MICROCOPIO OPTICO

Fundamento óptico en que se basa el microscopio compuesto.

PARTE MECANICA DEL MICROSCOPIO:

PIE:

+forma de herradura o rectangular.

Es lo más pesado posible, debe asegurar la estabilidad del microscopio.

COLUMNA:

Es vertical, parte del pie y llega al tubo.

Lleva el mecanismo del movimiento lento y el piñón del movimiento rápido.

Está compuesta por: Pilar: desde el pie hasta la articulación con el brazo “charnela”. Es fija

Brazo: es la parte móvil, puede inclinarse, suele tener forma arqueada.

TUBO:

Soporta el ocular en su extremo superior y los objetivos en su extremo inferior a través del
revolver. Está formado por un cilindro metálico único que mide 160mm. Posee un sistema de
movimiento rápido (tornillo macrométrico) y uno lento (tornillo micrométrico) para movilizar el
tubo y enfocar los preparados.

PLATINA:

Superficie plana, redonda o cuadrada, con un orificio en el centro que permite el paso de los rayos
luminosos procedentes del aparato de iluminación. Está perpendicular al eje óptico del
microscopio. Su función es soportar el objeto observado gracias a 2 pequeños brazos con resortes
(“pinzas sujeta objetos”). Puede ser fija o móvil, gracias a 2 cremalleras ubicadas
perpendicularmente entre sí, que permiten desplazamiento antero-posterior y lateral.

SUBPLATINA:

Conjunto de piezas debajo de la platina que sirven como soporte al aparato de iluminación: aro
donde se coloca el condensador, que puede moverse de arriba abajo; anillos para colocar filtros;
diafragma iris para regular entrada de luz, formado por laminas semisuperpuestas; soporte para
el espejo que permite moverlo en todas las direcciones (en la parte inferior).

PARTE OPTICA:

APARATO DE ILUMINACIÓN:

A- FUENTE LUMINOSA: desde luz difusa del día hasta lámparas eléctricas de bajo voltaje y
filamento muy concentrado. En la microfotografía se utiliza el Kohler: permite obtener un
disco luminoso homogéneo muy intenso y de diámetro variable para adaptarlo al tamaño
del campo observado en el objeto. En todos los casos debe dirigirse a los rayos luminosos
hacia el objeto siguiendo el eje óptico.
B- ESPEJO: está por debajo de la platina, posee una cara plana (luz artificial) y una cóncava
(luz natural, para concentrar los rayos). Puede moverse ampliamente.
C- PRISMA: en los microscopios que poseen fuente luminosa la desviación de los rayos se
hace a través de un Prisma en vez de un Espejo.
D- CONDENSADOR: formado por un sistema de lentes convergentes, que al ser atravesado
por los rayos luminosos proyecta un amplio cono de luz sobre el preparado (concentra los
rayos para lograr una intensidad suficiente). El más usado es el Abbe, de abertura
numérica 1,20, compuesto de 2 lentes (superior: plano-convexa; inferior: biconvexa).
E- DIAFRAGMA IRIS: regula la cantidad de luz que recibe el objeto. Está posicionado entre el
condensador y el espejo.
F- FILTROS: discos de cristal de caras planas y paralelas que se interponen en la trayectoria
de los rayos antes del condensador. Según función: Difusión: proporcionan campo
luminoso uniforme, aunque la fuente luminosa no lo haga. Luz de día: son azules, por lo
que absorben el exceso de rayos luminosos amarillos y rojos de luz proveniente de
filamentos incandescentes. Absorción: son grises por lo que absorben un % de luz cuando
es excesiva y no se puede reducir con diafragma. Absorción selectiva: para
microfotografía. Compensación: para fotografía a color.

OBJETIVOS:

Formado por varias lentes, sencillas o múltiples, montadas en la “montura del objetivo” (tubo
metálico) para formar un sistema centrado que actúa como una sola lente. Gracias a esto se
aumenta la distancia frontal y corregir las aberraciones.

Aberración cromática: se da cuando un haz de luz blanca (compuesto por una gama de ondas
monocromáticas, cada una de longitud diferente) atraviesa una lente y es descompuesto, por lo
que sus componentes sufren una refracción según la longitud de onda, siendo el resultado final la
formación de varias imágenes reales no coincidentes en el mismo plano focal y de contornos
coloreados. Este tipo de aberración se corrige con 2 cristales: Crown y Flint, que poseen distinto
índice de refracción y distinto poder dispersivo. Este sistema hace coincidir 2 colores (verde claro y
rojo). Hay objetivos que permiten la coincidencia de 3 colores: Apocromáticos.

Aberración de esfericidad: es la imposibilidad de reunir todos los rayos en un punto focal. Es

directamente proporcional a la curvatura de la lente. Los rayos que inciden periféricamente en la
lente son proporcionalmente más refractados que los que están próximos al eje óptico y así se
forman en distintos puntos del eje una serie de focos del mismo objeto: espacio focal (imagen
borrosa). Para su corrección se utilizan objetivos aplanáticos dobles o triples lentes con diferentes
índices de refracción, dispuesto de forma tal que los rayos marginales fuertemente refractados
por uno de las lentes sean desviados en sentido contrario por otra y así converjan en el foco.

Angulo de abertura y apertura numérica:

El ángulo de abertura está limitado por los rayos más periféricos que partan de un punto
cualquiera del objeto y penetren en la lente, que permitan formar la imagen.

Hay 2 factores que lo modifican: El diafragma porque limita la cantidad de rayos que penetran y el
Índice de Refracción del medio que deban atravesar los rayos.

Fórmula: a= n . sen µ siendo a abertura numérica, n índice de refracción del medio interpuesto y
senµ el seno del semiángulo de apertura.

Límite de resolución:

Capacidad de un sistema óptico para mostrar separados 2 puntos situados muy próximos entre sí,
o sea es la menor distancia que puede haber entre 2 puntos para que el sistema óptico los capte
como separados. Se expresa en µm (micrómetros).

Poder de penetración:

Propiedad de poder observar varios planos del preparado con una misma posición de enfoque. Es
inversamente proporcional a su abertura numérica.

Poder de definición:

Cualidad de un objetivo de formar imágenes claras de contornos nítidos. Los objetivos centrados y
corregidos de sus aberraciones tienen mayor poder de definición.

Distancia focal:

Es la distancia entre el centro óptico del sistema y el plano focal anterior.

Distancia frontal:

Es la distancia entre la cara inferior de la lente frontal del objetivo y el plano del objeto en
observación. Mientras mayor aumento tiene el objetivo menor es la distancia frontal.

Aumento propio del objetivo:

Relación entre el tamaño real del objeto observado y el tamaño de la imagen que da el objetivo.
Suele venir grabada en el objetivo: 2.5x, 10x, 40x, 100x.
Clasificación de los objetivos:

 Secos: se interpone el aire entre el objeto y la lente frontal del objetivo. Seco débil:
aumento de 10x; Seco fuerte: aumento de 40x o 45x.
 De inmersión: se interpone un líquido de índice de refracción mayor al aire. Agua: n 1.33 o
Aceite n 1.515, Yoduro de metilo: n 1.529.
 De corrección: corrigen las diferencias en el espesor de los cubreobjetos usados.
Acromáticos: corregidos para 2 colores; Planacromáticos: corrigen 2 colores y dan una
imagen plana; Apocromáticos: corregidos para 3 colores; Planapocromáticos: corrigen en 3
colores y dan una imagen plana.

OCULARES:

Cilindro hueco de metal que lleva un sistema de lentes convergentes:

 Una inferior (lente de campo o colectora): recibe la imagen del objeto, la refracta y da una
imagen más pequeña, corregida en esfericidad y muy luminosa que se forma en el plano
del diafragma ocular.
 Una superior (lente ocular): amplifica la imagen y la hace virtual.
 Entre las 2 hay un diafragma ocular: delimita el campo visible.

Tipos:

 Negativo o de Huyghens: las 2 lentes son plano-convexas y el diafragma entre ellas. No

pueden usarse como lupas porque el foco está situado entre las 2 lentes. Más frecuentes.
 Positivos o de Ramsden: 2 lentes plano-convexas, cuyas convexidades están hacia adentro
y el diafragma está debajo de ambas. Pueden usarse como lupas porque ambos focos
están por fuera del ocular.
 De compensación: se usan en combinación con los objetivos de gran aumento porque
corrigen la aberración cromática residual.
 Micrométrico: tiene en el plano del diafragma una placa de vidrio con divisiones (10
grande) y subdividas (10 pequeñas c/u), se utiliza para calcular el coeficiente
micrométrico= (n° divisiones del objetivo x 10) / n° divisiones oculares y poder calcular la
medida de lo que observamos en los preparados.

Dispositivo binocular:

Evita la fatiga de la visión monocular. La imagen dada por el objetivo es duplicada por un sistema
de prismas y cada una se observa por un ocular.

Aumento propio del ocular:

Se indica en la parte superior: 4x, 8x, 10x, 12x.

Aumento final obtenido con el microscopio:

Se debe multiplicar el aumento del objetivo por el del ocular. Tiene un límite que es el aumento
máximo.
Aumento máximo:

Para que un incremento en el aumento sea útil, debe ser acompañado de un aumento en el poder
de resolución y está condicionado por la abertura numérica del objetivo usado y no debe ser
mayor de 500 a 1000 veces el valor de dicha abertura numérica.

Unidades de medida:

mm: milímetros.

µ: micra o micrométros.

Å: angstrom.

LENTES: elementos ópticos que producen convergencia o divergencia de los rayos luminosos
(+vidrio).

Sus caras pueden ser:

 2 curvas
 2 planas
 1 plana + 1 curva
 Convexas: son convergentes (+): aumentan el tamaño de la imagen.
 Cóncavas: son divergentes (-): dan una imagen reducida en tamaño.

Eje principal de la lente: línea perpendicular al plano de la lente que pasa por el centro óptico de
ella.

REFRACCIÓN: Cambio de dirección de un rayo de luz u otra AIRE

radiación que se produce al pasar oblicuamente de un medio

a otro de distinta densidad.

VIDRIO
Si un rayo incide a 90° respecto a una lente de caras paralelas, el rayo no se desvía de

su trayectoria al atravesar el vidrio y volver al aire. Pero si el rayo incide de forma

oblicua será desviado 2 veces: primero al pasar del aire al vidrio, y segundo del vidrio al aire.

Leyes:

 Todo rayo que pase por el centro de una lente no se refracta.

 Todo rayo paralelo al eje principal el refractado y corta a dicho eje en un punto “foco”.
Distancia focal: distancia que separa el foco del centro de la lente.

En una lente biconvexa (convergente) los rayos oblicuos

respecto de la superficie de la lente son refractados

acercándose al eje de la lente.

En una lente bicóncava (divergente) pasará lo contrario,

los rayos al refractarse se alejarán del eje de la lente.

Formación de imágenes por las lentes convergentes (biconvexas): depende de cuan alejado esté
el objeto de la lente.

A- El objeto está a una distancia mayor que el doble de la distancia focal: la imagen será real,
invertida y un tanto más pequeña mientras más alejado esté el objeto.
B- El objeto está al doble de la distancia focal: la imagen será real, invertida y del tamaño del
objeto.
C- El objeto está entre el foco y el doble de la distancia focal: la imagen será real, invertida y
un tanto más grande mientras más cercano esté el objeto.
D- El objeto está situado en el foco de la lente: la imagen estará en el infinito.
E- El objeto está entra le lente y el foco: la imagen será virtual, derecha y un tanto más
pequeña mientras más cercano esté el objeto.

Imagen real: formada por los rayos convergentes sobre una pantalla o placa fotográfica.

Imagen virtual: se forma por rayos divergentes, son imágenes subjetivas que no pueden recogerse
en una placa. La podemos percibir ya que el ojo prolonga los rayos divergentes por detrás del
objeto y las hace converger para formar la imagen virtual.
HISTORIA Y DESCUBRIMIENTOS:

El primer microscopio compuesto fue construido por Hans y Zacaría Janssen (Holanda) entre 1590
y 1610.

Un tiempo después Antoni van Leeuwenhoeck (Holanda) construyó su propio microscopio, de

5,5cm, lente pequeña, casi esférica, entre 2 láminas de cobre que en frente poseía una lámina de
mica en forma de portaobjetos, con el que observó por primera vez protozoos y bacterias.

John Marshall (Inglaterra) introdujo por primera vez el condensador en el siglo XVII, montado en
un anillo ajustable debajo del objeto a observar.

Dollond (Londres) en 1790 introdujo una placa circular que permitía variar el tamaño del orificio
por donde entra la luz.

Recién en 1830 Joseph Lister sustituyó la lente por dos con diferentes curvaturas, creando una
lente acromática.

A fines del siglo XVIII el modelo ya había llegado al máximo poder resolutivo para la luz visible, por
lo que comenzaron a desarrollarse otros tipos de iluminación, como la luz ultra violeta.

El microscopio electrónico de transmisión, que permitía ver “dentro de las células”, se desarrolló
gracias al descubrimiento del tubo de rayos catiónicos y con él, el avance de la biología celular.
Además, se desarrollaron sistemas especiales, como contraste de fases, fluorescencia, luz
polarizada, fenómeno de interferencia, campo oscuro, micrografía y el microscopio electrónico de
barrido que devuelve imágenes exactas de las superficies de los objetos gracias a una emisión
electrónica.
Tipos de Microscopio

Existen otros sistemas de iluminación y de formación de imágenes y de acuerdo con esto existen
otros tipos de Microscopio:

1) MICROSCOPIO DE FONDO OSCURO

El objeto recibe iluminación lateral oblicua y la imagen se forma con

los rayos que se reflejan en el preparado: Entonces aparece un objeto
brillante sobre fondo oscuro.

Se utiliza Condensadores para interceptar los rayos centrales y solo

deja pasar los periféricos. Y se utiliza aceite de cedro: Para evitar que
los rayos se desvíen antes de penetran el objeto.

Permite estudiar especímenes vivos no teñidos

2) MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA

En vez de utilizar el espectro de luz visible, para incrementar el poder

de resolución. Se utilizan radiaciones de menor longitud de onda,
situadas en la zona espectral ultravioleta. Esto se logra usando como
fuente luminosa una Lámpara de arco con electrodo de Mercurio,
encerrada en una ampolla de cuarzo

Lentes y porta obejto de Cuarzo

Medio de inmersión: la Glicerina
La longitud de onda: entre 2.000 y 4.000 A
Daña especimenes vivos, es para tecnicas fotograficas

3) MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE

Lo creo Zernike
El fenómeno de este microscopio se base en el desplazamiento de
fase que sufren los rayos de un haz luminoso al atravesar un objeto
transparente debido al atraso de la velocidad de la luz (un atraso de
¼ de longitud de onda). Esto aumenta mucho el contraste,
permitiendo observar el preparado como si estuviese coloreado (sin
estarlo)

Se utiliza un Diafragma Anular, debajo del condensador y una Placa de Fase, en el interior
del objetivo

*SE UTILIZA PARA LA OBSERVACION DE CELULAS EN ESTADO VIVO: Ej Estudio de células en

Mitosis
 4) MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN
(Es un microscopio común al que se le agregan un Polarizador y Analizador)
 Definición Luz Polarizada:
La Luz se compone de ondas electromagnéticas, con alta velocidad de vibración (por esto
no pueden verse las ondas). Estas ondas vibran en forma perpendicular a la dirección del
rayo en muchos planos perpendiculares
La Luz Polarizada confina (une) todas las vibraciones de onda en 1 plano perpendicular a
la dirección del rayo de luz.

 Concepto de Isotropía y Anisotropía

Cuando un rayo atraviesa un medio y no sufre modificaciones decimos que ese medio
tiene una “elasticidad óptica” igual en todas las direcciones.

Pero si esta elasticidad no es uniforme en todos los sentidos, las vibraciones del rayo que
lo atraviesa no serán iguales y la luz será polarizada.

- ISOTROPICOS O MONORREFRINGENTES: Cuerpos con igual densidad óptica en todos los

sentidos
- ANISOTROPICOS O BIRREFRINGENTES: cuya densidad óptica es desigual

 Aparato de Polarización

El mejor medio de obtener un haz de luz polarizada en línea recta es hacerla atravesar un Prisma
de Nicol: Todo rayo que lo penetre, será descompuesto en dos rayos que no se propagaran con
igual velocidad.

-Polarizador: Es el prisma que produce los rayos de luz polarizada. (Por debajo del Condensador)

-Analizador: Es otro Nicol, para reconocer si un objeto es mono o birrefringente. (Por debajo del
Ocular)

En la actualidad no se usan más los prismas de Nicol por ser muy caros, hoy en día usamos los
Discos de Polaroid, formados por una lámina de nitrato de celulosa que contiene cristales de
herapatita y sulfato de yodoquinina.

*SE VEN FIBRAS COLAGENO, LAMINILLAS OSEAS, LA MIELINA, FIBRA MUSCULAR ESTRIADA

Fibras Musculares Estriadas

5) MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA
Se relaciona con el Microscopio de Cambio de Fase y con el Polarizador.

En este microscopio se hacen visibles las diferencias de velocidad que sufren los rayos de
un haz luminoso cuando este atraviesa un objeto transparente.
Se basa en el empleo de un haz de luz blanca, polarizado antes de atravesar el
condensador y dividido luego mediante un prisma de cuarzo en dos haces paralelos y
próximos entre si antes de entrar al ocular, atraviesan un analizador y un dispositivo
colector que los reúne nuevamente.
Entonces, por fenómenos de INTERFERENCIA entre ambos haces las diferencias de fase
que han sufrido sus rayos se traducen en variaciones de intensidad luminosa y en cambios
de color.

Permite medir el espesor del objeto observado.

Las imágenes se ven con Aspecto de Relieve y con color

6) MICROSCOPIO DE FLORECENCIA
*SE UTILIZA MUCHO PARA LOCALIZAR ANTÍGENOS, ANTICUERPOS Y MICROORGANISMOS

La Fluorescencia: Es la propiedad que poseen solo los fluorocromos de

emitir luz de un determinado color cuando son excitadas por un haz de
luz de menor longitud de onda que al emitida.

Utiliza condensadores de vidrios

El objeto que se desea estudiar se “marca” con el fluorocromo
Se coloca un filtro llamado Supresor

EPIFLUORECENCIA
En este método: La obtención de la imagen fluorescente se hace iluminando el objeto (ya
marcado con fluorocromo), mediante el Sistema de Epiluminación (iluminación desde
arriba por reflexión)
El fenómeno fluorecente se produce en la superficie por lo que da mayor nitidez

LUPA ESTEREOSCÓPICA
Dispositivo para la observación de objetos pequeños con visión
tridimensional (visión estereoscópica)
Iluminación por reflejo: Episcopia
Iluminación por transparencia: Diascopia
7) MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIÓN
En este utilizamos un haz de electrones, en vez de un haz de luz: Para aumentar la resolución

Cada electrón está asociado a una onda.

El límite de resolución es superior al del Microscopio Óptico, aproximadamente de 6
Angstrom, debido a que la aberración de las lentes electromagnéticas es de unos 10
Angstrom y el aumento de 100.000 X.

Los preparados deben ser muy delgados.

Los preparados deben deshidratarse primero, lo cual hace imposible la observación en tejido
vivos
Los especímenes No se montan en un portaobjetos, se monta en Película de Colodión

8) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

*SE UTILIZA PARA OBSERVAR CUERPOS OPACOS COMO

METALES, MINERALES, INSECTOS Y SUPERFICIES CON
RELIEVE.

La superficie es “barrida” rápidamente en sentido

horizontal y vertical

Se basa en el fenómeno de la Emisión Secundaria, es decir,

el desprendimiento de los electrones orbitales de los
átomos superficiales cuando estos sufren el impacto de un
haz de electrones acelerados.

Sus partes son diferentes del Microscopio Óptico. Este está compuesto por:

-El generador de barrido, -La platina, -La unidad detectora que recibe las señales, -El sistema
de visualización de esas señales