https://www.geog.cam.ac.

uk/facilities/laboratories/techniques/protocol/

Las diapositivas de referencia de polen hechas a partir de especímenes recogidos en el campo

o adquiridos a través de un jardín botánico son una valiosa ayuda en la identificación de polen
fósil, y son especialmente importantes cuando se trabaja en una región para la que la flora
está mal representada en una colección de referencia existente. Este protocolo detalla cómo
hacer muestras de polen moderno de plantas con flores para su uso de referencia en el análisis
de polen.

Equipo:
Pinzas,

hoja de afeitar,

buscador

Pequeños frascos de vidrio con tapa

Microscopio estereoscópico de baja potencia

Identificación
El polen puede extraerse de flores frescas o de especímenes prensados o secos. Para que el
material de referencia sea útil para otros, es esencial la identificación exacta de la planta. Si
tiene material del que no está seguro de la identificación, por ejemplo de una planta que crece
abundantemente cerca de la ubicación de un núcleo, intente identificar la planta mediante
guías impresas o la ayuda de un botánico. Consulte una obra de referencia, como Flora
Europea, y confirme la identidad precisa de sus especímenes.

Aislamiento de las anteras

El objetivo en las primeras fases de la preparación es el aislamiento y la concentración de las
partes de la flor portadoras de polen (anteras). Examine el espécimen con una lupa y,
utilizando unas pinzas o una cuchilla de afeitar, corte o separe las partes exteriores de la flor
para exponer las anteras que contienen el polen. A continuación, puede recogerlas y sellarlas
en un frasco etiquetado. Esta etapa permite confirmar la presencia de polen. Las flores que
están a punto de abrirse suelen proporcionar más polen que las que ya están abiertas; las
flores que están completamente abiertas pueden haber desprendido ya su polen. Las anteras
antes de la dehiscencia (desprendimiento de polen) suelen distinguirse fácilmente por su color
dorado y la presencia de polen que cae libremente; las anteras que ya se han dehiscenciado
suelen ser de color marrón más oscuro. Por supuesto, en el caso de flores muy frágiles o
pequeñas, puede ser preferible recoger flores enteras. Foto: recogida de anteras de Cistus
ladanifer.

Esta fase preparatoria también permite saber cuántas anteras deben recogerse. Las distintas
plantas producen cantidades muy diferentes de polen, y no se puede prescribir un número
determinado como suficiente. Por lo general, la inspección con lupa proporciona una
indicación de la abundancia del polen presente. Mientras que las anteras de una sola flor
grande y polinífera pueden ser suficientes, en el caso de las flores pequeñas o compuestas
puede ser necesario incluir diez o veinte flores. Foto: anteras de varios tipos de flores
diferentes listas para las siguientes etapas.
Evitar la contaminación
Si prepara varias muestras, tenga cuidado con la contaminación cruzada. Trabajar en una pila
de papel de desecho le permite empezar una nueva hoja para cada nuevo espécimen. Aclare y
seque sus utensilios y sus manos entre un espécimen y otro, y limpie periódicamente su
superficie de trabajo con toallas de papel húmedas. Si está preparando un grupo de
especímenes de un grupo de plantas estrechamente relacionadas, es aún más importante
evitar la contaminación cruzada. Los utensilios metálicos pueden flamearse en un mechero
Bunsen entre muestra y muestra.

Procedimiento de laboratorio para la preparación del polen

Estas etapas representan una versión reducida del método utilizado para recuperar el polen de
los sedimentos (compárese con el Protocolo de preparación del
polen-https://www.geog.cam.ac.uk/facilities/laboratories/techniques/pollen/). En resumen,
las etapas requeridas aquí son

1.Calentar el 10% de NaOH

2.Tamizado

3.Lavado con agua

4.Acetólisis.

5.NaOH 1% y tinción con safranina (opcional)

6.Deshidratación en TBA

7.Recuperación del residuo y suspensión en aceite de silicona

NaOH caliente al 10%.

Vaciar el contenido de los frascos de muestras en tubos de centrífuga grandes. Cubrir el
material vegetal con NaOH (tubos llenos aproximadamente de 1/4 a 1/3). Con varillas de vidrio
con punta de bola, ayudar a la maceración de cada muestra expulsando el aire con una acción
de aplastamiento o molienda. Colocar en un baño de agua a 90° C durante 4 minutos.

Si no se está familiarizado con el protocolo de preparación del polen, deben consultarse las
explicaciones detalladas de las etapas equivalentes. Aquí se expondrán las adiciones y
variaciones importantes en cada etapa para las muestras de referencia modernas.
Tamiz
Prepare un segundo juego de tubos de centrífuga con embudos y tamices flameados como en
el protocolo estándar, pero utilizando tubos pequeños en lugar de grandes. Vaciar el contenido
de los tubos grandes en los tamices. Lavar el contenido del tamiz con un chorro suave de agua
desionizada de una botella de lavado. A diferencia del procedimiento estándar, no es
necesario chorrear el contenido del tamiz, intentando lavar todo el material fino. La separación
del polen de las partes de la flor en las muestras se habrá realizado en la etapa 1; un lavado
excesivo en los tamices sólo forzará el material orgánico no deseado.

Equilibrar los tubos en los soportes de la centrífuga. Centrifugar, 5 minutos a 3500 rpm. (Los
ajustes más largos y rápidos recomendados en este protocolo reflejan el pequeño tamaño de
los residuos)

Decantar el sobrenadante. Es posible que a partir de este momento no se vea prácticamente

ningún residuo. No se desespere ni deseche el tubo... es fácil que aún tenga suficiente polen
para trabajar al final.

Lavados de agua
Whirlimix. Rellenar con agua desionizada. Balance. Centrifugar. Decantar.

Repetir la operación hasta que el sobrenadante sea claro y no tenga color; normalmente son
suficientes 3 lavados.

Acetólisis
Whirlimix. Completar con ácido acético glacial, CH3COOH. Equilibrar. Centrifugar. Decantar.

Preparar la mezcla de acetólisis (9 partes de anhídrido acético por 1 parte de ácido sulfúrico
concentrado) siguiendo el mismo método y las mismas precauciones que el protocolo
estándar, dejando 4-5 ml por muestra. Verter la mezcla en los tubos y colocarla en un baño de
agua a 90° C durante 4 minutos.

Retirar del baño de agua. Completar con ácido acético glacial. Equilibrar. Centrifugar. Decantar
en el fregadero del armario de los gases.

Hacer un whirlimix. Rellenar con agua desionizada. Balancear. Centrifugar. Decantar.

NaOH. Tinción al 1% y safranina (opcional)

(Si no se desea la tinción, se puede omitir esta etapa; pasar a la etapa 6).

Mezclar en forma de torbellino. Añadir un chorro de NaOH al 10%. Whirlimix. Completar con
agua desionizada. Equilibrar. Centrifugar. Decantar.

Whirlimix. Añadir una gota de solución acuosa de safranina al 0,2%. Whirlimix. Completar con
agua desionizada. Equilibrar. Centrifugar. Decantar.
Deshidratación en TBA
Prepare la TBA según el protocolo estándar, siguiendo las mismas precauciones. Llenar los
tubos hasta la mitad. Equilibrar. Centrifugar. Decantar en un vaso de precipitados que
contenga agua; verter en el fregadero de la vitrina de gases.

Recuperación de residuos y suspensión en aceite de silicona.

Whirlimix. El residuo en los tubos se transferirá a viales de vidrio etiquetados utilizando
pipetas Pasteur de vidrio con tetina de goma. Este método es útil para las muestras en las que
hay cantidades muy pequeñas de residuos. Aspirar el residuo del primer tubo en una nueva
pipeta y verterlo en un vial etiquetado. Añada otro chorro de TBA al tubo, haga un remolino y
transfiéralo de nuevo al vial. Repita con más chorros de TBA hasta que todos los restos de
residuos hayan sido transferidos al vial. Repita el procedimiento para cada muestra posterior.

Colocar los viales en los soportes de centrífuga. Equilibrar (agua en las ranuras vacías del
soporte de centrífuga). Centrifugar. Decantar el TBA en un vaso de precipitados que contenga
agua; desechar en el fregadero de la vitrina.

Añadir unas gotas de aceite de silicona a los frascos y agitar con una varilla de cóctel para
suspender el residuo. Tenga cuidado de no diluir demasiado el residuo añadiendo mucho
aceite de silicona. Añada sólo unas gotas; se puede añadir más aceite a medida que el TBA se
seca durante las 24-48 horas siguientes, y de nuevo al hacer los portaobjetos.

Realización de portaobjetos permanentes de residuos de polen de referencia

Equipo:

Residuos de polen de la parte B

Barras de cóctel

Portaobjetos de vidrio y cubreobjetos circulares (13-16mm de diámetro)

Crisol pequeño

Parafina

Placa caliente

Pipetas de vidrio y tetinas de goma

Fuente de calor suave (quemador de Meths)

Soporte para mantener el crisol sobre el calor

Bandeja metálica volteada para enfriar los portaobjetos

Cuchillas de afeitar, Meths y toallas de papel

https://www.geog.cam.ac.uk/facilities/laboratories/techniques/pollen/

Protocolo de preparación del polen fósil (V. 1-1)

Llevar bata de laboratorio, guantes de látex o vinilo y tener a mano un par de gafas de
seguridad.

Las muestras suelen ser de entre 0,5 y 2 cm3 y pueden tomarse con un muestreador
volumétrico calibrado o con desplazamiento de agua en una probeta de 5 cm3. Éstas deben
colocarse en tubos de centrífuga de plástico de 50 ml (pueden utilizarse tubos pequeños si las
muestras son especialmente pequeñas).

Para cuantificar la concentración de polen dentro de las muestras se puede añadir un pico
exótico, de 1 a 3 pastillas de licopodio, dependiendo de la naturaleza del sedimento, es decir, 3
si es probable que haya mucho polen. Una proporción de 1:1, o 1:2 es deseable para la
precisión estadística, aunque 1:5 es aceptable. No olvide anotar el número de lote de las
pastillas de licopodio, que se relaciona con las concentraciones de esporas contenidas en las
pastillas y que se utiliza en los cálculos posteriores.

1. HCl caliente al 7%, calentar el baño de agua en la vitrina de gases a ~90oC (tarda 20-30
minutos). Llenar los tubos 2/3 con HCl y colocarlos en el baño de agua durante 20-30 minutos
para que el HCl disuelva el carbonato, puede haber una reacción violenta, se puede utilizar una
gota de alcohol metílico para romper la tensión superficial y evitar que las muestras hagan
espuma. Agitar de vez en cuando con varillas de vidrio (una para cada tubo). Esto acidifica las
muestras a pH1.

- Si las muestras son muy calcáreas puede ser necesario eliminar el carbonato utilizando una
pequeña cantidad de HCl concentrado.

Equilibrar y centrifugar, tubos grandes 3000rpm/5 minutos, tubos pequeños 3000rpm/3

minutos.

2. 2. Lavar con H20, decantar el sobrenadante líquido claro "amarillo" o "marrón" en un

movimiento fluido de los tubos a un vaso de precipitados grande (el contenido del vaso de
precipitados puede vaciarse en el fregadero y lavarse con agua), los residuos sólidos deben
quedar en el fondo de los tubos. Agitar y rellenar con agua desionizada, asegurarse de que
toda la muestra se moviliza, utilizar una varilla de vidrio si es necesario.

Equilibrar y centrifugar.
- Mientras se centrifuga, preparar los tamices, es decir, flamear con un quemador de gas
(usando pinzas) y apagar en agua, también preparar los embudos y el segundo lote de tubos
con etiquetas.

3. 3. Calentar el 10% de NaOH, decantar y mezclar. Llenar los tubos de 1/3 a 1/2 con
NaOH. Esto eleva el pH a alcalino (pH14) llevando los ácidos húmicos a la solución. Colocar en
el baño de agua durante 2-4 minutos. No hacer Whirlimix ni decantar.

4. 4. Tamizar, poner el segundo lote de tubos en una gradilla con embudos y tamices. El
tamizado debe realizarse con gafas de seguridad, ya que incluso una pequeña cantidad de
NaOH puede dañar seriamente los ojos.

Vierta cada muestra a través de los tamices, lávela con agua desionizada (puede ser útil un
limitador de boquilla para aumentar la presión del agua y restringir la cantidad utilizada). Lavar
a fondo el tamiz utilizando el "método de las esquinas" si se desea, es decir, trabajando a
través del tamiz de arriba a abajo y luego de izquierda a derecha. Coloque los tubos, tamices y
embudos usados en el fregadero después de su uso. Las muestras difíciles pueden pasarse por
el tamiz con un dedo limpio enguantado o una varilla de vidrio (hay que tener cuidado de no
dañar la malla del tamiz). Como alternativa, unos cuantos lavados con agua antes del tamizado
eliminarán el material húmico y diluirán el NaOH, lo que hará más seguro el tamizado.

5. Lavar con H2O, el mismo procedimiento que el 2, repetir hasta que el líquido que se
decanta sea claro (esto suele llevar 5-6 lavados, pero si tienes mala suerte hasta ~16!). Esto
elimina los ácidos húmicos (marrón) y las arcillas (normalmente gris). Las muestras pegajosas
pueden ser difíciles de mezclar y deben ser agitadas con una varilla de vidrio, las muestras muy
ricas en arcilla pueden beneficiarse del uso de pirofosfato de sodio al 4% para ayudar a romper
los enlaces electrostáticos (la colocación en el baño de agua durante ~10 minutos ayudará aún
más a este proceso), un par de lavados de agua pueden ser necesarios para eliminar
completamente las partículas.

- Los tamices metálicos deben lavarse a fondo en agua caliente con detergente, no deben
lavarse en Decon, que es corrosivo. Los embudos deben lavarse con detergente y luego
colocarse en un recipiente que contenga Decon (véase el protocolo de lavado).

6. Lavar con HCl al 7%, igual que en el caso 2, pero utilizando una cantidad menor de HCl
en lugar de H2O. Haga esto sólo una vez. Esto es para acidificar las muestras antes del HF,
ayudar a la acción del HF en las muestras y asegurarse de que no hay carbonato residual.

7. HF(acido fluorhidrico) frío/caliente, ¡MUY PELIGROSO! Utilice el sistema de

compañeros. Usar delantal largo de goma marrón, guantes de látex o vinilo, guantes de goma
negros y máscara completa. Prepare un vaso de precipitados grande con una solución saturada
de carbonato de sodio (que neutraliza el HF) en la vitrina de gases. Asegúrese de conocer la
ubicación de todo el equipo de seguridad relacionado y el
procedimiento en caso de derrame;

Pastillas de gluconato de calcio para tomar si se entra en contacto con el HF en la nevera.

Gel de gluconato de calcio para llevar al hospital para aplicarlo e inyectarlo bajo las
quemaduras de HF - en la nevera.

Cal apagada para neutralizar grandes derrames de HF - en un bote grande.

La manguera de agua en caso de que te contamines, en cuyo caso quítate toda la ropa
contaminada y lávate durante 15 minutos con agua corriente fría.

Todo el trabajo DEBE realizarse en la vitrina de gases. Abra la guillotina lentamente, ya que
puede producirse una breve inversión del flujo de aire que haga salir los humos al laboratorio si
se abre rápidamente.

Caliente - Vierta cuidadosamente HF en cada tubo 1/2 - 2/3 de su capacidad y déjelo durante
~2 horas en el baño de 90oC en la vitrina de gases. Lavar todo bien en carbonato sódico. Las
muestras especialmente ricas en silicatos pueden requerir varios HF o incluso dejarlas toda la
noche con el calentador de agua apagado, el ventilador encendido y un buen etiquetado.

Frío - Como alternativa, las muestras pueden dejarse bien etiquetadas y con los tapones de los
tubos puestos en la parte posterior de la vitrina de gases durante un periodo de tiempo más
largo; es mejor dejar el ventilador encendido durante este periodo.

Una vez transcurrido este tiempo, coloque los tapones en los tubos antes de sacarlos del baño
de agua. Equilibrar (añadir agua en los recipientes de los tubos para equilibrarlos) centrifugar
con los tapones puestos. Retire los tapones de los tubos y decántelos con cuidado por el
fregadero de la caja de humos. Sumergir todo el tubo en la solución saturada de carbonato de
sodio para eliminar los goteos de HF del tubo. No permita que entre carbonato de sodio en el
tubo.

Limpiar el suelo de la vitrina de gases con un paño empapado en solución de Carbonato Sódico,
por si hubiera alguna salpicadura inadvertida.

El HF elimina los silicatos de las muestras. Esto también puede lograrse mediante la separación
por densidad, que hace flotar la materia orgánica dejando los minerales de silicato.
8. HCl caliente al 7%, colocar en un baño de agua durante 20-30 minutos para eliminar
los residuos de silicato y los fluorosilicatos. El calentamiento aumenta la solubilidad.

9. HNO3 al 10%, el ácido nítrico diluido puede ser necesario en esta etapa para eliminar
los sulfuros. Siga el procedimiento como en el punto 2.

9. Lavar con H2O, mismo procedimiento que el 2.

10. 10. Lavado CH3COOH, ácido acético concentrado (glacial) (huele a

vinagre). Mismo procedimiento que el 2, excepto que se utiliza CH3COOH en lugar de agua.
Sin embargo, al decantar, vierta los residuos en el fregadero de la vitrina y trate de mantener
las muestras en la vitrina en todo momento, y entre usted y la vitrina al centrifugar, utilice
tapones para los tubos si es necesario. Esto sirve para eliminar el agua y poder realizar la
acetólisis.

11. Acetólisis, utilice guantes de nitilo verde. Esta mezcla reacciona de forma
exotérmica (produce calor) y puede ser violenta y peligrosa, especialmente cuando entra en
contacto con el agua.

Para realizar la mezcla de acetólisis, combina 9 partes de anhídrido acético (es decir, 45 ml)
con 1 parte de ácido sulfúrico conc. (es decir, 5 ml) (viértelo primero en un vaso de
precipitados más pequeño, ya que la botella es poco manejable) en una probeta. Colocar 5 ml
de la mezcla en cada tubo, trabajando en la vitrina de gases, e incubar en baño de agua
durante 3 minutos.

Este procedimiento elimina la celulosa y los polisacáridos de las muestras por oxidación.

12. Lavar CH3COOH, sacar del baño de agua y completar con ácido acético para enfriar y
detener la reacción de acetólisis y equilibrar. Centrifugar y decantar por el fregadero en la
vitrina de gases.

13. 13. Lavar el H2O, con el mismo procedimiento que el 2. Mientras tanto, poner la
botella de lavado de TBA en el baño de agua para que se derrita. Aflojar la parte superior para
evitar una explosión debido a una acumulación de presión.
14. 14. Lavar ~1% de NaOH, después de decantar Whirlimix y añadir un chorro de
NaOH al 10%, Whirlimix de nuevo y rellenar con H2O. Equilibrar, girar y decantar en el
fregadero o en un vaso de precipitados con agua. Whirlimix.

El propósito de esta etapa es llevar el pH de ligeramente ácido a ligeramente alcalino. (¡El

Safranin se vuelve azul en soluciones ácidas!).

15. Lavar con H2O, el mismo procedimiento que el 2.

16. Lavado H2O + Safranin acuoso al 0,2%, para el lavado el mismo procedimiento
que el 2, pero añadiendo 1-4 gotas de colorante (dependiendo de la muestra), Whirlimix,
completar con H2O, equilibrar, centrifugar y decantar.

17. 17. Lavado de TBA, retire el TBA calentado del baño de agua y llene los tubos hasta
la mitad, mejor si lo hace en la vitrina de gases. Tenga cuidado de no mancharse con el TBA, ya
que es tóxico, o de no respirar los vapores. Equilibrar (rellenar con TBA), girar y decantar en un
vaso de precipitados con agua. Whirlimix. El TBA elimina el agua de las muestras para poder
añadir líquido/aceite de silicona, decantar en el fregadero de la vitrina.

18. Vial de restos, etiquetar los viales (nº tres veces arriba y abajo, profundidad,
sitio y nº de muestra). 19. Poner una pequeña cantidad de TBA en el TUBO 1 (no en el vial 1) y
Whirlimix como de costumbre. Luego verter en el VIAL 1, repetir hasta que todo el residuo esté
en el vial 1. Una vez completadas todas las muestras, coloque los viales en los "soportes de
tubos" de la centrífuga utilizando pinzas y gire como de costumbre. Colocar los tubos en el
fregadero para lavarlos.

Decantar los viales en el vaso de precipitados con agua (para controlar los vapores de TBA) y
añadir aceite de silicona (1-6 gotas aproximadamente iguales a la cantidad de residuos) a los
tubos con una pipeta desechable o una varilla de cóctel. Mezcle bien con una varilla de cóctel
dejando una en cada tubo, colóquelo de forma segura en un vaso de precipitados forrado con
tejido y tápelo para evitar la contaminación. El TBA se evaporará a lo largo de un par de días,
es necesario comprobar y remover las muestras para asegurarse de que no se han secado y
remover durante este periodo. ¡¡¡Entonces podrás hacer los portaobjetos y empezar a
disfrutar del recuento de polen!!!