Rev Lab Clin.

2015;8(1):8---18

Revista del Laboratorio Clínico

www.elsevier.es/LabClin

ORIGINAL

Aplicación de la secuenciación masiva de nueva

generación al diagnóstico molecular de la
hipercolesterolemia familiar
Estefanía Martínez-Barrios a , Ana Isabel Martínez-Puchol b , Alba Roset a ,
Daniel Zambón c , Joan Clària a,b,d y Montserrat Bernat a,∗

a
Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Centro de Diagnóstico Biomédico, Hospital Clínic, Barcelona, España
b
Institut d’Investigacions Biomèdiques, August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, España
c
Unidad de Lípidos, Servicio de Endocrinología, Hospital Clínic, Barcelona, España
d
Departamento de Ciencias Fisiológicas I, Facultad de Medicina, Universitat de Barcelona, Barcelona, España

Recibido el 19 de noviembre de 2014; aceptado el 3 de febrero de 2015

Disponible en Internet el 6 de marzo de 2015

PALABRAS CLAVE Resumen

Secuenciación de Introducción: La hipercolesterolemia familiar es una enfermedad autosómica dominante que
nueva generación; cursa con niveles plasmáticos elevados de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad.
Secuenciación La presencia de esta alteración en el metabolismo lipídico se asocia a un aumento del riesgo
Sanger; cardiovascular en los pacientes que la padecen, siendo de gran importancia la realización de un
Diagnóstico diagnóstico genético para ofrecer un tratamiento adecuado y disminuir la morbimortalidad. El
molecular; objetivo de este trabajo es describir la aplicación de la secuenciación de nueva generación al
Hipercolesterolemia diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar, en comparación con la secuenciación
familiar Sanger, la técnica convencional usada hasta el momento.
Material y métodos: Se analizaron 110 muestras de sangre venosa periférica procedente de
pacientes que presentaban cuadro clínico de hipercolesterolemia familiar mediante secuen-
ciación de nueva generación, utilizando un panel comercial que permite la identificación de
mutaciones en los genes LDLR, APOB, PCSK9 y LDLRAP1 (SEQPRO Lipo, Progenika) con la tecno-
logía GS JUNIOR 454 (Roche).
Resultados: Aplicando esta tecnología fue posible secuenciar los genes asociados a la
hipercolesterolemia familiar descritos hasta el momento en grupos de hasta 20 pacientes
simultáneamente. Se detectaron un total de 35 mutaciones en las 110 muestras analizadas,
localizándose el 94,29% en el gen LDLR. Todas las mutaciones identificadas fueron confirmadas
mediante el método de secuenciación Sanger.

∗ Autor para correspondencia.

Correo electrónico: mbernat@clinic.ub.es (M. Bernat).

http://dx.doi.org/10.1016/j.labcli.2015.02.001
1888-4008/© 2014 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.
NGS en hipercolesterolemia familiar 9

Conclusiones: La utilización de la secuenciación masiva de nueva generación permite la reali-

zación de un diagnóstico genético más rápido y un análisis molecular más eficiente de los genes
implicados en la hipercolesterolemia familiar con una fiabilidad similar a la técnica convencional
Sanger.
© 2014 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.

KEYWORDS Applicability of next generation sequencing to the molecular diagnosis of familial

Next generation hypercholesterolemia
sequencing;
Sanger sequencing; Abstract
Molecular diagnostic; Introduction: Familial hypercholesterolemia is an autosomal dominant disorder that causes
Familial increased levels of cholesterol associated with low density lipoproteins in plasma. The presence
hypercholesterolemia of altered lipid metabolism in these patients increases their level of risk of suffering from a
cardiovascular disease. The certainty of having this genetic disorder by making a timely and
precise molecular diagnostic is crucial for the appropriate treatment and the reduction of
the disease morbidity-mortality. The aim of this work is to describe the applicability of next
generation sequencing technology to the genetic diagnosis of familial hypercholesterolemia and
compare this novel method with the conventional Sanger sequencing method.
Material and methods: A next generation sequencing commercial panel (SEQPRO Lipo, Proge-
nika) was used to analyze 110 peripheral venous blood samples from patients with familial
hypercholesterolemia. This enables the assessment of mutations in genes associated with the
disease (e.g. LDLR, APOB, PCSK9 and LDLRAP1) with the GS JUNIOR 454 technology (Roche).
Results: Application of next generation sequencing enables the sequencing of the genes
involved in the familial hypercholesterolemias, described so far, in groups of 20 patients simulta-
neously. Using this novel technology, a total of 35 mutations were detected in the 110 analysed
samples, with 94.29% being located in the LDLR gene. Mutations were confirmed by Sanger
sequencing.
Conclusion: Next generation sequencing enables a quick genetic diagnosis and a more efficient
molecular analysis of all genes described so far to be involved in familial hypercholesterolemia,
with similar reliability to that of conventional Sanger sequencing.
© 2014 AEBM, AEFA y SEQC. Published by Elsevier España, S.L.U. All rights reserved.

Introducción La técnica más utilizada hasta el momento para la bús-

queda de mutaciones en el ADN es la secuenciación según
La hipercolesterolemia familiar (HF; OMIM#143890) es un el método Sanger10 . Aunque esta técnica presenta una alta
trastorno genético de herencia autosómica dominante del sensibilidad y especificidad, su rendimiento es insuficiente
metabolismo de las lipoproteínas con una prevalencia en para el cribado de la HF donde es preciso realizar un número
la población general alrededor de 1:500 para heterocigo- muy elevado de secuencias para establecer un diagnóstico
tos y 1:1.000.000 para homocigotos1 . Este trastorno está genético. Con el desarrollo de la secuenciación de nueva
caracterizado por un incremento en la concentración plas- generación («next generation sequencing» [NGS]) el ren-
mática del colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad dimiento de la secuenciación ha aumentado de manera
(cLDL), cursando a menudo con el desarrollo de xantomas, significativa ya que permite secuenciar de forma paralela
aterosclerosis, además de un elevado riesgo de presentar millones de fragmentos y a un coste mucho menor11,12 .
enfermedades coronarias prematuras2 . Se han descrito más La NGS permite la detección de mutaciones puntuales,
de 1.500 mutaciones responsables de HF en los genes LDLR, pequeñas deleciones e inserciones y variaciones en el
APOB, PCSK9, y LDLRAP1, la mayoría de ellas en el gen número de copias (CNV)13 . Estas características apuntan a
LDLR3---7 . la NGS como una herramienta eficaz para la realización del
El diagnóstico de la HF está basado en una combinación diagnóstico genético de la HF de forma rápida y econó-
de criterios clínicos, bioquímicos y genéticos8 que han per- mica sin renunciar a una alta especificidad, sensibilidad y
mitido establecer diferentes índices diagnósticos, siendo los precisión14,15 .
criterios de la red de clínicas de lípidos holandesa los más El objetivo de este trabajo es describir la aplicación de
utilizados en España9 (tabla 1). Este índice permite otor- la NGS para la búsqueda de mutaciones en pacientes con
gar una estratificación a los pacientes con HF en diagnóstico HF con el fin de evaluar la sensibilidad de la técnica, a la
de certeza (≥8 puntos), probable (6-7 puntos) y posible (3- vez que identificar las ventajas e inconvenientes que esta
5 puntos). pueda presentar en el flujo de trabajo en el laboratorio, en
10 E. Martínez-Barrios et al

Tabla 1 Criterios diagnósticos para la hipercolesterolemia familiar basados en la red de clínicas de lípidos holandesas
Historia familiar
Familiar de primer grado con enfermedad coronaria prematura (hombres 1
< 55 años y mujeres < 60 años)
y/o
Familiar de primer grado con niveles de cLDL > 210 mg/dl 2
Familiar de primer grado con xantomas tendinosos y/o arco corneal < 45 años
y/o
Familiar < 18 años con cLDL ≥ 150 mg/dl
Antecedentes personales
Paciente con enfermedad coronaria prematura 2
(hombres < 55 años y mujeres < 60 años)
Paciente con enfermedad cerebrovascular o arterial periférica prematura 1
(hombres < 55 años y mujeres < 60 años)
Examen físico
Xantomas tendinosos 6
Arco corneal < 45 años 4
Análisis de laboratorio
cLDL ≥330 mg/dl 8
cLDL 250-329 mg/dl 5
cLDL 190-249 mg/dl 3
cLDL 155-189 mg/dl 1
Análisis genético
Mutación funcional en el gen del LDLR, APOB o PCSK9 8
Diagnóstico de HF:
Certeza: ≥ 8 puntos; probable: 6-7 puntos; posible: 3-5 puntos
cLDL: colesterol de la lipoproteína de baja densidad.
Fuente: Alves et al.5 y Abifadel et al.6 .

comparación con la técnica convencional de secuenciación Metodología «next generation sequencing»

Sanger.
Se utilizaron 20 ␮L de ADN de cada muestra a una con-
Material y métodos centración de 20 ng/␮L para la amplificación mediante PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) de las diferentes
Pacientes incluidos en el estudio regiones de los genes: LDLR, APOB, PCSK9 y LDLRAP1. Para
ello se utilizaron los cebadores específicos contenidos en
el panel SEQPRO Lipo de Progenika (www.progenika.com),
Se incluyeron 110 pacientes que presentaban valores de alta
siguiendo las indicaciones del fabricante. Las condiciones de
probabilidad o certeza diagnóstica clínica de HF basados en
amplificación fueron de 94 ◦ C por 15 minutos; 23 ciclos de:
los criterios de la red de clínicas de lípidos holandesa, consi-
94 ◦ C por 30 segundos, 65 ◦ C por un minuto y 72 ◦ C por
derándose estos como casos índices. Estas muestras fueron
un minuto y una extensión final de 72 ◦ C por 7 minutos,
recogidas en el Hospital Clínic de Barcelona durante los años
utilizando el termociclador GeneAmp PCR system 9700 de
2012, 2013 y 2014 y la secuenciación de las mismas se rea-
Applied Biosystems. A partir del producto de la PCR
lizó en el Servicio de Bioquímica y Genética Molecular del
de amplificación (amplicones) se realizó una segunda
Centro de Diagnóstico Biomédico de este hospital.
PCR donde se añadieron las etiquetas identificativas (Mul-
tiplex Identifiers, MIDs) que permiten la identificación de
Extracción de ADN cada muestra según el paciente de origen. Las condicio-
nes de amplificación de esta segunda PCR fueron: 94 ◦ C
La extracción de ADN se realizó a partir de 1 ml de sangre por 15 minutos; 17 ciclos de: 94 ◦ C por 30 segundos,
venosa de forma automatizada con el extractor QIAsymp- 61 ◦ C por un minuto y 72 ◦ C por un minuto y una extensión
hony (QIAGEN) utilizando el kit QIAsymphony DSP ADN Kit final de 72 ◦ C por 10 minutos, utilizando el termociclador
(Ref. 931255) según el protocolo de la casa comercial descrito anteriormente. La correcta amplificación de las
(www.qiagen.com). La concentración y pureza de la mues- muestras se comprobó mediante visualización por electro-
tra de ADN fue evaluada mediante espectrofotometría con el foresis en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR.
Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). La concentración óptima Los amplicones fueron posteriormente purificados
de ADN requerida para la NGS se consideró 20 ng/␮L, con una mediante el kit Agencourt AMPure XP (Ref. A63880), el cual
pureza de entre 1,60-1,95 para OD260/OD280 y alrededor de permite la unión de los amplicones a bolas magnéticas y así
1,5 para OD260/OD230. eliminar el exceso de adaptadores y cebadores (Protocolo:
NGS en hipercolesterolemia familiar 11

000387v001). Una vez purificadas las muestras fueron cuan- Metodología Sanger
tificadas por fluorimetría usando el kit Quant-iT PicoGreen
(Ref. P11496) de ADN de doble cadena, en el equipo Synergy Con el fin de determinar la sensibilidad y fiabilidad de la
HT (BioTek). La concentración de las muestras en este paso NGS, todas las mutaciones encontradas fueron confirmadas
se consideró apta por encima de 10 ng/␮L. En base a las mediante la técnica convencional de secuenciación San-
concentraciones obtenidas, las muestras fueron diluidas ger. La amplificación del fragmento de interés fue realizada
hasta una concentración de 109 moléculas/␮L, a partir mediante una PCR clásica, usando dNTPs (Ref. 11969064001)
de la cual se realizó una mezcla de todas las muestras de y Taq Polimerasa (Ref. 11146165001) ambos de Roche y los
la carrera en un mismo tubo en una cantidad equimolar cebadores específicos de la región a amplificar con condi-
(pool de amplicones). El pool de amplicones se diluyó ciones de amplificación específicas para cada región. Estas
finalmente hasta una concentración de 106 moléculas/␮L. reacciones se llevaron a cabo en el termociclador GeneAmp
A continuación, se procedió a la clonación mediante PCR PCR system 9700. El producto obtenido fue purificado
en emulsión (emPCR). El objetivo de la emPCR es realizar para eliminar los cebadores y nucleótidos no incorporados,
una amplificación clonal de la librería para que la señal usando las EXCELAPURE 96-Well UF PCR Purification plates
sea detectable en la secuenciación16,17 . Para conseguir de EdgeBio (Ref: 36181). El producto purificado fue some-
esto, se realiza una emulsión de agua en aceite en la que tido a electroforesis en gel de agarosa al 2% para confirmar
se obtienen millones de microgotas aisladas por una fase que el tamaño del fragmento amplificado era el correcto.
lipídica, cada una de las cuales contiene los reactivos de A partir del producto purificado se realizó la PCR de
la PCR y una bola de captura («bead») unida a un único secuenciación usando el kit Big Dye Terminator v.3.1 (Ref.
amplicón de cadena sencilla. Cada micela de la emulsión 4337455) de Applied Biosystems, basado en el método San-
funciona como un microrreactor, dentro del cual tiene lugar ger, en el cual se incorporan nucleótidos dideoxido (ddNTPs)
la amplificación clonal. Las condiciones de amplificación marcados con fluorescencia a una nueva cadena de ADN
para la emPCR fueron de 94 ◦ C por 4 minutos; 50 ciclos de: sintetizada por una polimerasa. Estos ddNTPs carecen de
94 ◦ C por 30 segundos, 58 ◦ C por 4,5 minutos y 68 ◦ C por 30 uno de los grupos hidroxilo y al producirse dicha incorpora-
segundos, utilizando el termociclador GeneAmp PCR system ción se produce la terminación de la cadena, generando así
9700. Una vez finalizada la emPCR el producto final fue fragmentos de diferente longitud con el último nucleótido
recogido en un falcón de 50 mL donde se llevó a cabo la marcado10,20 . Una vez finalizada la PCR de secuenciación se
rotura de la emulsión, el lavado, la recuperación y el enri- realizó la purificación de los productos usando las PERFORMA
quecimiento de las beads cargadas de ADN. El resultado del DTR V3 96-Well Short Plates de EdgeBio (Ref: 63887) para eli-
enriquecimiento fue evaluado mediante GS Bead Counter minar los ddNTPs no incorporados y evitar interferencias en
y se confirmó un enriquecimiento de beads de entre 0,5 × el análisis.
106 y 2 × 106 en todas las carreras que se realizaron. A Finalmente, el producto obtenido fue cargado en un
continuación sobre un total de 0,5 × 106 beads se realizó secuenciador automático (Genetic Analyzer 3130XL, Applied
la ligación de los primers A y B para la secuenciación y Biosystems) para separar los fragmentos mediante electro-
se añadieron las beads con el ADN control. Todo ello fue foresis capilar. Este secuenciador produce una inyección
realizado con el kit GS Junior Titanium emPCR Kit Lib-A electrocinética para que las moléculas puedan entrar en el
(Ref. 05996520001) siguiendo las instrucciones de la casa capilar y migren por él hasta llegar al láser que se encarga de
comercial Roche (Protocolo: emPCR Amplification Manual excitar el fluorocromo. De esta manera, la cámara capta la
Lib-A). señal emitida transformándola en un electroferograma que
Finalmente, la secuenciación fue realizada utilizando los permite conocer la secuencia de la cadena20 .
kits GS Junior Titanium Sequencing Kit (Ref. 05996554001)
y GS Junior Titanium PicoTiter Plate Kit (Ref. 05996619001)
en el ultrasecuenciador GS Junior 454 siguiendo las indica- Resultados
ciones de la casa comercial Roche (Protocolo: Sequencing
Method Manual). Se utilizó el programa de secuenciación «Next generation sequencing»
de 200 ciclos para la obtención de secuencias de 400 bases
aproximadamente. El ultrasecuenciador GS Junior 454 tiene Se analizaron mediante NGS 110 muestras de pacientes con-
como principio la pirosecuenciación, técnica basada en la siderados casos índice de HF, utilizando la tecnología GS
liberación de los pirofosfatos que se producen durante Junior 454 de Roche. Las muestras fueron distribuidas en
la reacción de síntesis del ADN. Mediante una serie de 8 carreras de secuenciación obteniéndose un promedio de
reacciones enzimáticas los pirofosfatos son transformados 82.200 lecturas/carrera, el rendimiento de las cuales fue
en un haz de luz que es detectado por una cámara CCD de hasta 40 Mb con una cobertura por región de 80-100x,
y las señales son procesadas por un sistema de análi- siendo la cobertura mínima aceptada en las regiones con
sis de datos que permite la identificación de todos los variantes de 15x. Los controles de calidad usados para vali-
nucleótidos incorporados a la cadena en cada ciclo de la dar cada carrera fueron los siguientes; la obtención de un
secuenciación, permitiendo así conocer la secuencia de mínimo de 70.000 lecturas (Passed Filter Wells) con una
estudio16---19 . media de 360 bases de longitud (Length Average), (fig. 1),
Una vez finalizada cada carrera de secuenciación se una longitud de los ADN control superior a 515 (control tipo
revisó el control de calidad de las secuencias siguiendo los I) y 520 bases (control tipo II), (fig. 2A y B) y un porcen-
parámetros establecidos por la casa comercial Progenika y taje de lecturas fallidas (Failed: % Dot ± Mixed) y de corta
se prepararon las muestras para el análisis bioinformático longitud (Failed: % Short) no superior al 12 y al 50%, respec-
por parte del especialista. tivamente (fig. 3). Todos estos parámetros fueron superados
12 E. Martínez-Barrios et al

Figura 1 Resultados del control de calidad (lecturas con filtros superados y longitud) de la librería de amplicones obtenida con
el kit SEQPRO Lipo, en una carrera de NGS realizada con el ultrasecuenciador GS 454 de Roche.

Tabla 2 Parámetros de control de calidad de la carrera de secuenciación establecidos por Progenika

CC superado Intermedio CC fallido
◦
N. lecturas y longitud
Librería
Pocillos leídos totales >150.000 140.000-150.000 <140.000 Recomendado
Pocillos con clave superada >140.000 130.000-140.000 <130.000 Recomendado
Pocillos con filtros superados >70.000 50.000-70.000 <50.000 Recomendado
Longitud media >360 340-360 <340 Crítico
Longitud controles
ADN control tipo I
Longitud media >515 <515 Crítico
ADN tipo II
Longitud media >520 <520 Crítico
Calidad de las bases
Librería
Calidad de bases media >35 30-35 <30 Crítico
ADN control
Calidad de bases media >35 30-35 <30 Crítico
Filtros
Librería
% Lecturas fallidas <12% 12%-15% >15% Crítico
% Lecturas cortas <50% 50-55% >55% Crítico
ADN control
ADN control (400pb)
>98% combinado >80 62-80 <62
CC: control de calidad.
NGS en hipercolesterolemia familiar 13

Figura 2 A) Resultados del control de calidad del ADN Control tipo I, en una carrera de NGS realizada con el ultrasecuenciador GS
454 de Roche. B) Resultados del control de calidad del ADN Control tipo Il, en una carrera de NGS realizada con el ultrasecuenciador
GS 454 de Roche.

en todas las carreras realizadas. En la tabla 2 se muestran Mutaciones detectadas

los diferentes apartados de este control de calidad.
Un total de 33 de las 110 muestras analizadas por
NGS presentaron variantes clasificadas como patogéni-
Análisis de los resultados cas (mutaciones asociadas al riesgo de desarrollar HF).
El 93,94% (31/33) de dichas muestras presentaron una
El análisis de los resultados fue realizado con el software única variante en heterocigosis, uno de los pacientes
LipoNext LNX Analysis Software, el cual transforma los datos presentó una mutación en el gen LDLR y otra en el
brutos del sistema Junior en genotipos y analiza las secuen- gen PCSK9, mientras que otro resultó ser un heteroci-
cias proporcionando las variantes encontradas y su estado goto compuesto presentando dos mutaciones en el gen
de patogenicidad, siempre que este sea conocido. Todos los LDLR. En total fueron identificadas 35 mutaciones en
resultados fueron validados por el especialista. 33 pacientes.
14 E. Martínez-Barrios et al

Figura 3 Resultados del control de calidad (lecturas fallidas y de corta longitud) de la librería de amplicones obtenida con el kit
SEQPRO Lipo, en una carrera de NGS realizada con el ultrasecuenciador GS 454 de Roche.

El 94,29% (33/35) de estas mutaciones se encontraron los 12 exones del gen PCSK9 y los 9 exones del gen LDLRAP1.
en el gen LDLR, de las cuales el 60,61% (20/33) correspon- En total 41 exones secuenciados de manera bidireccional por
dían a un cambio de sentido o sentido erróneo (missense), paciente y hasta 20 pacientes por carrera, lo que da un total
el 21,21% (7/33) correspondían a la formación de un codón de 820 exones secuenciados en tan solo 42 horas de trabajo
de terminación (nonsense) y el 18,18% (6/33) afectaban la de laboratorio. Esto significa que para secuenciar el mismo
maduración (splicing) del ARN. Las dos mutaciones restan- número de exones por la técnica de Sanger se necesita-
tes se hallaron en los genes PCSK9 (localizada en una región rían 165 horas de trabajo de laboratorio (aproximadamente
no codificante) y LDLRAP1 (mutación tipo missense). Las 20 días).
mutaciones encontradas y su clasificación se muestran en la El flujo de trabajo y el tiempo invertido en cada paso
tabla 3. del proceso se muestra en la tabla 4 (NGS) y tabla 5
De las muestras con variantes patogénicas, el 58,82% (secuenciación Sanger), así como el tiempo estimado para
(20/34) eran portadoras de mutaciones directamente aso- la secuenciación de los genes implicados en la HF por ambas
ciadas con la HF ya fuera por previa validación in vitro técnicas (tabla 6).
o porque las mutaciones producían un alelo nulo (clasifi-
cación mutacional A). El 38,24% (13/34) de las muestras
eran portadoras de mutaciones asociadas con la HF en otras Discusión
poblaciones o asociadas con el fenotipo de la enfermedad
en estudios familiares pero sin validación in vitro (clasifi- La confirmación mediante Sanger del 100% de las mutaciones
cación mutacional B). En una de las muestras se localizó encontradas con la técnica NGS aquí descrita, demuestra la
una variante de la cual se desconocía la patogenicidad. alta sensibilidad y especificidad de la misma para el diag-
Por otra parte, 2 muestras de las 110 analizadas presenta- nóstico genético de la HF. Estos resultados coinciden con
ron la variante V067 (c.829G > A p.Glu277Lys) considerada un estudio realizado por Maglio et al., en el cual se encon-
anteriormente como patogénica, aunque actualmente se tró una sensibilidad del 99,6%, una especificidad del 100%
considera un polimorfismo. Con el fin de simplificar los resul- y una precisión del 99,6% en la metodología NGS para la
tados, las variantes encontradas cuya patogenicidad no se detección de mutaciones puntuales21 . En dicho estudio, rea-
encuentra aún validada no son mencionadas en este trabajo. lizado en la población sueca, se encontró que el 90% de las
mutaciones identificadas pertenecían al gen LDLR y el 10%
restante se localizaban en los genes APOB y PCSK9 (8% y 2%
Validación del estudio
respectivamente). Estos resultados muestran, al igual que
los obtenidos en este estudio, que el gen donde se encuen-
Para validar el estudio todas las mutaciones encontradas por tra la mayor proporción de mutaciones es el LDLR (94,29%),
NGS fueron comprobadas por secuenciación Sanger confir- mientras que la proporción es minoritaria en los otros genes
mándose en el 100% de los casos. En la figura 4 se muestra implicados. No se observaron coincidencias en el tipo de
un ejemplo de una mutación detectada mediante ambas mutaciones encontradas en ambos estudios, pero la alta
técnicas. variabilidad de las mutaciones encontradas en este estu-
dio corrobora la gran heterogeneidad mutacional del gen
Comparación de métodos LDLR presente en la población española, tal y como describió
Palacios et al.22 .
En concreto, en una sola carrera de NGS fue posible analizar En resumen, la principal ventaja de la aplicación
los 18 exones del gen LDLR, 2 de los 26 exones del gen APOB, de la NGS al diagnóstico de la HF es la posibilidad
NGS en hipercolesterolemia familiar 15

Tabla 3 Variantes encontradas en el estudio, previamente identificadas como patogénicas y su clasificación mutacional
Gen cADN Proteína Tipo Código mutación n Tipo de mutación
LDLR c.1358 + 1G > A NA Splicing M011 1 A
c.2390-1G > C NA Splicing M023 2 B
c.2399 2403 p.Phe800GlyfsX132 Nonsense M024 2 A
delTCTTCinsGGGT
c.1618G > A p.Ala540Thr Missense M042 1 A
c.1103G > A p.Cys368Tyr Missense M051 2 B
c.283T > G p.Cys95Gly Missense M056 1 A
c.91G > T p.Glu31X Nonsense M064 1 A
c.1027G > A p.Gly343Ser Missense M070 1 A
c.97C > T p.Gln33X Nonsense M076 1 A
c.460C > T p.Gln154X Nonsense M077 1 A
c.[274C > G(+)313 + 1G > C] p.Gln92Glu Missense + Splicing M080+ M025 1 A
c.1815 1825del11 p.Leu606ArgfsX6 Nonsense M121 1 A
c.2389G > A p.Val797Met Missense M134 2 A
c.1898G > A p.Arg633His Missense M152 1 A
c.2099A > G p.Asp700Gly Missense M220 1 B
c.895G > T p.Ala299Ser Missense M222 2 A
c.796G > A p.Asp266Asn Missense M282 1 A
c.660delC p.Asp221ThrfsX44 Missense M395 1 A
c.810C > A p.Cys270X Nonsense M603 1 A
c.2389 + 5G > A NA Splicing M613 1 B
c.1019 1020 delGCinsTG p.Cys340Leu Missense M614 1 B
c.968G > T p.Gly323Val Missense M654 1 B
c.1129T > C p.Cys377Arg Missense M698 1 B
c.1592T > A p.Met531Lys Missense M699 1 B
c.1468T > C p.Trp490Arg Missense M717 1 A
c.73G > A p.Asp25Asn Missense M720 1 B
c.2389 + 2 2389 + 5 NA Splicing NC 1 Aún no descrita
delTAAGinsGGCCCAT
c.829G > A p.Glu277Lys NP V067 2 Antes M067
PCSK9 c.(-287)G > A NA NA NC 1 B
LDLRAP1 c.605C > A p.Ser202Tyr Missense M3023 1 B
A: mutaciones directamente asociadas con la HF ya fuera por previa validación in vitro o porque las mutaciones producían un alelo nulo;
B: mutaciones asociadas con la HF en otras poblaciones o asociadas con el fenotipo de la enfermedad en estudios familiares pero sin
validación in vitro; n: número de pacientes; NA: no aplica; NC: no codificada; NP: no patogénica.

de secuenciar todos los genes asociados a la enfermedad muestra secuenciada aumentan significativamente y no se
en una sola carrera de secuenciación, es decir: los 18 consigue el máximo rendimiento de la técnica. Esto puede
exones del gen LDLR, 2 de los 26 exones del gen APOB, retrasar el tiempo de realización de la técnica y por consi-
los 12 exones del gen PCSK9 y los 9 exones del gen LDL- guiente el tiempo de respuesta si no se dispone de un número
RAP1. La aplicación de la NGS al cribado de la HF resulta suficiente de casos índices en un periodo determinado de
en una disminución del tiempo de trabajo de laboratorio tiempo para realizarla.
y en una reducción de los costes como consecuencia de Otra limitación de la técnica es debida al principio de
esta menor carga laboral, de hecho autores como Sharma pirosecuenciación que esta utiliza, ya que puede presentar
et al. han postulado a la NGS como la herramienta más errores de secuenciación en las regiones ricas en homopolí-
eficiente y económica para el diagnóstico genético de la meros.
HF23 . Este abaratamiento de la secuenciación ha llevado Finalmente, es importante mencionar que aunque la NGS
a la NGS a convertirse en la técnica de elección para el es una herramienta eficaz para el diagnóstico de la HF no
diagnóstico genético de un gran número de patologías tales siempre es posible identificar mutaciones en los pacientes
como: la distrofia corneal y retinopatías24,25 , el análisis de afectos, esto puede ser debido a que existen otros loci aso-
los genes BRCA1 y BRCA2 en cáncer de mama26,27 , la escle- ciados a la enfermedad aún sin identificar. Además, el kit
rosis múltiple28 , así como el análisis de la resistencia a SEQPRO Lipo aquí utilizado solo cubre dos exones del gen
antirretrovirales en VIH29 , entre otras. APOB, mientras que autores como Vandrovcova et al. reco-
Por otro lado, una limitación de la aplicación de la NGS miendan secuenciar el gen APOB por completo para realizar
para el diagnóstico de la HF en el laboratorio es la necesidad un diagnóstico más exhaustivo de la enfermedad14 .
de realizar cada carrera de secuenciación con un número Con los datos obtenidos se concluyó que, aunque la
igual o superior a 12 muestras; de no ser así los costes por secuenciación tanto por Sanger como por NGS permiten una
16 E. Martínez-Barrios et al

Tabla 4 Flujo de trabajo de la NGS y tiempo en horas invertido en promedio en cada paso del proceso de una carrera de
secuenciación utilizando el ultrasecuenciador GS Junior 454 de Roche
Flujo de trabajo Proceso manual Proceso automatizado Tiempo total
(en horas) (en horas) (en horas)
Preparación de la librería de amplicones 7 3,5 10,5
Preparación de las muestras a [20 ng/L] 1,5 1,5
Preparación de la PCR de amplificación 1 1,5 2,5
Dilución del producto de PCR 0,5 0,5
Preparación de la PCR de incorporación de 1 1,5 2,5
MIDs
Comprobación de amplificación por 0,5 0,5 1
electroforesis en gel de agarosa
Purificación del producto de PCR con Agencourt 1,5 1,5
Cuantificación y preparación del pool 1 1
Preparación de la emPCR 9 6 15
Preparación de los reactivos y de la emulsión 1 1
Captura de la librería 1 1
Preparación de la PCR en emulsión 1 6 7
Recuperación y lavado de las beads 2,5 2,5
Enriquecimiento 2,5 2,5
Preparación para la secuenciación 1 1
Secuenciación 6 10,5 16,5
Prelavado del ultrasecuenciador 0,5 0,5 1
Preparación de la placa de secuenciación 0,5 0,5
PTT(pico titer plate)
Preparación de las beads para la secuenciación 2 2
Dispensación de las capas en la PTT 2 2
Preparación del ultrasecuenciador para la 1 10 11
carrera
Total 22 20 42
MIDs: identificadores de la multiplex; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; PTT: pico titer plate.

Tabla 5 Flujo de trabajo de la secuenciación Sanger y tiempo en horas invertido en promedio en cada paso del proceso
utilizando el analizador automático ABI 3130xl de Applied Biosystems (16 capilares, placa de 96)

Flujo de trabajo Proceso manual Proceso automatizado Tiempo total

(en horas) (en horas) (en horas)
Amplificación fragmento de interés 2 2,5 4,5
Purificación producto PCR 1 1
Comprobación de amplificación por electroforesis 1 0,5 1,5
en gel de agarosa
PCR secuenciación 2 2,5 4,5
Purificación PCR secuenciación 1 1
Electroforesis capilar 0,5 6 6,5
Total 7,5 11,5 19
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.

Tabla 6 Tiempo estimado según la metodología aplicada, para la secuenciación de los genes implicados en la HF (gen LDLR:
18 exones, gen APOB 2/26 exones, gen PCSK9: 12 exones y gen LDLRAP1: 9 exones, en total 41 exones por muestra)

Metodología Tecnología Tiempo Número Tiempo Tiempo estimado para la

invertido por de muestras invertido por secuenciación de 20
carrera (horas) por carrera muestra (horas) muestras (horas)
NGS GS Junior (Roche) 42 20 2,1 42
Sanger ABI 3130xl (16 19 2,3 8,3 165
capilares)
NGS en hipercolesterolemia familiar 17

Figura 4 Ejemplo de la mutación M064, c.91G > T (verde), detectada por ambas técnicas. Sanger, panel superior, mostrando
electroferograma y NGS, panel inferior, con la tabla obtenida mediante el software LipoNext LNX Analysis. También se puede
observar la variante no patogénica c.81C > T (rosa). El color de esta figura solo puede apreciarse en la versión electrónica del
artículo.

detección específica de las mutaciones asociadas a la HF, clinical management of familial hypercholesterolemia. Clin
por motivos económicos, de carga laboral y de rapidez en la Investig Arterioscler. 2013;25:182---93.
obtención de los resultados, el método NGS es el más indi- 2. Goldstein JL, Hobbs HH, Brown MS. Familial hypercholesterole-
cado en el estudio de los casos índice. Por otro lado para mia. En: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editores. The
metabolic and molecular basis of inherited disease. New York:
el estudio de casos familiares, donde se busca una muta-
McGraw-Hill; 2001. p. 2863---913.
ción ya conocida, el método Sanger sigue siendo la opción
3. Varghese MJ. Familial hypercholesterolemia: A review. Ann
más adecuada. Aplicando este algoritmo se consigue agili- Pediatr Cardiol. 2014;7:107---17.
zar significativamente el flujo de trabajo en el laboratorio y 4. Usifo E, Leigh SE, Whittall RA, Lench N, Taylor A, Yeats C, et al.
disminuye el tiempo de respuesta. Low-density lipoprotein receptor gene familial hypercholeste-
rolemia variant database: update and pathological assessment.
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Conflicto de intereses 5. Alves AC, Etxebarria A, Soutar AK, Martin C, Bourbon M.
Novel functional APOB mutations outside LDL-binding region
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. causing familial hypercholesterolaemia. Hum Mol Genet.
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Queremos agradecer al Servicio de Bioquímica y Genética 7. Fellin R, Arca M, Zuliani G, Calandra S, Bertolini S. The his-
Molecular del Hospital Clínic de Barcelona, en especial a tory of Autosomal Recessive Hypercholesterolemia (ARH). From
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