TP Nº 2 2° PARTE Antibiograma

Medicina Microbiología Trabajos prácticos 2022
TRABAJO PRÁCTICO N°2: Diagnostico Bacteriano Directo: Coloración de Gram y ZN.

Cultivos bacterianos. Métodos de detección de resistencia antibacteriana. Antibiograma:
Pruebas de sensibilidad cuantitativa y cualitativa
2° PARTE: ANTIBIOGRAMA
Objetivo general:
“Determinar la importancia clínica y microbiológica de las pruebas de susceptibilidad antibiótica”.
Objetivos específicos
• Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al método de difusión del disco.

• Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de antibióticos a probar
en un antibiograma.
• Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.
Introducción
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones

más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se desarrolla
mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el
laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo, en
una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia clínica. El
antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo
determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población
bacteriana. Su resultado, la farmacología del antimicrobiano, en particular en el lugar de la
infección, y los aspectos clínicos del paciente y de su infección, sustentan la elección de los
antimicrobianos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Asimismo, ofrece, en su
conjunto, elementos objetivos de actuación en los tratamientos empíricos. El panorama actual
de las resistencias de los microorganismos a los antimicrobianos hace ineludible su
determinación, incluso en aquellos casos en los que la sensibilidad se considera universal y no se
han descrito, por el momento, mecanismos de resistencia. Cada laboratorio de microbiología
establecerá según su estructura, demanda asistencial y Política de Antibióticos un esquema de
organización y técnicas de trabajo que aseguren la realización e información posterior de los
antibiogramas.
Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemente normalizados y sujetos a procesos

de control que aseguren su reproducibilidad. Por el momento no existe un método universal que
reproduzca las condiciones en las que se encuentra un microorganismo produciendo una
infección y, por tanto, la situación ideal en las que deben desarrollarse las pruebas de
sensibilidad.
Resistencia a los antiomicrobianos

La base del desarrollo de la resistencia bacteriana está en la presión de selección que constituye
la presencia de un antibiótico. Donde antes se seleccionaban las bacterias más aptas para la
supervivencia en el sitio del organismo de que se trate, en presencia del antibacteriano,
sobrevivirán solamente aquellas variantes capaces de resistir a las concentraciones de antibiótico
presentes.
El antibiótico se convierte en el primer factor de selección. Es casi inevitable que al cabo de un
plazo variable de tiempo aparezcan variantes resistentes de la bacteria contra la que se pretende
luchar con una nueva droga. Esto se ha ido cumpliendo inexorablemente con la mayoría de los
agentes antimicrobianos.
Esto no implica que con el uso consciente y racional de los antimicrobianos, no se pueda minimizar la
emergencia de resistencias.
Las denominadas resistencias intrínsecas son aquellas constitutivas de la bacteria. Por ejemplo
las diferencias de membrana entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, hacen que ciertos
antibióticos beta-lactámicos no encuentren el receptor adecuado para fijarse y ejercer su efecto
en las últimas. Sin embargo, es la resistencia adquirida la que nos interesa.
El origen de la resistencia adquirida es genético, bien basado en mutaciones que modifiquen el

blanco del antibiótico y eliminar su susceptibilidad; o basado en la adquisición horizontal de
elementos genéticos que confieran funciones que neutralicen o eliminen el antibiótico. La
transmisibilidad de los factores de resistencia puede dar lugar a un problema aún mayor: la multi-
resistencia. Estos microorganismos no solamente son resistentes a una serie de drogas, sino que
esa multi-resistencia sigue siendo transferible, por lo que se transforman en reservorios de
resistencia.
De todas maneras, ante el uso de antibióticos, las bacterias desarrollarán, indefectiblemente

resistencias. Es muy difícil interpretar de donde viene la resistencia, algunos genes pudieron estar
esperando evolucionar.
Otros genes pudieran haber existido en bacterias no patógenas y haber sido transferidos a
especies de interés médico (O’Brien, 1997). Sabemos que existían plásmidos codificados para
resistencia en la era preantibiótica. Seguramente la resistencia es tan antigua como la síntesis de
antibióticos por bacterias. Por ejemplo, en el caso de actinomicetos, es frecuente hallar
resistencias a los agentes que esos mismos microorganismos producen (Burns, 1995).
Heinemann y col (2000) argumentan que no hay coevolución entre resistencia y susceptibilidad,
ellos dicen que la disminución en el uso de antimicrobianos tanto en medicina como en
agricultura no reemplazará un cambio fundamental en el diseño de medicamentos para frenar la
evolución de las resistencias y favorecer la evolución de cepas susceptibles.
Las resistencias cromosómicas: Este tipo de resistencias dan lugar, en general, a cambios
estructurales. Son cambios, en general, graduales. Se producen por mutaciones que son errores,
que se producen en el proceso de replicación del ADN.
Estas mutaciones pueden generar muy profundos (y algunas veces rápidos) cambios en el nivel
de resistencia, como es el caso de la estreptomicina cuya CIM puede aumentar mil veces a través
de una sola mutación. Clásicamente, antes de conocerse los mecanismos que la producían, el
desarrollo de resistencias rápidas fue definido como resistencia tipo estreptomicina.
En el caso de resistencias más lentas, se las conocía como resistencias tipo penicilina. Esto
indudablemente habla a las claras de que había una comprensión intuitiva del fenómeno, pero
seguramente no de su gravedad (se desconocía en ese entonces la existencia de las resistencias
transmisibles). La mayoría de las veces, las mutaciones son escalonadas, lentas, como en el caso
de las quinolonas. Esto requiere una mutación a nivel del gen que codifica la producción de una
enzima (girasa de ADN) que ayuda en el proceso de transcripción de ADN. Sin embargo, el
desarrollo de resistencia a quinolonas es más rápido, como en el caso de las enterobacteriáceas
en que una sola mutación da lugar a un nivel bajo de resistencia, requiriendo una segunda
mutación para adquirir un nivel elevado. Por su parte, en Campylobacter, una sola mutación es
capaz de generar un elevado grado de resistencia a quinolonas. En este caso en particular, el
desarrollo de resistencia no requiere de ADN externo, solamente la droga y la bacteria.
Las resistencias transferibles: En este caso, la bacteria obtiene la información genética que
codifica resistencia de otra bacteria que es resistente. ¿De dónde proviene el material genético
original? Se piensa que los genes que codifican la resistencia pueden provenir de las mismas
bacterias productoras de antibióticos. La resistencia en este caso está codificada en ADN
extracromosómico que se autoduplica dentro de la bacteria y es transferido a otras por varios
mecanismos.
Las bacterias pueden volverse resistentes a los antimicrobianos, pero, ¿por qué mecanismos?:
• Inactivación enzimática de los antibióticos

• Impermeabilidad de la membrana o pared celular
• Expulsión por mecanismos activos del antibiótico
• Modificación del sitio blanco del antibiótico en la bacteria
Criterios a tener en cuenta en la elección correcta de los antibióticos, durante la realización de

las pruebas de susceptibilidad:
• Microorganismo aislado.
• Mecanismo de acción del antibiótico.
• Espectro de acción del antibiótico.
• Biodisponibilidad del antibiótico en órganos y sistemas (localización de la infección).
• Origen o fuente de la infección (hospitalaria o extrahospitalaria).
• Estados fisiológicos del paciente (edad, gestación, entre otros).

• Estados patológicos subyacentes (inmunosupresión, tratamiento previo con antibióticos, insuficiencia
renal o hepática, entre otros).
Método del antibiograma disco-placa (método de difusión).
Fundamento
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los

métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para
la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma disco-placa
consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con
el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan
pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar,
el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través
del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas
18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La
concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas
se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI)
obtenida por métodos de dilución.
Existen unos diámetros de inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada

antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibición debe interpretarse como sensible (S),
intermedia (I) o resistente (R) según las categorías establecidas por el NCCLS.
Tabla extraída como ejemplo.
Indicaciones
El antibiograma está indicado cuando se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso
y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede
presentar resistencia a los antimicrobianos más habituales. Estas pruebas de sensibilidad
también son útiles en estudios epidemiológicos ya que el resultado del antibiograma puede ser
considerado como el primer marcador epidemiológico de que se dispone. El método de disco-
placa es fácil de realizar, rápido y barato.
Interpretación
Comparando los diámetros del halo de inhibición con las CMIs, y estableciendo las
correspondientes rectas de regresión, se han fijado unos criterios para clasificar las cepas
estudiadas. De esta forma se han fijado tres categorías: sensible (S), intermedia (I) y resistentes
(R). Anteriormente se añadía la categoría moderadamente sensible (MS) que tiende a eliminarse
y los resultados correspondientes a la misma se han situado en la categoría de intermedia. Las
interpretaciones seguirán las normas establecidas por el NCCLS (Tabla 1 a 5) pero, por regla
general, un diámetro de inhibición de 30 a 35 mm es indicativo de una cepa altamente sensible,
mientras que diámetros de zona de inhibición inferiores a 15 mm son los que presentan las cepas
resistentes.
El término sensible indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha determinado
la CMI o su correspondiente halo de inhibición puede tratarse de forma adecuada empleando las
dosis habituales de antimicrobiano, en función del tipo de infección y de la especie considerada.
El término intermedio indica que el halo de inhibición traducido en valores de CMI se aproxima
a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse
eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de
antimicrobiano (por ejemplo en orina) o cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual.
El NCCLS también incluye en esta categoría aquellos casos de antimicrobianos con márgenes de
toxicidad estrechos en los que pequeños errores técnicos podrían suponer cambios de
interpretación en la categoría clínica.
Finalmente, el término resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por

las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente
antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias
específicos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada respuesta clínica
cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano.
Método de dilución en caldo o ágar
Fundamento
La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante

alguna de las variantes de los métodos de dilución. Estos métodos se basan en la determinación
del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del
antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar).
Las primeras determinaciones se realizaron empleando baterías de tubos con caldo de cultivo
con un rango determinado de antimicrobiano (macrodilución). Esta metodología es muy
engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realización. La
aparición de un sistema de inoculación múltiple para placas de agar popularizó el método de
dilución en agar, en el que cada placa, con una cierta concentración de antimicrobiano, permite
inocular simultáneamente un gran número de microorganismos. La utilización de micropipetas y
de placas de microtitulación facilitó la utilización del método de microdilución con caldo; en la
actualidad se han popularizado los métodos automatizados comerciales de microdilución en
caldo, fácilmente integrables en sistemas semi-automáticos de lectura e interpretación de
resultados, pero con el grave inconveniente del incremento en el coste.
Tradicionalmente estos métodos se han venido usando para la determinación de la CMI y la

concentración mínima bactericida (CMB) de los antimicrobianos. En la mayoría de los casos se
preparan diluciones del antimicrobiano en progresión geométrica en base 2 utilizando un medio
de cultivo adecuado; posteriormente se inocula dicho medio y tras la correspondiente incubación
para permitir el crecimiento del microorganismo se realiza la lectura, determinando qué
concentración causa la inhibición del crecimiento del microorganismo. Si se realiza un subcultivo
en medio sin antimicrobiano de los medios sembrados previamente puede determinarse
también la actividad bactericida.
Indicaciones
Los métodos de dilución se consideran de referencia para la determinación cuantitativa de la

actividad de los antimicrobianos. Son los métodos indicados cuando, además de la actividad
inhibitoria, se quiere determinar también la actividad bactericida.
La gran cantidad de variables (dependientes del microorganismo, del medio de cultivo, del
inóculo) que influyen en estos métodos son responsables de oscilaciones en el resultado
finalmente obtenido, por lo que para su correcta evaluación es necesario que se realicen de
forma estandarizada.
La determinación de la actividad antimicrobiana mediante técnicas de dilución se realiza

utilizando una escala discontinua (habitualmente concentraciones crecientes en base 2) en vez
de una escala continua (como sucede en el método de difusión), por lo que los valores de CMI
reales de un determinado antimicrobiano se encontrarán en algún valor situado entre la CMI
experimentalmente obtenida y la concentración inmediatamente inferior. Desde el punto de
vista clínico la diferencia entre los valores real y experimental de CMI no suelen ser trascendentes
cuando se trata de concentraciones bajas, pero pueden tener importancia para las CMIs altas
que se acerquen a las concentraciones alcanzables in vivo.
En comparación con los métodos de difusión, los métodos de dilución son técnicamente más complejos
y casi siempre más caros.

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TRABAJO PRÁCTICO N°2: Diagnostico Bacteriano Directo: Coloración de Gram y ZN.

“Determinar la importancia clínica y microbiológica de las pruebas de susceptibilidad antibiótica”.

• Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al método de difusión del disco.

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones

Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemente normalizados y sujetos a procesos

Resistencia a los antiomicrobianos

El origen de la resistencia adquirida es genético, bien basado en mutaciones que modifiquen el

De todas maneras, ante el uso de antibióticos, las bacterias desarrollarán, indefectiblemente

• Inactivación enzimática de los antibióticos

Criterios a tener en cuenta en la elección correcta de los antibióticos, durante la realización de

• Mecanismo de acción del antibiótico.

• Espectro de acción del antibiótico.

• Biodisponibilidad del antibiótico en órganos y sistemas (localización de la infección).

• Origen o fuente de la infección (hospitalaria o extrahospitalaria).

• Estados fisiológicos del paciente (edad, gestación, entre otros).

Método del antibiograma disco-placa (método de difusión).

El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los

Existen unos diámetros de inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada

Tabla extraída como ejemplo.

Finalmente, el término resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por

Método de dilución en caldo o ágar

La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante

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