Universidad Andrés Bello Facultad de Tecnología Médica Lab. de Inmunología Aplicada TMD 255 Profesores: Carolina Otero Acuña y Mauricio Cabaña

Universidad Andrés Bello
Facultad de Tecnología Médica

Lab. De Inmunología Aplicada TMD 255
Profesores: Carolina Otero Acuña y Mauricio Cabaña
Laboratorio N°1
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-NUCLEARES MEDIANTE TECNICA DE
INMUNOFLUORESCENCIA EN SUERO HUMANO
Nombres: Iván Villavicencio B.

Diego Troncozo Z.
Fecha: 9 de octubre 2016

Introducción
Un trastorno autoinmunitario ocurre cuando el sistema inmunitario ataca y destruye
tejido corporal sano por error. Muchas patologías en las que se presentan problemas en
la regulación de la autotolerancia del sistema inmune, cursan con la aparición de
autoanticuerpos. Las enfermedades autoinmunes específicas de un órgano, se
caracterizan por la presencia de autoanticuerpos específicos contra ese tejido. Mientras
que las enfermedades autoinmunes sistémicas, se caracterizan por la producción de
autoanticuerpos dirigidos frente a múltiples proteínas intracelulares, ya sea a nivel del
núcleo o citoplasma, denominados como anticuerpos antinucleares1.
Existen varias técnicas de laboratorio que permiten identificar patologías autoinmunes,

como por ejemplo; Inmunofluorescencia indirecta (IFI), Ensayo por inmunoadsorción
ligado a enzimas (ELISA), Electroinmunotransferencia (Western-blot) u otras. Para este
laboratorio, nos centraremos en estudiar la primera.
Los anticuerpos antinucleares detectados por IFI, resulta útil para realizar screening,
diagnosticar a un paciente de algún trastorno autoinmune y posteriormente realizar un
seguimiento en conjunto a su tratamiento. Hay que considerar que los ANA detectados
por IFI, deben ser evaluados en base al patrón y al título. Por tal motivo, su detección
debe realizarse de manera ordenada y razonable por el Tecnólogo Médico o Bioquímico
a cargo.
Actualmente, la detección de los ANA se hace empleando como sustratos las líneas
celulares HEp-2 y HeLa, siendo la primera por su facilidad de crecimiento la más
utilizada. La detección de ANA mediante IFI en líneas celulares se considera la prueba
inicial de laboratorio que apoya al diagnóstico de las enfermedades autoinmunes debido
a su alta sensibilidad. Sin embargo, dada su relativa baja especificidad, es necesario
emplear técnicas más sensibles y específicas como: radioinmunoanálisis (RIA), ELISA,
electroinmunotransferencia (EIT) o Western blot, etc. para aumentar la sensibilidad y
especificidad de los ANA para el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes. Con
esta línea celular se pueden reconocer más de 30 patrones Nucleares y
Citoplasmáticos2
Objetivos
 Aprender metodología sobre la técnica de IFI y el correcto manejo de los
materiales necesarios para desempeñar la detección de ANA
 Comprender los fundamentos de la técnica a realizar, con el fin de poseer las
competencias necesarias para su futura realización.
 Adaptarse al instrumental que se utiliza para la detección de ANA, como lo es el
microscopio de fluorescencia
 Lograr una correcta interpretación de patrones, aspecto fundamental y principal
de esta técnica.
Materiales y Métodos
Para poder realizar esta técnica, se requiere de una muestra del paciente que se desea
analizar, para esto se procedió con la extracción de 4 ml sangre venosa a un integrante
del grupo de trabajo, siguiendo el protocolo de punción. Una vez realizada la extracción,
se depositó en un tubo de tapa roja (sin aditivo) y se procedió con la centrifugación de
este a una velocidad de 2500 rpm por 5 minutos, esto con el fin de realizar la correcta
separación del suero, que es el que se utilizará.
Posteriormente, una vez obtenido el plasma, se realizaron 3 diluciones seriadas, con un
factor de dilución de 1:20, 1:200 y 1:500. Estas diluciones utilizaron como solvente el
buffer PBS (Buffer Fosfato Salino) que es isotónico y no presenta toxicidad para la
célula. Los instrumentos utilizados para hacer las diluciones fueron micropipetas de 10
a 100 µl y de 100 a 1000 µl. El volumen final fue a elección, en este caso se preparó
500 µl para cada dilución.
Una vez diluido el suero, se continuó con la dilución de los controles negativo y positivo,
con un factor de dilución de 1:10 con PBS como solvente, a un volumen final de 500 µl.
Sobre un portaobjeto, el cual contiene células HEp-2 distribuidas en 5 pocillos, se
procedió a cargar con 30 ul el primer y segundo pocillo, los controles (-) y (+)
respectivamente, así mismo y de forma correlativa se cargan los sueros diluidos, sobre
los pocillos 3 (1:20), 4 (1:200) y 5 (1:500).
Una vez cargado el portaobjeto, se incubo en una cámara húmeda durante 15 minutos.
Pasado este tiempo, se removió el exceso del preparado y se incubo en una solución
de PBS durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, se eliminó el excedente con una
toalla absorbente y se añadió 25 µl de FITC (Isotiocianato de fluoresceína) a cada
pocillo. Acto seguido, se incuba nuevamente en cámara húmeda durante 15 minutos,
procurando esta vez que el portaobjetos no esté expuesto a la luz, con el fin de alterar
los resultados. Después de ese tiempo, se lava durante 5 minutos en buffer fosfato
salino.
Luego se removió el exceso del buffer y se aplicó un medio de montaje sobre cada
pocillo con una gota de este último, permitiendo conservar la muestra y luego montar
un cubreobjetos de 22x70 mm sobre la preparación. Ya finalizado esta técnica, se deja
reposar 5 minutos a temperatura ambiente para luego observarlo al microscopio de
fluorescencia.
Resultados
Para esta actividad se analizó el plasma sanguíneo de un varón adulto de 25 años,

estudiante de la Universidad Andrés Bello. Luego del procedimiento señalado en el
procesamiento de la muestra, se añadió una gota de medio de montaje a cada pocillo
que previamente se le fijaron las células Hep-2 y se analizó al microscopio. La placa
en total constaba de 2 controles (positivo y negativo) y tres muestras de suero que
fueron diluidos de forma seriada de la siguiente forma: 1:20, 1:200 y 1:500,
colocándolos en los pocillos 1, 2 y 3 respectivamente.
Figura 1. En esta figura se observa el Control Positivo y Control Negativo, respectivamente, en células HEp-
2 captadas por microscopia de fluorescencia 40x.
En el control positivo, correspondiente a suero humano con Anticuerpos Antinucleares

(ANA), se observa claramente un patrón homogéneo, y en control negativo, que era
suero humano con Azida de Sodio 0,095% no se logra apreciar fluorescencia. (Figura
1)
Como se mencionó, se realizaron 3 diluciones seriadas del suero del paciente a
analizar, dando como resultado lo siguiente (Figura 2-3)
Figura 2 Imagen captada por microscopia de fluorescencia del suero del paciente con una dilución de 1:20.
En la muestra diluida en 1:20 se hacen notar unas estructuras fluorescentes no
nucleares, sin presentar un patrón específico, que deberá refutarse con las siguientes
diluciones que poseen más relevancia diagnostica2
Figura 3 Imagen captada por microscopia de fluorescencia del suero del paciente, a la izquierda se
muestra el pocillo con la dilución 1:200 y a la derecha la dilución 1:500
Como se puede apreciar, al aumentar el título del suero, se va perdiendo

progresivamente la intensidad de la fluorescencia, producto de una disminución en la
reacción del conjugado de IgG anti-humana con Isotiocinato de Fluoresceína. (Figura 3)
Esclareciendo el resultado negativo del suero del paciente.
Discusión
En esta técnica, se parte con un soporte que lleva fijado un Ag conocido (células HEp-
2), al que se le añade el suero del paciente. Para después agregar la anti-
inmunoglobulina humana, la que en teoría formará el complejo Ag-Ac, siempre y cuando
en muestra presentara Anti-inmunoglobulina HE-p2. Luego se realizar un primer lavado,
el cual permite eliminar los anticuerpos circundantes en el suero que no se fijan al Ag.
Luego se agrega un anti-inmunoglobulina (conjugado), el que está marcada con un
fluorocromo (Isotiocianato de Fluoresceína) fijándose a la anti-inmunoglobulina humana
en su fracción constante (Fc), para después realizar un segundo lavado y retirar el
excedente, para que posteriormente se fije el preparado en un cubreobjetos y ser
evaluado con un microscopio de fluorescencia.
Los controles preparados, determinan que nuestra técnica está bien preparada los que
están certificados por el fabricante. El control (-) no contiene ANA, pero sí anti-
inmunoglobulinas conjugadas con fluorocromo, además de las células HEp-2 puestas
en el pocillo. La razón por la cual el control (-) no emite fluorescencia, es porque al no
tener el anti- anticuerpo especifico contra células HEp-2, estos se desprenden con las
series de lavados. Por otra parte, el control (+) contiene ANA, anti-inmunoglobulinas
conjugadas con fluorocromo, además de las células HEp-2 puestas en el pocillo. Por
tanto al tener presentes anticuerpos antinucleares, realizará un complejo Ag-Ac que no
se desprende con los lavados de la técnica3.
Los anticuerpos antinucleares o mejor conocidos como ANA, se sabe que son
anticuerpos capaces de reaccionar con estructuras citoplasmáticas, como con
estructuras nucleares (DNA o RNA), siendo especialmente evidente en pacientes con
LES (Lupus Eritematoso Sistémico). Esta técnica de detección de ANA (positivo, como
en el caso del LES) constituye una parte importante y fundamental en los test de
screening para él LES, sin embargo, esta técnica posee una baja especificidad, por lo
que debe confirmarse con otras técnicas más específicas y sensibles como ELISA o
Western Blot4.
Junto con esto, que para el resultado en la detección de estos anticuerpos, se debe
tener en cuenta los títulos con los que se trabajara, ya que se ha demostrado mediante
estudios que a mayor título, aumentan los valores predictivos positivos, obteniendo
valores de hasta un 6%, lo que obliga de cierta forma a realizar la técnica con títulos por
sobre 1:320 para que la técnica tenga veracidad y pueda considerarse significativo,
como en el caso de ANA asociados a enfermedades Reumática5. (Tabla 1)
Tabla 1 Valores predictivos positivos de ANA positivos según título.
Para la determinación de distintas enfermedades autoinmunes, se utilizan distintos

tipos de líneas celulares, siendo las más usadas las células HEp-2, que son células del
carcinoma laríngeo humano, que poseen la facultad de poder expresar los 4 patrones
de Inmunofluorescencia del núcleo. Además de esto, resultan útiles ya que se pueden
observar en distintos estadios de la mitosis, además de ser especialmente útiles ya
que poseen Antígenos humanos que no han sido hallados en tejidos de roedores y en
mayor concentración, tales como los antígenos SSA/Ro, que son partículas de RNA
asociadas al núcleo, también posee antígenos centromericos, que son visibles en toda
las fases de la división celular. Con esta línea celular se pueden reconocer más de 30
patrones Nucleares y Citoplasmaticos 2.
El Conjugado de Anti IgG humana con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) son los más
importantes para el diagnóstico y monitoreo de las enfermedades del tejido conectivo
(ETC), mientras los ANA-IgM son de menor relevancia clínica en estos pacientes. Sin
embargo, poco se sabe de los ANA-IgA ya que estos Ac han sido menos investigados 6.
(Tabla 2)
Tabla 2 Prevalencia de isotipos de ANA en pacientes con ETC
Basándonos en los resultados obtenidos en el práctico, y comparando las imágenes con

los controles, determinamos que el suero del paciente no presentaba afecciones
autoinmunes, ya que no presenta un patrón moteado u homogéneo en la muestra. La
presencia de fluorescencia pudo deberse al excedente de reactivo que quedé al no
retirarse en los lavados previo al montaje.
Dentro de la población, los pacientes que tienen antecedentes de familiares con
enfermedades autoinmune, personas de mayor edad, mujeres gestantes, pacientes con
infecciones crónicas o con neoplasias; tienen más probabilidad de tener títulos más altos
en técnicas de IFI2.
Conclusión
Se cumplió este paso práctico, con el fin de poder realizar la técnica de

Inmunofluorescencia indirecta (IFI) en muestra sanguínea.
Se comprendió los fundamentos teóricos de cada paso técnico en el laboratorio.
Se completó de forma exitosa la preparación sin ruidos de fondo o artefactos que
pudiesen interferir con la técnica
Bibliografía
1. Davidson A, Diamond B. Autoimmune diseases. N Engl J Med. 2001;345: 340-50.
2. Mm C, Giménez V, Ferreira L, Rovira C, Picaguá E, Granados E. Frecuencia de los

patrones de anticuerpos anti-nucleares en pacientes con sospecha clínica de LES
Frequency of antinuclear antibody patterns in patients with SLE clinical suspicion.
2010;8(2):27–33.
3. Temario general, Manual del auxiliar de laboratorio. (2203). Editorial MAD, 2° Edición,
España, pp. 574.
4. Cabiedes J, Núñez-Álvarez CA. “Anticuerpos antinucleares”. Reumatol Clin.

2009;6(4):224–30.
5. Abeles AM, Abeles M. The clinical utility of a positive antinuclear antibody test result.
Am J Med [Internet]. 2013;126(4):342–8.
6. Arcavi M, Dadone J. Anticuerpos antinucleares, imagenes y caracteristicas obtenidas
por inmunofluorescencia. Importancia de los isotipos IgA, IgM e IgG. Medicina (B Aires).
2009;69(5):502–6.

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Nombres: Iván Villavicencio B.

Fecha: 9 de octubre 2016

Existen varias técnicas de laboratorio que permiten identificar patologías autoinmunes,

Para esta actividad se analizó el plasma sanguíneo de un varón adulto de 25 años,

En el control positivo, correspondiente a suero humano con Anticuerpos Antinucleares

Como se puede apreciar, al aumentar el título del suero, se va perdiendo

Para la determinación de distintas enfermedades autoinmunes, se utilizan distintos

Tabla 2 Prevalencia de isotipos de ANA en pacientes con ETC

Basándonos en los resultados obtenidos en el práctico, y comparando las imágenes con

Se cumplió este paso práctico, con el fin de poder realizar la técnica de

1. Davidson A, Diamond B. Autoimmune diseases. N Engl J Med. 2001;345: 340-50.

2. Mm C, Giménez V, Ferreira L, Rovira C, Picaguá E, Granados E. Frecuencia de los

4. Cabiedes J, Núñez-Álvarez CA. “Anticuerpos antinucleares”. Reumatol Clin.

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