Orquideas de Entre Rios
Orquideas de Entre Rios
Orquideas de Entre Rios
PID 2172
Lallana, Víctor H.; Billard, Cristina E.; Reinoso, Patricia D.; Martínez, Vanina A.; García, Luz F.
AUTORES: Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Entre Ríos. Ruta Pcial. Nº 11 Km 10,5
Oro Verde - Entre Ríos (3100), Argentina.
CONTACTO: victorl@fca.uner.edu.ar
RESUMEN
El proyecto se centra en el rescate y propagación de especies nativas de orquídeas de la zona del litoral,
en particular las que crecen en la diversidad de hábitats palustres y selvas ribereñas de los arroyos de
Entre Ríos, contribuyendo a la preservación de las especies ante el avance de las actividades antrópicas
en los ecosistemas.
El objetivo principal del proyecto es consolidar y ampliar un banco de germoplasma de semillas de
orquídeas nativas (BGO) con fines a su conservación y propagación por técnicas de cultivo «in vitro». Se
evaluará la viabilidad mediante prueba de tetrazolio de las semillas del BGO y longevidad según las
condiciones de almacenamiento, realizando pruebas de germinación «in vitro» y posterior propagación,
hasta la etapa de aclimatación de plantas en macetas, confeccionando los respectivos protocolos para
las especies evaluadas.
Los resultados del proyecto serán transferidos a cultivadores, viveristas, jardines botánicos y público
en general, a través de charlas técnicas y cursos de capacitación, lo cual contribuirá a la toma de con-
ciencia en preservación de especies nativas y a la compra de plantas producidas por esta técnica. De
igual forma, se vinculará los datos del BGO al Sistema Nacional de Datos Biológicos.
Palabras clave: Recursos genéticos nativos, orquídeas, semillas, longevidad, germinación, micropropa-
gación
Universidad Nacional de Entre Ríos | ISSN 2250-4559 | Eva Perón 24; 3260 FIB Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina | (84-111) | 84
Lallana, Víctor H., et al. | Banco de Germoplasma de orquídeas nativas de la región litoral
Introducción
La familia Orchidaceae, de amplia distribución mundial, comprende alrededor de 880 géneros con
22.075 especies (Stevens, 2001). Ochidaceae constituye claramente una de las familias de plantas más
grande y variada (Dresler, 2005). La mayor diversidad está concentrada en las zonas tropicales y subtro-
picales pudiendo crecer como epífitas, terrestres, lacustres, rupícolas, humícolas y subterráneas (Jonh-
son 1992).
En Argentina, esta familia comprende 91 géneros (http://www.floraargentina.edu.ar/) y unas 246
especies nativas (Zuluaga & Morrone 1999). Freuler (2003) eleva la cifra a 280 especies agrupadas en
aproximadamente 78 géneros, de los cuales 33 son epifitos con 98 especies, y 45 son terrestres con 163
especies. Se distribuyen desde Tierra del Fuego hasta Misiones y Jujuy; pero la mayor concentración
se encuentra en la región subtropical (selva paranaense y de las yungas) donde se halla el 50% de las
especies mencionadas (Tabla 1). Algunas especies se consideran amenazadas y con algún riesgo de con-
servación (Cellini et al., 2009, Frueler, 2003).
Tabla 1. Número de especies de orquídeas de las provincias de la región Litoral (Provincias de Misiones, Chaco, For-
mosa, Santa fe, Corrientes y Entre Ríos).
Isaurralde y Radins, 2007 en el libro Misiones Orquídeas cita como área de distribución a 11 orquí-
deas para la provincia de Entre Ríos, mientras que la Flora vascular de la Republica Argentina eleva el
listado a 19 especies (Tabla 2).
Tabla 2. Listado de especies de orquídeas citadas para Entre Ríos, incluido su status y hábitat. Fuente: http://www.
darwin.edu.ar/Proyectos/FloraArgentina/fa.htm
Las orquídeas constituyen unas de las familias de plantas de mayor demanda entre las ornamentales.
La explotación irracional a que han sido sometidas unido a las exigencias medio ambientales de éstas
para su reproducción y desarrollo natural, han contribuido a que muchas especies se encuentren ame-
nazadas o en peligro de extinción (Rodríguez et al., 2005).
Para preservar la flora nativa, que es objeto de depredación y de tala de bosques con desaparición
de especies, es necesario buscar nuevas formas de propagación. Pierik (1994) ha argumentado que la
deforestación de los bosques, la degradación de los ecosistemas montañosos y la contaminación am-
biental han conllevado a que algunas especies se encuentren en peligro de extinción y con el menor
conocimiento sobre su propagación.
Una de las formas más utilizadas para la propagación de orquídeas (Arditti, 2008) es a través de la
propagación sexual simbiótica, y por fragmentos de tallos y seudobulbos, procesos insuficientes para
atender la demanda de producción de nuevas plantas. El cultivo de tejidos es usado para la propagación
rápida de orquídeas obteniendo plantas de alta calidad genética y con bajos costos y es empleado in-
dustrialmente en Tailandia, Singapur, Malasia, Indonesia y otros países (Arditti y Ernst, 1993). Esta técnica
es utilizada por muchos productores de Brasil desde hace más de 20 años (Tardeu de Faria et al., 2006).
La propagación de las orquídeas se realiza en forma agámica y por semillas. A través de la técnica de
cultivo «in vitro» se pueden obtener un gran número de plantas, transformándose en una valiosa herra-
mienta cuando se trata de propagar especies en peligro de extinción (Flachsland et al., 1996) o híbridos
desde el punto de vista comercial (Penningsfeld, 1985; Kanjilal et al., 1999; APO, 2007) o del manteni-
miento de la biodiversidad (Pritchard, 1990).
Muchas plantas de orquídeas han desaparecido y nos enfrentamos al peligro de perder especies
completas. Las orquídeas deben competir con la agricultura, el crecimiento urbano y la industria (Dres-
ler, 2005). Gran parte de la vegetación natural de los países latinoamericanos ha desaparecido y la pre-
sión a favor de la agricultura y la urbanización es muy probable que no vaya a disminuir.
El proyecto se enmarca dentro de la investigación básica y aplicada con transferencia habiendo plan-
teado las siguientes hipótesis o justificación:
• El preocupante avance de la agriculturización sobre áreas de montes nativos y selvas ribe-
reñas amenaza la biodiversidad. En tal sentido preocupa la pérdida de especies nativas de
interés desde el punto de vista ecológico, agronómico u ornamental.
• Los datos del Banco de Germoplasma de orquídeas (BGO), debidamente sistematizados, se-
rán vinculados al Sistema Nacional de Datos Biológicos (http://datos.sndb.mincyt.gob.ar). -Se
deben conocer las especies en estudio en sus aspectos botánicos, ornamentales y agronó-
micos, además debe(n) ser multiplicada(s) y utilizada(s) acorde al beneficio agronómico y
ecológico que puedan dar.
• La transferencia, a través de cursos, charlas técnicas y cartillas, ofrecidas a viveristas, asocia-
ciones de orquidiófilos y jardines botánicos, contribuirá a la toma de conciencia para no ad-
quirir, ni vender recursos nativos, en su estado original y propiciar la compra de estas especies
obtenidas por técnicas de cultivo de tejidos.
Materiales y métodos
Se brinda una síntesis de las metodologías empleadas en los principales títulos que se informan en re-
sultados, debiendo considerarse que muchos aspectos metodológicos han sido publicados y otros pro-
tocolizados para trabajos en laboratorio o gabinete y puestos a disposición del público a través de una
página WEB (Orquier, 2017).
Tabla 3. Descriptores del Catálogo de Accesión de muestras de semillas de orquídeas. Banco de Germoplasma de
Orquídeas – FCA
6 CAJA Texto
HELADERA
7 ENVASE Texto
8 Nª DEL COLECTOR Texto
9 NOMBRE COLECTOR Texto
10 LUGAR Texto
11 FOTO FRUTO Tilde
12 FECHA DE INGRESO al BGO dd/mm/aa
13 POL. NAT. Tilde
14 AUTOGAMIA Tilde
15 POLINIZACION MANUAL ALOGAMIA Tilde
16 HIBRIDO Tilde
17 Nº FLORES POL. Número
18 Nª FRUTOS COSECHADOS Número
19 FECHA COSECHA FRUTOS dd/mm/aa
20 FECHA COSECHA SEMILLAS dd/mm/aa
21 FOTO VIABILIDAD SI / NO
22 UNA Tilde
23 PRUEBA DE VIABILIDAD VARIAS Tilde
24 Nº INFORME Alfanumerico
25 ENSAYO CVO. IN VITRO Tilde
26 CATÁLOGO FÍSICO Tilde
27 CATÁLOGO DIGITAL Tilde
28 MUESTRA ELIMINADA Color
Durante 2017 se trabajó activamente en el rediseño de la Base de Datos para incluir la misma en el
Sistema de Nacional de Datos Biológicos, completando los formularios “ad hoc” y haciendo las consultas
correspondientes al administrador nacional, tarea realizada por la Ing. Agr. Patricia D. Reinoso.
Dentro de los objetivos del BGO se encuentra la conservación de las muestras en el tiempo la cual
se realiza en frio (5± 1°C) con las semillas guardadas en envases pequeños de vidrio con tapa de goma
y debidamente rotulados. Estos envases se guardan en uno mayor con tapa hermética y dentro del cual
se coloca silica gel para mantener baja la humedad.
Los bancos de semillas proveen un medio para preservar al máximo la diversidad genética en un
espacio y costo mínimo (Seaton y Pritchard, 2003). La determinación periódica de la viabilidad de las
semillas es un dato importante a evaluar para conocer el grado de conservación de las muestras y más
aun teniendo en cuenta el pequeño tamaño de las semillas y el desarrollo de un embrión inmaduro sin
endosperma (Arditti y Ernst, 1993). A los fines de comprobar la conservación de las semillas en el tiempo,
se realizan pruebas de viabilidad a lo largo del tiempo de almacenamiento (Lallana y García, 2012) y se
determina la longevidad de las muestras.
El procedimiento de la prueba de viabilidad de semillas de orquídeas no figura en las normas ISTA
(2012) y se elaboró un protocolo publicado en la Revista Análisis de Semillas (García y Lallana, 2014).
Se consideraron semillas viables aquellas que presentan una coloración de rosado a rojo oscuro; y no
viables las semillas blancas o sin tinción con embrión visible. Los datos se expresaron en porcentaje de
semillas viables. Simultáneamente se evalúa el número de semillas vanas de las muestras, las cuales
resulta imposible separar antes del análisis de viabilidad, para trabajar con semillas puras tal cual lo
establecen las normas ISTA (2012). De esta forma al número de semillas viables y no viables se suma el
número de semillas vanas y se obtiene el total de semillas de la muestra y sobre este valor se calcula el
porcentaje de semillas vanas de la muestra.
siembra se realiza la desinfección de las semillas de acuerdo a protocolos ya establecidos y que consiste
básicamente en someter las semillas a una solución con hipoclorito de sodio o calcio y tres lavados con
agua destilada (Mweetwa et al., 2008; McKendrick, 2000, Billard et al. 2014). Las cajas de Petri se rotulan
y sellan en el contorno con una cinta adhesiva y en la base se coloca una cuadricula (1 cm x 1 cm) de
acetato para facilitar el proceso de recuento de las semillas germinadas en 3 cuadros por caja. La ger-
minación se evalúa a partir de los 10 días y durante un mes aproximadamente – dos o tres veces- según
las especies, realizando observaciones bajo lupa binocular de cada caja y contando los distintos estados
de desarrollo según las etapas establecidas por (Mitchell, 1989).
Ensayos de aclimatación
La aclimatación de plantas cultivadas «in vitro» es la última fase del proceso de micropropagación y
es considerada una etapa crítica donde se determina la sobrevivencia y establecimiento de plántulas
(Lesar et al., 2012). Es una etapa crítica ya que implica cambios drásticos en la condición de cultivo para
las plantas, la cual puede provocar estrés y muerte. Durante el cultivo «in vitro» las plantas presentan
un crecimiento anormal con cambios de tipo morfológico, anatómico y fisiológico (Cañal et al., 2001).
Se procedió a probar diferentes técnicas y sustratos para el cultivo de orquídeas, con el fin de favo-
recer el proceso de aclimatación y establecimiento de las plantas. El proceso debe hacerse en forma
gradual y tarda alrededor de dos a tres meses para que las plantitas puedan aclimatarse en condiciones
de invernáculo.
Las plantas provenientes de distintos ensayos con tiempos variables de cultivo «in vitro», son retira-
das con pinzas de los frascos de cultivo y se lavan cuidadosamente con agua destilada para separar los
restos de medio de cultivo que pudieran permanecer adheridos a las mismas. Luego se toman medidas
del número y longitud de hojas y raíces y se fotografían. Posteriormente, en algunos casos se aplicó fun-
gicida (Carbendazim) mediante inmersión de las plantitas o bien a posteriori con pulverizador manual.
Luego las plantas se acondicionan en vasos de Tergopor® (6 cm diámetro x 10 cm alto) conteniendo la
mitad de su volumen cubierto con sustrato de piedra negra partida, humedecido a saturación y coloca-
dos en una bolsa plástica atada en su extremo para formar un efecto de cámara húmeda evitando el
estrés de las plantitas. En otros casos las plantas se colocaron en macetas plásticas pequeñas con lecho
de musgo de Sphagnum y envueltos como en el caso anterior (cámara húmeda), permaneciendo en es-
tas condiciones por 48-72 h en laboratorio. Concluida esta primera etapa de aclimatación las plantas de
especies de hábitat epífito, se montan en palos pequeños de 1 a 2 cm de diámetro y 15 cm de longitud
(usando especies de bignonia, eucaliptus, roble, pino, según disponibilidad). Para el montaje también se
ha desarrollado un protocolo que consiste básicamente en ubicar sobre la superficie del palo las raíces
de 1 o 2 plantas, cubrirlas con musgo de Sphagnum y atarlas firmemente con hilo encerado. Cada palo
se rotula y se le coloca un gancho de alambre en un extremo.
Las plantas montadas en palo se colocan en una bandeja amplia, en posición inclinado (20°) apo-
yados en los bordes, con 1 cm de agua en la base y se tapan con un nylon, para lograr una cámara hú-
meda, la cual no es del todo cerrada, ya que por los costados se permite intercambio de aire. En estas
condiciones de laboratorio con luz natural difusa se mantienen durante 4 a 7 días y luego se llevan a un
umbráculo en el invernáculo, donde permanecen otra semana o 10 días, para luego ser colocadas sobre
una pared sombreada del invernáculo.
Para el caso de orquídeas terrestres se realiza el mismo procedimiento, pero en vez de ser montadas
en palos, se acondicionan en bandejas multicelda o en macetitas de plástico con diferentes sustratos
comerciales o mezclas preparadas, a base principalmente de corteza de pino, musgo de Sphagnum,
cascara de arroz o perlita. También permanecen en condiciones de laboratorio los primeros días y luego
se llevan a invernáculo con riegos periódicos por aspersión. Las plantas en invernáculo son pulveriza-
das con fertilizantes comerciales (20-20-20) una vez por mes y se controla la presencia de plagas y de
babosas.
Protocolos
Se ha continuado en forma permanente con la revisión y actualización de los protocolos desarrollados
en el marco del proyecto, la mayoría subidos a la página WEB (www.orquier.fca.uner.edu.ar). Estos inclu-
yen aspectos básicos de la preparación de medios de cultivo, manejo y calibración de instrumental del
laboratorio, desinfección de frutos y semillas, siembra, esterilización, manejo del Banco de germoplas-
ma, conteo de semillas, montaje de plantas, entre otros.
Las distintas actividades del proyecto conllevan gran número de información que debe ser ordenada
y mantenida en base de datos tipo Excel, las cuales son permanente actualizadas. El proyecto mantiene
activas 12 base de datos.
Síntesis de resultados
Tabla 4. Base de datos (BD) activas para seguimiento de las actividades, colecciones y banco de germoplasma de
semillas de orquídeas, número de descriptores y de registros (Años 2015 a 2017)
Detalle N° de
Volumen
BD principal BD complementarias resumido descriptores o N° de registros
de datos
(*) campos
Colección de
---- 1) 14 76 especies 1.064
referencia
Muestras eliminadas
Lista alfabética
Catalogo de 95 especies
Almacenadas en 2) 28 5.852
accesión 114 híbridos
heladera
Lista especies sin repetir
Germinación “in
5) 10 29 Ensayos 290
vitro”
Híbridos
Cruzamientos Autogamia 6) 11 82 cruzamientos 902
Alogamia
Ensayos
9) 20 106 Ensayos 2.120
Aclimatación
A diciembre de 2017 el BGO tenía asentados 384 registros (Tabla 5). Actualmente existen 95 especies
no repetidas y 114 híbridos. Considerando las bajas, el saldo es de 286 muestras almacenadas en refri-
gerador (Tabla 5).
Tabla 5. Evolución anual de la base de datos del Banco de Germoplasma de semillas de orquídeas
Total sp. No
Saldos Especies no
Año Ingresos Bajas Híbridos repetidas +
acumulados repetidas
Híbridos
2010 80 52 28
2011 130 64 66 27 15 42
2012 227 83 144 53 36 89
2013 270 83 187 63 44 107
2014 304 88 216 73 50 123
2015 339 91 248 76 58 134
2016 367 98 269 69 93 162
2017 384 98 286 95 114 209
Ingresos: total acumulado del número de ID hasta el último registro de la base de datos.
Bajas: total acumulado anual de muestras eliminadas de la base de datos.
Saldos: diferencia entre ingresos y bajas (cantidad neta de muestras en el banco de germoplasma).
Se realizaron las acciones correspondientes para la inscripción del BGO en el Sistema Nacional de
Datos Biológicos, inscribiendo el Jardín Botánico de la Facultad de Ciencias Agropecuarias registrado
provisoriamente como centro número 1245 -361, Acrónimo: JBPA y para el banco de germoplasma de
semillas de orquídeas el numero 1245 -445, Acrónimo: BGO, quedando pendiente la carga de algunos
datos formales del responsable institucional, para luego poder dar inicio a la carga de datos.
Vinculado a esta temática durante 2017 se presentaron 3 trabajos en congresos (Sedano et al., 2017;
Michel y Lallana, 2017) de los cuales uno salió publicado como resumen expandido (Michel et al., 2017).
También se generaron tres nuevos protocolos vinculados a Método de conteo directo de semillas de or-
quídeas, Conteo de semillas de orquídeas con software ImageJ y Metodología para la medición de caída
libre de semillas de orquídeas.
hasta que finaliza la caída de las semillas “DOS”, y corta el cronometro del tiempo DOS. Esta operación
se realiza en tres repeticiones por muestra. Los ensayos preliminares se hicieron con tres especies (Tabla
6) y luego se midieron velocidades de caída en 13 especies más.
Tabla 6. Valores medios y desvío estándar de velocidad de caída libre de semillas (seg/1,5 m) de tres especies nativas
de orquídeas (n= 3). Volumen de aire de la semilla (% Aire) y relación largo ancho (Rel. L/A)
Las semillas con mayor volumen de aire tardan más tiempo en caer (Arditti y Ghani, 2000), si bien se
requiere aún realizar un mayor número de ensayos para confirmar esta hipótesis.
Las semillas de orquídeas se caracterizan por ser muy pequeñas, carecer de endosperma y el em-
brión es inmaduro. Otra característica común de muchas especies de orquídeas es la producción de una
altísima cantidad de semillas por cápsula, pero sólo un 5 % germinan en condiciones naturales (Tardeau
de Faria, 2006). Una cápsula de Gomesa bifolia puede contener 1,7 millones de semillas (Lallana et al.
2010) y una cápsula de Cycnoches vemtricosum var. Chlorochilon 4 millones de semillas (Arditti, 1961).
En otras especies el número de semillas es menor a 100.000 por cápsula (Silva Pereira et al., 2014). La
producción de un gran número de semillas por cápsula ha sido descripta como una característica común
de plantas que poseen requisitos muy específicos de germinación (Rauh et al., 1975; Rasmussen, 1995).
No obstante que el número de semillas por cápsula puede variar entre especies de la familia, cono-
cer la cantidad de semillas es útil para estudios sobre germinación en condiciones naturales o para la
siembra aséptica de semillas (Silva Pereyra at al, 2014).
A partir de las semillas almacenadas en el BGO y de acuerdo a la metodología de conteo propuesta
por Lallana (2015) se evaluaron 8 especies y 2 híbridos (Tabla 7) de orquídeas, estableciendo el número
de semillas por fruto a partir el peso previo de las semillas. Se puede observar una gran variabilidad
entres las especies desde unos pocos miles hasta más de un millón de semillas por fruto.
Tabla 7. Número de semillas por mg, de semillas por fruto y peso medio de semillas en nanogramos, de varias espe-
cies de orquídeas.
ID Especie Sem.mg-1 Sem.fruto Peso ng
352 Gomesa flexuosa 14896 1.385.328 67,13
353 Gomesa bifolia 13025 1.055.025 76,78
301 Brasilorchids picta 2058 143.539 485,91
337 Cattleya porhyroglossa 2023 1.394.915 494,32
109 Polystachya concreta 1949 2.729 513,08
274 Gom_bif x Gom_bif pétalos marrones 1623 15.629 616,14
302 Chloraea membranaceaa 1502 31.211 665,78
304 Oncidium fimbriatum 1488 141.658 672,04
321 Bletilla striata 1463 138.009 683,53
323 Oncidium cebolleta 1326 76.942 754,15
277 Gom_bif CR13 x Gom_bif Pét. amarillo 836 8.694 1196,17
Viabilidad y longevidad
Periódicamente se efectúan pruebas de viabilidad mediante la prueba de tetrazolio (García y Lallana,
2014) para establecer la longevidad de las semillas almacenadas en frio. Lallana y García (2016), evalua-
ron la viabilidad de semillas con 2, 3, 4 y 5 años de almacenamiento en frio (5 °C) provenientes del BGO
de la FCA-UNER. Los resultados se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8. Resultados de ensayos de viabilidad inicial y final y porcentaje de semillas vanas en 18 especies y 5 híbridos
de orquídeas. Los casilleros en blanco indican NO determinado. TA: tiempo de almacenamiento en años, T: hábitat
terrestre, E: epífito. Las especies se indican con las tres primeras letras del género y las tres primeras de la especie y
están ordenadas de menor a mayor tiempo de almacenamiento (Días VF).
TA Días Viabilidad % Días Viabilidad %
Especie Hábitat
(años) (VI) Inicial (%) Vanas (VF) Final (%) Vanas
Onc_fim <2 E 547 100 0
Pap_ter <2 E 96 88 593 0
Bra_spp. <2 E 761 0
Tri_jon <3 E 53 97 6 919 99 1
Pol_con <3 T-E 270 97 954 94 2
Ble_str <3 T 346 92 63 1093 96 72
Bra_tub <4 E 1120 0
Gom_bif <4 E 339 98 2 1140 62
Gom_long <4 E 1063 99 1 1140 100
Gom_bif (híbrido) <4 E 339 81 5 1140 61
Cat_nob <4 E 371 96 14 1223 98
Chl_mem <4 T 15 16 33 1231 2 33
Bip_pen <4 T 9 86 13 1240 0
Cyc_ela <4 T 1240 97 1
Bra_pic <4 E 1344 91 12
Cat_leo x Cat_mul <4 E 1372 0
Epi_dif x Epi_iba <4 E 1379 0
Epi_iba <4 E-T 332 71 33 1501 0
Myr_tib <5 E 1523 0
Ble_str <5 T 1558 0
Iso_lin <5 T-E 413 91 1624 28 0
Zig_max +5 E 1915 34 19
Cat_int x Cat_pao +5 E 52 99 1994 82 19
Lae_ten x Lae_pur +5 E 2201 82 20
De las especies e híbridos evaluados, pocos logran mantener la viabilidad en el tiempo con valores
por encima del 60 % comparando situación inicial y final (Tri_jon, Pol_con, Gom_lon, Cat_int x Cat_pao).
Dos híbridos intragenéricos de Laelia y Cattleya mantuvieron altos valores de viabilidad después de 5
años de almacenamiento en frio (Tabla 8). En solo dos muestras (Bip_pen y Epi_iba) la viabilidad decayó
a cero a los 3 y 4 años respectivamente, mientras que Pap_ter en menos de un año decayó a cero (Tabla
8). Dos muestras de Gom_bif disminuyeron su viabilidad un 36 y 20 % entre 1 a 3 años de almacenamien-
to, respectivamente, mientras que Iso_lin decayó un 69 % entre la situación inicial y final (4 años). En
algunas especies, la viabilidad final cero, podría explicarse por procesos de incompatibilidad polínica
de algunos híbridos o falta de polinizador específico lo cual determina semillas vanas y no viables y no
por condiciones de almacenamiento de las muestras. En otros estudios (Lallana y García 2012 y 2015)
se halló que la pérdida de viabilidad en la mayoría de las especies se da en forma gradual y leve en el
tiempo. Las semillas del género Gomesa presentan altos valores de viabilidad (mayor al 90%) recién
cosechadas (Lallana y García, 2105), reduciendo a la mitad su viabilidad en un periodo de dos años de
almacenamiento en frío, mientras que Bipinnula pennicillata en 3,5 años de almacenamiento disminuyó
del 87% al 61% su viabilidad y en Bletilla striata en 15 meses disminuyó de 70% al 36%.
Figura 1. Semillas viables (tinción roja a anaranjado) de Gomesa bifolia, G. longicurnu, Oncidium fimbriatum y Bleti-
lla striata (viables y no viables).
El método de almacenamiento empleado, sin secado previo, permitió la conservación de las semillas
de orquídeas por largos periodos (uno a cinco años), según las especies, siendo de bajo costo y sencillo
de implementar.
Distribución geográfica Argentina: Buenos Aires, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Jujuy, Misiones, Salta,
Santiago del Estero, Santa Fe, Tucumán.
Brasil: Paraná, Rio Grande Do Sul, Santa Catarina
Paraguay: Alto Paraná, Guairá, San Pedro
Uruguay: Artigas, Cerro Largo, Colonia, Lavalleja, Maldonado, Río Negro, Rivera, Rocha,
Salto, San José, Soriano, Tacuarembó, Treinta y tres Orientales.
Elevación (m.s.m): Mín. 0; Máx. 600
Hábito Hierba perenne
Nativa SÍ
FRUTO
Fecha de colecta: 19/10/2012
Colector: Jonathan
Lugar de colecta: Paraná
SEMILLA
Descripción cualitativa de las semillas observadas en lupa:
Semillas numerosas, de color blanquecino, testa reticulada; presentan forma filiforme, relación largo/
ancho: alargada. De tamaño medio. El embrión es visible, se encuentra en la parte central de las semi-
llas; presenta un color pardo claro caracterizando a las semillas que lo poseen de dicho color; el em-
brión ocupa aproximadamente 1/3 parte de la semilla.
Figura 2. Ejemplo de la ficha C-11 correspondiente a la especie Cyclopogon elatus del catálogo descriptivo de semi-
llas de orquídeas
Figura 3. Desarrollo plantas de Gomesa bifolia var Federal a los 90 días de cultivo “in vitro”, en medio simplificado
con fertilizante.
Título Título
12,29 26,08
10,56 20,57
ALTURA (mm)
LR (mm)
8,82 15,06
7,08 9,55
4,04
5,34
N-100 E1-3C E2-6C E3-12C
N-100 E1-3C E2-6C E3-12C
Ensayo
Ensayo
Figura 4. Altura media y longitud radical (LR) de plantas de Gomesa bifolia var Federal evaluados a 90 días de creci-
miento en distintos medios de cultivo “in vitro”.
La altura de las plantas mostró diferencias entre los tratamientos de máxima fertilización y el N-100
y E1 3C, no obstante el desarrollo de hojas (color y tamaño) fue significativamente mejor en N-100. En
cuanto a la longitud radical (Figura 4), se observa un efecto significativo en el tratamiento E1 3C (menor
dosis de fertilizante), pero el desarrollo de la parte aérea (hojas) fue pobre y con hojas de color amari-
llento.
En síntesis, se concluye que el medio de cultivo simplificado no reemplaza totalmente a los medio
completos y presenta deficiencia de algunos nutrientes que impide un normal desarrollo de la parte
aérea. Por otra parte se observó un importante estímulo al crecimiento radical (número y longitud de
raíces) en los tratamientos fertilizados (Figura 5).
Título
8,26
6,54
Num hojas y raices
4,82
3,10
1,39
N-100 E1-3C E2-6C E3-12C
Ensayo
Figura 5. Numero de hojas y de raíces de plantas de Gomesa bifolia var Federal evaluados a los 90 días de crecimien-
to en distintos medios de cultivo “in vitro”.
En otro ensayo montado en paralelo E08-16 (24/08/16), con la misma especie, se evaluó el creci-
miento y desarrollo de plantas en dos medios: medio simplificado con Crop 12 (0,3 ml.L-1) versus Muras-
higue y Skoog al 50 % de la concentración de sales.
Las plantas en medio simplificado presentaron poco desarrollo de la parte aérea, hojas de color ver-
de amarillento a marrón y algunas secas. Buen desarrollo de raíces. Las mismas plantas en medio M&S al
50 % presentaron color verde intenso, gran desarrollo de la parte aérea y desarrollo de raíces, evaluados
a los 90 días (Figura 6).
Figura 6. Desarrollo de plantas de Gomesa bifolia var Federal a los 90 días de cultivo “in vitro” en dos medios (M&S;
Murashige and Skoog y Simp.; simplificado).
En tres años de ejecución del proyecto se han iniciado 35 nuevos ensayos de cultivo “in vitro”, mante-
nido 38 ensayos en repiques, cultivado 18 especies y 20 híbridos de orquídeas (Tabla 9).
Tabla 9. Número de nuevos ensayos por año, repiques, especies e híbridos mantenidos en cámara de crecimiento y
detalle de las especies nativas en cultivo por año.
Ensayos Ensayos
Año especies híbridos Especies nativas (nuevos ensayos)
nuevos Repiques
Brasilorchis picta, Brassavola tuberculata,
2015 8 14 (1) 6 12 Oncidium fimbritum, Encyclya argentinensis,
Isochilus linearis
Cyrtopodium punctatum, Leptotes unicolor,
2016 16 (2) 9 6 6 Chloraea membranacea, Brassavola
tuberculata
Microlaelia lundii, Isabella pulchella, ,
2017 11 (3) 15 6 2 Chloraea membranácea, Oeceoclades
maculata
(1) Cyclopogon elatus, Gomesa bifolia x G. flexuosa; (2) Seis híbridos de Gomesa bifolia var Federal por otros Oncidium de pétalos
amarillos, marrones y un híbrido intraespecifico (Maxilaria variabilis x Brasilorchis picta); (3) Sophrolaelia (hibrido), Epidendrum
sp.; Catleya labiatta, C. aurantiaca, C. gutata y Neobentania graciliens
Para el control y seguimiento de los ensayos en cámara de crecimiento se ha desarrollado una plani-
lla Excel semiautomática permite actualizar las altas y bajas de los frascos en cultivo, debido a: conta-
minación, repique, secado del medio de cultivo o extracción para aclimatación.
Vinculado a la micropropagación de especies nativas de orquídeas de la región litoral se presentó
una ponencia oral sobre “Conservación y multiplicación de orquídeas Nativas Argentinas” en el I Congre-
so de Jardines Botánicos del Cono Sur (Córdoba, 2016). Se hizo un balance de las distintas experiencias
en micropropagación de orquídeas del proyecto, y se mostraron ejemplos de plantas que alcanzaron
la floración construyendo una planilla modelo “Historia de vida de una planta de orquídea” donde se
visualizan las distintas etapas del proceso. En el trabajo se menciona que los resultados del proyecto
serán transferidos a aficionados, viveristas y público en general, a través de charlas técnicas y cursos de
capacitación, lo cual contribuirá a la toma de conciencia en preservación de especies nativas y a la com-
pra de plantas producidas por esta técnica. En 5 años se logró la micropropagación y aclimatación de 18
especies nativas y cuatro híbridos (Tabla 10), de los cuales 6 especies y dos híbridos fueron obtenidos en
los tres últimos años (2015-2017).
Tabla 10. Especies e híbridos de orquídeas nativas micropropagadas en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos-FCA.
Gom_bif (Salta) x Gom_bif pétalos marrones (E) Gom_bif (ID36) x Gom_bif pétalos marrones (E)
Leptotes unicolor (E) Chloraea membranácea (T)
*Referencias: (*P) Especies sobre las que existen trabajos publicados (Billard et al., 2014 a,b; Dalzoto, 2013; Dalzoto y Lallana,
2013 a y b, 2015; Dalzotto et al. 2013, 2015; Di Persia y Lallana 2015; Lallana y García, 2012, 2013, 2015, 2016; Lallana et al., 2010;
2016; Lallana y Barsnti, 2016; Lallana y Wagner, 2017; Michel et al, 2017) y/o presentados en congresos (*C), (E) plantas epífitas,
(T) plantas terrestres.
Aclimatación
En general se observa que cuando las plantas son aclimatadas con tamaños menores a 3 cm de altura,
se obtienen magros resultados de sobrevivencia. El tiempo de aclimatación en laboratorio (alta hume-
dad y baja intensidad lumínica) también es importante en lograr una mayor tasa de sobrevivencia. Los
cambios ambientales que sufren las vitro plantas son importantes y drásticos, por lo cual el proceso de
aclimatación deber realizarse en forma gradual.
Con el propósito de sistematizar la historia de vida de las plantas micropropagadas y aclimatadas
se elaboró una ficha tipo con información técnica de los pasos metodológicos y que concluye con una
infografía ilustrativa de los meses de cada etapa (Germinación, cultivo “in vitro”, Aclimatación) hasta la
floración de la planta. Las especies de las cuales se dispone de información sistematizada son seis, cuya
infografía se muestra a continuación:
Oncidium fimbriatum: Tiempo de cultivo desde semilla hasta primera floración: 26 meses.
Tiempo en meses à
1 2 4 5 .. .. .. .. .. .. 13 14 15 16 .. .. .. .. 25 26 27 28
Germi-
Cultivo “in vitro” Aclimatación – crecimiento vegetativo Flor
nación
Ciclopogon elatus: Tiempo de cultivo desde semilla hasta primera floración: 22,5 meses
Tiempo en meses à
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 .. .. .. 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Polystachya concreta: Tiempo de cultivo desde semilla hasta primera floración: 46 meses
Tiempo en meses à
1 2 3 4 5 .. .. .. .. .. .. 25 26 27 28 .. .. .. .. 44 45 46 47
Epidendrum campaccii: Tiempo de cultivo desde semilla hasta primera floración: 35 meses
Tiempo en meses à
1 2 3 4 .. .. .. .. .. .. 15 16 17 18 .. .. .. .. 33 34 35 36
Germi-
Cultivo “in vitro” Aclimatación – crecimiento vegetativo Flor
nación
Gomesa bifolia “Federal”: Tiempo de cultivo desde semilla 50 meses (sin floración)
Tiempo en meses à
1 2 3 4 .. .. .. .. .. 16 17 18 19 20 .. .. … … 48 49 50
El ciclo completo a floración es variable según las especies, desde 22 meses hasta 46 meses, y algu-
nas plantas como Gomesa longicurnu aún no han florecido, llevando 70 meses en cultivo.
Figura 7. Valores finales de sobrevivencia de 65 ensayos de aclimatación de especies e híbridos de orquídeas en dis-
tintos meses. Las letras mayúsculas y números hacen referencia a los meses y año de cada ensayo (5=2015 y 6=2016).
Referencias: H1: Oncidium bifolium (CR-06) x G. flexuosa, H2: Cattleya hibrido 269, H3: Brassavola (boliviana) x L. purpurata, H4: L.C.
Roseliensis x Sgto. Cabral, H5: Laelia superbiers x L. rubescens aurea, H6: Dendrobium amarillo x D. blanco, H7: Cattleya intermedia
x C. pao azucar, H8: Laelia purpurata x L. purpurata, CACF: Cattleya An Carol Freckle s “Attacky”
el invernáculo de la FCA-UNER. Los porcentajes anuales resultan elevados, entre el 58 y 80 % (Tabla 11),
evaluados en largos periodos de tiempo.
Tabla 11. Numero de ensayos de aclimatación por año, número total de plantas y porcentaje medio de supervivencia
Número de: Número de plantas Porcentaje medio
Año ensayos especies híbridos INICIO FINAL de supervivencia
2015 40 11 8 762 614 80 %
2016 25 5 4 912 531 58 %
2017 57 4 7 1482 1008 68 %
Tabla 12. Clasificación del número de ensayos de aclimatación por año, en función de cuatro rangos porcentuales
de supervivencia de plantas
Rango (%) Supervivencia 2015 2016 2017
0 – 10 1 6 5
11 – 39 2 5 12
40 – 80 12 6 22
81 - 100 25 8 18
De análisis de la Tabla 12 surge que la supervivencia en el rango entre el 40 y 100 % fue de 95%, 56
% y 70%, para los años 2015, 2016 y 2017, respetivamente. Estos resultados indican altos porcentajes de
supervivencia para esta etapa crítica de la aclimatación de plantas de orquídeas, en su gran mayoría
epífitas (más del 80 %).
Por último, es importante destacar que los porcentajes de supervivencia son variables según las es-
pecies y dentro de una misma especie se observan casos con cero (%) de sobrevivencia, según la época
del año en que las plantas fueron aclimatadas (Lallana y Wagner, 2017). En el caso de los híbridos del
género Gomesa (Gom_bif x Gom_bif pétalos marrones), a partir de mayo en adelante se registran ma-
yores porcentajes de supervivencia (80 a 100%), para el híbrido de Gomesa bifolia “Federal” la situación
es más regular y no se observan tantas diferencias entre los meses de febrero a junio oscilando entre
36 y 100 %, mientras que el híbrido Gom_bif x Gom_bif pétalos amarillos los porcentajes más bajos (31
%) se obtuvieron cuando las plantas se aclimataron en marzo, mientras que las extraídas entre mayo y
septiembre alcanzaron porcentajes más altos (50 al 100 %).
Protocolos
Como ya se indicó al inicio de Material y métodos, todos los protocolos están disponibles para su con-
sulta en Orquier, (2017). Código QR:
Otros procedimientos ↓
Solucion a partir de droga pura [Ver el archivo adjunto]
Soluciones de volumen o concentración conocida [Ver el archivo adjunto]
Rotulación de ensayos en cámara de cultivo [Ver el archivo adjunto]
Estructura de informes técnicos [Ver el archivo adjunto]
Ensayos de viabilidad ↓
Análisis de viabilidad de semillas de orquídeas con la prueba topográfica por tetrazolio [Ver el archivo
adjunto]
Ensayos de aclimatación ↓
Aclimatación de plántulas (Fase Ex Vitro) [Ver el archivo adjunto]
Informes técnicos de ensayos de aclimatación [Ver el archivo adjunto]
Ficha técnica para la colecta de especies [Ver el archivo adjunto]
Montaje de plantas de orquídeas en palo [Ver el archivo adjunto]
Estadística y software ↓
Medición digital de la longitud y ancho de semillas de orquídeas [Ver el archivo adjunto]
Medición digital de la longitud radical [Ver el archivo adjunto]
Conclusiones
La difusión de los resultados del proyecto se logró a través de numerosas presentaciones en reunio-
nes científicas, conferencias, charlas técnicas, un curso y 10 publicaciones científicas en revistas nacio-
nales e internacionales según se detalla en los siguientes indicadores de producción:
Nacionales (7): Michel y Lallana, 2015; Di Persia y Lallana, 2015; Lallana et al., 2016; Lallana y Barsanti,
2016; Lallana y García, 2016; Lallana y Wagner, 2017; Michel y Lallana, 2017
Internacionales (3): Dalzotto et al., 2015; Lallana y García, 2015; Dalzotto y Lallana, 2015
Trabajo Final de Graduación (Tesinas de grado) en el marco del PID 2172: 1(una) (Di Persia, 2015).
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Director
LALLANA, Víctor Hugo
Unidad de Ejecución
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Dependencia
Universidad Nacional de Entre Ríos
Contacto
victor.lallana@fca.uner.edu.ar
Becarios
María Virginia Barsanti, FCA-UNER, Beca de Iniciación en la Investigación (2014-2016) Juan
Francisco Di Persia, FCA-UNER, Beca de Estímulo a las Vocaciones Científicas (CIN). (2014-2015)
Michel Analía, FCA-UNER, Beca de Estímulo a las Vocaciones Científicas (CIN). (2015-2018)
Alumno
Diego Heinze
Colaboradora
Ing. Agr. MSc. Marcela Sánchez