Cuestionario Microbiología 11

CUESTIONARIO MICROBIOLOGÍA – III UND - PRÁCTICA Nº 10 Y 11
CULTIVO, AISLAMIENTO DE HONGOS Y RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS FÚNGICAS. ANTIFUNGIGRAMA
1. Qué función cumple el KOH en la investigación de hongos en un Examen - Directo.
Tomar un fragmento de la colonia y observarlo con azul de lactofenol o unas gotas de solución de KOH 10%. Es
el método habitual, pero puede destruir los aparatos esporíferos y dificultar la identificación. Se observa:
• Talo: filamentos o levaduras; grosor; bifurcaciones; presencia o ausencia de tabiques
(micelio tabicado o cenocítico); color del talo.
• Esporas asexuadas y aparato conidiógeno.
• Esporas sexuadas y estructuras donde se forman.
Hidróxido de potasio (KOH) 10% Disuelve rápidamente las células permitiendo digerir material proteico,
observando con mayor nitidez los elementos fúngicos, su efecto de clarificar puede incrementarse al calentar a
la llama ligeramente la preparación. Adicionalmente, se puede emplear colorantes para pigmentar la pared de
los hongos y mejorar la visualización. La observación de hifas, permite sugerir la presencia de invasión micótica.
2. ¿Por qué es importante usar el Método de la Tinta China en Micología?
TINTA CHINA: Es un método de contraste. Permite visualizar la cápsula de polisacárido de Cryptococcus

neoformans, mediante la presencia de un halo claro y nítido alrededor de la levadura. Existen artefactos
(hematíes, burbujas de aire, leucocitos, gotas de grasa y partículas de talco) que pueden interferir y confundir al
analista. La sensibilidad de la técnica es de 50% en pacientes sin VIH y se puede incrementar hasta 88% en
pacientes VIH con meningitis criptococósica.
3. Mencione 2 medios de cultivo para aislamiento de hongos de importancia clínica en el hombre.
➢ Mueller-Hinton. En pocas palabras, este es el medio de cultivo que se usa para la prueba de sensibilidad
a los antimicrobianos.
➢ Agar Sabouraud glucosa. : El Agar Sabouraud Glucosado, con o sin antibióticos añadidos, es el medio de
aislamiento por excelencia para la identificación de levaduras. Para el cultivo de hongos patógenos y no
patógenos. El pH bajo dificulta el crecimiento de algunas microorganismos pero no de los hongos.
4. Mencione 3 géneros de hongos importantes en Odontología y con qué enfermedad está relacionada.
Candida albicans
Se identificaron un total de 107 cepas de Candida correspondientes a 15 especies, distribuidas del

siguiente modo: C. albicans 23%, C.
glabrata 18%, C. tropicalis 13%, C.
krusei 10%, C. intermedia y C.
lipolytica con 1,5%. En 77% de los casos
estuvieron implicadas especies diferentes
de C. albicans. Se identificó la existencia de
relación entre cáncer del sistema
reproductor y C. guilliermondii (p =
0,0001, < 0,05; OR 17) y entre C.
colliculosa y cánceres respiratorios (p =
0,0003 < 0,05; OR 19,5). El 99% de las
especies de Candida identificadas fueron
sensibles a los antifúngicos
5. Qué métodos automatizados se emplean en la actualidad para identificación de levaduras.
La espectrometría de masas, conocida como matrix-assisted laser desorption/ionization

time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), es una técnica utilizada en la
identificación de microorganismos mediante la creación de un espectro basado en el perfil
de proteínas, que es único para una especie dada. El objetivo del presente trabajo fue evaluar
la identificación de aislamientos clínicos de levaduras por MALDI-TOF MS en un hospital
universitario de Argentina y analizar 2 procedimientos para la extracción de proteínas: el
recomendado por el fabricante del equipo y una técnica abreviada rápida. Utilizando el
primero de estos procedimientos se analizaron 201 aislamientos identificados previamente por
métodos convencionales y se obtuvo coincidencia en la identificación a nivel de
especie en el 95,38 % de los aislamientos analizados. Con 100 de estos
aislamientos se utilizó, además, el procedimiento abreviado para la extracción
de proteínas; se obtuvo una identificación correcta a nivel de género y especie
en el 98,0 % de ellos. La espectrometría de masas MALDI-TOF MS demostró ser
una técnica rápida, sencilla y precisa para la identificación de levaduras.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
S0325754115000346
Prueba del tubo germinativo

Se realiza de acuerdo con el siguiente procedimiento:
1- Suspender un inóculo muy pequeño de células de la levadura obtenidas a partir de una colonia aislada en 0,5 ml de suero de oveja (o de
suero humano, procedente de un individuo sano).
2- Incubar los tubos a 35-37o C, no superando las 3 horas.
3- Después de la incubación, tomar una gota de la suspensión y colocarla sobre un portaobjetos. Observar con el microscopio a poco
aumento la presencia de tubos germinativos. Un tubo germinativo se define como un apéndice con la mitad de ancho y 3 a 4 veces el
largo de la célula de la cual emerge. En la mayor parte de los casos no existe constricción en el origen del tubo germinativo.
Producción de cápsula
El procedimiento se desarrolla del siguiente modo:
1. Tomar una pequeña cantidad del inóculo suspendiéndola en una gota de una solución acuosa de tinta India al 50% en un portaobjetos.
2. Observar al microscopio la presencia de la cápsula, que se distingue como un halo claro alrededor de las células.
Prueba selectiva rápida para ureasa
Se realiza según el siguiente procedimiento:
1. Pasar un hisopo de algodón impregnado con un substrato con urea deshidratado sobre la superficie de dos o tres colonias, de modo que la punta
se cubra con el microorganismo.
2. Colocar el hisopo con la levadura dentro de un tubo que contenga 3 gotas de cloruro de benzalconio al 1% (pH 4,86 ±0,01) y rotar con firmeza
contra el fondo para poner en contacto los microorganismos con las fibras de algodón.
3. Tapar el tubo e incubar a 45oC durante 30 minutos.
4. Examinar a los 10, 15, 20 y 30 minutos para detectar un cambio de color de amarillo a púrpura. Un color rojo a púrpura indica producción de
ureasa.
6. En qué consiste el Fungigrama y cuando se debe solicitar.
Prueba de sensibilidad a los hongos o Fungigrama :
Los mecanismos mediante los cuales un hongo puede adquirir resistencia a antifúngicos son
celulares y moleculares:
Los mecanismos celulares más importantes son: cambio a cepas más resistentes: cepas
endógenas con resistencia intrínseca, mutaciones no cromosomales, con expresión transitoria,
que da como resultado células temporalmente resistentes (resistencia epigenética), C. albicans
va a depender, como principal factor de virulencia, a su capacidad de adhesión, que favorece
la formación de un complejo denominado biopelícula que le permite adherirse firmemente a
los tejidos del huésped propiciando la invasión y diseminación de la infección, actuando como
un importante mecanismo de resistencia antifúngica.
Los mecanismos moleculares de resistencia son: alteraciones en el ingreso del antifúngico por
mutación de la enzima que permitía su ingreso, alteraciones por modificación o degradación
intracelular del fármaco, alteraciones de otras enzimas que participan en la vía biosintética del
ergosterol, bombas de eflujo que expulsan al fármaco una vez ingresado antes que pueda
actuar sobre el target específico.
Cándida utiliza principalmente dos mecanismos de resistencia a un azol: por mutaciones
moleculares de las enzimas relacionadas en la síntesis del ergosterol y bombas de eflujo: ATP-
binding cassette (ABC) y facilitadores mayores (MF).
https://www.noticieromedico.com/post/infecciones-f%C3%BAngicas-invasivas-ifi
Fungigrama o antifungigrama, se recomienda sea en las siguientes situaciones:

 fracaso terapéutico
 profilaxis previa con anti fúngicos de paciente con IFI
 aislamiento de una especie poco frecuente, con sensibilidad in vitro desconocida.
Para la realización de los estudios de sensibilidad a los hongos hay dos estándares
internacionales: National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), de los Estados
Unidos, y el (EUCAST), que es un estándar europeo
La actividad in vitro de los anti fúngicos se evalúa mediante métodos de dilución en medios
sólidos (dilución en agar) o líquidos (dilución en caldo): la menor concentración de antifúngico
(expresada en unidades/ml o mg/ml) que inhibe el desarrollo del hongo es la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI) e interpretados a las categorías cualitativas de sensible (S),
moderadamente sensible (MS), intermedio (I) o resistente (R).
7. ¿Qué tipo de examen directo es el más adecuado para la observación y diferenciación de Candida sp.?
Fundamente
El examen Directo no sustituye al cultivo. Brinda información preliminar o presuntiva al ser una técnica rápida
que puede ser útil al clínico y en algunos casos llegar a ser diagnóstica.
El método de disco difusión consiste en depositar en la superficie de una placa de agar Mueller Hinton II
modificado (MHm) previamente inoculada con la cepa Candida spp., discos de papel de filtro impregnados
con los diferentes antifúngicos fluconazol
(25 μg) y voriconazol (1 μg). Tan pronto el
disco impregnado en antifúngico se pone
en contacto con la superficie húmeda del
agar, el filtro absorbe agua y el antifúngico
difunde por el agar, formándose un
gradiente de concentración. Transcurridas
24 a 48 h de incubación, los discos pueden,
o no, aparecer rodeados por una zona de
inhibición de crecimiento de Candida spp.
Hidróxido de potasio (KOH) 10%

 El examen directo con KOH consiste en la toma de muestras: escamas, pelos o
fragmentos de uñas, su incubación con hidróxido potásico al 10-30% y su posterior
visualización en el microscopio, lo que permite observar la existencia de hifas septadas
(dermatofitosis), formas levaduriformes o pseudohifas (candidiasis) que son suficientes
para confirmar el diagnóstico.

Para examinar las muestras en las que se requiere ver la presencia de estructuras
fúngicas, se utilizara el reactivo de Hidróxido de potasio al 10-30%, el cual tiene la
característica de disolver las células no micóticas, permitiendo visualizar con
mayor nitidez las estructuras fúngicas.
Los mohos están constituidos por filamentos multinucleados denominados hifas que se reproducen continuamente por sus
extremos y con frecuencia se arborizan. Las levaduras se reproducen por gemación y ocasionalmente pueden formar
filamentos o pseudohifas.
8. ¿Por qué se utiliza Agar Sabouroud como medio de cultivo de hongos dermatofitos? Fundamente
El cultivo de dermatofitos (o examen micológico de piel/pelo/uñas) permite diagnosticar la presencia de

hongos que afectan piel o fanéreos (pelo y/o uñas).
El cultivo es la siembra de las muestras biológicas en los medios idóneos (Agar Sabourauddextrosa). Las
muestras se pueden recolectar con un hisopo estéril o con el asa de platino previamente calentada al rojo y
enfriada en el medio de cultivo, lo cual facilita la adherencia en el caso de pelos y escamas.
9. ¿Qué otros métodos conocen para la identificación de Candida sp.?

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CULTIVO, AISLAMIENTO DE HONGOS Y RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS FÚNGICAS. ANTIFUNGIGRAMA

1. Qué función cumple el KOH en la investigación de hongos en un Examen - Directo.

2. ¿Por qué es importante usar el Método de la Tinta China en Micología?

TINTA CHINA: Es un método de contraste. Permite visualizar la cápsula de polisacárido de Cryptococcus

3. Mencione 2 medios de cultivo para aislamiento de hongos de importancia clínica en el hombre.

Se identificaron un total de 107 cepas de Candida correspondientes a 15 especies, distribuidas del

La espectrometría de masas, conocida como matrix-assisted laser desorption/ionization

Prueba del tubo germinativo

6. En qué consiste el Fungigrama y cuando se debe solicitar.

Prueba de sensibilidad a los hongos o Fungigrama :

Fungigrama o antifungigrama, se recomienda sea en las siguientes situaciones:

Hidróxido de potasio (KOH) 10%

El cultivo de dermatofitos (o examen micológico de piel/pelo/uñas) permite diagnosticar la presencia de

9. ¿Qué otros métodos conocen para la identificación de Candida sp.?

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