Universidad del Valle de Guatemala

Facultad de Ciencias y Humanidades

Análisis Instrumental
Segundo Ciclo, 2022
Instructor: Ángel Ramírez
Auxiliar: Eva Vasquez

Práctica No.10
“CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN:
DETERMINACIÓN DE AZUCARES EN MIELES”

Miriam Georgina Morán Guzmán

Carné: 21187
Sección 22
Fecha de realización: 18/11/22
Fecha de entrega: 22/11/22
1
I. SUMARIO

El objetivo principal esta práctica consistió en la determinación sacarosa, glucosa y

fructosa, en dos muestras de diferente miel comercial, por medio de un método de HPLC.
Los reactivos se basaron en 4 estándares contenidos de los respectivos azúcares. El equipo
empleado fue de un cromatógrafo líquido de alta resolución Agilent modelo 1100 y una
balanza analítica OHAUS 210 g  0.0001 g. Por otro lado, la cristalería fue de un balón
aforado de 250.03 mL y marca Kimax. El porcentaje p/p de la sacarosa, glucosa y fructosa
de la primera muestra, resultó en 19.17  33.84 %, 23.84  7.42 % y 26.38  9.40 %
respectivamente. Para la segunda muestra, 40.10  70.80 %, 25.94  8.08 % y 20.16  7.18
% en ese mismo orden. De los resultados descritos, únicamente las cantidades de glucosa se
encuentran en los parámetros establecidos en la literatura; en el caso de la sacarosa, el
porcentaje resultó significativamente mayor y el de la fructosa, menor a todos los rangos
que se observaron en la literatura; por lo que, se consideró la posible adulteración de las
mieles comerciales. Por otra parte, se tomó por cumplido el objetivo principal; sin embargo,
no fue posible establecer la efectividad del método debido a que la cantidad de los azúcares
no se presenta en los empaques de las mieles, interfiriendo así, en el cálculo de un
porcentaje de error. La principal fuente de error se observó en la transferencia de la miel
desde el beaker, hasta el balón aforado. En caso de próximas experimentaciones, se
recomienda realizar el análisis de las muestras en triplicado, con el fin de obtener datos más
precisos.

II. MARCO TEÓRICO

A. Aspectos

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), es un tipo de técnica cromatográfica

que utiliza una fase estacionaria dividida, y una fase móvil líquida; siendo ambas
inmiscibles entre sí (Skoog et al., 2014). Agregando, la separación en el método ocurre
gracias a la interacción física y química entre las fuerzas del analito de la muestra, y las de
las fases del equipo. Dicho procedimiento es de gran utilidad también para la cuantificación
e identificación de diferentes analitos presentes en una muestra (Suárez & Morales, 2018).
Lo que diferencia la HPLC de la GC (cromatografía de gases), es que la primera no se
limita a la volatilidad o estabilidad térmica de las muestras, sino que separa compuestos
como: especies iónicas, polímeros, productos naturales lábiles, etc. (Ozores, 2015).

Los cromatógrafos especiales para esta técnica, constan de un reservorio, inyector, bomba,
horno, columna, detector y registrador. Un reservorio es de vidrio, y contiene el volumen
del disolvente. La bomba, por otro lado, succiona la fase móvil para agregarla al sistema, y
el inyector funciona de la misma manera, pero, con la muestra por analizar y la introduce en
el flujo de la fase móvil. Seguidamente, se presenta la columna, llena de la fase estacionaria
y donde se movilizará la muestra; el horno se procura de que la columna se encuentre en las
condiciones ideales para esta. Finalmente, el detector convierte los cambios de los efluentes
en señales eléctricas, para que el registrador las plasme en forma de un cromatograma
(Skoog et al., 2014).

2
B. Aplicación en la carrera

Debido a la selectividad y versatilidad de la técnica HPLC, esta se ha visto en las diferentes

industrias como farmacéuticas, alimentarias, forenses, entre otras. No obstante, en el campo
farmacéutico es donde más suele ser observada dicha cromatografía; esto de las siguientes
maneras. Primero, en diagnósticos clínicos: las catecolaminas y la epinefrina son de suma
importancia para la identificación del Parkinson, enfermedades del corazón y/o distrofia
muscular. Segundo, determinación de pureza: la HPLC permite verificar la pureza de un
compuesto en un fármaco, como lo son los alcaloides, antibióticos, y esteroides. Y tercero,
en manufactura: al caracterizar moléculas/productos con potencial para fabricar fármacos,
como lo son las sustancias provenientes de las plantas, animales, etc. (Ryding, 2018).

Por otra parte, la cromatografía líquida de alta resolución también es empleada en la

purificación de agua, identificación de pesticidas en alimentos, detección de impurezas
tanto en fármacos como productos de consumo, y drogas en una muestra biológica (Dong,
2019).

C. Reacciones químicas
N/A

D. Ecuaciones utilizadas

Ecuación 1. Incertidumbre entre de divisiones y multiplicaciones.

√( )( )( )
2 2 2
Sa Sb Sc
S y= + + ...∗ y
a b c
Donde,
Sy es la incertidumbre de la operación
Sa,b,c... las incertidumbres de los datos
“y” el resultado de la operación
a,b,c... los datos

Ecuación 2. Concentración.

soluto
concentración=
volumen de soluto
Donde,
soluto = g de soluto
volumen de soluto = L de soluto

Ecuación 3. Modelo matemático

y=mx+b
Donde,
y = absorbancia

3
m = pendiente de la gráfica
x = concentración
b = intercepto

Ecuación 4. Porcentaje p/p.

masa soluto
% p / p= ∗100
masa solución
Donde,
masa soluto = g de soluto
masa solución = g de solución

III. RESULTADOS

Cuadro 1. Sacarosa en muestras.

Muestra Sacarosa (g sacarosa/g mx) % de sacarosa en muestra
1 0.1917  0.34 19.17  33.84
2 0.4010  0.71 40.10  70.80
El presente cuadro demuestra la cantidad de sacarosa encontrada en ambas
muestras de miel comercial analizadas.

Cuadro 2. Glucosa en muestras.

Muestra Glucosa (g glucosa/g mx) % de glucosa en muestra
1 0.2384  0.0742 23.84  7.42
2 0.2594  0.0808 25.94  8.08
El presente cuadro demuestra la cantidad de glucosa encontrada en ambas
muestras de miel comercial analizadas.

Cuadro 3. Fructosa en muestras.

Muestra Fructosa (g fructosa/g mx) % de fructosa en muestra
1 0.2638  0.0940 26.38  9.40
2 0.2016  0.0718 20.16  7.18
El presente cuadro demuestra la cantidad de fructosa encontrada en ambas
muestras de miel comercial analizadas.

IV. DISCUSIÓN

Como objetivo principal en la presente práctica, se estableció la determinación de sacarosa,

glucosa y fructosa, en dos muestras de diferente miel comercial, a través de un análisis en
un cromatógrafo líquido de alta resolución. Los porcentajes de dichos azúcares para la
primera muestra fueron 19.17  33.84 %, 23.84  7.42 % de sacarosa, glucosa y fructosa
respectivamente; y 40.10  70.80 %, 25.94  8.08 % y 20.16  7.18 % en el mismo orden,
para la segunda muestra.

Basado en lo anteriormente mencionado, se estableció que el objetivo fue cumplido de una

manera satisfactoria. Asimismo, se consideró un método preciso, ya que, los datos
4
obtenidos acerca de los estándares crearon curvas de calibración lineales con valores de R 2
de 0.9975, 0.9924 y 0.9993 para la sacarosa, glucosa y fructosa. No obstante, no fue posible
concluir en cuanto a la efectividad del método, puesto que, los empaques de las mieles
comerciales no suelen presentar los valores teóricos contenidos en el producto, por lo que
no existió un punto de comparación para los resultados obtenidos.

Respecto a los porcentajes resultantes de los azúcares, el valor de la glucosa, en ambas

muestras de miel, se encontró en los parámetros establecidos por David Ball (2007) y
Priscila da Silva (2016); los cuales pronuncian que la cantidad de glucosa en la miel de
abeja suele encontrarse en el intervalo de 20-40% (da Silva et al., 2016). Por otro lado, la
fructosa se presenta desde un 30% hasta el 75%, por lo que las muestras analizadas cuentan
con menor cantidad de fructosa en comparación a la literatura (Ball, 2007). Finalmente, la
sacarosa debería de manifestarse en un 0.1% hasta 9%; siendo así, el porcentaje obtenido
experimentalmente, significativamente elevado a lo esperado. A raíz de este análisis, se
concluyó que las mieles comerciales analizadas, se encontraban adulteradas, ya que, su
composición química se observó significativamente alterada.

Como principal fuente de error, se identificó la dificultad al transferir la miel desde el

beaker, hasta el balón aforado; causa de la consistencia pegajosa y viscosa de la muestra. A
pesar de los múltiples lavados, al final del trasvase, una parte de la miel se quedó en el
recipiente.

En caso de próximas experimentaciones, con el fin de aumentar la precisión de los

resultados obtenidos, se recomienda realizar un análisis triplicado para cada muestra de
miel, para poder llevar a cabo un análisis estadístico que respalde la precisión del método, y
también su efectividad.

V. CONCLUSIONES

1. El objetivo principal se basó en la determinación de tres azúcares en dos muestras de

miel comercial; este se cumplió satisfactoriamente, obteniendo los siguientes porcentajes de
sacarosa, glucosa y fructosa para la primera muestra: 19.17  33.84 %, 23.84  7.42 % y
26.38  9.40 % respectivamente; y 40.10  70.80 %, 25.94  8.08 % y 20.16  7.18 % en el
mismo orden, para la segunda muestra.

2. La cantidad obtenida de glucosa en la muestra, fue la única que se asimiló a los

parámetros de porcentaje de los azúcares observados en la literatura; mientras que la
sacarosa presentó ser mayor, y la fructosa, menor. Considerando así, la adulteración de las
mieles.

3. Las curvas de calibración realizadas para los tres azúcares presentaron un R 2 de 0.9975,
0.9924 y 0.9993 para la sacarosa, glucosa y fructosa respectivamente; manifestando la
precisión del método.

5
4. No fue posible concluir completamente acerca de la efectividad del método, debido a la
falta de valores teóricos exactos para la comparación de los datos experimentales obtenidos
con los mismos.

5. La principal fuente de error se observó en la transferencia de la miel en un beaker, al

balón aforado; ya que su consistencia dificultó los lavados del recipiente.

6. En caso de próximas experimentaciones, se recomienda (si fuera posible), llevar a cabo

el análisis de cada muestra de miel, en triplicado; con el fin de mejorar la precisión de los
resultados.

VI. APÉNDICE

A. Procedimiento
Se siguió el procedimiento de acuerdo con la guía Ana Silvia Colmenares de Ruiz, 2013:
“Práctica #10: Cromatografía líquida de alta resolución: Determinación de azúcares en
mieles”. No hubo modificaciones.

B. Datos originales

Cuadro 4. Valores de los estándares de sacarosa.

(Cromatógrafo HPLC Agilent, modelo 1100)
Estándar Masa (g) Retención (min) Área (nRIU*s)
1 0.1522 8.443 9.25E+05
2 0.3023 8.424 1.66E+06
3 0.4509 8.407 2.46E+06
4 0.6088 8.382 3.43E+06
El presente cuadro demuestra los datos obtenidos de los estándares de sacarosa.

Cuadro 5. Valores de sacarosa en las muestras de miel comercial.

(Cromatógrafo HPLC Agilent, modelo 1100)
Muestra Retención (min) Área (nRIU*s)
1 8.224 5.29E+06
2 8.373 1.10E+07
El presente cuadro muestra los datos obtenidos de los picos de sacarosa en las muestras.

Cuadro 6. Valores de los estándares de glucosa.

(Cromatógrafo HPLC Agilent, modelo 1100)
Estándar Masa (g) Retención (min) Área (nRIU*s)
1 0.0954 9.661 1.11E+06
2 0.1882 9.646 2.08E+06
3 0.3792 9.646 3.52E+06
4 0.7606 9.641 5.94E+06
El presente cuadro demuestra los datos obtenidos de los estándares de glucosa.

Cuadro 7. Valores de glucosa en las muestras de miel comercial.

6
 (Cromatógrafo HPLC Agilent, modelo 1100)
Muestra Retención (min) Área (nRIU*s)
1 9.613 9.10E+06
2 9.595 9.85E+06
El presente cuadro demuestra los datos obtenidos de los picos de glucosa
en las muestras de miel analizadas.
Cuadro 8. Valores de los estándares de fructosa.
(Cromatógrafo HPLC Agilent, modelo 1100)
Estándar Masa (g) Retención (min) Área (nRIU*s)
1 0.1204 10.533 1.57E+06
2 0.235 10.51 3.11E+06
3 0.4759 10.502 5.86E+06
4 0.968 10.497 1.13E+07
El presente cuadro demuestra los datos obtenidos de los estándares de fructosa.

Cuadro 9. Valores de fructosa en las muestras de miel comercial.

(Cromatógrafo HPLC Agilent, modelo 1100)
Muestra Retención (min) Área (nRIU*s)
1 10.49 1.54E+07
2 10.48 1.18E+07
El presente cuadro demuestra los datos obtenidos de los picos de fructosa
en las muestras de miel analizadas.

C. Datos modificados
N/A.

D. Cálculos de muestra

Cálculo 1. Concentración de estándar #1 de sacarosa.

0.1522 g
[ sacarosa ] = =6.088 g/ L
0.025 L

Este calculó se empleó para obtener la concentración de sacarosa en el primer estándar. Se

repitió con los diferentes valores de peso de sacarosa en los 3 estándares restantes, y de
glucosa y fructosa; a partir de esto, se realizó la curva de calibración Área vs
Concentración. Los resultados se pueden ver en el cuadro 10 página 7. Ecuación 2.

Cálculo 2. Concentración de sacarosa en muestra de miel.

6
5.29 x 1 0 −45630 80545
x=
136892 4853

y=38.34 67.68 g /L sacarosa

7
Este cálculo se utilizó para calcular la concentración de sacarosa en la muestra de miel
analizada. Se repitió con la otra muestra, al igual que con el resto de las azúcares. Los datos
se encuentran en cuadro 5, pág. 5, y, figura 1 pág. 8. El resultado en cuadro 8, pág. 10.
Ecuación 3.

Cálculo 3. Peso en gramos de sacarosa en gramos de muestra de miel.

38.34 67.68 g/L * 0.025 0.00003 L

peso =
5 g de miel

¿ 0.19167 ± 0.34 g de sacarosa /g de muestra

El presente cálculo se realizó con el fin de determinar la cantidad de sacarosa presente, en

la muestra rescatada de miel. Se repitió con la segunda muestra y con los valores del resto
de los azúcares. Los datos se encuentran en cuadro 1, pág. 3, y el resultado en cuadro 1,
pág. 3.

Cálculo 4. Porcentaje peso-peso de sacarosa.

% p / p= 0.19167 ± 0.34 g de sacarosa / g de muestra * 100

= 19.167 33.84 % p/p

Este calculó se empleó para obtener la concentración de sacarosa en el primer estándar. Se

repitió con los diferentes valores de peso de sacarosa en los 3 estándares restantes, y de
glucosa y fructosa; a partir de esto, se realizó la curva de calibración Área vs
Concentración. Los resultados se pueden ver en el cuadro 1 página 3. Ecuación 4.

E. Análisis de error

Cálculo 5. Incertidumbre de concentración de sacarosa en muestra de miel.

Sy=
√( 45630 )(
8054 5 2
+
136892)
4853 2
∗38.34=± 67 . 68 g/ L

Dicho cálculo fue utilizado para determinar la propagación de error de concentración de

sacarosa en la muestra de miel. Este procedimiento se realizó con el resto de los valores
calculados que hayan contado con incertidumbre. El resultado se encuentra en el cuadro 11,
página 8. Ecuación 1.

F. Datos calculados

Cuadro 10. Concentraciones de estándares de azúcares.

Estándar Concentración Concentración glucosa Concentración

8
 sacarosa ( 0.004 g/L) ( 0.004 g/L) fructosa ( 0.004 g/L)
1 6.088 3.816 4.816
2 12.092 7.528 9.400
3 18.036 15.168 19.036
4 24.352 30.424 38.72
El presente cuadro demuestra las concentraciones de los estándares de azúcares.

Cuadro 11. Concentraciones de azúcares en muestra.

Muestra Concentración Concentración Concentración
sacarosa (g/L) glucosa (g/L) fructosa (g/L)
1 38.34  67.68 47.69  14.85 52.77  18.89
2 80.20  141.59 51.88  16.15 40.31  14.36
El presente cuadro demuestra las concentraciones los azúcares presentes en
las muestras de miel comercial.

Cuadro 12. Porcentajes p/p de azúcares en muestra.

Muestra Porcentaje p/p Porcentaje p/p Porcentaje p/p
sacarosa (%) glucosa (%) fructosa (%)
1 19.17  33.84 23.84  7.42 26.38  9.40
2 40.10  70.80 25.94  8.08 20.16  7.18
El presente cuadro demuestra los porcentajes peso-peso de los azúcares
presentes en las muestras de miel comercial.

Figura 1. Gráfica área vs concentración sacarosa.

9
 Figura 2. Gráfica área vs concentración glucosa.

Figura 3. Gráfica área vs concentración fructosa.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Ball, D. W. (2007). The Chemical Composition of Honey. Journal of Chemical

Education, 84(10), 1643. https://doi.org/10.1021/ed084p1643
- da Silva, P. M., Gauche, C., Gonzaga, L. V., Costa, A. C. O. & Fett, R. (2016). Honey:
Chemical composition, stability and authenticity. Food Chemistry, 196, 309-323.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.09.051
- Dong, M. (2019). HPLC Applications in Food, Environmental, Chemical, and Life
Sciences Analysis. HPLC and UHPLC for Practicing Scientists, 335-369.
https://doi.org/10.1002/9781119313786.ch13
- Ozores, M. (2015). Cromatografía de líquidos HPLC. Laboratorio de Técnicas
Instrumentales UVa. https://www.laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-
qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc
- Ryding, S. (2018). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Applications.
News-Medical.net. https://www.news-medical.net/life-sciences/High-Performance-
Liquid-Chromatography-(HPLC)-Applications.aspx
- Skoog, D. A., West, D., Holler, J., & Crouch, S. (2014). Fundamentos de química
analítica (9.a ed.). Cengage Learning.

10
- Suarez, D. & Morales, Y. (2018). Principios básicos de la cromatografía líquida de
alto rendimiento para la separación y análisis de mezclas. Revista Semilleros:
Formación Investigativa.
https://repository.uamerica.edu.co/bitstream/20.500.11839/7731/1/6131978-2018-1-
IQ.pdf

VIII. TABLAS DE DATOS EXPERIMENTALES

IX. ANEXOS
N/A.

11