PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETECCIÓN DE

ANTICUERPOS DE LEPTOSPIRA EN SUERO SANGUÍNEO MEDIANTE LA TÉCNICA

DE MICROAGLUTINACIÓN MAT

OBJETIVO

Describir el procedimiento para realizar la técnica de Microaglutinación (MAT) en suero sanguíneo

para la detección de anticuerpos de Leptospira.

ALCANCE

Este método analítico está diseñado como guía de consulta por parte de los profesionales
responsables de llevar a cabo la prueba para MAT para la detección de Anticuerpos para Leptospira.

GLOSARIO

 Leptospira: son bacterias helicoidales flexibles y finas de 6-15 µm de longitud y 0.1 µm de

ancho. Están formadas por entre 18-30 giros de espiral; aerobias estrictas y de crecimiento
lento con un tiempo de generación de 3-15 horas.
 Leptospirosis: es una enfermedad transmisible que afecta tanto a los animales como al ser
humano causado por una infección por cualquiera de los agentes patógenos del género
Leptospira.
 MAT: Prueba de aglutinación microscópica para el diagnóstico de la Leptospirosis, es la
prueba serológica estándar y se utiliza principalmente para diagnosticar la enfermedad en
individuos y en rebaños.
 ANTICUERPO (Ac): Son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de
forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de una
forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema
inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños tales como bacterias, virus o
parásitos.

RESPONSABLES

Coordinador de laboratorio y Analista del Laboratorio

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

 Organización mundial de sanidad animal. Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las

Vacunas para los Animales Terrestres 2021. Capítulo 3.1.12. Leptospirosis.
 El reto del diagnóstico laboratorial de la leptospirosis porcina. Francisco Javier García
Peña. Grupo de estudio de medicina de la conservación de animales salvajes (GEMAS).
 Manual de procedimientos bacteriológicos y serológicos para el diagnóstico de la
Leptospirosis. Instituto Nacional de Salud. Ministerio de Salud del Perú.
 Guía para la Vigilancia por laboratorio de Leptospira spp. Instituto Ncaional de Salud.
Gobierno de Colombia. 2017.
  Guía de control y manejo de Leptospirosis. Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca.
Organización Panamericana de la Salud. Organozacion Mundial de la Salud.
OPS/HCP/HCV/URU.ZOO.01/02.
 ACREDITACIÓN DE LA TÉCNICA MAT PARA LA DETERMINACIÓN DE
LEPTOSPIROSIS. M. V. Schust1, L. E. Samartino1, G. Romero1, C. Auteri1 y B. F.
Brihuega1
 Estudio de mecanismos de la inmunidad innata en la patogénesis de la Leptospirosis.
Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias
Biológicas. 2014
 LEPTOSPIROSIS HUMANA: GUIA PARA EL DIAGNOSTICO VIGILANIA Y
CONTROL. Organización Panamericana de la Salud-Organización Mundial de la Salud-
ILS International Leptospirosis Society.

GENERALIDADES

La leptospirosis es una enfermedad transmisible que afecta tanto

a los animales como al ser humano causado por una infección por cualquiera de los agentes
patógenos del género Leptospira. Las leptospiras son espiroquetas que pueden ser saprofitos de vida
libre que se encuentran en agua dulce o pueden causar infecciones agudas o crónicas en animales.
La familia Leptospiraceae comprende tres géneros: Leptospira, Leptonema y Turneriella. Dentro
del género Leptospira, se pueden distinguir tres clados, de patógenos, no patógenos y un grupo
intermedio. Las leptospiras se dividen además en serovares; los serovares relacionados
antigénicamente se agrupan en serogrupos por conveniencia. El género Leptospira se dividió en dos
especies, L. icterohaemorrhagiae, que comprende todas las cepas patógenas, y L. biflexa, que
contiene cepas saprofitas aisladas del agua. L. icterohaemorrhagiae se subdividió en serotipos, pero
L. biflexa no. Las cepas patógenas se llamaran L. interrogans y las cepas saprófitas L. biflexa
(Wolff y Turner 1963).

El diagnóstico de leptospirosis se puede lograr mediante la detección directa del organismo o sus
componentes en fluidos o tejidos corporales, mediante el aislamiento de leptospiras en cultivos o
mediante la detección de anticuerpos específicos. La recolección de muestras apropiadas y la
selección de pruebas para el diagnóstico dependen del momento de la recolección y la duración de
los síntomas. (Figura 1)
 figura1. Relación entre la respuesta inmune, sintomatología y muestras a enviar para diagnostico

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
  Guantes desechables
 Tapabocas
 Láminas portaobjetos desengrasadas
 Microplacas fondo en U con tapa estériles
 Microtubos para predilución con su soporte
 Canaletas
 Puntas de 10-200μl, 5-50 μl y 1000μl para las micropipetas
 Tubos tapa rosca 15ml estériles
 Filtros estériles 0.20, 0.22 ó 0.45μm. Diámetro de 25mm
 Jeringa de 5mL
 Recipientes para descartar material
 Toallas desechables
 Marcadores
 Antígenos: un panel con los diferentes serovares de leptospira.

EQUIPOS

 Microscopio de campo oscuro

 Cabina de bioseguridad
 Micropipeta monocanal de 100-1000μl
 Micropipeta monocanal de 2 – 20μl ó 5 - 50μl
 Micropipeta multicanal de 20-200μl.
 Incubadora de 30°C +/- 1°C
 Refrigerador de 5°C +/-3°C
 Congelador de -20°C+/- 10°C

REACTIVOS

 Medio EMJH (Anexo 1).

 Suplemento EMJH
 Antibiótico 5 Fluoro-Uracil (5-FU)

TIPO DE MUESTRAS
El suero sanguíneo es la muestra ideal. Se requiere que estén libres de hemólisis, contaminación,
glóbulos rojos y no lipémicos.

DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Y REACTIVOS

 Atemperar las muestra hasta que alcancel un temperatura ambiente entre 18°C-26°C
  Preparar los tubos de 15 ml con medio EMJH y suplemento para realizar la réplica de las
cepas ver (Anexo 2)
 Preparar la dilución de los serovares según la cantidad de muestras ver (Anexo 3)
 Diligenciar debidamente la Hoja de trabajo Microaglutinacion MAT para Leptospiras.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Primero se debe realizar la prueba de manera cualitativa y de esta manera saber que muestras son
positivas para poder titular.

 Realizar una dilución 1/25 de los sueros sanguíneas a analizar (15 μl de suero + 360 de
medio EMJH líquido).
 Marcar las microplascas por cada serovar a analizar.
 Colocar 50μl de medio EMJH en las palcas fondo en U de acuerdo a la cantidad de
muestras a procesar.
 Colocar 50μl del suero diluido 1/25 de acuerdo a la hoja de trabajo.
 Colocar 50 μl del serovar a estudiar ya preparado en un concentración 2x10(8). Al
final tendremos una dilución 1:100, esta es la dilución inicial con la que se trabaja
para saber si las muestras están positivas o negativas.
 En las columnas impares de la fila A no se coloca suero solo medio EMJH con
antígeno y este será nuestro control negativo.
 Incubar por 2 horas a una temperatura de 30°C +/- 1°C.
 Pasado este tiempo realizar la lectura.
 Para realizar la lectura se coloca 5 μl de la dilución 1:100 sobre una laminas
portaobjeto y se observa al microscopio de campo oscuro, primero revisar el control
negativo en el cual no se debe observar aglutinación de las leptospiras deben estar
sueltas y al revisar las muestras se debe presentar el 50% o más de aglutinación para
indicar que la muestra están positivas. (Figura 2).

Figura 2: Interpretación microscópica de la aglutinación. Fuente: HARTSKEERL, et al 2001

 Luego de realizar la primera lectura de la dilución 1:100 y se obtengan las muestras
que están positivas se realiza la segunda parte del procedimiento que sería la parte
cuantitativa.
 Realizar la titulación de los sueros que salieron positivos en la primera lectura hasta
la titulación donde genere una aglutinación del 50%. Las diluciones a titular seria:
1:200, 1:400 y 1:800.
 Realizar hoja de trabajo de acuerdo a las muestras por titular por cada serovar.
 Tomar el suero positivo y realizar una dilución 1/50 (20 μl de suero + 980 de
medio EMJH líquido).
 Colocar 50 μl de medio EMJH en la placa de predilución fondo en U.
 Adicionar 50μl del suero diluido. Y realizar diluciones seriadas hasta la dilución
requerida.
 Adicionar 50μl del antígeno preparado.
 Las columnas impares de la fila A solo se coloca medio EMJH con Antígeno y este
será el control negativo.
 Incubar por 2 horas a una temperatura de 30°C +/- 1°C.
 Pasado este tiempo realizar la lectura.
 Para realizar la lectura se coloca 5 μl de cada una de las diluciones sobre una
laminas portaobjeto y se observa al microscopio de campo oscuro, primero revisar
el control negativo en el cual no se debe observar aglutinación de las leptospiras
deben estar sueltas y al revisar las muestras se debe presentar el 50% o más de
aglutinación para indicar que la muestra están positivas. (Figura 3).
 Figura 3: Reacciones de la prueba de aglutinación microscópica (MAT) a: lamina
control, b: lamina con 25% de aglutinación, c: lamina con 50 % de aglutinación, d:
lamina con 75% de aglutinación, e: lamina con 100% de aglutinación, f: lamina con
100% de aglutinación y lisis, g: lamina con 100% de lisis, h: lamina negativa.
FUENTE: Céspedes, Manuel. 2005. Leptospirosis: enfermedad zoonótica y
reemergente:
Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública, vol. 22 no. 4.

RESULTADOS

El punto de corte se define como la dilución del suero que muestre el 50% de
aglutinación, dejado 50% de células libres, cuando se lo compara con un control
negativo, es decir:

 Si la proporción de las leptospiras libres está entre el 50% y 100%, la reacción

es negativa.
 Si la proporción de las leptospiras libres es menos que el 50% entonces la
reacción es positiva.

CRITERIOS DE ACEPTACION

El control negativo dispuesto en cada placa por cada serovar, no debe presentar ningún
tipo de aglutinación.

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

 Control de esterilidad del medio del cultivo

 Prueba de identidad de la cepas
 Revisión del cepario periódicamente
 Que las cepas no se encuentren contaminadas

DETERMINACIÓN DE LA IDENTIDAD DE LAS CEPAS

 Fuente de incertidumbre

La densidad correcta del cultivo usado como antígeno. Esta densidad debe ser aproximadamente de
1,5 a 2x108 leptospiras.

Se emplean como antígeno las cepas de referencia que deben ser replicados semanalmente para
realizar la prueba. Una vez revisado los cultivos, se eligen aquellos que tengan buen crecimiento y
no
formen aglutinaciones entre ellas. Cuando los cultivos están muy densos se deben diluir con buffer
fosfato salino PBS pH 7,2-7,4 o solución salina fisiológica 0,85%.

Para que el antígeno sea óptimo para la prueba tiene que observarse en el microscopio de campo
oscuro entre 150 a 200 leptospiras por campo o hasta lograr una opalescencia de 0,5 de la escala de
Mac Farland.
6.4.2.7 La prueba se basa en enfrentar diluciones seriadas de suero con igual volumen de una
suspensión
de leptospiras (antígeno) para luego observarse en microscopio de campo oscuro para estimar el
50% de aglutinación como el punto final de la reacción antígeno-anticuerpo.

La MAT detecta tanto los

anticuerpos tipo IgM como IgG. La prueba no puede ser estandarizada ya que utiliza antígenos
vivos y
factores como la edad y densidad del antígeno en el cultivo puede influir en el título de aglutinación
(BorgPetersen & Fargroeus, 1949; Carbrey, 1960).
el punto de corte se define como la dilución del suero que
muestre el 50% de aglutinación, dejado 50% de células libres, cuando se lo compara con un control
que
consiste de cultivo diluido 1:2 en tampón fosfato salino

Las cepas se subcultivan en medio EMJH (ver anexo 16, A16.4, p. 111) cada semana. Se debe usar
el cultivo entre el cuarto y décimo día de crecimiento a 30°C. Para restringir el crecimiento
bacteriano, se aconseja guardar los cultivos a temperatura ambiente en la oscuridad una vez el
cultivo haya crecido a una densidad de 2-4 x 10 8 leptospiras/ml. Después de 10 días, es mejor
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guardar el cultivo a 15°C. La viabilidad celular (densidad y movilidad) y la ausencia de
contaminación
se verifican usando el microscopio de campo oscuro.
o Antes de usar las cepas, se diluyen generalmente 1:2 con solución fisiológica tamponada para
obtener una densidad de 1-2 x 108 leptospiras/ml. La densidad celular de cada cepa debe verificarse
individualmente.

Inactivar el complemento calentando el suero a 56°C por 30 minutos

si la proporción de las leptospiras libres está entre el 50% y 100%, la reacción es negativa;
- si la proporción de las leptospiras libres es menos que el 50% entonces la reacción es positiva.

El umbral positivo o valor de corte de la reacción es fijado en 1/100 por parte de muchos
laboratorios. Sin
embargo, el título de anticuerpos debe ser interpretada a la luz de:
- la fecha de obtención de la muestra en relación con los primeros signos clínicos;
- la evolución de los títulos de anticuerpos entre las dos o tres muestras sucesivas;
- el serogrupo causal;
- el tratamiento dado.

Anexo 1. Medio EMJH

El medio más utilizado es el Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH), el cual contiene

1% de albúmina sérica bovina y Tween-80 como fuente de ácidos grasos

de cadena larga. En los cultivos en medios semisólidos se puede apreciar la formación de un anillo
de crecimiento, denominado “zona de Dinger”, donde las leptospiras se concentran ya que allí la
tensión superficial del oxígeno es la óptima

Actualmente de usa la marca Difco y se compone de dos elementos:

 Un medio base referencia EMJH 0794-17-1

  Un suplemento Líquido referencia 279510

Se prepara según indicaciones del producto, se adiciona 10% de suplemento y se deja en incubación
a 37°C durante 24-48 horas, esto es prueba de esterilidad. Si no se observa contaminación se
homogeniza y se distribuye en tubos tapa rosca de 16 x 150 en cantidad de 8.0 ml por tubo.

ANEXO 2

ANEXO 3 PREPARCIÓN DE LOS CULTIVOS DE LEPTOSPIRA

Los medios semisólidos contienen 0,1 - 0,5% de agar (p/v). Tales medios son de preferencia para el
aislamiento de varias cepas y para el mantenimiento a mediano plazo (hasta varios años). El
crecimiento
se inicia fácilmente en estos medios y, usualmente, es más fácil su visualización en forma de uno o
más
anillos densos de crecimiento, varios milímetros debajo de la superficie del medio. La ausencia de
anillos,
sin embargo, no necesariamente significa ausencia de leptospiras. Medios semisólidos en tubos con
tapa
de rosca son usados, por lo general, para el mantenimiento de cultivos de reserva, que son
conservados
a temperatura ambiente y, preferiblemente, son transferidos cada tres meses a medios frescos.