LABORATORIO DE INMUNOHISTOQUMICA

Autores: Dr. Agustn Chong Lpez Dr. Ernesto Arteaga Hernndez Lic. Noris Iglesias Garca Lic. Brbara Chvez Tapia

Departamento

Anatoma Patolgica

DESARROLLO Recursos humanos y materiales Patlogos especialistas Licenciados Tecnologa de la Salud Microscopio de fluorescencia Microscopio estereoscpico Microscopio binocular Criostato Termos de nitrgeno lquido Congelador de 20C Refrigerador domestico Metro pH Balanza de precisin Horno de microondas Micropipetas Eppendorf varias medidas Papel de aluminio y parafilm Cristalera de laboratorio adecuada Anticuerpos fluoresceinados Anticuerpos monoclonales Sistemas de revelado

Laboratorio de inmunofluorescencia
Recepcin de las muestras Los tejidos deben recibirse en fresco, en cmara hmeda con suero fisiolgico y lo ms rpidamente posible. El tcnico debe comprobar que el nombre del paciente que aparece en el envase sea el mismo que el de la solicitud. Colocar el tejido en papel de aluminio y se sumerge en nitrgeno lquido previa identificacin con el nombre del paciente. El da del corte se extrae el tejido congelado y se coloca sobre una platina de congelacin cubierto por OCT (gel de corte) dentro de la cabina del criostato. Realizar cortes de 3-4 micras cuando el criostato tenga la temperatura adecuada alrededor de - 20C. Estos cortes se dejan secar a temperatura ambiente. Fijar con acetona pura a 4C por 5 minutos. Dejar secar a temperatura ambiente. Guardar los cortes en el congelador a menos 20 grados C, envueltos en papel de aluminio. Marcar las lminas con lpiz diamante anotando el nmero de inscripcin de la biopsia y el antisuero a emplear. Los cortes sobre las lminas portaobjetos previamente fijados y secados al aire se sumergen en Buffer Fosfato Salino (PBS) durante 5 minutos. Secar las lminas alrededor de los cortes. Cubrir los cortes con el antisuero primario fluoresceinado. Incubar en cmara hmeda oscura durante una hora. Lavar en PBS durante 5 minutos. Montar las lminas con medio de glicerina-gelatina. Delimitar el corte con un marcador por la cara inferior de la lmina. Identificar cada lmina con el nmero de la biopsia y el nombre del anticuerpo empleado mediante un marcador visible fcilmente. Guardar las lminas en bandejas cubiertas para evitar la luz.

Corte de la muestra

Tcnicas de inmunofluorescencia

Conservar las bandejas a 4C hasta su lectura en el microscopio de fluorescencia. Encender la fuente elctrica y se esperan cinco minutos para su calentamiento mximo. Colocar los filtros excitadores y bloqueadores correspondientes. Colocar la lmina en el microscopio. Hacer incidir la luz adecuada sobre el corte. Observar la fluorescencia emitida por el tejido y se describen por el especialista. Una vez terminada las observaciones se apagar la lmpara la cual no debe encenderse de nuevo hasta pasada una hora.

Microscopio de fluorescencia

De ser necesario conservar las imgenes diagnsticas se realizarn fotos microscpicas.

Laboratorio de inmunohistoqumica enzimtica

Recibo de las muestras Las muestras a procesar pueden proceder de: Archivo de bloques de parafina Lminas citolgicas Cortes de tejido fresco congelado similares a los de inmunofluorescencia. Procedimientos Cortar muestras incluidas en parafina en micrtomo a 4 micras de espesor. Identificar con lpiz diamante nmero de inscripcin y anticuerpo a utilizar. Desparafinar en estufa 60C durante 1 h seguido de 3 baos de xilol 15 min Alcohol absoluto tres baos de 15 minutos. Agua corriente. Las lminas citolgicas y los cortes por congelacin se procesan como ya se ha referido y se identifican igualmente. En cualquiera de los casos antes referidos las lminas se colocan en PBS tres baos de 5 minutos. Bloqueo peroxidasa endgena con solucin H2O2 y metanol durante 5 min. PBS tres baos de 5 minutos (3x5).

Se realizaran tcnicas de recuperacin antihiginica si son necesarias (ver procedimiento Recuperacin antignico) Incubacin de 30 minutos en suero normal del animal de enlace. PBS 3x5 Incubacin con el anticuerpo primario en cmara hmeda a temperatura ambiente durante una hora. PBS 3x5 Incubacin en anticuerpo de enlace biotinilado durante 15 minutos. PBS 3x5 Incubacin en el sistema Avidina-Biotina-Peroxidasa durante 15 minutos. PBS 3x5 Revelado con diamino bencidina (DAB) bajo control microscpico. Agua corriente Contraste con hematoxilina de Mayer. Montaje en medio permanente. Etiquetear con nmero de inscripcin de la seccin de IHQ, nmero de la biopsia o citologa y, adems, anticuerpo empleado. Cortar muestras incluidas en parafina en micrtomo a 4 micras de espesor. Identificar con lpiz diamante nmero de inscripcin y anticuerpo a utilizar. Desparafinar en estufa 60C durante 1 h seguido de 3 baos de xilol 15 min Alcohol absoluto tres baos de 15 minutos. Agua corriente. Las lminas citolgicas y los cortes por congelacin se procesan como ya se ha referido y se identifican igualmente. En cualquiera de los casos antes referidos las lminas se colocan en PBS tres baos de 5 minutos. Bloqueo peroxidasa endgena con solucin H2O2 y metanol durante 5 min. PBS tres baos de 5 minutos (3x5). Se realizaran tcnicas de recuperacin antihiginica si son necesarias (ver procedimiento recuperacin antignico) Incubacin de 30 minutos en suero normal del animal de enlace. PBS 3x5

Procedimientos

Incubacin con el anticuerpo primario en cmara hmeda a temperatura ambiente durante una hora. PBS 3x5 Incubacin en anticuerpo de enlace biotinilado durante 15 minutos. PBS 3x5 Incubacin en el sistema Avidina-Biotina-Peroxidasa durante 15 minutos. PBS 3x5 Revelado con diamino bencidina (DAB) bajo control microscpico. Agua corriente Contraste con hematoxilina de Mayer. Montaje en medio permanente. Etiquetear con nmero de inscripcin de la seccin de IHQ, nmero de la biopsia o citologa y, adems, anticuerpo empleado. Con cada anticuerpo deber trabajarse una lmina de control positivo (caso conocido) y una lamina de control negativo. Los tejidos que se procesan en el laboratorio de inmunohistoqumica se reciben casi todos fijados en formalina e incluidos en parafina. Las estructuras tridimensionales de las protenas tisulares se alteran en grado variable durante este proceso. Esto tiene una gran repercusin en subsecuentes investigaciones inmunohistoqumicas. Algunos antgenos tisulares (eptopes) son resistentes a la fijacin con formol e inclusin en parafina y son reconocidos por anticuerpos especficos. Otros eptopes pierden su reactividad antignica despus de estos procesos de rutina. La continua prctica con nuevos anticuerpos ha mejorado el proceder inmunohistoqumico y el uso de pretratamientos proteolticos de los cortes histolgicos es beneficioso en muchos casos. No obstante el xito mayor se ha obtenido con mtodos de pretratamiento con calentamiento de los cortes histolgicos que han permitido el desenmascaramiento de estos eptopes, lo que ha mejorado ostensiblemente los resultados inmunohistoqumicos. La fijacin en soluciones que contengan formaldehdo causa reacciones cruzadas en las protenas. El procesamiento de inclusin en parafina altera la forma de las protenas.

Tcnicas de recuperacin antignica

Fijacin y procesamiento de los tejidos

La recuperacin antignica revierte algunos de estos procesos rompiendo las uniones cruzadas, restaurando la conformacin del eptope/antgeno y removiendo los iones clsicos con citrato.

Buffer para la recuperacin antignica

La composicin y el pH de los buffer utilizados en los mtodos de recuperacin antignica que utilizan calor son cruciales para obtener buenos resultados. Buffer Citrato 0.01 mol/L con pH 6.0 Buffer Tris/EDTA, pH 9.0

Mtodos de recuperacin antignica

Mencionaremos los mtodos de recuperacin antignica ms utilizados en nuestro laboratorio: digestin enzimtica, horno de microondas y calentamiento al vapor

Digestin enzimtica: el pretratamiento de los cortes histolgicos fijados en formalina e incluidos en parafina con distintas enzimas proteolticas refuerza o mejora la reactividad inmunohistoqumica de ciertos antgenos. Los procederse varan de acuerdo a los laboratorios, la fijacin de los tejidos, el tipo de anticuerpo y los antgenos estudiados. Su seleccin depende de la experiencia previa en el laboratorio. Tripsina
Tripsina, 0.05 mol/L Tris/ ClH, 015 mol/L ClNa, pH 7.8 ClCa 0.1 %, pH 7.8

Pronasa
Pronasa, 0.05 mol/L Tris/ClH, 0.1 mol/L ClNa, pH 7.2 (TBS)

Pepsina
Pepsina, 0.2 mol/L ClH Nota: Utilizar laminas pretratadas con adhesivos. Los cortes deben estar desparafinados y rehidratados.

Mtodo de pretratamiento con tripsina

Cubrir los cortes con solucin de trabajo de tripsina. Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados C por 20-40 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la fijacin en formol y el antgeno en estudio. Recomendamos Tripsina al 0.1% durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Detener la reaccin lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

Mtodo de pretratamiento con pronasa

Cubrir los cortes con solucin de trabajo de pronasa. Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados C por 5-10 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la fijacin en formol y el antgeno en estudio. Recomendamos pronasa, 0.01 % durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Detener la reaccin lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

Mtodo de pretratamiento con pepsina

Cubrir los cortes con solucin de trabajo de pepsina precalentada a 37C Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados C por 10-30 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la fijacin en formol y el antgeno en estudio. Detener la reaccin lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica. Horno de microondas Horno de microondas domestico 750-800 watt rotatorio. Utilizar coplins o gradillas de cristal o plstico para Microondas Utilizar lminas pretratadas con adhesivo. Desparafinar y rehidratar los cortes

Mtodo de horno de microondas

Coloque las lminas en la gradilla y rellene los espacios vacos con lminas en blanco. Llene el recipiente contenedor con 200 mL de buffer de recuperacin antignica e introduzca la gradilla con las lminas. Cubra el contenedor para minimizar la evaporacin. Coloque el contenedor en el centro del horno. Caliente los cortes a 2x7 minutos. Rellene el contenedor con 50 mL de agua destilada entre los dos tratamientos. Los cortes no se pueden secar durante el proceder. Despus del segundo tratamiento retire el contenedor del horno y mantenga los cortes en el buffer a temperatura ambiente durante 15-20 minutos para su enfriamiento. Lavar en agua destilada.

Bloquee la peroxidasa endgena y coloque las lminas en agua destilada. Enjuagar en TBS o PBS. Contine con la tcnica de inmunohistoqumica. Calentamiento al vapor Vaporizador (steamer) domstico. Laminas pretradas con silano u otro adhesivo.

Mtodo de calentamiento con vapor

Llene el depsito de la base con agua destilada a temperatura ambiente. Coloque la rejilla de la base Coloque la cmara vaporizadora sobre la rejilla Llene el contenedor de incubacin con 200 mL del buffer de recuperacin antignica Coloque la tapa de la cmara de vaporizar. Ponga el timer por 75 minutos. El equilibrio entre el bao y la cmara de incubacin a 95C toma unos 45 minutos Remueva la tapa de la cmara y coloque las lminas en el buffer ya precalentado. Vuelva a cubrir la cmara Incube durante 20-40 minutos Retire de la cmara vaporizadora el contenedor del buffer y las laminas Enfriar las laminas por 20 minutos a temperatura ambiente Enjuague en agua destilada Bloquear peroxidasa endgena y colocar las laminas en agua destilada Enjuagar en TBS o PBS Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

Biopsias renales
Recibir la muestra y se acepta si es enviada en suero salino fisiolgico. Observar en el microscopio estereoscpico para seleccionar los fragmentos que contengan glomrulos. Seleccionar el fragmento para incluir en parafina. Registrar la muestra con nmero consecutivo de biopsias del departamento. Identificar con el mismo nmero al cilindro de tejido y se fija en DuboscqBrazil o formol 10 % durante 40 minutos.

Procesar a mano con tiempos de 10 min. en cada bao de la siguiente manera: Tres pases en alcohol de 80, absoluto y absoluto. Tres pases en xilol. Tres pases en parafina a 60C. Inclusin en parafina. Quince cortes seriados y numerados, a dos micras de espesor en el micrtomo vertical. Hematoxilina y eosina (ver tcnica de hematoxilina-eosina) a los cortes N 1-5-9 y 13. PAS (ver tcnicas especiales) a los cortes N 2-6-10 y 14. Plata metenamina (ver tcnicas especiales) a los cortes N 3-7-11 y 15. Tricrmica de Mason (ver tcnicas especiales) a los cortes N 4-8 y 12. Deshidratacin en alcohol absoluto dos pases. Aclaramiento en xilol dos pases. Montaje en blsamo. Etiquetear con N del corte y tcnica realizada adems del N de la biopsia.

Biopsia endomiocrdica
Recibir las muestras fijadas en formol 10 %. Inscribir segn nmero de orden de las biopsias del departamento. Si es una biopsia de seguimiento se le da el mismo nmero de la primera seguido del dgito que indique el nmero de orden de la muestra. Realizar el mismo proceder de procesamiento de las biopsias renales los pasos del 6 al 10. Cortar cuatro cortes seriados a tres micras. Realizar las coloraciones de hematoxilina y eosina y tricrmica de Mallory. (ver procedimientos de coloracin) Deshidratacin, aclaracin y montaje.