos
bioactivos.

7.2.2. Extracto acuoso de P. peltatum (EAP)

Por cada 25 gramos de material vegetal molido, se adicionó 250 ml de agua destilada.
Se cubrió completamente de la luz y se dejó macerar por 48 horas a temperatura
ambiente.

Método de liofilización

Según Voigt en 1982, describe que la liofilización se basa en el hecho de que el agua
en estado de congelación, todavía tiene cierta presión de vapor y que, por tanto,
puede ser separada del sistema por sublimación.

52
En el diagrama de fases del agua adjunto, se puede observar el punto triple del agua
(0,01 °C; 4.58 Torr), para lo cual si se elige una presión inferior a 4.58 Torr, se puede
comprobar que a temperaturas inferiores a 0.01 °C, se produce una transformación
directa de la fase sólida en fase gaseosa, sin pasar por el estado líquido, el hielo se
sublima.

Figura 20. Diagrama de estado del agua

Fuente: (Voigt, 1982)

Procedimiento

Después de la maceración se filtró, se colocó aproximadamente 5 ml del material

vegetal filtrado en frascos ámbar tapa rosca. Los frascos fueron llevados a -80°C para
su congelación, el proceso de la liofilización tuvo un tiempo de duración de 20 a 24
horas. Una vez transcurrido el tiempo, para una mejor conservación de sus
compuestos bioactivos, el extracto liofilizado se dejó a -20°C hasta su uso.

53
7.3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana
(PBMC-humana)

Se tomaron 20 ml de sangre periférica de voluntarios (as), se agregó de inmediato

ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) relación 1:10 a la jeringa. Posteriormente se
trabajó en condiciones de esterilidad en la campana de flujo laminar. La muestra de
sangre se la diluyó con PBS, pH 7.4, 0.15 M,, relación 1:1.

5 ml de la muestra fueron estratificadas sobre Ficoll Hypaque, densidad 1.077, se

centrifugó 20 minutos a 1500 rpm.

Figura 21. Muestra diluida sobre Ficoll Hypaque.

54
 Figura 22. Muestra centrifugada con Ficoll Hypaque.

El halo de PBMC-humana fue separado en un tubo falcón estéril de 15 ml, el cual se

volvió a centrifugar por 10 minutos a 800 rpm. Posteriormente se eliminó el
sobrenadante, el pellet se removió cuidadosamente y fue lavado con PBS pH 7.4, 0.15
M, por tres veces más. El pellet se resuspendió con 1 ml de medio de cultivo para
realizar el ajuste celular correspondiente.

7.4. Ajuste de la densidad celular

A partir del recuento de células se ajustó la densidad celular a 2,5x106 células/ml.

Figura 23. Cámara de Neubauer

55
7.5. Viabilidad celular

Para determinar la viabilidad celular se empleó azul tripán al 0.2%, colorante azoico
que se utiliza para ensayos de viabilidad, el cual permite diferenciar células vivas de
células muertas. Las células vivas con la membrana celular intacta no son coloreadas
debido a que son muy selectivas a los compuestos que dejan pasar a través de la
membrana, sin embargo, el colorante atraviesa la membrana de las células muertas.
Por lo tanto las células muertas se muestran en un distintivo color azul.

Se observa de inmediato al microscopio con previa homogenización. Con el recuento

de células realizado en la cámara de Neubauer, se calculó la densidad celular y luego
se realizó el ajuste.

El recuento de las células se realizó en los retículos de conteo de glóbulos blancos en

la cámara de Neubauer, para determinar el porcentaje de viabilidad (para continuar
con los experimentos se requiere de una viabilidad igual o mayor al 95%).

El cálculo re realizó de la siguiente manera:

% de células vivas= (N° de células vivas/ N° de células totales) x 100

Una vez que se ajustó la concentración de las células, se colocaron las PBMC-
humana en policubetas de 96 pozos a una concentración de 2.5 x 106 células/ml por
triplicado.

Para el cultivo de las células se empleó el medio (RPMI) SIGMA®, suplementado con
10% de suero fetal bovino inactivado (FBS).Como control negativo (C-) se consideró
solo células y el control positivo (C+) células estimuladas con fitohemaglutinina (FHA)
a una concentración de 8 μg/ml. La concentración del EEP y EAP, a la cual no
presentan citotoxicidad, fue determinado a partir de 1; 10; 25; 50 y 75 (μg/ml).
Posteriormente se llevó a incubación durante 48 horas a 37 °C, una atmósfera con 5%
de CO2 y 95% de humedad relativa.

56
7.6. Test de Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil tetrazol MTT

Fundamento del método

Según José, (2013) la citotoxicidad es definida como la capacidad de ciertos
compuestos de provocar una alteración en las funciones celulares básicas e induce
daño en las células. El ensayo MTT es uno de los test más utilizados para estudios de
citotoxicidad in vitro.

La técnica fue descrita por Mosmann en 1983 y se basa en el análisis de la actividad

metabólica celular. La sal soluble de Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil
tetrazol (MTT) es transformada en cristales de formazán mediante la actividad de la
enzima de la cadena respiratoria mitocondrial succinato-reductasa, esta enzima se
encuentra únicamente activa en las células viables, los cristales azules de formazán
no son insolubles en el agua, pero solubles en dimetil sulfoxido (DMSO). De manera
que en el ensayo, el número de células vivas será directamente proporcional a la
cantidad de formazán producido.

Figura 24. Reacción química de MTT (Aguilar 1996)

Procedimiento

La policubeta que contiene las células se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm,
luego las células se incubaron con una solución de 100 μl de RPMI sin rojo fenol y 10
μl de reactivo MTT a una concentración de 5 mg/ml durante 4 horas a 37°C. Durante
57
ese tiempo las células vivas, metabolizan el MTT transformándolos en pequeños
cristales de formazán, gracias a la actividad enzimática de sus mitocondrias.

Posteriormente, se adicionó 100 μl de SDS para disolver el formazán y se incubó por

4 horas más, para luego leer la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm
mediante lector de placas de Elisas.

La absorbancia es proporcional a la cantidad de células viables presentes en el

cultivo. El valor obtenido de las células consideradas como control negativo se tomó
como referencia (100% de viabilidad) a partir de él se calculó el % de viabilidad de las
células expuestas a las distintas concentraciones de los extractos.

7.7. Evaluación de citoquinas en sobrenadantes de PBMC-humana

El análisis de los niveles de las citoquinas INF-γ e IL-10 en sobrenadantes de cultivo

PBMC-humana se realizó mediante la técnica de ELISA tipo sándwich (por sus siglas
en inglés, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). OptEIA (BD Pharmingen),
siguiendo las instrucciones del proveedor.

Procedimiento

Primero se sensibilizó la placa de ELISA de 96 pozos con 100 μl en cada pozo de

anticuerpo de captura de la IL-10 e IFN-γ el cual se diluyo con PBS pH 7.4, 0.15 M, se
incubo a 4°C durante la noche. Luego se realizó el lavado con 300 μl de PBS tween,
para posteriormente bloquear los pozos de la placa con 200 μl de buffer de bloqueo y
se dejó por 1 hora a temperatura ambiente. Se procedió el lavado de la placa con PBS
tween.

Se realizó una curva patrón, los estándares fueron diluidos en solución de dilución,
PBS pH 7.4, 0.15 M, tween, 0.05 % para el IFN-γ (IFN-γ recombinante de ratón - BD
Pharmingen) de concentración inicial del estándar de 25 ng/ml, los rangos fueron de
250 a 1,75 pg/ml. Para la cuantificación de la IL-10, de concentración inicial del
estándar 41 ng/ml (IL-10 recombinante de ratón - BD Pharmingen), los rangos fueron

58
455.5 a 7,12 pg/ml. Luego se añadió 100 μl de la muestra a cada pozo y se incubo a
temperatura ambiente durante 2 horas.

Se realizó nuevamente el lavado con PBS tween para añadir 100 μl de la solución de
detección más la estreptovidina (anticuerpo de detección diluido en solución de
dilución 1:125 para el IFN-γ y 1:50 para IL-10; estreptovidina diluida en solución de
dilución 1:250 para el IFN-γ e IL-10), se incubó durante 1 hora. Las placas fueron
nuevamente lavados con PBS tween y se agregó a cada pozo 100 μl de sustrato
(TMB) y se dejó actuar por 15 minuto en oscuridad. Se agregó 50 μl de solución de
parada (ácido sulfúrico).

La absorbancia es proporcional a la concentración de las citoquinas obtenida a una

longitud de onda de 450-630 nm. Los valores de absorbancia obtenidos se
interpolaron en una curva patrón a partir de titulaciones del estándar.

7.8. Determinación de la actividad antioxidante

La valoración de la capacidad antioxidante se basa en la determinación de la

reducción del daño oxidativo producido por un agente oxidante a un sustrato oxidable.
Dicha inhibición es directamente proporcional a la actividad antioxidante del
compuesto que se valora.

7.9. Producción de óxido nítrico en la línea celular RAW 264.7

Fundamento del método

El NO es un gas inestable que origina otros productos como nitratos y nitritos. Para su
valoración se suelen emplear métodos indirectos como el ensayo de Griess, que
determina los productos estables de la oxidación del NO mediante la valoración
colorimétrica de la concentración de nitritos (NO2) obtenidos en el sobrenadante del
cultivo celular (Weissman, 2001).

Griess en 1879 describió por primera vez un ensayo fundamentado en la reacción de

diazotización a partir de naftiletilendiamina y sulfanilamida, bajo condiciones ácidas,
que da origen a un compuesto coloreado azólico. El reactivo de Griess está
59
compuesto por una solución de N-1-(naftil) etilendiamina dihidrocloruro y una solución
de sulfanilamida. La sulfanilamida reacciona con los NO2 en medio ácido y esto,
seguido del acoplamiento con aminas bicíclicas tales como el N-1-(naftil) etilendiamina
dihidrocloruro, origina un complejo coloreado púrpura la cual presenta una rápida
oxidación a nitritos adecuado para la determinación espectrofotométrica, permitiendo
determinar de manera indirecta la producción de NO. (Miranda, 2001).

Procedimiento

Las células RAW 264.7, se sembraron a una concentración de 2,5 x 106 células/ml en
medio de cultivo Dulbecco´s modified Eagle´s medium (DMEM). Posteriormente las
células se trataron con 1,10 y 25 µl/ml de EEP y 1,10 y 25 µl/ml de EAP más LPS 200
ng/ml, la policubeta que contiene a las células tratadas se llevó a incubación por 48 h
a 37 °C una atmósfera con 5% de CO 2 y 95% de humedad relativa.

La acumulación de NO2 se determinó mediante la mezcla de 50 µl del sobrenadante

del medio de cultivo con igual cantidad del reactivo de Griess relación 1/1, durante 15
minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Al término de la reacción se realizó la
lectura a 540 nm, usando un lector de placas de Elisa. La concentración de NO2 (µM)
se obtuvo por interpolación en una curva estándar de NaNO2 de concentraciones entre
1,756 y 100 µM.

Se consideró como control positivo a las células estimuladas con LPS, y las células
sin LPS, EEP y EAP como control negativo. Los resultados se expresaron como % de
concentración de NO2 (µM).

7.10. Ensayo de decoloración del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH*)

Fundamento del método

Para la cuantificación de la actividad antioxidante se utilizó el reactivo de DPPH*. Éste
método fue originalmente diseñado por Marsden Blois en 1958, y dentro de sus
modificaciones posteriores destaca la de Brand-Williams 1995, que es el método
utilizado en la actualidad.

60
La reacción química consiste en que el radical DPPH* sustrae un átomo de hidrogeno
proveniente de un donador (compuesto químico puro o un extracto), producto de este
cambio se desarrolla un cambio de color de violeta a amarillo al disminuir la
concentración del radical libre y presenta un máximo de absorbancia a 517 nm.
(Molyneux, 2004).

Figura 25. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante
(Alam et al., 2019)

Los resultados del ensayo DPPH* se han presentado de diferentes maneras. La

mayoría de los estudios expresan los resultados como el valor de la concentración
máxima de la media inhibitoria (IC50), definido como la cantidad de antioxidante
necesario para disminuir la concentración inicial de DPPH* al 50%. Este valor se
calcula graficando el porcentaje de inhibición contra la concentración del extracto.
(Deng. 2011).

Procedimiento

Para la preparación del radical DPPH*. Se disolvieron 2 mg de DPPH* Sigma-Aldrich

en 100 ml de metanol grado analítico, posteriormente se dejó reposar hasta que el
reactivo se estabilice a temperatura ambiente y conservado a 4°C en un frasco ámbar.

61
Se preparó una solución patrón de ácido ascórbico a diferentes concentraciones de
250 125 76 35 17 y 7 μg/ml para la elaboración de una curva de calibración. Ambos
extractos fueron medidos por triplicado a diferentes concentraciones de 250 125 76 35
17 y 7 μg/ml, el mismo procedimiento se realizó para la sustancia patrón ácido
ascórbico.

A 187,5 μl del radical DPPH* se añadió 62,5 μl de cada una de las diluciones de ácido
ascórbico del extracto acuoso y etanólico, se mezcló y se dejó reposar en la oscuridad
por 15 minutos. Posteriormente se midió la absorbancia a 517 nm. El porcentaje de
captación de radicales libres DPPH* se calculó en base a la siguiente ecuación
(Molyneux, 2004).

% de captación de DPPH = (Abs. DPPH – Abs. Muestra) x100

Abs. DPPH

El porcentaje de captación representa la pérdida del color purpura a amarillo del

radical DPPH*, cuando se agrega un compuesto antioxidante, disminuye así la
absorbancia de la solución, que es medida a 517 nm.

62
Análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± de la desviación estándar (D.E). Las

diferencias entre medias fueron evaluadas con la prueba T para dos muestras
relacionadas a un nivel de confianza del 95%. Los datos estadísticamente
significativos fueron representados como (p≤0.05), haciendo uso del programa SPSS
versión 22.

8. RESULTADOS

8.1. Ensayo de citotoxicidad

Para evaluar el posible efecto tóxico del EEP y EAP sobre PBMC-humana, se
incubaron las células durante 24 horas con diferentes concentraciones de ambos
extractos. El porcentaje de viabilidad celular luego de ser tratada con diferentes
concentraciones del EEP y EAP, se evaluó con respecto al control (solo células), valor
que se tomó como 100% de viabilidad.

63
Efecto citotóxico del extracto etanólico de P. peltatum (EEP)

La viabilidad de las PBMC-humana que fueron expuestas a 25 μg/ml o más del EEP
se vio afectada significativamente con relación al control (células vivas 84,2 %),
(p<0.05). Las concentraciones del extracto de 10 y 1 μg/ml, no presentaron ningún
efecto toxico, manteniéndose vivas más del 90% de las células.

Gráfica 1. Actividad citotóxica del extracto etanólico en PBMC-humana. Los

resultados se expresan como medias y desviación estándar de un mínimo de tres
experimentos independientes. *(Indica significancia estadística, p≤ 0.05 respecto al
control positivo). Se observa que concentraciones superiores a 10 μg/ml presentan
citotoxicidad.

64
Efecto citotóxico del extracto acuoso de P. peltatum (EAP)

La viabilidad de las PBMC-humana que fueron expuestas a 25 μg/ml y

concentraciones mayores del EAP, mostraron efecto citotóxico con un (p<0.05) con
relación al control. Las concentraciones del extracto de 10 y 1 μg/ml, no mostraron
ningún efecto, manteniéndose vivas las células en porcentaje similar al control de
células no tratadas.

Gráfica 2. Actividad citotóxica del extracto acuoso en PBMC-humana. Los

resultados se expresan como medias y desviación estándar de un mínimo de tres
experimentos independientes. *(Indica significación estadística p≤ 0.05 respecto al
control positivo). Se observa que concentraciones superiores a 10 μg/ml presentan
citotoxicidad.

65
8.2. Efecto del EEP y EAP sobre la proliferación en PBMC-humana

Para evaluar el valor terapéutico del EEP y EAP, fue importante analizar su efecto
sobre PBMC-humana. Se analizó el efecto del EEP y EAP sobre la proliferación de
células activadas con FHA, mediante el método MTT. Como se puede observar en la
Figura 3, la proliferación celular a concentraciones de 1 y 10 μg/ml del EEP y EAP no
se vio afectado de manera significativa con respecto a las células estimuladas con
FHA (control positivo).

Gráfica 3. Efecto del EEP y EAP Sobre la proliferación en PBMC-humana. Los

resultados se expresan como medias y desviación estándar de un mínimo de tres
experimentos independientes. Se observa que concentraciones de 1 y 10 μg/ml no
presentan ningún efecto toxico sobre la proliferación celular.

66
8.3. Efecto del EEP y EAP en la producción del IFN-γ en PBMC-humana bajo el
estímulo de fitohemaglutinina (FHA)

La activación de las células es importante ya que denota su capacidad de respuesta

ante un estímulo, por lo que es vital averiguar el efecto de los extractos sobre la
producción de IFN-γ por PBMC humana estimuladas con FHA. Como se puede
observar, el EEP de concentración 10 μg/ml indujo una marcada producción de IFN-γ,
el efecto fue mayor en un 36,5% respecto al control positivo y 6,5% más que el EAP a
la misma concentración como se observa en la gráfica 4. Ambos extractos EEP y EAP
a una concentración de 1 μg/ml no presentan efecto, comparados con el control.

Gráfica 4. Producción del IFN-γ en PBMC-humana estimuladas con FHA y

tratadas con EEP y EAP. Los resultados se expresan como medias y desviación
estándar de un mínimo de tres experimentos independientes. *(Indica significación
estadística p≤ 0.05 respecto al control positivo). Se muestra que los EEP y EAP
estimulan la producción de IFN-γ a una concentración de 10 μg/ml.

67
8.4. Efecto del EEP y EAP en la producción del IFN-γ en PBMC-humana sin
estimulo.

En la gráfica 5, se muestra el efecto estimulante del EEP a una concentración de 10

μg/ml a través de un marcado incremento en la producción de IFN-γ similar al control
positivo (células estimuladas) y 83,5 % más que el control negativo (solo células). Sin
embargo 1 μg/ml del EEP no presenta el mismo efecto. Por otra parte el EAP a la
concentración de 1 μg/ml y 10 μg/ml no muestran esa capacidad de estimular al IFN-γ.

Grafica 5. Producción de IFN-γ sólo en PBMC-humana y tratadas con EEP y

EAP. Los resultados se expresan como medias y desviación estándar de un mínimo
de tres experimentos independientes. *(Indica significación estadística p≤ 0.05
respecto al control positivo). El EEP muestra una fuerte capacidad de estimulación de
la producción de IFN-γ con respecto al control negativo y similar al control positivo.

68
8.5. Efecto del EEP y EAP en la producción de la IL-10 en PBMC-humana bajo
el estímulo de FHA.

Al presentar un fuerte efecto sobre la producción de IFN-γ, es importante saber si los

extractos tienen efecto sobre la producción de la IL-10 por PBMC-humana
estimuladas con FHA. En la gráfica se observa que el EEP y EAP a 10 μg/ml
presentan un efecto inhibidor en un porcentaje de 21% y 18% respectivamente con
relación al control positivo (p≤0.05). Por otro lado el EEP a 1 μg/ml inhibió solo el 9% y
el EAP a la misma concentración presenta gran dispersión de los datos.

Grafica 6. Producción de la IL-10 en PBMC-humana estimuladas con FHA

tratadas con EEP y EAP. Los resultados se expresan como medias y desviación
estándar de un mínimo de tres experimentos independientes. *(Indica significación
estadística p≤ 0.05 respecto al control positivo). Se observa que el EEP y EAP inhiben
la producción de la IL-10 con respecto al control positivo.
69
8.6. Efecto del EEP y EAP en la producción de la IL-10 en PBMC-humana sin
estimulo.

En la gráfica 7, se puede observar que el EE y EA de 1 y 10 μg/ml en sobrenadantes

de PBMC-humana no presenta ningún efecto sobre la concentración de la IL-10 con
respecto al control negativo (células sin estímulo), (p>0.05).

Grafica 7. Producción de la IL-10 en PBMC-humana sin estímulo y tratadas con

EEP y EAP. Los resultados se expresan como medias y desviación estándar de un
mínimo de tres experimentos independientes. Se observa que células no estimuladas
previamente con FHA, no responden a ningún efecto del EEP y EAP.

70
8.7. Efecto de los extractos sobre la producción del óxido nítrico (NO)

La producción de NO por macrófagos se determinó mediante la reacción de Griess

por medio de la cantidad total de NO2 obtenidos en el sobrenadante del cultivo celular
(Green, 1987). Evaluamos los efectos de 1, 10 y 25 μg/ml del EEP y EAP sobre
macrófagos murinos Raw 264.7 incubadas durante 48 horas en presencia y ausencia
de LPS 250 ng/ml.

En la gráfica 8 los resultados demuestran que la producción de NO en células

activadas con LPS (control positivo) fue evidente con relación a células sin tratar (41,4
μM y 4,47μM de NO2 respectivamente) (p< 0.05). El tratamiento de las células con el
EEP de 10 μg/ml activadas con LPS indujo una reducción del 61,4% y con y 25 μg/ml
se indujo una reducción del 90,9% lo que muestra un potente efecto inhibidor de la
producción de NO respecto al control positivo 100 % μM de NO2. Por otro lado el EAP
de 10 y 25 μg/ml no tuvo un efecto inhibidor significativo sobre la producción de NO.
El extracto acuoso a 1 μg/ml muestra un aumento en la producción de NO, sin
embargo, la diferencia no es estadísticamente significativa, (p=0.08).

71
Grafica 8. Efecto del EEP y EAP sobre la producción de nitritos totales por
macrófagos murinos Raw 264.7 activadas con LPS. Los resultados se expresan
respecto a las células estimuladas con LPS (100% de producción de NO) y se
presentan como medias de un mínimo de tres experimentos independientes. *(Indica
significación estadística p≤ 0.05 respecto al control positivo). Las concentraciones de
10 y 25 μg/ml del EEP presentan fuerte capacidad inhibidora de la producción de NO
con respecto al control positivo. Se observa también que el EEP de 10 y 25 μg/ml
presenta una marcada inhibición de la producción de NO respecto al EAP a las
mismas concentraciones. *(Indica significación estadística p≤ 0.05 respecto al EAP).

72
8.8. Actividad antioxidante

La actividad antioxidante in vitro del EEP y EAP se evaluaron por el método de

inhibición del DPPH el cual reporta sus resultados como IC50 o también denominada
concentración inhibitoria, es decir, la concentración efectiva del antioxidante necesaria
para inhibir la concentración inicial de DPPH en un 50 %.

Se realizó la curva del Ácido ascórbico como estándar de comparación de la actividad

antioxidante con los EEP y EAP.

Tabla 1. Resultados de la curva estándar y actividad antioxidante de ácido ascórbico.

Concentración del ácido % de captación de

ascórbico μg/ml radicales libres
250 73.7
125 44.2
62.5 21.9
31.25 8.3
15.75 3.0
7.875 0.7

73
 90
80 y = 0.3061x + 0.2008
R² = 0.9855
70
60
porcentaje %

50 162.69
40
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300
Ácido ascorbico (μg/ml)

Gráfica 9. Curva de la concentración inhibitoria media del ácido ascórbico en la

actividad antioxidante.

Se observa que el ácido ascórbico a una concentración media de 162.7 μg/ml es

capaz de neutralizar el 50% de radicales libres IC50 (concentración que el extracto
necesita para inhibir al 50%).

Actividad antioxidante del extracto etanólico de P. peltatum

Para determinar la actividad antioxidante del EEP se midió el porcentaje de captación

de radicales libres a diferentes concentraciones de los extractos como se observa en
la Gráfica 10.

74
Tabla 2. Resultados de la actividad Antioxidante del EEP.

Concentración del % de captación de

EEP (μg/ml) radicales libres
1000 84
500 71,7
250 58,9
125 42,6
62,5 16,1
31,25 7,1

Gráfica 10. Porcentaje de Captación de radicales a diferentes concentraciones del

EEP.

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
31,25
62,5 ug/mL 125 ug/mL 250 ug/mL 500 ug/mL 1000 ug/mL
ug/mL
% de captacion 7.15 16.13 42.64 58.93 71.74 84.04

75
 100
90
80
70 y = 0.0715x + 23.311
porcentaje %

60 R² = 0.7495
50 373.27; 50
40
30
20
10
0
0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00
P. peltatum (μg/ml)

Gráfica 11. Curva de la concentración inhibitoria media del EEP en la actividad

antioxidante.

Se observa que el extracto etanólico, a una concentración media de 373,27 μg/ml es

capaz de neutralizar el 50% de radicales libres IC50 (concentración que el extracto
necesita para inhibir al 50%).

Actividad antioxidante del extracto acuoso de P. peltatum.

Para determinar la actividad antioxidante del EAP, se midió el porcentaje de captación

de radicales libres a diferentes concentraciones de los extractos como se observa en
la Gráfica 12.

76
Tabla 3. Actividad Antioxidante del EAP.

Concentración del % de captación de

EAP (μg/ml) radicales libres
1000 59,1
500 34,3
250 16,7
125 8,1
62,5 0,3
31,25 0,3
15,62 0,07

70.00

60.00

50.00

PORCENTAJE
40.00

30.00

20.00

10.00

0.00
15.62ug 31.25ug 62.5ug/ 125ug/ 250ug/ 500ug/ 1000ug/
/mL /mL mL mL mL mL mL
Series1 0.00 0.00 0.30 8.06 16.71 34.33 59.10

Gráfica 12. Porcentaje de captación de radicales a diferentes concentraciones del

EAP.

77
 70
y = 0.0621x - 0.6805
60 R² = 0.9882

50 816.11; 50
porcentaje %

40

30

20

10

0
0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00
P. peltatum (μg/ml)

Gráfica 13. Curva de la concentración inhibitoria media del EAP en la actividad

antioxidante.

Se observa que el EAP a una concentración media de 816,11 μg/ml es capaz de

neutralizar el 50% de radicales libres IC50 (concentración que el extracto necesita
para inhibir al 50%).

78
9. DISCUSIÓN

La especie P. peltatum ha sido utilizada en la medicina tradicional por presentar

actividad antioxidante (Puertas & Benjamin, 2009); es una especie con muchos usos
medicinales en diferentes regiones del mundo y se ha comprobado que los extractos y
sus compuestos bioactivos, tienen actividad antiinflamatoria, diurética, antipirética,
analgésica y antioxidante (Soto, 2015) (Desmarchelie & Ralentización, 2000).Por su
amplio uso tradicional se evaluó el efecto antiinflamatorio y antioxidante de los EEP y
EAP en PBMC-humana y el efecto sobre el óxido nítrico en macrófagos murinos Raw
264.7.

Al iniciar los estudios para conocer más sobre sus efectos en la respuesta inmunitaria,
se analizó su posible efecto citotóxico mediante la determinación de la viabilidad de
las células, luego de 24 horas de incubación en presencia de diferentes
concentraciones de los EEP y EAP. Las concentraciones de 1 y 10 μg/ml no
presentan ningún efecto sobre las células. El extracto acuoso de concentración 10
μg/ml causa una leve reducción en la proliferación celular, sin embargo, el efecto no
es significativo con relación a las células estimuladas con FHA (p= 0.4). En tanto los
EEP y EAP a concentraciones de 1 y 10 μg/ml no afectaron la viabilidad y la
proliferación, se utilizaron estas dos concentraciones en los posteriores experimentos.

Los extractos vegetales empleados en la medicina tradicional para el tratamiento de

distintas afecciones en las que interviene el sistema inmunitario, constituye un punto
de partida para la búsqueda de compuestos inmunomoduladores, La polarización de
los linfocitos T ya sea hacia una respuesta Th1 secretores de interferón γ (IFN-γ) e
interleucina 2 (IL-2) o hacia una respuesta Th2 que liberan IL- 4 e IL-13 en respuesta
a antígenos que activan a las células del sistema inmunitario innato. Los diferentes
tipos de células colaboradoras se inactivan mutuamente, de modo que los TH1 (a
través del IFN-γ) inhiben selectivamente la actividad de los TH2 y los TH17. A su vez,
los TH2 inhiben la proliferación de los TH1 y los TH17 mediante la IL- 10 y la IL- 4 por
lo tanto es de interés averiguar si los extractos de P. peltatum, podrían inducir o inhibir
la producción de estas moléculas en PBMC-humana.

79
En caso de una respuesta inmune inflamatoria las células (linfocitos) se activan, al
activarse liberan mediadores y también proliferan. Al tratarse de una planta con efecto
sobre la inflamación, se requiere estimular a las células para simular el proceso
inflamatorio, aunque de manera parcial. Por esta razón se estimuló a las PBMC
humana con FHA, un mitógeno policlonal que se comporta en forma análoga a las
células estimuladas por antígenos.

Los resultados mostraron que la concentración de 10 μg/ml del extracto etanólico de

P. peltatum presenta un efecto de mayor intensidad sobre la producción de IFN-γ por
PBMC-humana activadas con FHA, con relación EAP. Por otro lado, se observa que
en las células no activadas con FHA y a la misma concentración del extracto 10 μg/ml
no se observa efecto sobre la proliferación celular (datos no mostrados) pero si
observa un fuerte estimulo sobre la producción de IFN-γ. Al no observarse una
estimulación significativa de la proliferación celular, sugiere que los extractos de P.
peltatum no actuarían sobre los factores involucrados en la proliferación celular, como
la IL-2 que es una de las citoquinas más importante con ese efecto y como
estimulante de otras células del sistema inmune. Ambas citoquinas son producidas
por células Th1. Sin embargo, se ha observado que estímulos que aumentan la
producción de IFN-γ en cultivo celular, no aumentan la de IL-2 o incluso la inhiben y
que la inducción de la proliferación celular puede manifestarse sin la producción de
IFN-γ (H, Arase, & Saito., 1996). De tal forma que la producción de IFN-γ y
proliferación linfocitaria pueden ocurrir con relativa independencia.

Los compuestos fenólicos podrían estimular la producción de IFN-γ por medio de la

estimulación de IL-12 (Magrone & Candore, 2008), los flavonoides también tienen
actividad sobre la producción de esta citoquina (Chavez & col, 2018). Los extractos de
P. peltatum presentarían actividad inmunomoduladora sobre la subpoblación de
linfocitos CD4+ Th1, la cual promueven la respuesta inmunitaria celular a través de la
producción de IFN-γ. No se tiene reportes anteriores del efecto sobre la producción
del IFN-γ y por qué vía de señalización actúa, por lo que este resultado serviría como
precedente para futuras investigaciones sobre la composición diferencial de los
constituyentes con actividad inmunomoduladora.

80
Como consecuencia del incremento de IFN-γ se observó que los extractos etanólico y
acuoso de P. peltatum a una concentración de 10 μg/ml inhibieron significativamente
la concentración de IL-10 en células activadas previamente con FHA, en contraste con
las células no activadas que no mostraron ningún efecto al ser expuestas a los
extractos. Al ser inhibida la IL-10 sus funciones como potente antiinflamatorio,
inmunosupresor y clave en la regulación del sistema Inmunitario es neutralizada,
contrastando con resultados publicados por (Bermúdez, 2017) quien reporta una
actividad antiiflamatoria, mediante la reducción de sales de tetrazolio a compuestos de
formazan en neutrófilos aislados demostrando la inhibición de la inflamación.

La diferencia entre nuestros resultados y los de Bermúdez, (2017) podría deberse

también al activador de células utilizado PHA. Los linfocitos y posiblemente los
monocitos son las células afectadas por la PHA, mediante su transformación a un
estado en el cual son capaces de dividirse. Las células polimorfonuleadas (PMN) no
parecen formar parte de la población celular que inicia la división posteriormente a la
acción de la PHA, originando efectos diferentes en la producción de citoquinas. Por
otra parte la composición del extracto podría ser otro factor importante, ya que al ser
un extracto crudo no se pudo determinar la actividad por los diferentes componentes
que contiene la planta en estudio. En otros estudios, se han reportado que plantas con
propiedades antiinflamatorias pueden presentar efectos inmunomoduladores
(Yamada, 1991), explicando de esa manera los datos publicados sobre la actividad del
principal componente natural, 4-Nerolidil catecol como antiinflamatoria y antioxidante
(Nuñez & Castro, 2005) y actividad antitumoral in vitro (Pinto, 2006).

Los macrófagos son células efectoras de la respuesta inmunitaria innata y se

encuentran involucradas en el inicio y la posterior regulación de la respuesta
inmunitaria adaptativa. Los agentes más potentes en la activación de los macrófagos
son el IFN-γ, partículas de LPS e incluso se ha demostrado que componentes de
extractos vegetales presentan esta capacidad.

Los organismos en condiciones normales producen óxido nítrico en cantidades traza

para el mantenimiento de un óptimo estado de salud. Sin embargo, en un proceso
inflamatorio generalizado se produce una sobre producción de óxido nítrico que
81
actuaría como microbicida debido a que genera peroxinitritos como consecuencia de
la inducción de la enzima iNOS por su reacción con radicales libre de oxígeno
ejerciendo un efecto tóxico para distintos tipos celulares.

De esta manera consideramos importante evaluar la actividad de extractos de P.

peltatum sobre la liberación de óxido nítrico. El EEP de 10 y 25 μg/ml mostró un efecto
antagónico al LPS al reducir 63% y 90,5 % el NO respectivamente, este efecto del
EEP deja entrever un posible efecto antiinflamatorio. Se observa un efecto contrario
con la menor concentración del EAP que incrementó la producción de NO. sin
embargo son datos estadísticamente no significativos. Debemos considerar que los
EEP y EAP presentan un cocktail de metabolitos secundarios, que pueden estar
actuando de manera sinérgica o antagónica, en los diferentes procesos.

Existen diferentes estudios que mencionan efectos sobre la actividad antioxidante de

la especie P. peltatum y se han aislado y caracterizado un gran número de
metabolitos secundarios, algunos con similitud estructural a sustancias antioxidantes
de origen sintético. Por lo que en este estudio se evaluó la actividad antioxidante de
los extractos en estudio. Se observó que el EEP presenta mayor actividad
antioxidante que el EAP, el IC50 obtenido es de 373,27 μg/ml y 816,11
respectivamente y al poseer un IC50 bajo, se necesita una menor concentración del
extracto para inhibir el 50% del radical (DPPH). Estos datos concuerdan con la
literatura donde existen varios estudios que señalan que los extractos orgánicos
polares tienen de 3 a 4 veces más fenoles que los extractos acuosos (Moreno, 2006;
Brunet, 2006). Esto quiere decir que el extracto acuoso, generalmente tendrá una
menor actividad antioxidante que los extractos orgánicos polares, también puede ser
debido a que los compuestos activos presentes en los extractos acuosos pueden ser
atenuados por otros componentes de la mezcla.

En contraste con nuestros resultados, otros estudios determinaron la actividad

antioxidante de extracto hexano crudo de hojas de P. peltatum (DPPH), obteniendo
como resultado un IC50 ≤ 200 mg de extracto/μmol de DPPH. (Puertas & Mejía,
2009). Sin embargo en un estudio realizado por Bermúdez (2017) se determinó que el
IC50 del extracto hidroalcohólico de P. peltatum| de 3891,67 μg/ml. La principal
82
diferencia entre los resultados podría deberse a múltiples factores como: las diversas
condiciones en que se efectuaron los estudios, factores (climáticos, atmosféricos,
topográficos y edáficos), como también a la parte de la planta que se utilizó en la
investigación, las condiciones climáticas de crecimiento y la extracción de metabolitos
(Soto, 2015).

A pesar que se observó que P.peltatum presenta actividad antioxidante, al realizar un

análisis de correlación entre la concentración citotóxica, la concentración que se
requiere, tanto del EEP y EAP, para lograr un porcentaje de inhibición del 50% de
radicales libres es significativamente mayor a la que se determinó, por lo que no se
considera un antioxidante.

83
10. CONCLUSIONES

 Este estudio mostró que el extracto etanólico y acuoso de hojas de P. peltatum

no presentan un efecto citotóxico sobre las PBMC humana a concentración
menor o igual a10 μg/ml utilizando la técnica de MTT.
 Se evaluó el efecto de los extractos etanólico y acuoso de P. peltatum, sobre la
proliferación celular encontrándose efectos no significativo con relación al
control positivo.
 Los extractos etanólico y acuoso de P. peltatum presentan un efecto
inmunomodulador, a través de la estimulación de la respuesta inmunitaria al
promover significativamente la producción de IFN-γ en PBMC humana
estimuladas con FHA y células no estimuladas, mostrando una tendencia dosis-
dependiente.
 Los extractos etanólico y acuoso de P. peltatum inhiben la producción de la IL-
10 en células estimuladas. Sin embargo, no presenta ningún efecto sobre
células que no fueron estimuladas previamente con FHA.
 Los extractos de P. peltatum mostraron efecto inhibidor sobre la producción de
óxido nítrico en presencia de LPS en macrófagos RAW 264.7 por el método de
Griess.
 Los datos que se presentan en este estudio sobre la actividad antioxidante,
sugieren que ambos extractos en estudio de P. peltatum no poseen capacidad
de captación de radicales libres a dosis no citotóxicas.

84
RECOMENDACIONES

Los compuestos bioactivos presentes en los extracto de P. peltatum tienen la

capacidad de modular el sistema inmunitario. Es de interés conocer los principios
activos que presenta cada uno de los extractos y poder establecer los mecanismos
moleculares a través de los cuales actúa y ejerce sus efectos inmunomoduladores.

Los próximos pasos deberían ser, aislar los compuestos bioactivos presentes en los
extracto de P. peltatum y evaluarlos de forma independiente para poder individualizar
sus funciones.

85
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