En imas Industriales

Qu son las en imas? Las en imas son catali adores biol gicos, los catali adores son
sustancias que reducen la energía de activaci n de una reacci n y aumentan así su
velocidad
Las en imas son prote nas con gran especificidad por las reacciones que catali an. Es
decir, cada en ima catali a un solo tipo de reacci n qu mica o, en el caso de unas pocas
en imas, una sola clase de reacciones estrechamente relacionadas
Las en imas tienen una enorme variedad de funciones dentro de la c lula: degradan
a cares, sinteti an grasas amino cidos, participan en el reconocimiento transmisi n de
se ales del e terior se encargan de degradar subproductos t icos para la c lula, entre
muchas otras funciones vitales.

Seg n la historia, en el Egipto de hace m s de dos mil a os se sab a que al almacenar

leche en v sceras o est magos secos de animales se formaba un s lido blanquecino o
cuajo, que al prensarse para eliminar el suero daba lugar al queso fresco. La en ima
responsable de esta transformaci n es la quimosina.
A finales del siglo XIX, un farmac utico dan s, fund la primera compa a biotecnol gica
para vender un producto llamado renina. El producto se basaba en e tractos de la mucosa
interna de est magos de ternera.
En 1835 la primera teor a sobre la cat lisis qu mica fue publicada, inclu a un ejemplo de lo
que ho conocemos como un en ima: la diastasa de la malta, se alando que la hidr lisis del
almid n se catali a m s efica mente por sta que por el cido sulf rico
En 1860 Louis Pasteur propuso que la fermentaci n del a car para transformarse en
alcohol era inducida por ciertos catali adores biol gicos, ra n por la cual los en imas
fueron llamados inicialmente "fermentos"
En 1897 se demostr que en ausencia de c lulas vivas, catali an reacciones
En 1913 se propone un modelo para e plicar el comportamiento cin tico de las en ima

Ca ac e í ica de la en ima
S n e ecífica e deci e cada en ima ca ali a n l i de eacci n
Tienen al e m lec la
El mecani m de la ca áli i en imá ica
𝐸 𝑆⇄𝐸 𝑆⇄ E+P
La ma or a de las en imas, al igual que el resto de prote nas, pueden ser desnaturali adas
si se ven sometidas a agentes desnaturali antes como el calor, los pHs e tremos

Efecto del pH:

La ma or a de las en imas presentan un pH ptimo para el
cual su actividad es m ima; por encima o por debajo de
ese pH la actividad disminu e bruscamente. Este efecto se
debe a que, al ser los en imas de naturale a proteica, al
igual que otras prote nas, se desnaturali an pierden su
actividad si el pH var a m s all de unos l mites estrechos

Efecto de la temperatura

Al aumentar o disminuir la temperatura fuera del rango

tolerable de la en ima puede afectar los enlaces qu micos
en el sitio activo, causar que sean menos adecuados para
la uni n con los sustratos.

Clasificaci n de las en imas industriales

La en ima e em e a on a ili a o la nece idad e enía la ind ia a a acele a lo
oce o con baja elocidad la en ima biol gica gene an n oce o encillo de ma o calidad
ma o en abilidad la ob enci n de n od c o dife en e o en ma o can idad

Producci n enzimas industriales:

Para comprender la fermentaci n, se deben definir 3 etapas en el proceso en conjunto. El

Upstream, un conjunto de procesos antes de la fermentaci n, el Bioproceso donde se da el
dicho proceso de fermentaci n, el Downstream donde se finali a recuperando el producto.

Upstream

Esta parte inicial del proceso consiste en la propagaci n mantenimiento de la cepa para
producci n del in culo. Consiste en dos pasos:

1) Se debe tener la cepa aislada pura para asegurar que su crecimiento es ptimo.
Para esto, se deben aplicar m todos de aislamiento en laboratorio previos al
Upstream, logrando cultivos puros s lidos en agar congelado, en soluciones
liofili adas o en suspensiones de esporas, el cual se coloca en erlenme ers para
propiciar la generaci n de biomasa reali ar escaladas en biorreactores hasta llegar
al tama o de biorreactor deseado. si esquemati amos el proceso de inoculaci n:
 2) Paralelamente al primer paso, se debe preparar el medio de cultivo de la cepa, es
decir el sustrato. El sustrato es una me cla de nutrientes agua que posee una
calidad cantidad seg n el costo de producci n la calidad alcan able, esta puede
generarse con la me cla de los componentes en un tanque de agitaci n debe ser
esterili ado antes de ingresar al biorreactor. La esterili aci n de la corriente de
sustrato se puede llevar a cabo en autoclaves o intercambiadores de calor.
Finalmente la corriente esterili ada ingresa al biorreactor, en caso de ser un
proceso aerobio (seg n la en ima) entonces tambi n estar acompa ada de una
corriente de aire esteril.
En el esquema se puede ver el proceso e plicado anteriormente, adem s se inclu e
el tanque de generaci n de biomasa donde se producen las escaladas anteriores al
ingreso del biorreactor, la salida del biorreactor donde la corriente pasa a procesos
de Downstream.

Bioproceso (fermentaci n):

El proceso de fermentaci n se da en el biorreactor es en lo que se har hincapi en esta

secci n. La fermentaci n de en imas depende tanto de la en ima como de los medios de
cultivo o del biorreactor utili ado. Se dividir esta secci n en dos partes, Fermentaci n
seg n el biorreactor Fermentaci n seg n medio de cultivo.

Fermentaci n seg n el biorreactor

La fermentaci n puede llevarse a cabo en distintos fermentadores o tanques agitados. Si la

tasa de producci n espec fica es una fuerte funci n de la tasa de crecimiento, es decir, la
producci n asociada al crecimiento, el mantenimiento de una alta tasa de crecimiento ser
de alta prioridad. En tales casos, las t cnicas de cultivo continuo son mu adecuadas. La
eliminaci n constante de la masa celular permite una alta tasa de crecimiento sostenida
una productividad espec fica.
Algunas en imas se producen m s como un metabolito secundario, la productividad
espec fica puede entonces ser una funci n inversa de la tasa de crecimiento, es decir, una
producci n no asociada con el crecimiento. En este caso, un reactor de reciclado puede ser
el m s adecuado. Un reactor de reciclaje es similar al cultivo continuo, pero se agrega un
dispositivo para devolver una fracci n significativa de las c lulas al reactor. A menudo se
pueden lograr bajas tasas de crecimiento con alta concentraci n de c lulas en tales
sistemas, aunque su aplicaci n es mu costosa.

En muchos casos o la ma or a, sin embargo, la relaci n entre la tasa de crecimiento la

productividad espec fica puede ser bastante compleja, por lo que ni el cultivo continuo ni el
fermentador de reciclaje son una buena opci n. Aqu es donde los procesos de alimentaci n
por lotes son m s frecuentes, es decir utili aci n de tanques discontinuos. Comen ando con
una concentraci n de masa celular relativamente baja, la tasa de crecimiento se puede
controlar a lo largo del curso de la fermentaci n mediante la alimentaci n de un sustrato
limitante del crecimiento. Estos reactores no tienen entradas ni salidas, sino que se cargan
en un determinado tiempo de reacci n, se retiran los productos finales.

Muchos procesos de producci n de en imas se llevan a cabo en vol menes altos, por lo
que un peque o incremento en el rendimiento, pueden llevar a un impacto en la viabilidad
econ mica, por lo que la optimi aci n es un punto importante, para la modeli aci n de los
fermentadores, las ecuaciones de equilibrio combinadas con e presiones cin ticas han sido
las herramientas m s utili adas, tal as como las e presiones cin ticas de tipo Monod, quien
fue un bioqu mico franc s que estudi un modelo matem tico para relacionar tasas de
crecimiento de microorganismos.

Fermentaci n seg n el medio de cultivo:

Las en imas pueden producirse en cultivo l quido sumergido (FLS) o en sustrato s lido
(FSS).
La fermentaci n l quida o sumergida es una t cnica de crecimiento de microorganismos en
un medio l quido, donde todos los nutrientes se encuentran disueltos en el medio de cultivo
el proceso se lleva a cabo bajo condiciones f sico qu micas controladas, presenta las
ventajas de mantener ma or homogeneidad, ma or facilidad de controlar los factores de la
fermentaci n (temperatura, aireaci n, agitaci n pH), presenta mejor distribuci n del
o geno, del calor suministrado al sistema se puede llevar a cabo la medici n directa de la
biomasa. Las desventajas son que se obtiene una alta producci n en cantidad pero con
una baja pure a relativa causando ma ores costos de purificaci n. Este m todo es utili ado
en la industria de alimentos de productos como detergentes.
En contraste, la fermentaci n s lida se lleva a cabo en una superficie s lida (me cla de
residuos industriales) que se coloca dentro del reactor sin la aparente presencia de agua
libre, pero con la humedad suficiente, para apo ar el crecimiento de los microorganismos
sobre un sustrato. Debido a esto, las ventajas del m todo son que el costo de producci n
puede reducirse die veces m s en comparaci n con la fermentaci n sumergida producto
del menor consumo de energ a el empleo de sustratos econ micos, adem s se obtiene
una ma or concentraci n de en imas aunque menor producci n en cantidad. Sus
desventajas son la dificultad para me clar controlar el sistema por lo que no es mu
utili ado en la actualidad, salvo en casos especiales, como en la industria de la medicina,
biotecnolog a o para utili aci n anal tica.

Downstream

Inclu e todas aquellas etapas posteriores a la fermentaci n, estas son la recuperaci n,

purificaci n formulaci n del producto (biocatali ador/en ima de inter s). Este representa
alrededor del 60% de los costos de producci n, los cuales se reflejar n en el precio final del
producto. En principio sale del bioreactor un e tracto en im tico que puede estar constituido
por dos tipos de en imas (una u otra, no las dos), estas son seg n la naturale a del
biocatali ador son las en imas e tracelulares o intracelulares.
Recuperaci n del biocatali ador

Las operaciones de recuperaci n tienen como objetivo aislar el biocatali ador del medio de
cultivo, el cual es un e tracto en im tico constituido por el sustrato la en ima de inter s.
Estas operaciones aprovechan la diferencia de propiedades fisicoqu micas para la
separaci n, tal como sus densidades, pesos moleculares, etc. Por eso es que se utili an
m todos de separaci n s lido-l quido como la filtraci n o centrifugaci n. De acuerdo a la
naturale a del catali ador, depende el proceso:

Si se obtienen en imas e tracelulares: se trata de aquellas en imas que se producen se

e cretan al e terior de la c lula. En este caso, la en ima quedar diluida en el medio de
cultivo con lo cual las operaciones de recuperaci n incluir n la separaci n de las en imas
del medio en estado l quido (proceso S) su concentraci n (proceso C), que consta de la
e tracci n del agua, para luego convertirse en un e tracto crudo que ingresa a purificaci n.
(seguir l nea punteada en el esquema anterior)

Si se obtienen en imas intracelulares: son aquellas en imas que quedan retenidas dentro
de las c lulas. En este caso, las operaciones de recuperaci n incluir n la separaci n de las
c lulas (conteniendo la en ima) del medio de cultivo. Una ve obtenido el pellet de biomasa
puede optarse por liberar la en ima de la c lula por ruptura celular (proceso E), obtener el
e tracto crudo proceder a la purificaci n de dicho e tracto, o bien puede emplearse la
c lula como soporte de la en ima mediante t cnicas de permeabili aci n selectiva de la
membrana plasm tica.
La disrupci n o ruptura celular se trata de la disgregaci n de la membrana /o pared celular
con la consiguiente desestabili aci n de la misma liberaci n del contenido intracelular. La
disrupci n de la c lula usualmente requiere de m todos fuertes, en particular en
microorganismos como las bacterias levaduras debido a la estructura de la pared celular.
Los m todos de disrupci n celular pueden clasificarse en: m todos f sicos como molienda,
m todos qu micos (surfactantes, lcalis fuerte) m todos en im ticos (liso imas,
glucanasas). Este m todo es indeseado por lo caro que es romper las membranas, debe
haber inversi n en maquinaria o qu micos espec ficos.
Luego de que las en imas se obtienen en forma de e tracto crudo (ha an sido
e tracelulares o intracelulares), se las ingresa a la siguiente etapa, la purificaci n.

Purificaci n del biocatali ador

Las operaciones de purificaci n tienen como objetivo remover todos aquellos contaminantes
que se encuentran en el e tracto crudo que pueden interferir en su uso posterior. A su ve ,
a trav s de la purificaci n se logra incrementar la actividad espec fica de la en ima.
La composici n del e tracto crudo depender si la en ima es e tracelular o intracelular. En
el caso de ser e tracelular, el e tracto contendr un pool de en imas e tracelulares
peque os solutos de bajo peso molecular, estos pueden ser removidos por una
cromatograf a de e clusi n molecular.
En el caso de e tracto de en imas intracelulares que debieron pasar por un proceso de
disrupci n celular, contiene todos los componentes intracelulares, entre ellos, una me cla
compleja de prote nas cidos nucleicos. En este caso se resuelven empleando nucleasas.
Una ve eliminados los componentes no proteicos, el e tracto crudo consiste principalmente
en una me cla de prote nas. Idealmente, el grado de purificaci n final debe ser elevado al
igual que el rendimiento. Esto depender de la cantidad de etapas de purificaci n, a que se
puede obtener un rendimiento por etapa elevado, pero si el proceso tiene muchas etapas, el
rendimiento final ser bajo.
Las en imas para fines anal ticos o m dicos, deben tener una alta pure a. Los
procedimientos especiales empleados para la purificaci n de en imas son la cristali aci n,
la electroforesis la cromatograf a.

Formulaci n del biocatali ador

La formulaci n del producto consiste en la estabili aci n, estandari aci n presentaci n del
producto de acuerdo a su aplicaci n. Las en imas en general se presentan de dos formas:
s lidas o l quidas.

Presentaci n de en imas en forma s lida: se me clan con estabili antes se someten a

operaciones de secado a bajas T para no desnaturali arla. Tienen el beneficio de conservar
la vida til del producto por m s tiempo debido a la disminuci n de la actividad acuosa, esto
reduce la velocidad de ocurrencia de la ma or a de las reacciones de deterioro, pueden ser
almacenadas a temperatura ambiente sin refrigeraci n son m s f cilmente transportables.
En contraposici n, la presentaci n de en imas en forma s lida puede producir polvo
afectar a los trabajadores, los cuales pueden sufrir de alergias debido a ello.

Presentaci n de en imas en forma l quida: inclu e la adici n de estabili antes la posterior

filtraci n. Las ventajas de utili ar en imas l quidas est n dadas por la facilidad de manejo
dosificaci n, Sin embargo tiene la desventaja de ser m s vulnerable a desestabili aci n
contaminaci n microbiana, con lo cual generalmente debe ser almacenada en condiciones
de refrigeraci n.
Finalmente, parte de la formulaci n del producto es su estandari aci n, desde el punto de
vista de la comerciali aci n se requiere que el producto tenga caracter sticas estables en el
tiempo, terminando de esta forma el proceso de producci n.

Lipasas

Las lipasas pertenecen a la familia de las Hidrolasas que catali an la hidr lisis de
acilgliceroles de cadena larga a glicerol, cidos grasos libres, monoglic ridos, diglic ridos
hidroli an sustratos de triacilglicerol (triglic ridos), como los que est n presentes en grasas
aceites. Las en imas de este tipo tienen importancia fundamental en varias partes de la
industria, como en la del pan, del queso de los detergentes.
En el queso Roquefort, el hongo implicado Penicillium roqueforti, produce una lipasa
hidrosoluble que hidroli a la grasa de la leche. Los efectos deseables obtenidos por las
lipasas en la industria del pan son una mejor estabilidad de la masa mejores propiedades
de manejo de esta.
En cuanto a su utili aci n en detergentes, las lipasas hidroli an los triglic ridos presentes en
grasas a monoglic ridos diglic ridos m s hidrof licos, tambi n cidos grasos libres para
facilitar su lavado. El pH influ e fuertemente en la actividad de la lipasa en la eliminaci n
de las manchas descompuestas. La mejor tasa de eliminaci n requiere un pH superior a 8.
En cuanto a la producci n de las lipasas, los hongos filamentosos (mohos) son los
principales productores de estas, pues son capaces de secretar al medio. Algunos de los
hongos filamentosos m s citados son Mucor sp., Rhi opus sp., Penicillium sp. Aspergillus
sp. en cuanto al modo de cultivo, pueden ser producidas a partir de fermentaciones en
estado s lido en las que el crecimiento del microorganismo se produce en un sustrato s lido
presentando un limitante de agua para su crecimiento.

Proteasas

Las proteasas pertenecen a la familia de las Hidrolasas. Catali an la hidr lisis de los
enlaces pept dicos, hidroli an prote nas en fragmentos m s peque os, es decir, p ptidos o
amino cidos. Son derivadas de la bacteria Bacillus Subtilis de donde se aisl por primera
ve . Esta poblaci n de en imas se divide en dos categor as: las peptidasas las
polipeptidasas. Tal como las lipasas, estas tienen aplicaci n en la industria de la
panificaci n en los detergentes. En los productos de pan, la aplicaci n de una proteasa
espec fica moderada (t picamente una proteasa f ngica) modifica el gluten, proporcionando
una mejor e tensibilidad, un desarrollo m s r pido , por lo tanto, una mejor estructura
volumen del producto final.
En cuanto a la industria de los detergentes se utili an para eliminar manchas como sangre
hierba. La ma or a de las proteasas detergentes comerciales son subtilisinas, deriva este
nombre por su origen de la bacteria.
Las proteasas detergentes comerciales tienen una estructura mu similar no e isten
diferencias fundamentales entre ellas, difieren principalmente en la temperatura ptima, el
pH ptimo la cantidad de calcio en el medio (lo necesitan para estabili arse). Estas
variables como la temperatura el pH pueden modificar considerablemente el rendimiento
de las proteasas. Algunos son altamente alcalinos, es decir, tienen una actividad m ima en
el rango de pH alto, como Esperase Savinase. Otros son de baja alcalinidad(tienen gran
actividad en rangos m s bajos de pH), por ejemplo, Alcalase. Estos nombres (Esperase,
Alcalase Savinase) son nombres colocados por patentes por pertenecer a la industria de
los detergentes tienen implicadas proteasas.

La industria de la cerve a ocasionalmente utili a esta en ima para la fabricaci n de

a cares de malta del tipo de reempla o, a veces es necesario agregar una proteasa para
conseguir la degradaci n suficiente de la prote na.
Otras aplicaciones potenciales de las proteasas microbianas inclu en la recuperaci n de
plata de las pel culas de papeles fotogr ficos por digesti n, tierni aci n de la carne o
modificaci n de prote nas en cereales.
Finalmente la producci n de las proteasas viene dada por fermentaciones en estado s lido
o l quido en varias ocasiones, en general en estado s lido.

Aplicaci n a nivel nacional

Keclon: planta industrial de producci n de en imas prote nas ubicada en San Loren o,
Santa Fe, fundada por investigadores del CONICET. El objetivo de esta planta es el de
incrementar la eficiencia de las industrias aceitera de alimentaci n, todo esto basado en el
respeto a la reducci n de desechos biol gicos. Poseen tecnolog as de fermentaci n a gran
escala, procesos de purificaci n downstream de ltima generaci n, lo cual los posiciona
como referente regional para abastecer con productos sustentables a diversas industrias.
Entre los productos que comerciali an se encuentran aceites comestibles, biodiesel,
productos para la alimentaci n humana productos para la alimentaci n animal. Entre los
productos para la alimentaci n humana se encuentran un coagulante de leche para la
elaboraci n de queso que se produce en microorganismos en imas para lecher a,
panificaci n, c rnicos, entre otros.