Tinciã - N Bacteriana I

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA SAN MARTÍN
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA
Laboratorio de Biología Celular y Molecular. 2023-II

PRÁCTICA DE LABORATORIO N°9 TÉCNICAS DE TINCIÓN BACTERIANA I:
TINCIÓN SIMPLE
INTRODUCCIÓN
La observación de bacterias con microscopía óptica, en un laboratorio de Microbiología, puede
realizarse por diferentes procedimientos como son la observación directa de microorganismos “in
vivo” o el tratamiento con colorantes mediante diferentes tipos de tinción, procesos dirigidos a
incrementar el contraste y por consiguiente a optimizar el resultado.
Los microorganismos, específicamente, las bacterias, pueden observarse directamente al microscopio
de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos
procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la
movilidad bacteriana. La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y
su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con
diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste.
En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos
extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite
preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor
o fijación química.
La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste
en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un
mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos, pero no las
estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehído y ácido acético entre
otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de
procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une a ciertas
estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la
presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del
color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que
establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces
covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el colorante se une
a la desoxi-ribosa.
Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que no penetran en las células, sino que
impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.
La observación microscópica de las bacterias nos permite diferenciar tres de las formas más típicas
que son: cocos, bacilos y espirales entre otras. A continuación, se presentan 2 tipo de técnicas de
observación de estos microorganismos:
1. Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan las bacterias vivas, lo cual hace
que podamos detectar con facilidad la movilidad en las que la poseen y su forma.
2. Preparaciones coloreadas: Como las bacterias son incoloras y tienen el mismo índice de
refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlas visualizar mejor. Los
métodos para observar bacterias, proporcionan las siguientes ventajas:
• Un contraste entre la bacteria y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar los tipos
morfológicos bacterianos.
• Una visualización de las estructuras internas y externas tales como: endospora, equivalente
nuclear, gránulos citoplasmáticos, pared celular, capsula y flagelo.
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las
anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada
positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros
colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica
y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen
un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así
los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala,
eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir
positivamente ciertos componentes como las proteínas.
OBJETIVOS
1. Conocer los métodos de tinción bacteriana.

2. Diferenciar las formas de acción de los colorantes o reactivos, sobre Ia célula.
3. Diferenciar las características morfológicas, de agrupación y de tinción de las bacterias
observadas al microscopio.
MATERIALES Y REACTIVOS:
✓ Colorantes (Azul de metileno, Cristal violeta, Carbol fucsina)
✓ 1 asa de inoculación
✓ 1 Mechero de alcohol
✓ 1 encendedor
✓ Cinta de rotular (DEBE PROVEER EL ESTUDIANTE)
✓ Marcador (Sharpie) (DEBE PROVEER EL ESTUDIANTE)
✓ Microscopio
✓ Puente de coloración
✓ Frasco lavador
✓ Aceite de inmersión
✓ Papel de arroz
✓ Papel toalla (DEBE PROVEER EL ESTUDIANTE)
✓ Azul de metileno
✓ Fuscina / Safranina
✓ Láminas o portaobjetos
✓ Cultivos en agar de 24 -72 horas
PROCEDIMIENTO
1. Preparaciones no coloreadas. (Preparación en fresco).
✓ Coloque una gota de solución salina sobre un portaobjetos

✓ Toque con el asa una colonia de cultivo seleccionada por el docente
✓ Haga con esta muestra una emulsión en la gota.
✓ Cubra la preparación con el cubreobjetos.
✓ Observe al microscopio con objetivos de 10X y 40X
✓ Haga esquemas y describa lo observado.
2. Preparaciones coloreadas
a. Con colorantes básicos. (Tinción simple o directa).
✓ Seleccione 3 colonias previamente aisladas
✓ Prepare en láminas separadas el frotis de cada microorganismo siguiendo el procedimiento
anterior
✓ Cubra los frotis con el colorante indicado, usando el tiempo de exposición adecuado para
cada uno (Carbol fucsina / safranina de 15 a 30 segundos, cristal violeta 20 a 60 segundos y
azul de metileno 1 a 2 minutos.
✓ Lave el frotis con agua de la llave para remover el exceso de colorante.
✓ Coloque la lámina o portaobjetos paralela al flujo de agua para reducir la perdida de
microorganismos.
✓ Seque los alrededores del frotis con papel toalla y deje secar el frotis al aire.
✓ Repita el procedimiento para cada organismo usando un colorante diferente.
✓ Examine cada tinción bajo el objetivo de inmersión.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Dibuje un campo representativo de cada organismo.
2. Describa la forma y arreglo del organismo.
PREGUNTAS
1. Investigue en que consiste la técnica de tinción negativa.

2. ¿Por qué los colorantes básicos son más efectivos para las tinciones bacterianas que los tintes
ácidos?
3. ¿Una tinción simple puede ser usada para identificar algo más que las características
morfológicas de un microorganismo? Explique.
4. Investigue los diferentes tipos de tinción utilizados en microscopia.
Bibliografía
• CURTIS – BARNES- SCHNEK. BIOLOGÍA. 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana

2008
• PURVES. Vida. La ciencia de la Biología. 8ª Edición. Editorial Médica Panamericana. 2009
• LODISH – BERK – MATSUDAIRA. Biología Celular y Molecular. 5ª Edición. Editorial
Médica Panamericana. 2005
• Jiménez, Luis F., Merchant, Horacio, BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR, Prentice-
Hall, 2003
• Karp, Gerald, BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. Segunda edición, Mac Graw-Hill
Panamericana. 2008.
• Tortora G, Funke B, Case C. Introducción a la microbiología. Novena Edición. Mac Graw-
Hill Panamericana. 2016

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1. Conocer los métodos de tinción bacteriana.

1. Preparaciones no coloreadas. (Preparación en fresco).

✓ Coloque una gota de solución salina sobre un portaobjetos

1. Investigue en que consiste la técnica de tinción negativa.

• CURTIS – BARNES- SCHNEK. BIOLOGÍA. 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana

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