UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRONÓMICAS

DEPARTAMENTO DE PROTECCIÓN VEGETAL
LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN Y DIAGNÓSTICO
MICROBIOLOGÍA ANIMAL 2023

GUÍA INTRODUCTORIA AL USO DEL

MICROSCOPIO ÓPTICO

Material complementario previo a las

actividades prácticas.

Estimado estudiante

Objetivo: Esta guía introductoria te servirá para aprender conceptos básicos de microscopía,
necesarios para realizar el posterior trabajo práctico. Junto con esta guía se adjuntan una serie de
videos y links de utilidad que debes descomprimir para poder usarlos, te recomendamos desarrollar
las actividades que se plantean en esta guía con anticipación y detalladamente antes de iniciar tus
actividades prácticas.

Introducción

Sin duda ha sido fundamental para el desarrollo de la humanidad y la ciencia el establecer los
postulados de la Teoría Celular. En ella se describe a los seres vivos como sistemas biológicos
constituidos por unidades diminutas llamadas células, cuya actividad origina todos los procesos y
actividades que vemos en el organismo como un todo. Dado que las células son entidades pequeñas
y complejas, fue crucial el invento de un instrumento que permitiera estudiar las células a gran
aumento. Este instrumento es el microscopio, que, a través de sus diversas versiones en el curso de
la historia, ha permitido plasmarnos una noción de la asombrosa diversidad de las células existentes
y nos ha permitido construir una clasificación de los seres vivos.

El microscopio es un instrumento que permite aumentar una imagen un número determinado de

veces. Existen dos grandes tipos de microscopios, el microscopio óptico (de luz o campo claro) y el
microscopio electrónico (de electrones). El microscopio óptico fue el instrumento que llevó al
descubrimiento de la célula, mientras que el microscopio electrónico, dado su enorme poder de
resolución, permitió establecer una descripción detallada de las estructuras subcelulares (organelos
celulares).

El microscopio óptico funciona en base a lentes de vidrio convergentes, que como su nombre lo
indica, provocan que los rayos de luz converjan en un punto, al cual se le llama foco. Al lograr que
un número de rayos de luz que normalmente veríamos separados, enfoquen en nuestra retina,
podemos percibir esa imagen como una ampliación de la imagen real. Dependiendo de si el
microscopio posee un lente o un conjunto de lentes, se le llamará microscopio óptico simple o
microscopio óptico compuesto, respectivamente.

El microscopio óptico simple ha quedado obsoleto y el compuesto es actualmente el más utilizado.

Su sistema óptico posee un lente condensador (que concentra la luz), una serie de lentes objetivos
(cerca del objetivo a estudiar) con diferentes aumentos (usualmente 4x, 10x, 40x y 100x) y uno o
dos lentes oculares (cerca de los ojos) que generalmente proporcionan un aumento de 10x. Si el
microscopio posee sólo un lente ocular se llamará microscopio monocular, mientras que si tiene
dos se llamará microscopio binocular. Los términos de aumento se expresan en x, de tal forma que
un aumento de 10x significa que una imagen está aumentada 10 veces. El aumento total del
microscopio es el producto de los aumentos del lente objetivo más el lente ocular.

Actividad 1: Partes del microscopio y su función.

Lee cuidadosamente la tabla que se presenta a continuación, y con ayuda del video” hazte una
idea general del funcionamiento del microscopio.
https://www.youtube.com/watch?v=caTTL5zxwH0 , luego completa los cuadros nombrando sus
partes.

Parte del microscopio función

Fuente de luz Ampolleta que proporciona los rayos de luz
Lente condensador Concentra los rayos de luz
Diafragma iris Regula la cantidad de luz que llega a la muestra
Platina y pinza Sostienen la placa a observar
Controles x e y Mueven la placa en los ejes x e y
Tornillo macrométrico Mueve la platina hacia arriba o hacia abajo, permite el enfoque grueso de la muestra
Tornillo micrométrico Permite el enfoque fino de la muestra
Lentes objetivos Proporcionan diferentes grados de aumento (4x, 10x, 40x y 100x)
Revólver Sostiene los lentes objetivos y permite rotarlos
Lente ocular Proporciona una magnificación de 10x
Actividad 2: Uso correcto del microscopio óptico. El microscopio de campo claro tiene una serie de
reglas que debes seguir para su correcto uso. Debes asegurarte que el microscopio esté en
condiciones óptimas antes de empezar a trabajar con él, luego, debes lograr el enfoque de la
muestra a diferentes aumentos, y finalmente debes dejar el microscopio en un estado de reposo
adecuado para la mantención del equipo y para fututos usuarios.

A continuación, se enumeran los pasos que debes seguir para el correcto uso del microscopio, léelos
cuidadosamente, observa los videos y vuelva a leer los pasos.

https://www.youtube.com/watch?v=LXbWgRwXFPk

https://www.youtube.com/watch?v=1-oHFpF9j5U
https://www.youtube.com/watch?v=QBDHzLu_cy0

1. Debes asegurarte que el objetivo de menor aumento o lupa esté en el eje óptico del
microscopio. Si no es así, colócalo en su sitio. Comprueba el sonido metálico que indica que
está en su lugar. Si el condensador es ajustable y se observarán muestras teñidas, asegúrate
de que esté arriba (cercano a 2 mm de la platina) y con el filtro azul puesto (el filtro azul es
un dispositivo que selecciona los rayos de luz más cercanos al azul).
2. Prende el microscopio. Sube la intensidad de la luz si ésta es regulable y abre el diafragma.
 3. Pon la placa sobre la platina. Desplázala por la platina y sujétala con la pinza. Si la placa está
sucia, límpiala antes de ponerla. Asegúrate de colocar la muestra con el cubreobjetos hacia
arriba (lámina de vidrio delgada).
4. Centra la muestra con los controles x e y. Pon la parte coloreada o el lugar donde se
encuentra la muestra en el eje óptico del microscopio (lugar por donde pasa la luz). Cierra
un poco el diafragma para no encandilarte.
5. Mirando lateralmente, utiliza el tornillo macrométrico para acercar la platina hasta casi
tocar la preparación (respetando al menos unos 3mm) o bien hasta que la platina llegue a
su tope.
6. Mira a través del ocular o los oculares. Si es un microscopio binocular y es la primera vez
que miras por él, ajusta la distancia interpupilar (que cada ocular quede alineado con tu
pupila), cuando lo hayas hecho verás un único campo centrado, de lo contrario verás dos.
Con el tornillo macrométrico aleja lentamente la platina del objetivo. En una determinada
posición, el espécimen aparecerá en foco.
7. Con movimientos finos del micrométrico ajusta el foco a tus ojos. Utiliza para tu observación
la parte central del campo visual. Centra el espécimen si es necesario y ajusta el diafragma
(o mueve el condensador) de forma que obtengas una iluminación adecuada (campo claro
con iluminación homogénea, si es una muestra al fresco obtén el mayor contraste posible).
8. Para pasar a un aumento mayor, gira el revólver, hasta colocar el siguiente objetivo en el
eje óptico. Realiza nuevamente el enfoque fino con el micrométrico. No utilices el tornillo
macrométrico con los objetivos de 10x y 40x, para evitar romper la muestra o dañar los
lentes.
9. Procura no pasar al objetivo de 100x a menos que lo indique tu tutor. El uso de este objetivo
necesita la colocación de una gota de aceite de inmersión y una manipulación
extremadamente cuidadosa para evitar romper la muestra y dañar el lente.
10. Al finalizar tus observaciones, apaga la luz del microscopio (baja la potencia) y deja el
microscopio en posición de reposo:
a. Con el objetivo de menor aumento en el eje óptico.
b. Con el condensador en la posición más alta.
c. La platina en su posición más baja.
d. El carro atrás centrado y apegado al brazo del microscopio.
e. Si es oportuno, dejar el microscopio en el centro de la mesa (cuida levantarlo y evitar
los golpes o vibraciones, ya que son equipos calibrados).

Actividad 4: Simulación del uso del microscopio. Ya ha revisado los pasos esenciales para usar el
microscopio en forma correcta, ahora prueba ensayar esos pasos usando un programa
computacional que simula un microscopio real. Este link
https://www.ncbionetwork.org/iet/microscope/
contiene un tutorial. Revisa cuidadosamente todos los pasos y posteriormente ensaya enfocar
distintas muestras hasta el objetivo de 40x.
https://www.youtube.com/watch?v=6haJAHZ3_h0
https://www.youtube.com/watch?v=BdxgtHjLkXE&t=547s
https://www.youtube.com/watch?v=J6EHXJE7KkA

Una vez finalizada esta actividad, ya estarás preparado(a) para realizar tu actividad práctica. Te
recordamos repasar tanto las clases como tu guía resumen, de manera de llegar preparado(a) y que
la actividad sea provechosa, fluida y de un valor integral.

IRE/2023

14/02
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRONÓMICAS
DEPARTAMENTO DE PROTECCIÓN VEGETAL

MANUAL DE
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
ANIMAL

DOCENTES:
Licda. Rosmery Erroa
Licda. M.V.Z. Francis Alvarenga

EDICIÓN Y DISEÑO:
Licda. Rosmery Erroa
Lic. M.V.Z. Rudy Ramos

Ciudad Universitaria, febrero de 2022

Manual de Laboratorio de Microbiología Animal

Cuarta edición revisada

© Todos los derechos son propiedad de los editores
El Salvador, San Salvador 2017
PRESENTACIÓN

La microbiología es una ciencia cuyo estudio es relativamente joven frente a otras como la
química o las ciencias exactas, no obstante, su progreso en los últimos siglos ha comprendido
un despliegue de descubrimientos que se han acompañado del desarrollo de técnicas
especializadas, las cuales permiten ahondar en el conocimiento y su aplicación en diversos
campos asociados a la medicina, biotecnología, agroindustria, entre otros.
A pesar de todos los adelantos los procedimientos básicos siguen teniendo su frescura de
vigencia, conocerlas y dominarlas responde a la necesidad del ejercicio científico, ya que todas
las carreras de las ciencias naturales se relacionan con la microbiología, pues los
microorganismos nos han acompañado siempre, –aunque hasta hace algunas centurias lo
advertimos con claridad– juegan su papel y estamos en contacto con ellos para bien y para
mal.
El Manual de Laboratorio de Microbiología Animal abarca las técnicas básicas que en la
microbiología se ejercen, e incluye prácticas de laboratorio orientadas a la especialidad
veterinaria, que además de velar por la salud animal también se involucra en la vigilancia de
alimentos de origen animal.
Esperamos que este manual sea utilizado con la conformidad que debe a su carácter técnico,
ya que así será posible que ayude al alumno en su desempeño dentro de la cátedra y el
laboratorio, además invitamos que se hagan las observaciones que consideren pertinentes a
fin de mejorarlo.

Los Editores
PROGRAMACIÓN DE LABORATORIOS DE
MICROBIOLOGÍA ANIMAL CICLO I-2023

FECHA NOMBRE DE LA PRÁCTICA PÁG.

Febrero P-1 1-7
21 Preparación y manejo de medios de cultivo.
28 P-2 8-18
Técnicas para el estudio de las bacterias.
P-3 19-26
Marzo 07 Técnicas para el aislamiento de microorganismos, Coloración de
esporas y cápsula.
14 P-4 27-32
Distribución de los microorganismos en el ambiente y flora animal
normal
21 PRIMER EXAMEN PARCIAL DE LABORATORIO

P-5 33-43
Acción de los agentes físicos y químicos sobre los microorganismos, y
antibióticos.
P-6 44-48
Estructura y morfología de los hongos.
P-7 49-58
Fisiología bacteriana. Enzimas bacterianas.
P-8
Microbiología del Rumen.
SEGUNDO EXAMEN PARCIAL DE LABORATORIO 59-66

P-9 67-75
Análisis microbiológico del agua.
P-10 76-83
Análisis microbiológico de alimentos.
P-11 84-89
Cocos piógenos.

TERCER EXAMEN PARCIAL DE LABORATORIO

iv
 INTRODUCCIÓN.
El trabajo en un laboratorio de Microbiología requiere técnicas, aparatos, y destrezas
determinados, ya que se trata de manipular con seguridad seres vivos microscópicos, algunos
de ellos potencialmente patógenos.
Las prácticas de laboratorio incluidas en este manual ofrecen indicaciones básicas sobre
cómo manipular y trabajar con microorganismos con seguridad, observarlos y cultivarlos, así
como obtenerlos en cultivo puro y poderlos identificar.
El curso de Microbiología Animal se ha diseñado para los estudiantes de nivel III de
Licenciatura en Veterinaria y Zootecnia, y cuenta con 5 Unidades Valorativas.
Tiene una duración de 16 semanas y comprende: clases teóricas, laboratorios, así como
trabajos ex-aula.

OBJETIVOS.
I. En el área de los conocimientos (Objetivos Cognoscitivos). Que el alumno:
1. Enliste y describa las características generales de los microorganismos.
2. Comprenda y explique los ciclos biológicos de los agentes bacterianos causantes de
enfermedades en animales.
3. Integre sus conocimientos para establecer la interacción que existe entre el huésped,
agente etiológico y medio ambiente en el origen de las enfermedades animales.
4. Emplee su conocimiento sobre los agentes bacterianos y de las enfermedades que
causan, para seleccionar la muestra clínica, para el acertado diagnóstico.

II. En el área de los hábitos y actitudes (Objetivos Formativos):

1. Fomentar en el alumno la honestidad y el sentido de responsabilidad
2. Que aplique sus conocimientos teóricos en su futura práctica profesional.
3. Fomentar el deseo de superación continua, cultivando él habito de la consulta
bibliográfica en libros y revistas científicas, así como la lectura crítica de los mismos,
como parte de su aprendizaje.
4. Aprender a trabajar en grupo, a exponer y debatir en forma critica el material de
apoyo en las diferentes actividades de la asignatura.
5. Fomentar en el estudiante la disponibilidad de dar lo mejor de sí mismo en el desarrollo
de las tareas asignadas.

METODOLOGÍA.
Habrá tres clases teóricas por semana, así como una práctica de laboratorio de tres horas
de duración, con tres exámenes prácticos.
Cada alumno deberá de leer, y estudiar a profundidad el componente teórico, así como los
procedimientos descritos en la práctica correspondiente se elegirán al azar 5 o 6 estudiantes,
según el contenido de la práctica, los cuales expondrán una parte del contenido total del
desarrollo de la práctica, lo anterior corresponderá a su nota de exposición, al final de los 4
laboratorios por computo, todos los alumnos tendrán una nota de exposición asignada.
Los exámenes pre y post laboratorio, los parciales y el examen final, deberán ser
respondidos con tinta azul o negra, no se admitirá respuestas a lápiz ni con bolígrafo de color
rojo. Las preguntas en los exámenes parciales teóricos serán de complementar, selección
múltiple y apareamiento.
Con la finalidad de que cada estudiante aprenda del error se hará revisión de cada examen
parcial, y será el día de la entrega de las notas. En esta actividad el estudiante solo podrá hacer

v
uso de lápiz negro para anotar las respuestas correctas. En el caso de la sumatoria o respuestas
equivocadas, podrá anotarla en la primera hoja del examen en la parte superior de la misma.
El examen en los casos anteriores será devuelto al coordinador quien hará las correcciones
pertinentes. No se admitirán reclamos posteriores a la revisión. La revisión y resolución
de cada parcial se hará en hora día, en coordinación con el representante del curso.
La asistencia y participación a las actividades de la asignatura es obligatoria, y
responsabilidad de cada estudiante. Las inasistencias, deberán ser justificadas y respaldadas
con la debida documentación, según sea el caso.

vi
NORMAS QUE REGULARÁN EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA ANIMAL.

I. PARA LOS ALUMNOS.

1. Para proteger a usted, prevenir la contaminación y lograr un desarrollo óptimo del
curso, cumpla con las siguientes reglas de disciplina y bioseguridad:
2. Asistir puntualmente a las clases y prácticas de laboratorio.
3. La asistencia a las prácticas es obligatoria.
4. Desarrollar un trabajo a conciencia, para obtener un máximo aprovechamiento.
5. Iniciar su trabajo ex aula desde el inicio de la asignatura, lo que permitirá finalizarlo y
entregarlo en los tiempos establecidos.
6. Entregar sus trabajos ex aula el día que corresponda.
7. No se deben emitir gritos, ni hablar innecesariamente en clases y laboratorio.
8. No realizar tareas de otras materias durante el desarrollo de las prácticas.
9. No se permite abandonar la clase o laboratorio sin permiso de su instructor.
10. Llevar al laboratorio una libreta de anotaciones para realizar esquemas y tomar algunas
notas complementarias a su manual o guía.
11. Llevar el material que se solicita para cada una de las prácticas de laboratorio.
12. Hacer un uso adecuado y eficiente del equipo de laboratorio, limpiarlo y guardarlo en
el lugar correspondiente, después de usarlo.
13. Al finalizar la práctica, es necesario que usted deje limpio su sitio de trabajo en el
laboratorio.
14. No se permitirá la visita de otras personas cuando se esté realizando la práctica, excepto
en caso especial se le concederá permiso al estudiante para que solvente su problema
fuera del laboratorio.
15. Deberá existir respeto a profesores y compañeros.
16. Los teléfonos celulares y equipos de sonido deberán permanecer apagados durante las
clases y laboratorios
17. Usar en todo momento un lenguaje decoroso y comportarse correctamente en todo
momento de trabajo, y dentro del aula de clases.
18. El estudiante deberá usar gabacha gris en su trabajo de laboratorio.
19. El vestuario debe de ser adecuado (no shorts o pantalones cortos, no camisetas sin
mangas, no pantalones rotos ni ropa que muestre parte de su cuerpo, no gorras)
20. Antes de comenzar y después de haber terminado el trabajo de laboratorio, limpie su
mesa con un desinfectante. Es importante que lave bien sus manos con agua y jabón
antes de retirarse.
21. No se permite fumar, comer o beber, ni masticar chicle durante las clases o laboratorios.
22. No hablar al momento de hacer inoculaciones, ni destapar las cajas que contengan
cultivos lejos del área de seguridad.
23. Mantenga sus manos lejos de la boca, ojos, nariz, no maquillarse
24. Cuando se le derrame un cultivo, cúbralo inmediatamente con desinfectante y
posteriormente límpielo con papel toalla.
25. No sentarse sobre las mesas, bromear o escupir en el suelo del laboratorio.

II. PARA LOS DOCENTES.

 Puntualidad en el inicio y finalización de clases como en el laboratorio.
 Responsabilidad en record de notas de las mesas asignadas
 Responsabilidad en el buen desarrollo de las prácticas dirigidas o bajo su
responsabilidad

vii
 Cuido y manejo del equipo y cristalería por los alumnos asignados a su cargo, si es
cristalería los alumnos tendrán que reponer lo quebrado
 Cumplir con la fecha establecida para la entrega de notas de su respectiva mesa a los
alumnos y coordinación de la cátedra.

viii
 PRÁCTICA
PREPARACIÓN Y MANEJO DE
1 MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos para su crecimiento y reproducción requieren un medio de cultivo
adecuado que pueda proporcionarles elementos tales como Nitrógeno, Carbono, Fósforo,
minerales, vitaminas, etc., indispensables para su desarrollo. Diferentes tipos de medios son
usados para el crecimiento de bacterias y hongos.
Algunos microorganismos son capaces de sintetizar sus nutrientes si disponen de los
elementos básicos, éstos crecen en medios sencillos conocidos como medios basales; otros son
más exigentes y necesitan sustancias adicionales en el medio, tales como sangre, levaduras o
suero. Estos se conocen como medios enriquecidos.
Los requerimientos nutricionales de muchos microorganismos son desconocidos, por lo
tanto, no pueden ser cultivados en el laboratorio. Los medios de cultivo al momento de usarse
deben de estar completamente estériles y esto se logra con el uso del autoclave.

OBJETIVO.
Capacitar al alumno en la preparación de medios de cultivo y manejo de algunas técnicas
básicas como esterilización, llenado de tubos de ensayo y cajas de Petri.

MATERIALES POR LADO DE MESA QUE TRAERÁ EL ALUMNO.

 Guante de cocina.  Algodón.
 Gasa.  Mascarilla.

MATERIAL QUE SE LE PROPORCIONARÁ EN EL LABORATORIO

 Medios de cultivo.  Tubos de ensayo.
 1 Probeta de 100 mL  Papel aluminio.
 1 beacker de 250 mL  Balanzas de triple brazo.
 1 beacker de 100 mL  Espátulas.
 1 erlenmeyer de 250 mL  Trípode.
 1 erlenmeyer de 125 mL  1 malla de asbesto.
 Placas de Petri.  Autoclave.
 Pipeta y pipeteador.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Nota: Revisar clase teórica composición de medios de cultivo, tipos y variedades de medios
de cultivo

PROCEDIMIENTO.
I. Preparación de un medio de cultivo sólido o tipo gel, 75 mL. de medio por lado de mesa.
a) Disolución.
1. Solicite el frasco comercial a su instructor.
2. Mediante regla de tres haga el cálculo correspondiente de la cantidad a pesar según
la formulación del medio asignado, consulte a su instructor (a).

9
 3. Pese la cantidad indicada de medio de cultivo según indicación del frasco comercial.
4. Con la probeta mida la cantidad de agua a utilizar.
5. En un erlenmeyer del doble de volumen diluya la porción pesada, en una pequeña
cantidad de agua (1/3), mezcle y agregué el resto del agua, homogenice
completamente, tapar con algodón y gasa para evitar evaporación.
6. Caliente y lleve a ebullición durante 1-2 minutos en mechero o hot plate (agitador
magnético). Otros se calientan en baño maría según indicación; deberá agitarse de
vez en cuando para que la disolución sea uniforme. El medio estará disuelto cuando
ya no haya formación de grumos y se observe transparente y no turbio.
7. Terminada la cocción haga la distribución de medio como lo indica el fabricante y
según su uso, ya sea en erlenmeyer, tubos o cajas petri.
8. Para tubos de ensayo llene con la cantidad de medio hasta la mitad del tubo, tápelo
con su respectivo tapón. El sobrante déjelo en el erlenmeyer.
9. Para cajas distribuya en cajas de Petri estériles 15 ml cerca del mechero y use
mascarilla (solo para medios de cultivo que no requieran autoclavado).

b) Esterilización.
1. Esterilice en la autoclave (Figura 1-1 y 1-2), usando una temperatura de 121 grados
Centígrados y 15 lbs. de presión por pulgada cuadrada durante 15 minutos o por
filtración (Figura 1-3), según indicaciones comerciales.
2. Terminada la esterilización, incline los tubos para que al solidificar se les forme el
bisel. Guarde en refrigeración.
3. No calentar excesivamente el medio. La exposición prolongada a temperaturas
elevadas durante tiempo prolongado podría alterarlo.

II. Preparación de un Medio de cultivo tipo solución (caldo nutritivo). 50 mL. de medio por
lado de mesa (5 alumnos).
1. Pese la cantidad del medio deshidratado según la cantidad según el frasco (use
regla de tres) o la cantidad que le indique su instructor (a).
2. Disuelva en 50cc. de agua destilada, ligeramente tibia.
3. Con pipeta agregue 3 mL de medio a los tubos de ensayo.
4. El sobrante déjelo en el erlenmeyer.
5. Tápelos de igual manera que los anteriores.
6. Esterilice en autoclave a 15 lb de presión durante 15 minutos. Guarde en el
refrigerador.

NOTA: Si los tubos no tienen tapón, taponéelos con algodón, según indicaciones de su
instructor(a).

III. Llenado de cajas de Petri.

Después de esterilizar el medio de cultivo y las cajas de Petri, proceda al llenado de éstas.
Existen dos métodos:
1. Se vacían aproximadamente 15 mL, de medio contenido en el erlenmeyer, dentro de una
caja de Petri. Tapar. Dejar solidificar a temperatura ambiente, cerca de un mechero de
Bunsen del cual se debe estar separado una distancia no mayor de 25 cm. de la llama
(área de seguridad). Su instructor (a) le explicará cómo sostener, abrir, cerrar y manejar
las placas de Petri. Las placas de Petri con el medio ya solidificado deberán guardarse en
bolsas de plástico dentro del refrigerador.

10
 2. Identifique los medios preparados en caja petri por la parte interna de la caja, ponga
fecha y almacene en bolsas plásticas en el refrigerador.

NOTA: No todos los medios se verterán en las cajas ya que el procedimiento de

esterilización es largo. Coordine con su instructor para realizarlo después.

IV. Observar los diferentes medios de cultivo proporcionados, su estado estéril e inoculado,
anote su formulación y compare entre ellos si son basales, selectivos, diferenciales o
cromógenos, y sus cuidados para su preparación y almacenamiento en el laboratorio.

V. Preparación de medio Agar sangre.

1. Preparé el medio agar sangre (base) de acuerdo a las instrucciones del fabricante
(pesado, disolución y esterilizado).
2. Deje enfriar el agar sangre (base) a 50-45°C.
3. Agregue con cuidado la cantidad de sangre de acuerdo a la cantidad de medio
preparado (5-8%).
4. Mezcle agitando suavemente para mezclar, evitando la formación de burbujas.
5. Llenar las cajas según el apartado III.

CUESTIONARIO.
1. ¿Cuál es la diferencia entre un medio de cultivo natural y uno sintético?
2. ¿Qué es el agar y para que se emplea?
3. ¿Cómo prepararía un Agar Papa Dextrosa, si no tuviera el medio comercial formulado?
Explique el proceso completo
4. ¿Explique brevemente cuál es la diferencia entre el proceso de esterilización en autoclave y
en el horno?
5. ¿Qué medidas deberán tomarse para evitar al máximo, la contaminación de los medios de
cultivos preparados?
6. Elabore un flujograma de los medios que preparó en el laboratorio según la figura 1-4.
7. Porque es importante medir el pH de los medios de cultivo.
8. ¿Por qué es necesario preparar los medios de cultivo con agua destilada o desmineralizada?
9. Anote dos ejemplos de medios de cultivo que requieran su esterilización por filtración

BIBLIOGRAFÍA.
ATLAS, R. M. 1995. Principles of microbiology. Mosby-hear, Book, Inc. St. Louis, Missouri.
COLLINS, C. H. 1969. Métodos microbiológicos. Editorial Acribia, Zaragoza, España.
BURROWS, W. 1965. Métodos de microbiología. Editorial interamericana, S. A., México.
LYNCH, M. J. 1967. Métodos de Laboratorio. Editorial Interamericana, S. A., México.

11
 Sterilmatic Autoclave
Localicé cada uno de los indicadores del
modelo Sterilmatic Autoclave
1. Destape la autoclave levantando la
palanca de contrapuerta y seguridad
hacia arriba
2. Revise que el agua se encuentre
cubriendo el nivel indicado por el
fabricante
3. Coloque el material a esterilizar.
4. Tape el autoclave cerrando con la
palanca de seguridad girando hacia
adentro
5. Seleccione que proceso que realizará:
esterilización de líquido o instrumentos
6. Coloque la temperatura y el tiempo de
esterilización.
7. El autoclave encenderá
automáticamente cuando haga la
programación respectiva.
8. Cuando la temperatura alcance 100ºC,
se observará desprendimiento de vapor
en la parte trasera (agua a ebullición),
9. Cuando el proceso está en marcha
(temperatura y presión determinadas se
han alcanzado) se enciende la luz
indicadora FIGURA 1-1. Sterilmatic Autoclave.
10. Espere a que la presión llegue a cero,
para abrir el autoclave.
11. Retire el material estéril y saque el agua del autoclave.
12. Tiempo aproximado para una esterilización de 25 minutos.
13. Si al momento del proceso enciende el indicador LOW WATER, apagar el autoclave,
ponerle más agua e iniciar nuevamente.
14. Si nota alguna anormalidad, llame al instructor
15. Si tiene alguna duda; PREGUNTE.

12
 Yamato Sterilizer SQ500
Localicé cada uno de los indicadores del
modelo Yamato Sterilizer SQ500
1. Destape el autoclave desplazando la
palanca de seguridad a derecha y
después levantando la compuerta.
2. Revise que el agua se encuentre
cubriendo el nivel indicado por el
fabricante. Revisar también el nivel de
agua del depósito donde se enfría el
vapor.
3. Coloque el material a esterilizar.
4. Tape el autoclave cerrando con la
palanca de seguridad desplazándola a la
izquierda.
5. Seleccione que proceso que realizará:
esterilización, fundición, etc.
6. En el panel de control programe la
temperatura y tiempo deseado
7. Presione “START” para que inicie el
proceso.
8. En el panel de control se leerá “END”
cuando el proceso haya terminado y
pueda abrirse la compuerta del
autoclave.
9. Retire el material estéril.
10. Tiempo aproximado para una
esterilización: de 1 hora y 25 minutos. FIGURA 1-2. Yamato Sterilizer SQ500
11. Si nota alguna anormalidad, llame al
instructor
12. Si tiene alguna duda; PREGUNTE.

13
FIGURA 1-3. Esterilización de medios de cultivo mediante filtración Millipore.

14
FIGURA 1-4. Flujograma de preparación de medios de cultivo

15
 PRÁCTICA
TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO
DE LAS BACTERIAS

TINCIONES.
Las bacterias pueden ser estudiadas por medio de la observación al microscopio, una vez
que el microorganismo sea coloreado. Este procedimiento permite determinar la forma, color,
tamaño y agrupación de las bacterias.
Para la coloración se preparan frotis, que son extendidos de muestras de cultivos
bacterianos o de especímenes de procesos infecciosos en un portaobjeto limpio y
desengrasado, secados con calor suave y coloreado con diversos métodos de tinción. Se
necesitan 106 microorganismos por ml. para encontrar por lo menos uno por campo con el
objetivo de inmersión (100x).
Las bacterias pueden teñirse con una amplia variedad de colorantes, tales como Azul de
metileno, cristal violeta, fucsina (roja), y safranina (roja). Los dos métodos más importantes:
La técnica de Gram y la técnica del alcohol-ácido resistente, emplean coloración, decoloración
y tinción de fondo (coloración de contraste) para lograr la clasificación de la bacteria de acuerdo
a su afinidad específica por los colorantes. Los colorantes se combinan químicamente con el
protoplasma bacteriano. El método, sin embargo, es traumático y puede producir alteración.
Los colorantes más comúnmente usados son sales básicas, ya que la pared bacteriana es
positiva. La célula bacteriana es rica en ácidos nucleicos, los cuales portan cargas negativas en
forma de grupo fosfato; éstos se combinan con los colorantes básicos con carga positiva.
Los colorantes ácidos pueden ser usados para contrarrestar la acción de la tinción,
proporcionando el fondo de contraste.

TINCION DE GRAM.
Este método de coloración fue desarrollado, en forma empírica, por el patólogo danés Hans
Christian Gram en 1884.
Las bacterias fijadas al portaobjeto por el calor son teñidas con un colorante básico (cristal
violeta o violeta de genciana) el que es captado en forma similar por todas las bacterias. Luego
se aplica una solución de yodo o Lugol, que actúa como mordiente (fijación) del cristal violeta.
En este momento del proceso, todas las bacterias se tiñen de violeta. Posteriormente, las
bacterias son tratadas con una mezcla de alcohol-acetona (70:30) para la decoloración del
frotis. Las bacterias Grampositivas retienen el complejo cristal violeta-yodo, permaneciendo de
color violeta; las Gramnegativas se decoloran completamente por el alcohol.
Por último, se aplica un colorante de contraste (como la safranina, que es un colorante
rojo); de esta manera, las bacterias Gramnegativas, previamente decoloradas, toman el color
de la safranina (rojo).
La tinción de Gram depende principalmente del espesor de la pared celular y de su
permeabilidad cuando es tratada con alcohol o la mezcla de alcohol-acetona.
La pared celular de las bacterias Grampositivas contiene grandes cantidades de ácidos
teicoico y teicurónico, los cuales forman el 50% del peso de la pared. La pared celular de las
bacterias. Gramnegativas contienen tres componentes que yacen exteriores a la capa de
péptidoglucano: lipoproteína, membrana externa y lipopolisacárido.

16
 Existen otras teorías sobre el fundamento de la coloración de Gram, para lo cual se les
recomienda revisar la bibliografía.

OBJETIVOS. Que el estudiante:

 Observe y describa la forma, color, tamaño y textura de las colonias de las bacterias
suministradas.
 Aprenda a hacer un frotis de bacterias.
 Compare la coloración de las bacterias con azul de metileno y el método de Gram.
 Observe el movimiento bacteriano.

MATERIALES POR LADO DE MESA.

CULTIVOS EN PLACAS DE TSA: Frascos gotero con:
 Staphylococcus epidermidis.  Azul de metileno.
 Escherichia coli.  Safranina.
 Bacillus subtilis.  Verde malaquita.
 Vibrio sp.  Set de colorantes para Gram.
CULTIVOS EN TUBO CON CALDO:
 Escherichia coli (caldo TSC).  Láminas porta-objetos de 3x1 pg.
 Streptococcus sp (caldo BHI).  Tubo con solución salina 0.85%.

MATERIALES POR LADO DE MESA QUE TRAERÁ EL ALUMNO.

 Lupa.  Guantes.

PROCEDIMIENTO.

Morfología macroscópica de las colonias.

Observe las características macroscópicas de las colonias bacterianas que se le han
proporcionado (color, textura, dimensiones, bordes superficie). (Figura 2-1).

Preparación de un frotis bacteriano.

Encienda el mechero: Escoja tres láminas porta objeto de 3 x 1 pulgadas y límpielas
adecuadamente con papel absorbente; flaméelas ligeramente. Identifique a cada una de ellas
de acuerdo a la bacteria a utilizar y colóquelas cerca del área del mechero.

Prepare los frotis.

Esterilice el asa bacteriológica (Figura 2-2), déjela enfriar; sostenga el asa. Con la mano
izquierda o según convenga, tome el tubo que contiene la solución salina 0.85% estéril.
Destápelo y, flamee ligeramente la boca del tubo introduzca el asa en la solución y retírela sin
tocar la pared interna del tubo. Flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y colóquelo en el
lugar correspondiente. Deposite la cantidad de solución salina de 0.85% que trae el asa en el
centro de la superficie de uno de los porta-objetos seleccionados. Si a su criterio o al de su
instructor la cantidad de solución salina es muy pequeña, repita el proceso.
Tome una de las cajas con crecimiento bacteriano a usted asignadas y destápela cerca del
área del mechero y con el asa estéril, obtenga una pequeña muestra de una de las colonias y
homogenícela con la solución salina, depositada en el porta-objeto, extienda la muestra de
manera de que, el tamaño del extendido, cubra aproximadamente 1cm. de diámetro en la

17
superficie del porta objeto. Repita el proceso con las otras bacterias proporcionadas (Figura 2-
3). Esterilice el asa. Colóquela en su lugar.
Deje secar los frotis a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. Una vez secos, flamee
ligeramente la parte inferior del mismo, pasándola sobre la llama del mechero de 2 a 3 veces
de manera de que, el calor absorbido por éste, no lesione ni queme el dorso de su mano.
Coloque sus frotis en una bandeja para colorear.

Nota: Siempre tenga en mente de que, en los frotis fijados al calor, queda una buena
cantidad de bacterias vivas; esto constituye para el operador, una fuente indiscutible de
infección, razón por la cual se le recomienda, guarde todas las precauciones necesarias para
evitar contaminaciones indeseables.

Técnica para colorear los frotis.

Las coloraciones deben efectuarse en bandejas metálicas usualmente destinadas para ello.
Estas contienen soportes de metal o vidrio para sustentar los porta objetos y sirven para
recoger el exceso de colorantes, reactivos o agua de lavado, los cuales deben ser descartados
en el resumidero inmediatamente después de verificada la coloración.

Coloración con azul de metileno o Coloración Simple (Figura 2-4).

1. Cubra el frotis con la solución de azul de metileno o verde malaquita durante un minuto.
2. Decante el colorante dentro de la bandeja.
3. Lave suavemente por goteo con agua del chorro de manera que estas deslicen sobre
la superficie de frotis.
4. Escurra y seque cuidadosamente con papel absorbente.
5. Observe su preparación al microscopio utilizando los objetivos 4x, 10x, 40x y 100x.
6. Dibuje y esquematice lo que observe en sus campos microscópicos.

Coloración con Gram (Figura 2- 5).

1. Cubra los frotis con cristal violeta (solución alcohólica) Manténgalo así durante un
minuto, decante el colorante.
2. Lave el exceso por goteo con agua y escurra
3. Cúbralo con solución de Lugol para Gram durante un minuto, decante el reactivo.
4. Lave suavemente con agua de chorro, escurra.
5. Remueva el exceso de colorante del frotis, utilizando de 3 a 4 gotas de alcohol-
acetona e inmediatamente, lave con agua del chorro procurando que esta deslice
suavemente sobre la superficie del frotis; (esto evitará la excesiva decoloración o la
remoción completa del complejo cristal violeta- Lugol de aquellas bacterias que son
Grampositivas).
6. Cubra la preparación con solución de safranina durante 30 segundos.
7. Decante el colorante, lave con agua de chorro, escurra.
8. Seque cuidadosamente la preparación; obsérvela al microscopio como antes.
9. Esquematice y dibuje lo que observe.
10.Interprete sus resultados.

Dibuje los microorganismos observados. Anotar morfología (Figura 2-6), coloración y

nombre científico de los microorganismos.

Movilidad bacteriana.

18
 Las bacterias pueden ser examinadas en “estado vivo” por medio de la preparación en gota
pendiente a partir de una suspensión bacteriana de E. coli. Las bacterias suspendidas en la
excavación del portaobjeto se mueven libremente.
La movilidad se determina observando el movimiento bacteriano con el mayor aumento del
microscopio.
Demostración del movimiento bacteriano por gota pendiente.

1. Cubre-objetos con vaselina en los

bordes. Se coloca una gota de la
suspensión bacteriana en el centro del
cubre-objeto.

2. Colocar el cubre-objeto invertido sobre la

concavidad del portaobjeto. Presionar el
cubre-objeto sobre el porta-objeto

3. La gota del cubre-objeto debe quedar

suspendida.

Nombre de Forma Disposición Reacción al Gram

microorganismo

19
Microorganismo ___________________ Microorganismo ___________________ Microorganismo ___________________

Macroscopía Macroscopía Macroscopía

______________________ ______________________ ______________________

Microspcopía _____________________ Microspcopía _____________________ Microspcopía _____________________

Microorganismo ___________________ Microorganismo ___________________ Microorganismo ___________________

Macroscopía Macroscopía Macroscopía

______________________ ______________________ ______________________

Microspcopía _____________________ Microspcopía _____________________ Microspcopía _____________________

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál de las dos coloraciones (simple y Gram) es la más usada para el diagnóstico
microbiológico? y ¿Por qué?:
2. ¿Cocos Grampositivos en racimo pertenecen al género?
3. ¿Bacilos Grampositivos en cadena pertenece al género?
4. ¿Bacilos (coco bacilos) gramnegativos pertenecen al género?
5. ¿Bacilo curvado en forma de coma, pertenece al género?

BIBLIOGRAFÍA
Jawetz, E. et al. Microbiología Médica, 16ª ed. El Manual Moderno, SA, 1999 (OPS)
Carter, R. Bacteriología y Micología Veterinaria. Manual moderno, edición 1998.
Pedro N. Acha; Zoonosis y enfermedades transmisibles al hombre. Vol. I.

20
FIGURA 2-1. Morfología macroscópica de las colonias.

FIGURA 2-2. Esterilización del asa de cultivo

21
 FIGURA 2-3. Preparación de frotis bacteriano a partir de un cultivo en medio
sólido.

22
FIGURA 2-4. Coloración simple.

23
FIGURA 2-5. Coloración de Gram.

24
FIGURA 2-6. Morfología microscópica de algunas bacterias.

25
FIGURA 2-7. Coloración de Ziehl Neelsen o alcohol ácido resistente.

26
 PRÁCTICA TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS,
3 REPIQUE DE BACTERIAS;
COLORACIÓN DE ESPORA Y CÁPSULA

INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos en la naturaleza se encuentran formando comunidades en las cuales
no existe un solo tipo de microorganismos. Las bacterias u otros microorganismos que se
desarrollan en medios de laboratorio se llaman cultivos. Cuando en el medio de cultivo se
desarrollan dos o más tipos de microorganismos, estamos ante la presencia de un cultivo mixto,
si por el contrario, crece un solo tipo de microorganismos; esto se conoce como un cultivo
puro.
En el estudio de los microorganismos, es esencial usar un cultivo puro y que el medio que
se emplee sea estéril. Para obtener y mantener un cultivo puro, debe ser empleada una técnica
que no permita la introducción de contaminantes. El repique de bacterias consiste en trasladar
un cultivo a un nuevo medio de cultivo con el objeto de mantenerlo puro o de proporcionarle
nuevos nutrientes a los microorganismos.
La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que envuelve la pared celular de
algunas bacterias. Está compuesta de polisacáridos, mucopolisacáridos o polipéptidos. A
consecuencia de su elevado contenido en agua, se tiñen débilmente por los colorantes. Por
ello, algunas técnicas colorean el fondo de la preparación, destacando sobre él las cápsulas sin
teñir.
Las esporas son la forma de resistencia de las bacterias. Tienen forma esférica u oval. Al
microscopio, las esporas sin teñir se observan como gránulos brillantes. Según su localización
en la célula, se distinguen tres tipos de esporas: centrales, situadas en el centro de la célula,
subterminales, próximas al extremo y terminales, situadas en el extremo.

OBJETIVOS. Capacitar al estudiante en:

 El aprendizaje de las técnicas más empleadas para la obtención de colonias aisladas
de microorganismos.
 El mantenimiento de cultivos puros de microorganismos.
 La realización de la coloración de cápsula y espora.

MATERIALES (Por grupo de trabajo).

MEDIOS DE CULTIVO: CULTIVOS:
 5 tubos con caldo nutritivo.  Escherichia coli.
 5 tubos con TSA o agar nutritivo.  Bacillus subtilis.
 5 cajas de Petri con TSA.  Klebsiella sp.
 Staphylococcus epidermidis.
COLORANTES: VARIOS:
 Safranina.  Microscopios compuestos.
 Verde de malaquita.  Asas bacteriológicas.
 Cristal violeta acuosa 1%.  Porta objetos.
 Sulfato de cobre acuoso 20%.  Aceite de inmersión.
 Tinta china negra.  solución salina 0.85%.
 Bandejas de coloración

27
  Mecheros.

PROCEDIMIENTO: (Esta práctica deberá realizarse individualmente).

I. REPIQUE DE BACTERIAS.
Existen diferentes técnicas, de acuerdo a la naturaleza del medio de cultivo en el que se
hará la transferencia.

Nota: la práctica de repique NO lo hará con Klebsiella sp por razones de seguridad.

a) REPIQUE A CALDO NUTRITIVO (Figura 3-1).

1. Transfiera una porción de cada uno de los cultivos que se le han proporcionado a
medios estériles, de acuerdo a la siguiente técnica:
2. Tome el cultivo con la mano izquierda.
3. Asegure el asa como si fuese un lápiz. Esterilícela en la llama del mechero.
4. Quite el tapón y manténgalo entre el meñique y la palma de la mano derecha.
Flamee la boca del tubo. Tome el inóculo, flamee de nuevo la boca del tubo, tápelo
y colóquelo en una gradilla.
5. Transfiera la asada de cultivo (que contiene la bacteria) a un caldo estéril y agite
suavemente el asa dentro de éste.
6. Flamee la boca del tubo. Tápelo
7. Esterilice de nuevo el asa.

b) REPIQUE A MEDIO SÓLIDO EN TUBO.

1. Proceda igual que en a), hasta el numeral 3.
2. Transfiera una asada del cultivo a un tubo de TSA inclinado (bisel)
3. Introduzca el asa hasta el fondo del tubo y retírela suavemente, deslizándola sobre
la superficie hasta la punta y haciendo un pequeño zig zag sin herir el medio (Figura
3-2).

NOTA: Los 2 procedimientos anteriores se usan para el mantenimiento de cultivos puros.

c) REPIQUE A CAJA DE PETRI (Figura 3-3).

1. Transfiera una asada de cultivo sobre la superficie del medio cerca de la pared de
la caja de Petri.
2. Distribuya el inóculo frotando la superficie del medio con el asa, con cuidado para
no herirlo. Existen varias técnicas para hacer la siembra (ver esquemas)
3. La tapa de la caja es levantada solo parcialmente para evitar la contaminación con
microorganismos del aire. Su instructor(a) le explicará con más detalle.

*Identifique cada una de sus siembras con la siguiente información.

 Nombre del Microorganismo.
 Las iniciales de su nombre.
 Fecha.

28
II. COLORACIÓN DE CÁPSULA POR EL MÉTODO DE ANTONI.
1. Prepare un frotis con Lactobacillus spp o Escherichia coli.
2. Seque al aire libre y no fije a la llama.
3. Coloree con cristal violeta (solución acuosa) 2 minutos.
4. Lavar la preparación con una solución de SO4CU.
5. Seque al aire en posición vertical, examine la preparación con lente de inmersión.

II. PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN DE CÁPSULA POR EL MÉTODO DE TINTA CHINA

(Figura 3-4).
1. Coloque una gota de tinta china en una lámina 3x1”.
2. Coloque dos asadas de Klebsiella pneumoniae o Lactobacillus ssp en la lámina y
mézclela adecuadamente con la gota de tinta china.
3. Con ayuda de una lámina extienda la gota. Su instructor le dirá como hacerlo.
Descarte la lámina que utilizó para extender el frotis adecuadamente.
4. Dejar secar cerca del área del mechero y fijar cuidadosamente en el mechero.
5. Coloree durante un minuto con una solución de safranina al 1%.
6. Lavar con agua corriente y dejar secar.
7. Examine la lámina bajo el objetivo de inmersión ye esquematice sus resultados.

III. COLORACIÓN DE ESPORAS BACTERIANAS POR EL MÉTODO DE SHEAFFER Y

FULTON (Figura 3-5).
1. Prepare un frotis con Bacillus subtilis (cultivo de 5 días). Fije a la llama.
2. Cúbralo con solución de verde de malaquita. Encienda la mecha de algodón
impregnada de alcohol y caliente hasta emisión de vapores durante 3 minutos. No
deje que el colorante llegue a sequedad. Deje enfriar durante 10 minutos.
3. Lave con agua durante 20 segundos.
4. Cubra la preparación con Safranina durante 30 segundos. Lave con agua, seque y
observe con lente de inmersión (100x).

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el objeto de cultivar las bacterias en cajas de Petri?
2. Ventajas y desventajas de cultivar los microorganismos en medio sólidos en tubo.
3. Cuál es el objeto de realizar repiques de los cultivos cada 24 horas.
4. Diferencias entre cápsula y espora bacteriana, ¿cuál es su localización en la célula
y cuál es la función de cada estructura?

BIBLIOGRAFÍA:
LYNCH, M. J. 1967. Métodos de laboratorio. Ed. Interamericana, S. A., México.

29
ESQUEMATICE RESULTADOS

Bacteria:
_____________________________

Color:
_______________________________

Forma: ______________________________

Cápsula:
_____________________________

Bacteria:
_____________________________

Color:
_______________________________

Forma: ______________________________

Cápsula:
_____________________________

Bacteria:
_____________________________

Color:
_______________________________

Forma: ______________________________

Cápsula:
_____________________________

30
FIGURA 3-1. Repique a caldo nutritivo.

FIGURA 3-2. Repique a medio sólido en tubo.

31
(a) Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero. (b) Introducirla en la suspensión
bacteriana para recoger una muestra. (c) Sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido
en una placa Petri. (d) Volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un
segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez,
hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. (e) Después de la
incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso
entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.

FIGURA 3-3. Repique a caja de Petri.

32
 La suspensión bacteria-tinta es
Una asada del microorganismo extendida sobre el portaobjeto Flamee el frotis cuidadosamente
es mezclada en una pequeña gota con ayuda de un portaobjeto para fijar la bacteria al
de tinta china negra limpio. Dejar secar al aire portaobjeto.

Cubra el frotis con colorantes Lavar cuidadosamente la Dejar secar el frotis a

de Safranina al 1% por 1 Safranina al 1% con agua de temperatura ambiente. Examine
minuto chorro el frotis con el objetivo de
inmersión

FIGURA 3-4. Procedimiento de tinción de cápsula por el método de tinta china.

33
FIGURA 3-5. COLORACIÓN POR EL MÉTODO DE SHEAFFER Y FULTON.

34
 PRÁCTICA DISTRIBUCIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE

4 Y MICROBIOTA NORMAL DE LOS

ANIMALES
(DOS SESIONES DE LABORATORIO)

INFORMACIÓN.
I. Tres son los elementos del ambiente a ser tomados en cuenta para fines de esta práctica;
éstos son: el suelo, el agua y el aire.
El suelo representa el principal reservorio de los microorganismos del ambiente. En él se
encuentran las concentraciones más grandes y más variadas, los más sencillos y los más
complejos y además, alberga a un número significativo de microorganismos de interés en la
patología de las enfermedades del hombre y de los animales.
El agua también contiene un número grande de bacterias provenientes del suelo y de los
animales. De ella, se obtienen microorganismos de las nieves, aguas termales, fuentes
naturales de agua dulce y en especial, de ríos y quebradas contaminadas por el hombre;
lugares en los cuales, éste deposita sus desechos.
El aire actúa como vehículo. En éste, los microorganismos no se multiplican y constituye
una de las principales fuentes de infección. El aire libre está sobrecargado. En este encontramos
un ambiente saturado desde unos pocos centímetros por sobre el nivel del suelo, hasta una
altura próxima a los 7,000 metros, en donde todavía se encuentra a algunos de ellos; a mayor
altura, el aire enrarecido, la desecación y los rayos ultravioleta, se encargan de destruirlos. El
aire confinado es más dañino; de él se obtienen frecuentemente microorganismos que se han
adherido a partículas de polvo, moco o saliva provenientes de personas enfermas o portadores
de algunos microorganismos.

II. La microbiota normal de los animales, comprende a una población permanente de

microorganismos, que varía tanto en número como en clase de un sitio a otro en el
organismo. Durante la gestación y bajo condiciones normales, el feto se encuentra libre de
gérmenes, excepción que se hace cuando algunos agentes atraviesan la barrera
placentaria. Durante el parto y después de éste, el animal recién nacido se expone a la
flora de las vías genitales de la madre, sean estos o no miembros de la flora normal; a la
flora cutánea, oral y respiratoria tanto de la madre como de las personas que los cuidan y
los microorganismos del ambiente. Varias semanas después, éste, ha adquirido una flora
selectiva con la cual es capaz de convivir. El ambiente ocasionalmente le suministra
gérmenes, los cuales no lo colonizan debido a que no les proporciona un hábitat favorable;
aunque algunos, ocasionalmente puedan ser aislados del cuerpo del animal y cultivados en
el laboratorio.
Normalmente, muchos sitios del organismo animal son estériles un ejemplo es la sangre por
el contrario, las áreas, mucosas o tejidos que tienen comunicación con la piel, se encuentran
pobladas por gérmenes.
Si para fines de estudio de tipo bacteriológico, se obtiene una muestra de un área específica
de piel o mucosa de un animal y se inocula una parte de la muestra en un medio de cultivo
adecuado, se incuba a 37º C bajo condiciones de aerobiosis y simultáneamente, se utiliza parte
de la muestra para analizarla bajo condiciones de anaerobiosis, se pueden observar dos
fenómenos: En la primera muestra, se observará el hallazgo de un grupo específico de
microorganismos aeróbicos; mientras que en la segunda, el grupo de microorganismos que

35
prevalecerá, estará constituido por anaerobios facultativos y tal vez, por algunos saprófitos. En
piel, pueden encontrarse ocasionalmente algunos saprófitos, anaerobios y levaduras. En la
boca y en el intestino ocurre el mismo fenómeno.

PRÁCTICA DE LABORATORIO.
Esta práctica, ha sido diseñada para demostrar la presencia de los microorganismos en el
ambiente; así como también en los animales, utilizando para ello técnicas convencionales de
laboratorio. Para ello, se analizarán muestras tomadas de diferentes sitios del medio ambiente,
como son: aire, agua de charco, tierra de jardín. Así mismo constatarán la presencia de
microorganismos provenientes de diferentes áreas anatómicas del cuerpo del animal. (Oído,
piel, boca, ano, prepucio).

OBJETIVOS. Que el estudiante:

 Constate la presencia de los microorganismos en el ambiente.
 Conozca la existencia de los microorganismos de algunas áreas o regiones anatómicas
de los animales.
 Describa la morfología de las colonias bacterianas, de hongos; la forma microscópica
de las bacterias y su reacción a la coloración de Gram. Establezca diferencias.
 Se capacite en el uso adecuado de los micrómetros, con la finalidad de medir
estructuras de microorganismos.

MATERIAL QUE TRAERÁ EL ESTUDIANTE.

 Agua de charco.
 Muestras biológicas: hisopado de boca, oído, piel, genitales (prepucio, vulva, recto),
de un animal doméstico, aves u otro animal. La muestra se traerá en un tubo
conteniendo hisopo y medio de transporte AMIES o Cary Blair
 Un frasco de boca ancha (tipo gerber) con tierra de jardín.
Nota: Si su mascota se hecha en el jardín, tome de esa tierra.

MATERIAL A SUMINISTRAR.
 Placas de Petri con TSA o Agar  Bolsa con pipetas Pasteur estériles.
nutritivo  Bulbos de hule.
 Placas de Petri con medio de acuerdo  Láminas portaobjetos y cubre-objeto.
a la naturaleza de la muestra.  Set de coloración de Gram.
 Tubo con solución salina 0.85%.  Aceite de inmersión.
 Hisopos estériles.  Microscopio.

SESIÓN No. 1 (Primer día).

Prepare frotis del agua de charco, la tierra y del hisopado (uno de los medios de trasporte),
y realice coloración de Gram. También proceda en cada muestra según las siguientes
instrucciones:
1. Aire. Quite la tapadera a una de las placas de Petri con TSA y deje expuesta la
superficie del medio de cultivo al ambiente, durante un período de 30 a 60 minutos.
Tape, rotule o identifique con lápiz graso o tirro, sobre la superficie externa de la
parte de la caja que contiene el medio expuesto.

36
 2. Agua (charco). a) Agite brevemente el frasco que contiene el agua de charco,
déjelo reposar. Esterilice el asa, déjela enfriar. Con el asa estéril, obtenga una
muestra (inóculo) del agua de charco y deposítela sobre la superficie del medio de
cultivo y realice el método de siembra en estrías. Rotule e identifique la placa.
b) Coloque una gota del sedimento del agua de charco entre lámina y laminilla y
obsérvela al microscopio con objetivo 10 y 40X, en busca de microorganismos de
vida libre.
3. Tierra de jardín. Obtenga una pequeña muestra de tierra de jardín, esterilice el
asa y humedézcala en solución salina estéril. Destape una de las cajas con TSA y
coloque la muestra sobre el medio de cultivo, siembre por el método de estrías.
Rotule e identifique.
4. Hisopado de animal. Con uno de los hisopos inoculará en los medios de cultivo
proporcionados según el tipo de muestra. Pregunte a su instructor.
5. Testigo. Rotule una placa con TSA como testigo.
6. Incubación. Lleve las placas a la incubadora, acomode en posición invertida,
permanecerán entre 18 a 24 horas bajo condiciones de aerobiosis, a 36  1ºC.

CALIBRACIÓN DEL MICROSCOPIO.

Para conocer el tamaño de los microorganismos que se observan es necesario calibrar el
microscopio; esto se hace haciendo uso de un micrómetro ocular, que posee una escala con
valor desconocido y un micrómetro objetivo con una escala con valor conocido.
La calibración se hace dándole valor a la escala del ocular por comparación con la escala
del objetivo.

Procedimiento.
1. Quite el lente ocular del microscopio y sustitúyalo por el lente que contiene el
micrómetro ocular
2. Coloque el micrómetro objetivo en la platina del microscopio
3. Encienda el microscopio y enfoque la escala contenida en el micrómetro objetivo
4. Usando el objetivo 10X, haga coincidir la primera línea de la escala del ocular con
cualquiera de las líneas del objetivo de la siguiente manera:

Micrómetro ocular:

Micrómetro objetivo:

5. Observe hacia la derecha de ambas escalas. Fíjese donde coincida exactamente

una línea del ocular con una línea del objetivo; en este caso observamos que 8
divisiones del micrómetro ocular caben en una división del micrómetro objetivo,
cada división del micrómetro objetivo mide 0.1 mm; por comparación de ambas

37
 escalas 8 divisiones del ocular miden 0.1, una división equivale a 0.012 mm;
haciendo la conversión a micras = 12 micras.
6. Quite el micrómetro objetivo y en su lugar coloque la preparación y mida el tamaño
de las estructuras observadas.
7. Este cálculo o calibración es válido si usted está trabajando con el 10X, para cada
lente objetivo de su microscopio debe calibrar y repetir los cálculos
correspondientes.
8. Repita la calibración con el objetivo 40X y anote los cálculos en su libreta de
apuntes.

SESIÓN No. 2 (segundo día)

MATERIAL A SUMINISTRAR POR CADA LADO DE MESA

 Tubos con solución salina 0.85 %.  Portaobjetos.
 Set de coloración de Gram.  Microscopio.

PROCEDIMIENTO
1. Retire las placas de la incubadora y observe si hay crecimiento en ellas
2. Con la ayuda de su instructor, realice el examen macroscópico de las mismas, note
las características morfológicas de dos de las colonias mejor observadas realice
coloración de Gram. Anote sus resultados, describa forma, color tamaño relativo y
consistencia de las colonias escogidas. Discuta sus resultados.

38
Macroscopía Macroscopía
________________________________________ ________________________________________

Microspcopía Microspcopía
_______________________________________ _______________________________________

Macroscopía Macroscopía
________________________________________ ________________________________________

Microspcopía Microspcopía
_______________________________________ _______________________________________

Macroscopía Macroscopía
________________________________________ ________________________________________

39
Microspcopía Microspcopía
_______________________________________ _______________________________________

40
 SESION No. 2

Reporte los resultados obtenidos.

1- Medio ambiente.
Elementos Examen macroscópico Examen microscópico
colonia + a ++++ (gram)
1) Aire
2) Agua de Charco
3) Tierra de Jardín

2- Microbiota normal de los animales

Elementos Examen macroscópico Examen microscópico
colonias + a ++++ (gram)
1) Oídos
2) Fosas nasales
3) Piel
4) Hisopado rectal
5)
6)
7)
8)

CUESTIONARIO
1. Defina los conceptos:
a) Infección
b) Enfermedad
2. ¿Qué diferencia existe entre infección y enfermedad?
3. Defina y cite ejemplos de microorganismos:
a) Oportunistas:
b) Facultativos:
c) Estrictos:
d) Saprófitos

BIBLIOGRAFÍA
MURRAY, et. al., Flora microbiana en la salud y la enfermedad. Capítulo 8. Pág. 78. En:
Microbiología médica. 2ª edición, Harcourt Brace, 1997
JAWETZ, E. et. al., Flora microbiana normal del cuerpo humano, Capítulo 11, pág. 199, En:
Microbiología Médica, 15ª edición. Manual Moderno, México, 1996.
ZINSSER, et. al. Microbiología. 20ª edición. Editorial Panamericana. México 1994.

41
Licda Idalia Erroa
Medios de cultivo
Preparación de agar
El volumen de agua destilada
Volumen del Erlenmeyer

Volumen exacto
 Preparación del medio de cultivo
Calentamiento para disolución
del polvo

Siempre lo primero es leer las Pesaje de la cantidad exacta

instrucciones del fabricante para el volumen a preparar
 Esterilización en autoclave

Autoclavar 121 °C a 15 lb de presión por 15

min
Verificar la esterilización con cinta testigo

Disuelto completamente , sin Ya autoclavado el agar o caldo son

grumos listo para esterilizar completamente transparentes
Autoclave : Vapor húmedo

Uso de cinta testigo en cada

proceso de esterilizado
Variables de funcionamiento del autoclave
(Ver manual de laboratorio)
 Dispensar en tubos o cajas

Dejar enfriar hasta 45-55

°C y verter en cajas o
tubos
Debidamente rotulados

Cajas Petri se rotulan en

la base
Almacenamiento
Después de ser esterilizados se guardan
en refrigeración según indicaciones de
fabricante, hasta su uso
 Guardar en bolsas plásticas debidamente
rotulados con fecha de preparación,
nombre el medio
Entre 4 – 8 °C durante un mes, mientas no
muestren deshidratación
Vida útil recomendada un mes
Después de usarlo contienen bacterias
vivas y deben ser esterilizados en
autoclave para lavado de material ya sean
tubos o caja Petri de vidrio
Material descartable : también debe
esterilizarse antes de descarte
Tripticasa Soya agar (TSA)
Clasifique el medio de cultivo ____________
Haga cálculo para preparar 725 ml :_______

Clasificar el medio según su uso:

Especifique en que lo distribuirá después de

autoclave _ _________________________
Tripticasa Soya Caldo (TSC)
40 g de polvo para 1 L

Prepare 42 tubos con 10 ml cada uno

Realice el cálculo
Explique como procederá para prepararlo y
esterilizarlo

Clasifique el medio de cultivo según su uso

Agar XLD : Selectivo y diferencial
Agar MacConkey Selectivo y diferencial

Colonias lactosa positiva Colonias lactosa negativas

Caldo Lactosado
Caldo Lactosado
Caldo lactosado
Calcule la cantidad a pesar para preparar 50
tubos de 10 ml

13 g para 1L

Clasificar el medio de cultivo

Almacenamiento de los caldos
Se almacenan en gradillas para evitar
deterioro
Rotular
 Preparación de agar base sangre
Agar base esterilizado _____sangre de carnero estéril________ se agrega al 5% ____ homogenizar y llenar en cajas Petri esteriles
Preparación de agar base sangre
Nombre completo:
Clasificación según su uso :
Que tipo de microrganismos se aíslan:
Colocar cajas inoculadas y explicar el
fundamento

Preparar 500 ml (hacer el cálculo)

Numero de cajas que obtendrá con el

volumen preparado
Agar TCBS : Investigar
Colocar aquí la caja Petri Nombre completo:
Clasificación según su uso :
Que tipo de microrganismos se aíslan:
Colocar cajas inoculadas y explicar el
fundamento

Preparar 500 ml (hacer el cálculo)

Numero de cajas que obtendrá con el

volumen preparado
Agar Müller Hinton : Investigar
Colocar aquí la caja Petri Nombre completo:
Clasificación según su uso :
Que tipo de microrganismos se aíslan:
Colocar cajas inoculadas y explicar el
fundamento

Preparar 500 ml (hacer el cálculo)

Numero de cajas que obtendrá con el

volumen preparado
Agar Dextrosa Saboraud : Investigar
Colocar aquí la caja Petri Nombre completo:
Clasificación según su uso :
Que tipo de microrganismos se aíslan:
Colocar cajas inoculadas y explicar el
fundamento

Preparar 500 ml (hacer el cálculo)

Numero de cajas que obtendrá con el

volumen preparado
Método de Filtración : para no desnaturalizar
los componentes
Proceso :
Cuestionario:
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PRÁCTICA TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS BACTERIAS

COLORACION DE GRAM , CAPSULA , ESPORA , ALCOHOL ACIDO

RESISTENTE Observación microscópica de bacterias
Un solo
colorante

Observación microscópica
de bacterias
IDALIA ERROA
MICROBIOLOGÍA ANIMAL
Varios colorantes y
reactivos

Fundamento de coloración Gram Preparaciones húmedas o fresco

El estudio "en fresco" se desarrolló cuando Preparación húmeda
Las bacterias fijadas al portaobjeto por el calor son teñidas con un colorante básico (cristal todavía no se habían inventado la fijación y la
violeta o violeta de genciana) el que es captado en forma similar por todas las bacterias. Luego tinción.
se aplica una solución de yodo o Lugol, que actúa como mordiente (fijación) del cristal violeta.
En este momento del proceso, todas las bacterias se tiñen de violeta. Posteriormente, las
bacterias son tratadas con una mezcla de alcohol-acetona (70:30) para la decoloración del frotis.
Las bacterias Grampositivas retienen el complejo cristal violeta-yodo, permaneciendo de color
violeta; las Gramnegativas se decoloran completamente por el alcohol. Un estudio “en fresco" es aquel que no
precisa un tratamiento en el que se maten
Por último, se aplica un colorante de contraste (como la safranina, que es un colorante rojo); de las células, como es la fijación o la inclusión.
esta manera, las bacterias Gramnegativas, previamente decoloradas, toman el color
Cubreobjeto

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Gota pendiente
Laminas excavadas Agrupación bacteriana

Formas de bacterias

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Describa la morfología macroscópica

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Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis

◦ Reacción al Gram : positiva
Forma: cocos
Forma: Bacilos
Agrupación o disposición : cocos
agrupados en forma de racimos Agrupación o disposición: En
cadenas o estreptobacilos
Reacción al Gram : positivos
(morados ) Género: Bacillus
Género: Staphylococcus
Especie : epidermidis

Bacillus subtilis Escherichia coli

Forma: Bacilo corto
Reacción al Gram : positiva (morado)
Agrupación o disposición : Irregular
Forma: Bacilos
Reacción al Gram : Gram negativos
Agrupación o disposición en cadenas o (color rojo)
streptobacilos
Género: Escherichia
Género: Bacillus

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Vibrio sp Streptococcus piogenes

◦ Forma: bacilos curvados
Forma: cocos
Agrupación o disposición : Irregular
Agrupación o disposición : cocos
Coloración : Gram negativo en cadena /estreptococos
Género: Vibrio Reacción al Gram : positiva
(morados)
Género: Streptococcus sp

Tinción de Ziehl-Neelsen
Tinción de cápsula :Tinta china o nigrosina
Reacción al Gram : no tiene
Forma: bacilo
Disposición o agrupación:
Irregulares
Género: Mycobacterium La cápsula no se colorea, el
centro de la bacteria se
colorea de rojo con la
safranina

Tinción indirecta se colorea el fondo de color negro

para observar la estructura

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Agar TCBS “Tiosulfato, citrato, sales

Coloración de esporas :Sheaffer y Fulton biliares y sacarosa”
Colonias de Vibrio cholerae creciendo

Microscopía : Las colonias de color amarillo

brillante tienen un diámetro de 2 a 3 mm y
están rodeadas por una coloración amarillenta
difusa del indicador en el agar de hasta 1 cm
de diámetro.

Comparación de Vibrio parahaemolyticus y choleare Reporte morfología macroscópica

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Microscopía : Descripción Reporte morfología microscópica

No se puede realizar, estamos observando

una macroscopia

Observación macroscópica de las

Describa lo observado siguientes bacterias : Describalas

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¿Qué tipo de cultivo es’ ._________________

Macroscopía de Bacillus subtillis Macroscopía de Bacillus subtillis

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Agar MacConkey Agar MacConkey

Según la utilidad o el uso

del medio de cultivo

Reporte que tipo de

colonias observa

Reporte lo observado Reporte lo observado

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Streptococcus pneumoniae Reporte lo observado:

Nombre de la coloración :
Morfología:
FORMA
AGRUPACIÓN
Distribución :
REACCIÓN AL GRAM
Género:
Reacción al Gram :

Coloración simple Reporte lo que observa :

Colorante azul de
metileno

Morfología:

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Reporte lo observado : Reporte lo observado :

Nombre de la tinción : Morfología:
Morfología:
Distribución :
Distribución :
Reacción al Gram :
Reacción al Gram :

Reporte lo observado : Tinción de cápsula : Antoni

Morfología: Morfología:

Distribución : Distribución :

Reacción al Gram : Reacción al Gram :

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Según lo observado reporte :

Nombre de la coloración.

Morfología:

Distribución :

Reacción al Gram :
Género:

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INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos en la naturaleza se encuentran formando comunidades en las cuales no
existe un solo tipo de microorganismos. Las bacterias u otros microorganismos que se
desarrollan en medios de laboratorio se llaman cultivos. Cuando en el medio de cultivo se
desarrollan dos o más tipos de microorganismos, estamos ante la presencia de un cultivo mixto,
si por el contrario, crece un solo tipo de microorganismos; esto se conoce como un cultivo puro.

En el estudio de los microorganismos, es esencial usar un cultivo puro y que el medio que se
emplee sea estéril. Para obtener y mantener un cultivo puro, debe ser empleada una técnica
M I CROBI OLOG Í A A NI M A L que no permita la introducción de contaminantes. El repique de bacterias consiste en trasladar
I DA L I A ER ROA un cultivo a un nuevo medio de cultivo con el objeto de mantenerlo puro o de proporcionarle
nuevos nutrientes a los microorganismos.
I -2023

Tipos de asas
Asa en L
micológica

Asa en aro
bacteriológica

Asa digralskly
Asa en punta o hilo

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Forma de tomar el tapón del tubo

Apertura de caja Petri cerca del

mechero

Técnica : Siembra en medio líquido Lectura: Por presencia de turbidez

Partículas suspendidas en el caldo

Tipos de crecimiento . Verificación

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Técnica : Estrías simple en tubo

Se toma el material con ansa en anillo

y se siembra en estrías en un tubo que
contiene agar pico de flauta o agar
inclinado, respetando las indicaciones
señaladas anteriormente.

Esta técnica constituye un medio

adecuado para el cultivo de
microorganismos aerobios y aerobios
facultativos.

Tubos con bisel : Resultado de inoculación

TSA : bisel en estría simple

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Tipos de crecimiento en bisel Técnica por punción

Se introduce el ansa en punta con el inóculo
en un tubo conteniendo agar en columna, sin
tocar las paredes del tubo y en forma
paralela asegurándose que el inóculo quede
distribuido a lo largo de toda la punción. Se
retira el ansa y se quema.

Esta técnica permite conocer el

comportamiento de los microorganismos
frente al oxígeno y su movilidad

Agar semi solido : MIO Semi solidos SIM Movilidad

Punción Inoculación con punción

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Siembra mixta : Estriado y punción Técnica por punción : Estriado en tubo

Siembra de TSI
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, con
aguja de inoculación inocular el medio de cultivo, picando el
Estriado simple fondo y extendiendo sobre la superficie del mismo llamada
punción mixta

Técnica: Estriado placa

El esterilizar el ansa de siembra disminuye la

cantidad de microorganismos que se extiende en
una superficie determinada. Una vez inoculadas las
placas se incuban en estufa durante 24 – 48 h, a la
temperatura adecuada según el microorganismo a
cultivar. Utilizando esta metodología de siembra se
obtienen colonias aisladas en las últimas estrías,
separadas unas de otras, permitiendo a partir de las
mismas la obtención de cultivos puros mediante
resiembra en otro medio de cultivo.

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Estriado en medio solido Siembra por

Tipos de estriado agotamiento
Con el asa en anillo cargada de material se realiza una serie de
estrías paralelas no superpuestas, sobre una tercera parte de la
superficie de la placa de Petri conteniendo el medio de cultivo.
Se esteriliza el ansa y se efectúan una serie de estrías en
dirección perpendicular a la anterior, comenzando en la zona
donde termina la última estría. Este procedimiento se repite
varias veces.

Técnica de placa vertida o siembra a Siembra difusión en placa : recuento de

profundidad : Recuento de UFC viables
Se pipetea un volumen de inóculo (generalmente 0,1
ml) y se deposita sobre la superficie de la placa de Petri
que contiene el medio de cultivo solidificado. Con una
espátula de Drigalsky estéril (previamente embebida en
alcohol, flameada y enfriada) se disemina la muestra
por toda la superficie, efectuando movimientos de
rotación hasta su completa absorción.

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Reporte el tipo de inoculación

Fondo del
bisel

¿Qué tipo de siembra observa? ¿Qué tipo de siembra observa? :

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Investigue : El tipo de inoculación o siembra en

cada tubo :
A____________________________________
B.____________________________________
C.____________________________________
D.____________________________________
E. ___________________________________

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1- Aire

MVZ FRANCIS ALVARENGA

LICDA. IDALIA ERROA

I- 2023

MBA113

2- Agua de charco 3. Tierra de jardín

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4. Hisopado Animal 5. Testigo

6 – Incubación
Resultados : Ambiente

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Resultados : Ambiente Resultados : Tierra

Resultados : Muestra hisopado Recto de

Resultados : Agua de charco bovino

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Muestra de recto de bovino Muestra hisopado de vagina de Panchita

Coloración de Gram Muestra : Vagina de bovino

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Micrómetro : Medición de los

Placa Testigo microorganismos

Micrómetro : Medición de los Micrómetro : Medición de los

microorganismos microorganismos