Descripicon Vibrio Fisheri

DIVISIÓN ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE
Aliivibrio fischeri
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestro en ingeniería, tecnología y gestión
ambiental
PRESENTA
Martha Aurora López Padrón
ASESORA
Dra. Verónica Isidra Domínguez Rodríguez
VILLAHERMOSA, TABASCO. ABRIL DE 2021

Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri
“La ciencia no es perfecta, con

frecuencia se utiliza mal, no es
más que una herramienta, pero
es la mejor herramienta que
tenemos; se corrige a sí misma,
está siempre evolucionando y
se puede aplicar a todo. Con
esta herramienta conquistamos
lo imposible.”
- Carl Sagan.
2
“Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…”
DEDICATORIA
A la memoria de mi madre, deseando su paz eterna. Siempre serás parte

fundamental de todo lo que soy.
A mi Poky, por toda tu paciencia y apoyo que son invaluables para mí.
A mi hermano Luis, por las pocas, pero nutridas conversaciones que me

ayudan a crecer y me inspiran a ser mejor.
3
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico brindado

para la obtención de grado.
A mi asesora de tesis, la Dra. Verónica Domínguez por la oportunidad y apoyo

para realizar este trabajo de investigación.
A mi comité sinodal por sus valiosas aportaciones para la mejora de este

trabajo. De manera especial a la Dra. Consuelo Bautista por su esmero e
interés. Infinitas gracias.
Al Dr. Juan José Valdés de la Universidad Michoacana de San Nicolás de

Hidalgo, por su apoyo incondicional y totalmente desinteresado al aportar sus
conocimientos. Más científicos como usted.
A Liliana Hernández, Fidel Arias y Anahy Castro por todo su apoyo, pero sobre
todo por su invaluable amistad. Los quiero.
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Remediación: Gero, Paco,

maestro Saúl, Karen, Evelyn, Fany, Pascual, Paulo, Eder, Dr. Eduardo, Conta.
A mis compañeros de maestría: Arce, Fátima, Luis y Michel por ser los mejores
compañeros en este camino. Gracias por las risas, el apoyo y los ánimos.
A mi amigo Allan, por haberte convertido en pieza clave en mi vida y

brindarme tu apoyo y cariño incondicionales ante las adversidades que pasé.
Mil gracias por todo lo que haces por mí. Te quiero.
Por último, pero no menos importante, a mi mejor amiga Minú, por

permanecer luego de tantos tropiezos y unirnos más a través de los años.
Gracias por las porras y tu amistad sólida y sincera. Te quiero mucho.
4
Contenido
1. Introducción ....................................................................................................... 7
2. Justificación ....................................................................................................... 8
3. Antecedentes ..................................................................................................... 9
4. Marco teórico .................................................................................................... 11
4.1. Bioluminiscencia ............................................................................................... 11
4.2. Bioluminiscencia bacteriana .............................................................................. 11
4.3. Aliivibrio fischeri ................................................................................................ 12
4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri ............................................. 13
4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri .................................................... 13
5. Objetivos............................................................................................................ 15
5.1. Objetivo general ................................................................................................ 15
5.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 15
6. Metodología ....................................................................................................... 16
6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo . 16
6.1.1. Primera etapa ..................................................................................................................... 17
6.1.2. Segunda etapa ................................................................................................................... 20
7. Resultados y discusión ................................................................................... 23

7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo . 23
7.1.1. Comparación de medios................................................................................................... 28
.......................................................................................................................................
12.2 Viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio sólido y
líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia producida y densidad
óptica de los cultivos. ................................................................................................... 32
8. Conclusiones .................................................................................................... 37
9. Referencias bibliográficas .............................................................................. 38
5
Contenido de figuras
Figura 1. Diagrama de la metodología .............................................................................................. 16
Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada ....................................................................... 18
Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes ................................................................................. 20
Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad ............................................... 21
Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro ................................... 22
Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio
Photobacterium a 48 horas de incubación ............................................................................... 24
Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC ............................. 25
Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20 ............................. 26
Figura 9. Comparativa de los niveles de luminiscencia alcanzados en los tres medios .................. 28
Figura 10. Comparación de densidad óptica observada en los tres medios de cultivo .................... 29
Figura 11. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio Photobacterium ............................... 30
Figura 12. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio SWC ................................................ 31
Figura 13. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio LB20 ................................................ 31
Figura 14. Crecimiento en placa de A. fischeri ................................................................................. 32
Figura 15. Luminiscencia a un mes de conservación en medio sólido ............................................. 34
Figura 16. Luminiscencia obtenida durante seis semanas de conservación en medio líquido ........ 35
Contenido de tablas
Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri ................................................................. 14

Tabla 2. Condiciones de cultivo identificadas en la bibliografía consultada. .................................... 19
Tabla 3. Componentes de los medios Photobacterium y LB20 ........................................................ 36
6
1. Introducción
Las actividades industriales en la vida cotidiana, son una de las principales fuentes
de peligros ambientales, y el ser humano está en riesgo al vivir en un medio
dañado por la contaminación y las sustancias tóxicas que se encuentran en el
ambiente, cuyo saneamiento y conservación influyen directamente en la calidad de
vida de la población.
Uno de los principales aspectos que considera la legislación mundial en materia
de residuos, aire, agua y suelo, es la prevención de efectos tóxicos en la salud
humana por contaminación química. Se considera tóxico a aquel compuesto capaz
de alterar el funcionamiento de un sistema biológico e incluso causar su muerte.
La toxicidad que presenta una sustancia está medida por la determinación de la
concentración media que resulta letal para el 50% de una población expuesta de
forma aguda a dicha sustancia (Moreno, 2003).
Las bacterias marinas luminiscentes son bioindicadores, para la evaluación de
toxicidad en aguas y sedimentos y actualmente se emplean como biosensores
para identificar diversos contaminantes ambientales al ser posible medir la
luminiscencia que producen durante su metabolismo, que permite identificar un
efecto positivo o negativo de una sustancia a través del aumento o la disminución
(respectivamente) de la lumiscencia.
Aliivibrio fischeri (A. fischeri) es una bacteria bioluminiscente que se encuentra
frecuentemente en relaciones simbióticas con animales marinos como el calamar
bobtail (Euprymna scolopes). Su bioluminiscencia proviene de la expresión de una
serie de proteínas contenidas en el operón lux (Madigan y col., 2015) y es
ampliamente utilizada para realizar bioensayos de toxicidad, lo que genera interés
en el estudio de sus características.
En este trabajo se compararán tres métodos considerados adecuados para la
reproducción y conservación de la bacteria A. fischeri.
7
2. Justificación
La detección y evaluación de la toxicidad en agua, suelo y sedimentos permite un

monitoreo oportuno a los trabajos de remediación de sitios, además de brindar
información sobre los metabolitos resultantes de la transformación de las
sustancias primarias. Los ensayos basados en animales, plantas y algas son
costosos, lentos y requieren un gran volumen de muestra; estudios recientes han
enfatizado los beneficios de ensayos bacterianos rápidos, reproducibles y
rentables para la detección y evaluación de toxicidad (Isenberg, 1993).
En México se cuenta con un número limitado de pruebas normadas para el área
de bioensayos de toxicidad y éstas son:
 NMX-AA-087-SCFI-2010, para Análisis de agua-evaluación de toxicidad
aguda con Daphnia magna straus (Crustacea-cladocera).
 NMX-AA-110-1995-SCFI, para Análisis de agua- evaluación de toxicidad
aguda con Artemia franciscana kellogg (Crustacea-anostraca).
 NMX-AA-112-SCFI-2017, para Análisis de Agua y Sedimentos - Evaluación
de Toxicidad Aguda con Vibrio fischeri.
Resulta frecuente que se elijan como la primera prueba de toxicidad aguda los
bioensayos con A. fischeri al obtener resultados más rápidos y ser pruebas menos
costosas. Se ha informado en varios trabajos de investigación que el ensayo de
bioluminiscencia usando A. fischeri es el más sensible en una amplia gama de
productos químicos en comparación con otros ensayos bacterianos como la
inhibición de la nitrificación, la respirometría, la luminiscencia de ATP y la
inhibición de enzimas (Parvez y col., 2006).
La viabilidad del cultivo y conservación de A. fischeri a través de un método en
México, otorgaría respuestas rápidas a consideraciones de toxicidad ambiental,
además de permitir la disponibilidad del microorganismo para contribuir con las
diferentes investigaciones que se generan en materia de efectos tóxicos en agua,
suelo y sedimentos. La comparación de métodos disponibles y la selección del
que otorgue mayores facilidades de crecimiento de A. fischeri, aumentan las
posibilidades de disposición del microorganismo.
8
3. Antecedentes
Mccann y colaboradores (2003) estudiaron la dinámica poblacional de A. fischeri
en el calamar Euprymna scolopes, para lo que cultivaron A. fischeri en dos
medios: Sea Water-Tryptone (SWT) y medio Luria Bertani sólido. Amos medios de
cultivo inoculados fueron incubados a 28°C con un pH de 7.5, obteniendo cultivos
conservados en ultracongelación que posteriormente fueron inoculados en un
medio de agua de mar natural y presentaron una buena respuesta de
colonización.
En 2006, Sheerer y colaboradores desarrollaron un cultivo continuo en

fermentador para A. fischeri con extracto de carne, peptona, pequeñas cantidades
de NaCl y un regulador de fosfato, mediante el cual lograron mantener el pH en
intervalos favorables. Encontraron que la temperatura donde las bacterias emiten
mayor luminosidad es 26°C y que los cambios en la temperatura provocan
cambios en la luminosidad. Reportaron que, en cultivo continuo bajo las
condiciones utilizadas, las bacterias podrían mantenerse hasta por ocho semanas.
Chong y colaboradores (2013) cultivaron A. fischeri en medio LB20 para evaluar la

síntesis de señales de detección del quórum comparando densidad óptica y
luminiscencia entre una cepa silvestre y una mutante. Ambas cepas cultivadas a
30°C en agitación a 150 rpm y subcultivadas en medio fresco cada 24 horas
durante 10 días, obteniendo resultados que sugieren que el gen luxI se mantiene
en el genoma de A. fischeri por una función desconocida de relevancia para las
células individuales.
En 2016, Silva y colaboradores realizaron la caracterización morfológica de A.

fischeri a partir de una cepa liofilizada. Sometieron el cultivo a una agitación de
170 rpm y lo incubaron a 20 ° C. Separaron la biomasa por centrifugación a 2300 g
durante 40 minutos con solución de NaCl a 2% y centrifugaron de nuevo.
Utilizaron crioprotector congelado y la suspensión bacteriana obtenida fue
congelada.
9
Recientemente, Castillo (2018) cultivó una cepa de A. fischeri para su uso como
fuente alterna de iluminación. El cultivo se realizó en medio LB20 a diferentes
concentraciones de NaCl, Triptona y extracto de levadura a 27 °C y pH 7. La
luminiscencia fue obtenida a las 24 horas de incubación, siendo el medio con la
mayor concentración de los tres elementos el que presentó mayor crecimiento.
10
4. Marco teórico
4.1. Bioluminiscencia
La bioluminiscencia es la energía química procedente de una reacción química

exergónica que se transforma en energía luminosa, por lo que no depende de la
absorción previa de luz (Martín y col., 2010).
La luz que emiten los organismos vivos tiene diversas funciones en los individuos
que la producen: algunos la utilizan como camuflaje, mientras que otros atraen a
sus presas con ella. Algunos más la utilizan para alejar o distraer a los
depredadores (Desdín, 2015).
La producción de luminiscencia se lleva a cabo en diversos organismos como

animales vertebrados e invertebrados, hongos, plantas, insectos y bacterias,
siendo las bacterias marinas las más abundantes (Meighen, 1993).
4.2. Bioluminiscencia bacteriana

Las bacterias que poseen la capacidad de emitir luz, son en su mayoría bacterias
marinas, que pueden encontrarse de manera libre o en simbiosis con algunos
peces y calamares, aunque también hay especies que son saprófitas, es decir,
habitan en animales muertos (Martín y col., 2010).
Los géneros más representativos de bacterias bioluminiscentes son:

Photobacterium spp, Aliivibrio spp y Vibrio spp y las más abundantes son Vibrio
harveyi, Photobacterium phosphoreum y Aliivibrio fischeri. Aunque
Photobacterium, Aliivibrio y Vibrio aislados son aerobios facultativos, sólo son
bioluminiscentes en presencia de oxígeno (Madigan y col., 2015).
11
4.3. Aliivibrio fischeri
Los miembros del género Aliivibrio son bacterias Gram-negativas, presentan forma
de bacilo, y son motiles mediante un flagelo ubicado en uno de los polos del
cuerpo celular; generalmente estos microorganismos se localizan en ambientes
marinos. Tienen propiedades bioluminiscentes y se encuentran
predominantemente en simbiosis con varios animales marinos. En estas bacterias
el flagelo se considera como un factor de virulencia, debido a que participa de
manera significativa en el proceso de invasión al hospedero (McCarter, 2001).
Nealson y colaboradores (1979), descubrieron la percepción de quórum (número

de individuos necesario para la luminiscencia) en A. fischeri. Cuando la bacteria se
encuentra libre en agua de mar, su densidad normal es más bien baja y
permanece en condiciones de oscuridad; sin embargo, al encontrarse en simbiosis
en los órganos luminosos de calamares como Euprymna scolopes, forma densas
poblaciones, y es entonces cuando genera la luz.
La emisión de luz que realizan las bacterias bioluminiscentes, es dependiente de

la enzima luciferasa. Esta es una enzima dimérica que consiste en dos
subunidades (α y β), y tiene un peso molecular aproximado de 80 KDa (Wood,
1998). La actividad catalítica de esta enzima requiere de tres substratos: luciferina,
oxígeno y ATP. El producto de la actividad catalítica de esta enzima es un estado
oxidado de la luciferina a un componente de dioxicetano. Este emite un fotón y
produce CO2 y oxiluciferina. (Berovic y col., 2009). Considerando la estequiometría
de la reacción, por cada molécula de ATP consumida se emite aproximadamente
un fotón. Esta propiedad, junto con la alta especificidad de la enzima por el
nucleótido, hace que esta reacción sea un sistema analítico ideal para detectar la
presencia de ATP, su producción o consumo, que depende de la actividad
enzimática y para cuantificar substratos relacionados con el metabolismo del ATP
(García y col., 2001).
12
4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri
La regulación de la expresión de genes en el sistema de bioluminiscencia, permite

una rápida identificación fenotípica gracias a la medición de luminiscencia emitida
por el microorganismo, lo que facilita su aplicación biotecnológica. Uno de los
problemas más importantes de contaminación ambiental, es la presencia de
sustancias que pueden causar daños a la salud (Sáenz-Nevarez, 2010) y
permanecer en el ambiente incluso generando metabolitos de mayor toxicidad.
La bioluminiscencia bacteriana tiene varias aplicaciones biotecnológicas, entre las
que destaca la detección y evaluación de sustancias tóxicas. Existen algunos
sistemas que se comercializan y están validados para determinar, de manera
rápida y eficaz, la presencia de diversos contaminantes ambientales (metales,
detergentes, pesticidas, policlorobifenilos o bifenilos policlorados (PCB),
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), etc.) en muestras de agua, suelo y
sedimentos. El principio para la detección de estas sustancias es la disminución
de bioluminiscencia presentada en A. fischeri, que es causada por el
contaminante. El sistema Microtox, que en un inicio era utilizado para muestras de
agua, se ha modificado para la detección de sustancias tóxicas en ambientes
terrestres o compuestos genotóxicos (Mutatox, Microtox-solid phase, Deltatox,
etc.) a través de métodos estándar, aceptados por importantes agencias de
protección ambiental (USA, UE). Por otra parte, los genes lux (AB ó CDABE) se
han utilizado para una amplia gama de objetivos como inmunoensayos, detección
de virus, control de procesos biotecnológicos, procesos de biorremediación,
valoración de expresión de promotores, dispersión y colonización de bacterias
patógenas en sus hospedadores, etc. (Martín y col., 2010).
4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri
Las bacterias bioluminiscentes emiten luz sólo cuando existe alta densidad celular.
El fenómeno de detección del quorum fue descrito por primera vez en 1970 por
Nealson y col. al observar que la bioluminiscencia emitida por Photobacterium
13
fischeri (actualmente conocida como A. fischeri) no se detectaba hasta que se

alcanzaba cierta densidad celular (Sáenz-Nevarez, 2010). Dado lo anterior, un
medio de cultivo que permita una mayor reproducción de la bacteria, significará
una mayor probabilidad de una producción estable de luz.
Factores como la temperatura y el pH juegan papeles importantes en el cultivo de
esta bacteria, que presenta una mayor densidad en medios con NaCl al 2%-5%
(Soto y col., 2009)
En cuanto a la temperatura, se maneja un intervalo amplio para el cultivo de A.
fischeri, manteniéndose entre los 20 y los 35 °C, mientras que el pH debe
mantenerse entre 5 y 9 (Hongda, y col., 2008).
Hay también algunos factores que pueden influir en la estimulación o inhibición de
la luminiscencia del microorganismo, como el contenido de iones inorgánicos
presentes en el medio. La luminiscencia producida por A. fischeri necesita de la
presencia de compuestos de azufre y se ve estimulada por la presencia de
carbonatos (Tabei y col., 2011).
Los requerimientos nutrimentales de las bacterias varían incluso dentro del mismo
género. En el caso de A. fischeri, tiene requerimientos de pH y salinidad medio-
altos dada su naturaleza marina. A continuación, la tabla 1 muestra algunos de los
requerimientos para su crecimiento, mismos que han sido previamente descritos
Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri (Tabei y col., 2011; Garrity y col.,
2001; Hongda y col., 2008)
Fuentes de Temperatura pH Salinidad Iones
carbono inorgánicos
Glucosa Se desarrolla Crece en 1-6% NaCl MgSO4
D-Manitol en un intervalo medios con KCl
L-Glutamato de pH entre 5-9 Carbonatos
Salicina temperatura
Trialosa de 20-35°C
Citrato
Maltosa
Nota: Esta tabla muestra los requerimientos nutrimentales, así como factores físicos y químicos que favorecen el
crecimiento de A. fischeri
14
5. Objetivos
5.1. Objetivo general

Determinar las condiciones óptimas de cultivo y conservación de la bacteria
Aliivibrio fischeri en medio sólido y líquido, teniendo como variable de
respuesta la bioluminiscencia.
5.2. Objetivos específicos
Evaluar el crecimiento de Aliivibrio fischeri en tres medios de cultivo diferentes,

mediante la bioluminiscencia y la densidad óptica.
Probar la viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio

sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia
producida y la densidad óptica de los cultivos.
15
6. Metodología
6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres

medios de cultivo
Se ensayaron tres medios de cultivo líquidos que reúnen los requerimientos

nutrimentales del microorganismo (de acuerdo con Tabei y col., 2011; Garrity y
col., 2001; Hongda y col., 2008) para seleccionar el más favorable para su
crecimiento, dividiéndose la metodología en dos etapas (figura 1).
Figura 1. Diagrama de la metodología. El inciso a) hace referencia a la etapa uno, mientras que el inciso b) hace
referencia a la etapa dos.
a)
b)
16
Nota: Esta figura muestra las etapas que se llevaron a cabo durante la fase experimental del proyecto.
6.1.1. Primera etapa
Se seleccionaron tres medios de cultivo líquidos que cumplen los requerimientos

nutrimentales de A. fischeri. Los medios de cultivo utilizados son los siguientes:
 Photobacterium (Atlas, 2005): sal de acuario (33 g/L), extracto de levadura
(5 g/L), triptona (5 g/L), NH4Cl (5 g/L), glicerol (6 g/L) y CaCO3 (1 g/L)
 Sea Water Complete (Lebofee-Pierce, 2010): Peptona de caseína (5 g/L),
extracto de levadura /5 g/L), extracto de carne (3 g/L), NaCl (17.5 g/L), KCl
(7.5 g/L), MgSO4 (12.3 g/L) y CaCl2 (1.45 g/L)
 LB20 (Petrun-Lostroh, 2013): Extracto de levadura (5 g/L), Triptona de
caseína (10 g/L) y NaCl (20 g/L).
Se establecieron las condiciones óptimas de reproducción de la bacteria marina A.

fischeri identificando, además de los medios de cultivo, temperatura y pH. Se
trabajó con una cepa liofilizada identificada como NRRL B-11177. La cepa
liofilizada de la bacteria marina A. fischeri se reactivó con una solución a base de
sales minerales (20 g NaCl2, 2.035 g de MgCl2 6H2O y 0.30 g de KCl por litro de
17
agua ultra pura, de acuerdo a lo indicado en la NMX-AA-112-SCFI-2017),

incubando a 25-27°C (temperatura ambiente) con agitación de 100 rpm. Se
verificó la luminiscencia de la bacteria en un luminómetro marca MICROBICS®
modelo m500 (figura 2) y posteriormente se inocularon 3 mL en matraz
Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo líquido. Este proceso se
repitió en los tres medios seleccionados previamente esterilizados por calor
húmedo, donde el vapor saturado a presión favorece la penetración del calor a la
célula y por consiguiente la desnaturalización de proteínas (Acevedo y col., 2013).
Se realizó en un equipo autoclave marca All American ® modelo 50x.
Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada luego de reactivación
Nota: en esta figura se muestra la lectura proporcionada por el luminómetro al reactivar la cepa
liofilizada.
18
Además de los medios de cultivo seleccionados reportados para el crecimiento de

la bacteria, se mantuvieron las condiciones identificadas como favorables para el
cultivo del microorganismo:
Tabla 2. Condiciones óptimas para el cultivo de A. fischeri previamente reportadas.
Medios de cultivo reportados Condiciones Condiciones
como funcionales para bacterias recomendadas ensayadas en este
bioluminiscentes y utilizados en la estudio
fase de experimentación
LB20 (Petrun-Lostroh, 2013) pH 5-9 pH 7.5
Sea Water Complete (Lebofee- Agitación de 75- Agitación de 100 rpm
Pierce, 2010) 150 rpm
Photobacterium broth (Atlas, Temperatura 20- Temperatura de 25-
2005) 35°C 27°C
Nota: Se muestran las condiciones físicas y químicas aplicadas en fase experimental, en comparación con las condiciones
recomendadas en la literatura.
Los cultivos bacterianos fueron incubándose en agitación constante a temperatura

ambiente de 25-27 °C y a un pH 7.5 ± 0,2 a 100 rpm durante un periodo de 48
horas.
Posteriormente se midió la bioluminiscencia de la bacteria en el luminómetro, así
como DO en un espectofotómetro marca Genesys™ 10S modelo UV/VIS a λ=600
nm. La curva de crecimiento fue construida con los datos de DO obtenidos en el
transcurso de 48 horas en intervalos de 4 horas, se incluyeron los valores de la
luminiscencia para su comparación, promediando las repeticiones en ambos
parámetros. La luminiscencia también fue perceptible de manera visual (figura 3).
19
Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes
Nota: en esta figura se aprecia la luminiscencia de los cultivos de A. fischeri en medio líquido.
6.1.2. Segunda etapa

La técnica de conservación que se utilizó durante los períodos de trabajo fue el
subcultivo seriado (Acevedo y col., 2013), lo que implica que la bacteria fue
resembrada cada mes en los medios de cultivo seleccionados líquido y sólido. Se
sembró en placas Petri solidificando los medios líquidos empleados mediante agar
al 2%. Se resembró el microorganismo en medio líquido después de un mes de
ser mantenida en medio sólido para verificar su viabilidad (figura 4).
20
Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad
Nota: se muestra la toma de cultivo de A. fischeri para su siembra en medio líquido.
Los cultivos de A. fischeri se conservaron en los medios de cultivo líquidos y

fueron pasados de los matraces en agitación a viales de vidrio borosilicato de 3
mL, siendo conservados en refrigeración a 4°C posterior a las lecturas iniciales de
48 horas. De manera diaria, fueron agitados por medio de un equipo agitador
vórtex marca Thermo Scientific® modelo M37615 (figura 5), para posteriormente
medir la luminiscencia. Este procedimiento fue realizado durante 6 semanas.
Los niveles de luminiscencia se promediaron por semana y fueron graficados
comparando la luminiscencia generada en cada medio.
21
Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro
Nota: se muestra la colocación del vial en el equipo vórtex al momento de su agitación y posterior
Lectura de luminiscencia.
22
7. Resultados y discusión
7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en

tres medios de cultivo
La cepa de A. fischeri reactivada con la solución base sales minarales (NMX-AA-

112-SCFI-2017) mostró una luminiscencia de 67 luxes. Esta solución cumplió el
papel estabilizador de la membrana celular de la bacteria, permitiendo que
reestableciera sus procesos metabólicos (McLeod y col., 1968).
Se realizaron las mediciones de luminiscencia y densidad óptica (DO) en

intervalos de 4 horas durante 48 horas. El medio Photobacterium alcanzó su
máxima luminiscencia a las 24 horas (184 luxes), siendo visible desde las 12
horas (figura 6 a) que corresponden a la fase exponencial de la curva de
crecimiento (figura 6 b), con un tiempo de generación de 32.5 horas. Este medio
contiene CaCO3 y glicerol como fuentes de carbono y NaCl, cuya combinación
favorece la luminiscencia bacteriana (Ramesh y col., 2014). En la figura 6 b, se
muestra la curva de crecimiento celular construida con los datos de DO.
23
Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio Photobacterium a 48

horas de incubación
a)
180
160
140
Luminiscencia (luxes)
120
100
80
60
40
20
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
b)
Nota: Esta figura muestra la evolución en las lecturas de luminiscencia y DO durante las 48 horas de incubación de A.
fischeri en el medio Photobacterium.
24
El medio Sea Water Complete alcanzó su máxima luminiscencia (14 luxes) a las
12 horas de incubación (figura 7a, durante la fase de exponencial (figura 7 b) con
un tiempo de generación de 33.9 horas. Esto puede deberse a los ácidos
excretados por las células en medios complejos sin regulador de pH, lo que altera
el pH reduciéndolo a un nivel que ya no resulta óptimo para la emisión de luz y el
crecimiento (Nealson, 1979).
Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC

a)
16
14
12
10
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
b)
2.5
y = -0.0013x2 + 0.0963x + 0.168
2 R² = 0.9776
DO (absorbancia)
1.5
0.5
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
Nota: se muestra la evolución de luminiscencia y DO en A. fischeri en 48 horas de incubación en medio

SWC
25
En cuanto al medio LB20, este tuvo una luminiscencia máxima de 172 luxes
(figura 8 a), alcanzados a las 28 horas de incubación, correspondiente a la fase
exponencial en la curva de crecimiento bacteriano (figura 8 b) con un tiempo de
generación de 59 horas. Este medio cuenta con cantidades menores de elementos
como el aminoácido arginina, que está contenido en la triptona de caseína y el
extracto de levadura. Además, sólo cuenta con los aminoácidos presentes en
estos sustratos, por lo que no hay fuentes de carbono adicionales. Esto puede
generar ciertas condiciones de estrés a las bacterias, lo que puede detonar la
necesidad de emitir luz.
Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20

a)
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
b)
26
Nota: se muestra la evolución de la luminiscencia y DO de A. fischeri durante incubación de 48 horas en medio

LB20.
27
7.1.1. Comparación de medios
Se realizó la comparación de las curvas de crcimientocelular de la bacteria crecida

en los tres medios de cultivo, así como la luminiscencia para conocer la respuesta
del microorganismo en cada medio.
Figura 9. Comparativa de los niveles de luminiscencia alcanzados en los tres medios
200
180
160
Luminiscencia (Luxes)
140
120
100
80
60
40
20
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
Photobacterium SWC LB20
Nota: se muestra la comparación de la luminscencia obtenida en los diferentes medios de cultivo durante 48
horas de incubación.
Los medios de cultivo Photobacterium y LB20 mostraron resultados similares,

alcanzando lecturas de 184 y 172 luxes respectivamente a las 24 y 28 h de
incubación respectivamente, mientras que el medio Sea Water Complete
solamente alcanzó una luminiscencia de 14 luxes (figura 9), siendo este el que
produce la luminiscencia más baja.
Es probable que el medio Sea Water Complete no haya alcanzado los niveles de
luminiscencia deseados debido a la acción del CaCl2 o a la presencia de lisina en
el extracto de carne, elementos que pueden tener un efecto inhibitorio en la
luminiscencia (Hastings y col.,1977). También se reporta que la mezcla de MgSO4
28
y KCl disminuye la luminiscencia (Tabei y col., 2012), elementos presentes en este

medio.
En cuanto a los medios Photobacterium y LB20, éstos cuentan con mayores

cantidades de las sales minerales necesarias para el favorecimiento de la
luminiscencia, además de la presencia de un regulador de pH (Tris, en el caso del
medio Photobacterium), lo que coincide con lo reportado por Srivastava-MacLeod
(1971), que mencionan la importancia nutricional de éstas para el crecimiento de
las bacterias marinas bioluminiscentes y la inhibición del crecimiento de A. fischeri
en un medio con sales, pero sin capacidad amortiguadora de pH.
Por otro lado, el crecimiento bacteriano se muestra similar en los tres medios
(figura 10), con un tiempo de generación promedio de 17 horas y 1.6
generaciones. Los tres medios de cultivo cuentan con fuentes de carbono y
condiciones que permitieron el crecimiento bacteriano.
Figura 10. Comparación de densidad óptica observada en los tres medios de cultivo
2.5
2
DO (absorbancia)
1.5
0.5
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
Nota: se compara la DO observada en los tres medios de cultivo durante 48 horas de incubación.
29
Se comparó también la luminiscencia con respecto al crecimiento bacteriano (Fig.

11, 12 y 13) para conocer si había relación entre ambas, no encontrándose
correlaciones fuertes en ninguno de los casos de acuerdo con los datos de r2, que
es el coeficiente de determinación que indica la correlación entre variables. Esto
coincide con Hongda (2008), que reportó que las condiciones óptimas de
crecimiento son diferentes a las de la bioluminiscencia. Aunado a esto, es posible
que las bacterias inertes que permanecen en el medio, interfieran con la densidad
óptica detectada, por lo que la densidad del medio podría deberse a bacterias
inertes que no emiten luminiscencia.
Figura 11. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio Photobacterium
180
160
R² = 0.5976
140
120
100
80
60
40
20
0
-20 0 0.5 1 1.5 2 2.5
-40
DO (Absorbancia)
Nota: Se muestra el nivel de correlación entre DO y luminiscencia presentada en el medio Photobacterium

durante 48 horas de incubación
30
Figura 12. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio SWC
16
14 R² = 0.618
12
Luminiscencia (luxes) 10
0
0 0.5 1 1.5 2
-2
DO (Absorbancia)
Nota: En esta figura se presenta la baja correlación existente entre la DO y la luminiscencia observadas durante
48 horas de incubación en el medio SWC.
Figura 13. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio LB20
200
R² = 0.5174
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
-20 0 0.5 1 1.5 2
DO (absorbancia)
Nota: En esta figura se muestra el nivel de correlación entre la DO y la luminiscencia en el medio LB20 durante 48
horas de incubación.
31
7.2 Viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri

en medio sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición
de la bioluminiscencia producida y densidad óptica de los
cultivos.
Los cultivos líquidos de A. fischeri que se sembraron en los tres medios en su fase
sólida presentaron crecimiento a las 12 horas después de la siembra (figura 14);
no presentaron luminiscencia. Esto puede deberse a la disponibilidad de los
compuestos, que, al pasar de medio líquido a sólido, disminuye.
Figura 14. Crecimiento en placa de A. fischeri
Nota: en esta figura se presenta el crecimiento de A. fischeri en placa en el medio SWC.
Bajo estas condiciones de cultivo, Después de la resiembra de placa a medio

líquido, sólo el cultivo del medio LB20 presentó luminiscencia (figura 15), lo que
puede deberse a que, en un medio con menor cantidad de componentes como es
el caso del LB20, éstos están definidos y los inhibidores presentes en el medio
complejo están ausentes (Hastigs-Nealson,1977). Otra posibilidad es que, al haber
estrés por la escasez de nutrientes en un medio simple, las bacterias hagan uso
32
de la bioluminiscencia, que no les proporciona ninguna ventaja en condiciones sin

estrés (Węgrzyn y col., 2002).
33
Figura 15. Luminiscencia a un mes de conservación en medio sólido
300
250
200
150
100
50
0
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)
Nota: En esta figura se muestra la luminiscencia observada en cada uno de los tres medios luego de un mes de
conservación en medio sólido. Se monitoreó la luminiscencia cada cuatro horas durante 24 horas.
En cuanto a los viales preservados en medio líquido en refrigeración a 4°C,

presentaron elevados niveles de luminiscencia, con lecturas de hasta 250 luxes
(figura 16), incluso superiores a la etapa de incubación en la fase exponencial de
la curva de crecimiento, lo que puede indicar que A. fischeri ve favorecida la
emisión de luminiscencia a temperaturas incluso muy inferiores a las reportadas
por Silva y col. (2016), que cultivaron el microorganismo a 20°C, Scheerer y col.
(2006), reportando incubación a 26°C; y Castillo (2018), que realizó cultivos a
27°C. En el manual de Bergey (Garrity y col., 2001) también se sugiere que la
temperatura óptima para el cultivo de A. fischeri es de 35°C para observar
luminiscencia. Además, se puede observar una fase estacionaria prolongada a
esta temperatura en los medios líquidos.
34
Figura 16. Luminiscencia obtenida durante seis semanas de conservación en medio líquido
Nota: Se muestra la luminiscencia observada en los tres medios de cultivo durante seis semanas de conservación en medio
líquido.
Como se puede apreciar en la figura 16, la luminiscencia detectada en el medio de

cultivo SWC, comenzó a decrecer a la semana cuatro, mientras que en los medios
LB20 y Photobacterium, se continuaron registrando niveles de luminiscencia por
encima de 200 luxes. La capacidad previamente mencionada de los medios
Photobacterium y LB20 de estimular la producción de luminiscencia en A. fischeri,
puede tener influencia en estos resultados, manteniendo sus nutrientes
disponibles para los microorganismos por un tiempo más prolongado. La
luminiscencia expresada por A. fischeri en el medio LB20 empezó a decrecer en la
semana 6, conservando lecturas de hasta 200 luxes. Mientras, en el medio
Photobacterium continúa con lecturas superiores a los 250 luxes sin que se note
una reducción después de seis semanas. Al tener una mayor cantidad de fuentes
de carbono y de iones inorgánicos estimuladores de la luminiscencia bacteriana,
Photobacterium resulta ser el medio en el que las bacterias conservan su
luminiscencia y una densidad poblacional que permite la detección del quorum.
Estos resultados confirman que A. fischeri expresa los niveles más altos de
luminiscencia en los medios de cultivo Photobacterium y LB20 en comparación
con el medio SWC.
35
Considerando que los medios de cultivo donde se obtuvo mejor luminiscencia

fueron los medios Photobacterium (152 luxes) y LB0 (174 luxes) durante la fase
exponencial de la curva de crecimiento celular y durante la conservación en medio
líquido (250 luxes durante seis y cuatro semanas respectivamente), es pertinente
hacer una comparación de la complejidad de preparación.
Tabla 3. Componentes de los medios Photobacterium y LB20
Componentes Photobacterium LB20
Sal de acuario 33 g/L
Tris 6 g/L
Extracto de levadura 5 g/L 5 g/L
Triptona 5 g/L 10 g/L
NH4Cl 5 g/L
Glicerol 6 g/L
CaCO3 1 g/L
NaCl 20 g/L
Nota: En esta tabla se muestran los componentes de los medios Photobacterium y LB20 a fin de comparar la complejidad
de su preparación.
Tal como podemos observar en la tabla 3, la cantidad de elementos presentes en

el medio Photobacterium es muy superior en comparación con la cantidad de
elementos presentes en el medio LB20, por lo que este último resulta menos
complejo en su preparación, lo que puede representar una ventaja económica y
logística.
36
8. Conclusiones
De acuerdo a los objetivos planteados y los resultados obtenidos bajo las

condiciones específicas del presente estudio, se concluye lo siguiente:
1. La bacteria A. fischeri expresó los niveles más altos de luminiscencia

durante la fase exponencial del ciclo de crecimiento celular en los tres
medios ensayados.
2. La expresión de la luminiscencia no es directamente proporcional a la

concentración celular bacteriana.
3. A. fischeri puede ser cultivado de forma óptima en el medio líquido

Photobacterium, a 25-27 ºC, en condiciones de agitación a 100 r.p.m.,
alcanzando una luminiscencia de hasta 184 luxes a las 24 h de incubación
que corresponde a la fase exponencial de la curva de crecimiento celular.
4. A. fischeri puede ser mantenida viable durante seis semanas en los medios
líquidos Photobacterium y LB20 a 4°C reactivando la luminiscencia
mediante agitación para proporcionar el oxígeno necesario, alcanzando una
luminiscencia de hasta 250 luxes.
5. A. fischeri expresa los niveles más altos de luminiscencia en los medios de

cultivo Photobacterium y LB20, en comparación con el medio SWC.
37
9. Referencias bibliográficas
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Notes. 65: 14-20.
42

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DIVISIÓN ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dra. Verónica Isidra Domínguez Rodríguez

VILLAHERMOSA, TABASCO. ABRIL DE 2021

“La ciencia no es perfecta, con

A la memoria de mi madre, deseando su paz eterna. Siempre serás parte

A mi hermano Luis, por las pocas, pero nutridas conversaciones que me

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico brindado

A mi asesora de tesis, la Dra. Verónica Domínguez por la oportunidad y apoyo

A mi comité sinodal por sus valiosas aportaciones para la mejora de este

Al Dr. Juan José Valdés de la Universidad Michoacana de San Nicolás de

A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Remediación: Gero, Paco,

A mi amigo Allan, por haberte convertido en pieza clave en mi vida y

Por último, pero no menos importante, a mi mejor amiga Minú, por

7. Resultados y discusión ................................................................................... 23

Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri ................................................................. 14

La detección y evaluación de la toxicidad en agua, suelo y sedimentos permite un

En 2006, Sheerer y colaboradores desarrollaron un cultivo continuo en

Chong y colaboradores (2013) cultivaron A. fischeri en medio LB20 para evaluar la

En 2016, Silva y colaboradores realizaron la caracterización morfológica de A.

La bioluminiscencia es la energía química procedente de una reacción química

La producción de luminiscencia se lleva a cabo en diversos organismos como

4.2. Bioluminiscencia bacteriana

Los géneros más representativos de bacterias bioluminiscentes son:

4.3. Aliivibrio fischeri

Nealson y colaboradores (1979), descubrieron la percepción de quórum (número

La emisión de luz que realizan las bacterias bioluminiscentes, es dependiente de

4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri

La regulación de la expresión de genes en el sistema de bioluminiscencia, permite

4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri

fischeri (actualmente conocida como A. fischeri) no se detectaba hasta que se

5.1. Objetivo general

5.2. Objetivos específicos

Evaluar el crecimiento de Aliivibrio fischeri en tres medios de cultivo diferentes,

Probar la viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio

6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres

Se ensayaron tres medios de cultivo líquidos que reúnen los requerimientos

6.1.1. Primera etapa

Se seleccionaron tres medios de cultivo líquidos que cumplen los requerimientos

Se establecieron las condiciones óptimas de reproducción de la bacteria marina A.

agua ultra pura, de acuerdo a lo indicado en la NMX-AA-112-SCFI-2017),

Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada luego de reactivación

Además de los medios de cultivo seleccionados reportados para el crecimiento de

Los cultivos bacterianos fueron incubándose en agitación constante a temperatura

Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes

6.1.2. Segunda etapa

Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad

Nota: se muestra la toma de cultivo de A. fischeri para su siembra en medio líquido.

Los cultivos de A. fischeri se conservaron en los medios de cultivo líquidos y

Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro

7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en

La cepa de A. fischeri reactivada con la solución base sales minarales (NMX-AA-

Se realizaron las mediciones de luminiscencia y densidad óptica (DO) en

Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio Photobacterium a 48

Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC

Nota: se muestra la evolución de luminiscencia y DO en A. fischeri en 48 horas de incubación en medio

Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20

Nota: se muestra la evolución de la luminiscencia y DO de A. fischeri durante incubación de 48 horas en medio

7.1.1. Comparación de medios

Se realizó la comparación de las curvas de crcimientocelular de la bacteria crecida