PCB M Tesis 2019 Ismael Villegas Acosta

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
EL PAPEL DE LOS CARDENÓLIDOS EN LA

INTERACCIÓN Pentalinon andrieuxii Mull-
Syntomeida epilais Walker Y SU EFECTO EN LA
METILACIÓN DEL ADN DEL INSECTO COMO
ESTRATEGIA ECOLÓGICA DE CONSERVACIÓN
Tesis que presenta
ISMAEL FERNANDO VILLEGAS ACOSTA
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)

Mérida, Yucatán, México
2019
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó
para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de
Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en
contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados,
dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de
la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de
Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de
igual manera los productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o
pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le pertenecen
patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y en el
mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o
desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo
dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad
Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.
________________________________
ISMAEL FERNANDO VILLEGAS ACOSTA
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto titulado El papel de
los cardenólidos en la interacción Pentalinon andrieuxii Mull-Syntomeida epilais
Walker y su efecto en la metilación del ADN del insecto como estrategia ecológica
de conservación, en el que participé bajo la dirección de la Dra. Clelia De la Peña
Seaman.
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
Al CONACYT, por la beca otorgada número 453923.
Al Dr. Luis Manuel Peña Rodríguez y a la Dra. Clelia De la Peña Seaman, por la asesoría
y ayuda en la realización de la tesis.
A los técnicos Karlina García Sosa, Fabiola Escalante Erosa, Eduardo Castillo Castro y
Matilde Margarita Ortiz García, por su valiosa ayuda en la realización de este proyecto de
investigación, apoyo en mi desarrollo académico dentro de los diferentes laboratorios y en
las técnicas de laboratorio realizadas.
A mis compañeros del Laboratorio de Química Orgánica y Laboratorio de Epigenética y

Cromatina de Plantas, por las aportaciones, ayuda y consejos.
DEDICATORIAS
DEDICATORIAS
A mi familia, que me ha brindado siempre su apoyo de todas las formas posibles para
poder cumplir las metas que he establecido a lo largo de mi vida. En especial a las
mujeres que forman parte de ella: mi mamá Nohemí, Carmen, Montserrat, Rosaura,
Adelina, Chavelita.
Sin dejar de mencionar a mi papá Alfonso, Omar, Gustavo y Salvador, hombres que me
han aportado consejos invaluables.
Finalmente, a mis amigos que a lo largo de las experiencias vividas se han formado lazos
a los de una segunda familia Rosa, Javier, Mary José y Pedro.
Muchas gracias.
ÍNDICE
ÍNDICE
CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 3
1. ANTECEDENTES ...................................................................................................... 3
JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 10
HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 11
OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 11
OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................................ 11
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ..................................................................................... 12
CAPÍTULO II ................................................................................................................... 13
2. CRÍA Y REPRODUCCIÓN EN CAUTIVERIO DE Syntomeida epilais .................... 13
2.1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 13
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 14
2.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 16
2.4 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 20
CAPÍTULO III .................................................................................................................. 23
3. BÚSQUEDA DE CARDENÓLIDOS EN N. oleander, P. andrieuxii Y A. obesum .. 23
3.1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 23
3.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 28
3.4 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 35
i
ÍNDICE
CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 37
4. METILACIÓN DE 5-mC ASOCIADOS A LA ALIMENTACIÓN Y DESARROLLO DE

S. epilais ......................................................................................................................... 37
4.1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 37
4.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 38
4.4 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 42
CAPÍTULO V ................................................................................................................... 43
5. DISCUSIÓN GENERAL ........................................................................................... 43
CAPÍTULO VI .................................................................................................................. 47
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ..................................................................... 47
6.1 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 47
6.2 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 48
7. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 49
8. ANEXOS .................................................................................................................. 57
CAPÍTULO 3 ................................................................................................................... 57
CAPÍTULO 4 ................................................................................................................... 63
ii
LISTADO DE FIGURAS
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1.1 Ciclo de vida holometábolo de S. epilais (a) Huevo (b) Larva (c) Pupa (d)
Polilla. ................................................................................................................................ 6
Figura 1.2 Estructuras de olenadrina, nerigosida y urechitoxina, así como los azúcares
presentes en cada uno de los diferentes cardenólidos....................................................... 8
Figura 1.3 Planta de Pentalinon andrieuxii cultivada en vivero. ......................................... 9
Figura 1.4 Estrategia experimental.................................................................................. 12
Figura 2.1 Contenedores usados para la cría de S. epilais a) contenedor de plástico, b)

contenedor de vidrio c) contenedor de vidrio con cartón de huevo................................... 14
Figura 2.2 Enfermedades detectadas en larvas de S. epilais asociadas a la humedad en

el contenedor y contacto con sus heces. a) larvas muertas de S. epilais, b) larva de S.
epilais con hongo c) larvas de S. epilais enfermas sobre hojas de N. oleander. .............. 16
Figura 2.3 Porcentaje de pérdida de humedad en hojas de plantas usadas como alimento
para larvas de S. epilais. .................................................................................................. 17
Figura 2.4 Pupas de S. epilais y características morfológicas sexuales a) macho b)

hembra. ........................................................................................................................... 18
Figura 2.5 Cópula de S. epilais en cautiverio a) Cópula de polillas en una relación de 3

machos y 1 hembra b) Hembra ovipositando en hojas de P. andrieuxii en condiciones de
cautiverio. ........................................................................................................................ 19
Figura 2.6 Huevos de S. epilais, círculo negro: huevos no viables presentando

características amorfas y círculo azul: huevos viables, presentando características
óptimas para su desarrollo. .............................................................................................. 19
Figura 3.1 Perfiles cromatográficos por CCD de extractos totales de plantas hospederas
de S. epilais. PA) P. andrieuxii, AO) A. obesum, NO) N oleander .................................... 28
Figura 3.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones semipurificadas de plantas
iii
LISTADO DE FIGURAS
hospederas de S. epilais,(AO) A. obesum, (NO) N. oleander y (PA) P. andrieuxii. a)

Polaridad baja, b) Polaridad media y c) Polaridad alta ..................................................... 29
Figura 3.3 Perfiles cromatográficos de las fracciones de plantas hospederas de S. epilais

en CG-ES a) Polaridad baja, b) Polaridad media. ............................................................ 30
Figura 3.4 Perfiles cromatográficos por HPLC de oleandrina (negro tR min 8.01 min y
fracción de mediana polaridad de N. oleander enriquecida con oleandrina (azul). ........... 30
Figura 3.5 Perfiles de HPLC de la fracción de mediana polaridad del extracto metanólico
de S. epilais y el estándar de oleandrina (tR = 8.01 min). ................................................. 32
Figura 3.6 Perfil cromatográfico en CCD de los productos asilados de la hidrólisis ácida
de oleandrina. .................................................................................................................. 32
Figura 3.7 Estructuras de cardenólidos a) oleandrina, b) oleandrigenina, c) gitoxigenina.

........................................................................................................................................ 33
Figura 3.8 Perfiles cromatográficos por HPLC de los cardenólidos purificados ............... 34
Figura 3.9 Perfiles cromatográficos del producto de hidrólisis de P. andrieuxii, A. obesum

y N. oleander extractos totales. ........................................................................................ 34
Figura 3.10 Perfiles cromatográficos de los productos de hidrólisis de las fracciones de

mediana y alta polaridad de P. andrieuxii y A. obesum. ................................................... 35
Figura 4.1 Pesos de S. epilais durante su desarrollo holometábolo presentando diferentes

dietas en la etapa larval. .................................................................................................. 39
Figura 4.2 Gel de agarosa con muestras de ADN de las diferentes etapas de vida de S.
epilais, usadas en el análisis de metilación del ADN. ....................................................... 40
Figura 4.3 Metilación global en el ciclo holometábolo de S. epilais ................................. 41
Figura 8.1 Espectroscopia de oleandrina de RMN 1H, (CDCl3, 500 MHz) ....................... 57
Figura 8.2 Espectroscopia de oleandrina de RMN 13C, (CDCl3, 500 MHz) ...................... 57
iv
LISTADO DE FIGURAS
Figura 8.3 Espectroscopia de oleandrina de RMN, espectro de HMBC........................... 58
Figura 8.4 Espectroscopia de oleandrina de RMN, espectro de HSQC ........................... 58
Figura 8.5 Espectroscopia de oleandrigenina de RMN 1H, (CDCl3, 600 MHz ) ................ 59
Figura 8.6 Espectroscopia de oleandrigenina de RMN 13C, (CDCl3, 600 MHz) ............... 59
Figura 8.7 Espectroscopia de gitoxigenina de RMN 1H, (Acetona-D6, 600 MHz) ............ 61
Figura 8.8 Espectroscopia de gitoxigenina de RMN 13C, (Acetona-D6, 600 MHz) ........... 61
Figura 8.9 Curva de calibración con estándares de 5-mC ............................................... 63
v
LISTADO DE TABLAS
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1.1 Plantas hospederas de S. epilais y cardenólidos asociados al secuestro de

defensa contra depredadores. ........................................................................................... 7
Tabla 2.1 Resultados de pruebas de alimentación para S. epilais. .................................. 17
Tabla 2.2 Ciclo de vida de S. epilais establecido en condiciones de cautiverio................ 18
Tabla 3.1 Datos de colecta de plantas y No. de ejemplar del Herbario. ........................... 24
Tabla 3.2 Rendimientos de extractos de plantas hospederas de S. epilais y plantas

control. ............................................................................................................................. 25
Tabla 3.3 Rendimientos de particiones de los extractos metanólicos de hojas de N.

oleander, A. obesum y P. andrieuxii. ................................................................................ 25
Tabla 3.4 Datos espectroscópicos de RMN de oleandrina aislada de hojas de N. oleander.

........................................................................................................................................ 31
Tabla 8.1 Datos espectroscópicos obtenidos experimentalmente de oleandrigenina

comparados con oleandrina ............................................................................................. 60
Tabla 8.2 Datos espectroscópicos obtenidos experimentalmente de gitoxigenina

comparados con los reportados en la literatura (13C) y experimentalmente de
oleandrigenina ................................................................................................................. 62
Tabla 8.3 Pesos de insectos muestreados (mg) .............................................................. 63
Tabla 8.4 Porcentaje de metilación de 5mC .................................................................... 63
Tabla 8.5 Resultados de extracción de ADN ................................................................... 64
vi
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de etilo

MeOH Metanol
CG-ES Cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de
masas
CCD Cromatografía de capa
delgada
CCDP Cromatografía de capa
delgada preparativa
VLC Cromatografía líquida con
vacío
Hx Hexano
HPLC Cromatografía liquida de alta
eficiencia
DNMT Metiltransferasa
CDs Cardenólidos
5-mC 5-Metilcitosina
vii
RESUMEN
RESUMEN
RESUMEN
En la relación interespecífica entre plantas e insectos, se ha observado que plantas de la

familia Apocynaceae producen cardenólidos como mecanismo de defensa; estos
metabolitos pueden ser almacenados y utilizados por algunos insectos como protección
contra sus depredadores. Se ha reportado que la polilla Syntomeida epilais utiliza la
oleandrina, el principal cardenólido de Nerium oleander, como parte de sus mecanismos
de defensa. Recientemente se observó que S. epilais, además de alimentarse de N.
oleander, consume también Adenium obesum y Pentalinon andrieuxii, dos especies
pertenecientes a la familia Apocynaceae. Dado que, hasta ahora no se ha reportado la
presencia de oleandrina en A. obesum o P. andrieuxii, como parte de los objetivos de este
trabajo se decidió investigar la posible producción de este metabolito en los extractos de
hoja de ambas especies, con el fin de establecer su papel en la interacción planta-
insecto. Adicionalmente, y dado que se ha reportado que los mecanismos epigenéticos
están asociados al crecimiento, desarrollo, adaptación, determinación del sexo y fenotipo
de diferentes insectos, otro de los objetivos de este trabajo fue investigar los cambios en
los niveles de metilación del ADN en los insectos, como parte de su proceso de
adaptación a este tipo de defensa.
El estudio fitoquímico de las tres plantas hospederas de S. epilais mostró que N. oleander
es la única productora de oleandrina; sin embargo, los perfiles cromatográficos por HPLC
de los productos de hidrólisis de las fracciones de mediana y alta polaridad de P.
andrieuxii y A. obesum mostraron la presencia de oleandrigenina y gitoxigenina,
sugiriendo la posible presencia de cardenólidos estructuralmente relacionados con
oleandrigenina en los extractos crudos de hoja correspondientes. La futura purificación e
identificación de los cardenólidos presentes en P. andrieuxii y A. obesum permitirá
establecer su función en la interacción de S. epilais con cada una de las plantas.
Por otra parte, el estudio epigenético mostró que no existen variaciones significativas en
el porcentaje de metilación global del ADN en 5-metilcitocina durante la metamorfosis del
insecto y en la dieta proporcionada, sugiriendo que la metilación del ADN no juega un
papel importante durante estos procesos para S. epilais. Estudios futuros de los diferentes
mecanismos epigenéticos permitirán establecer el papel que juegan en el proceso de
adaptación del insecto a su planta hospedera y durante la metamorfosis.
ABSTRACT
ABSTRACT
It has been observed, in the interspecific relationship between plants and insects, that
plants of Apocynaceae family produce cardenolides as a defense mechanism. These
metabolites can be stored and used by some insects as protection against their predators.
It has been reported that the moth Syntomeida epilais uses oleandrine, the main
cardenolide of Nerium oleander, as part of its defense mechanisms. It was recently
observed that S. epilais, besides feeding on N. oleander, also consumes Adenium obesum
and Pentalinon andrieuxii, two species belonging to the family Apocynaceae. Given that
until now the presence of oleandrin in A. obesum or P. andrieuxii has not been reported
yet, as part of the objectives of this work it was decided to investigate the possible
production of this metabolite in the leaf extracts of both species, in order to establish their
role in the plant-insect interaction. Additionally, and given that it has been reported that
epigenetic mechanisms are associated with the growth, development, adaptation,
determination of sex and phenotype of different insects, another objective of this work was
to investigate the changes in DNA methylation levels in the insects, as part of their process
of adaptation to this type of defense.
The phytochemical study of the three host plants of S. epilais showed that N. oleander is
the only oleandrin producer; however, the chromatographic profiles by HPLC of the
hydrolysis products of the fractions of medium and high polarity of P. andrieuxii and A.
obesum showed the presence of oleandrigenin and gitoxigenin, suggesting the possible
presence of cardenolides structurally related to oleandrigenin in the extracts corresponding
leaf crudes. The future purification and identification of the cardenolides present in P.
andrieuxii and A. obesum will allow to establish their function in the interaction of S. epilais
with each of the plants.
On the other hand, the epigenetic study showed that there are no significant variations in
the overall DNA methylation percentage of 5-methylcytocin during the metamorphosis of
the insect and in the provided diet. This suggests that DNA methylation does not play an
important role during these processes for S epilais Future studies of the different
epigenetic mechanisms will allow to establish the role they play in the adaptation process
of the insect to its host plant and during the metamorphosis.
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
La ecología estudia la distribución, abundancia de organismos y las interacciones que

determinan la distribución y abundancia de estos organismos (Begon et al., 2009). A partir
de esto, las interacciones se pueden clasificar en intraespecífica o interespecífica. Dentro
de las interespecíficas destacan la relación que existe entre organismos de diferentes
especies y las formas en las que la evolución ha permitido esta interacción. Para poder
explicar cómo ocurren estas relaciones, es necesario considerar múltiples disciplinas,
entre las que destacan la química y la epigenética.
La epigenética se basa en el estudio de los factores no genéticos a nivel molecular, que

regulan la expresión de genes que se ven afectados por cualquier organismo (Krause et
al., 2009; Quintero, 2011). La relación entre la ecología y la epigenética se ha estudiado
para conocer las variaciones fenotípicas que presentan ciertos organismos para su
adaptación como resultado de sus interacciones sociales y ambientales (Kilvitis et al.,
2014). Una de las modificaciones químicas más estudiadas por la epigenética es la
metilación del ADN, dada su importancia en la expresión o represión de la expresión de
genes (De-la-Peña et al., 2015).
Los cambios en los niveles de metilación del ADN en insectos se han relacionado con
procesos de adaptación asociados a las etapas de desarrollo, reproducción y adaptación
a los ecosistemas. Se ha reportado que los porcentajes de metilación global de ADN son
menores del 5% en insectos de los órdenes Díptera y Lepidóptera y mayores del 10% en
los órdenes Hemiptera y Blattodea (Bewick et al., 2017).
Por otra parte, hasta ahora no se conoce él o los procesos involucrados en el desarrollo,
adaptación y evolución de los mecanismos de defensa usados por insectos para evitar a
sus depredadores (Higginson y Ruxton, 2010; Evans, 1990; Endler y Mappes, 2004;
Weiss, 2006). Uno de los mecanismos de defensa utilizado por los insectos que ha sido
ampliamente estudiado, es el uso de defensas químicas; éstas pueden ser sintetizadas de
novo, a partir de productos del metabolismo, o adquiridas como parte de su dieta (Rojas
1
INTRODUCCIÓN
et al., 2012). El estudio de este último mecanismo de defensa, forma parte de lo que se
conoce como Ecología Química.
La ecología química estudia el papel de los metabolitos secundarios en las interacciones

intraespecificas e interespecificas. Derivado de estos estudios se ha generado el término
“semioquímicos” para designar a los metabolitos secundarios están involucrados en
interacciones ecológicas (J H Law y Regnier, 1971; Ehrlich y Raven, 1964).
Una de las características más interesantes en la interacción planta-insecto es el alto

grado de especialización en la alimentación de los insectos herbívoros, que se han
clasificado como especialistas o generalistas. Los insectos especialistas se dividen en
monófagos y olífagos. Los monófagos (lepidópteros, hemípteros y coleópteros) se
caracterizan por alimentarse de una sola o un número limitado de especies de plantas
estrechamente relacionadas.
La alimentación especializada, en muchos casos, está dada por la influencia o beneficios

que les pueden aportar las plantas hospederas a los insectos; uno de los beneficios es la
asimilación de metabolitos secundarios como parte de una estrategia de defensa contra
potenciales depredadores. Los metabolitos secundarios pueden utilizarse una vez
modificados por un proceso de asimilación o pueden guardarse sin ser modificados, lo
que se conoce como secuestro (Rojas et al., 2012). Entre los metabolitos que se han
reportado como secuestrados en la dieta de insectos, se encuentran los alcaloides y los
terpenoides (Nishida, 2014). Dentro de los terpenoides se puede mencionar a los
cardenólidos como uno de los grupos de metabolitos más comúnmente secuestrado por
insectos (Cammack et al., 2011; Agrawal et al., 2012). El interés por el estudio de estos
metabolitos está dado por su diversidad estructural (incluyendo su presencia como
glicósidos o agliconas), modo de uso (mecanismo de defensa) y adaptación para su uso.
De igual forma, establecer el papel de la metilación del ADN en la adaptación para el uso
de este tipo de defensas por parte de insectos.
2
CAPÍTULO I
CAPÍTULO I
1. ANTECEDENTES
1.1 Interacción planta-insectos especialistas
Los metabolitos secundarios de las plantas pueden funcionar como defensa contra
depredadores, enfermedades o plantas competidoras, por lo que son importantes para la
supervivencia de la planta. Durante su estudio, las filogenias de plantas, mostraron que la
distribución de los metabolitos secundarios parece ser exclusivo de ciertas familias, lo que
implica un fuerte componente filogenético y ecológico (Wink, 2003).
Para el caso de las familias Liliaceae, Scrophulariaceae, Ranunculaceae, Asclepiadaceae

y Apocynaceae se ha observado que se han especializado en la producción de ciertos
metabolitos secundarios para la adaptación a sus ambientes hostiles; produciendo
cardenólidos como parte de su metabolismo secundario (Opitz y Müller, 2009; Wen et al.,
2016; Agrawal et al., 2012). Al mismo tiempo, aprovechando la producción de este tipo de
metabolitos, se ha identificado la presencia de insectos especialistas pertenecientes a los
órdenes hemíptera, coleóptera y lepidóptera, los cuales se alimentan de las plantas de
estas familias con el fin de secuestrar metabolitos secundarios y usarlos como mecanismo
de defensa contra depredadores (Holzinger y Wink, 1996).
Para el orden lepidóptera se han reportado aproximadamente 119,000 especies, entre

mariposas y polillas, siendo todas herbívoras son múltiples los ejemplos del secuestro de
cardenólidos y alcaloides de sus plantas hospederas, Euchaetes egle, Abrostola
asclepiadis, Danaus gilippus, Danaus plexippus alimentándose de Asclepias spp. y la
polilla Syntomeida epilais son ejemplos de insectos que usan defensas químicas como
mecanismo de defensa (Martin y Lynch, 1988; Hristov y Conner, 2005; Opitz y Müller,
2009; Leimu et al., 2005; Moranz y Brower, 1998).
1.2 Epigenética en insectos
La tolerancia y el uso de metabolitos tóxicos por parte de un organismo, puede ser

consecuencia de mutaciones específicas en los genes que codifican a enzimas; estas
mutaciones en los sitios de acción de los productos tóxicos confieren la resistencia
requerida para tolerar su presencia (Holzinger y Wink, 1996).
3
ANTECEDENTES
La epigenética estudia la influencia de los factores medioambientales en los mecanismos

de expresión de genes y su regulación, sin afectar la estructura primaria de ácidos
nucleicos; por esta razón, los mecanismos epigenéticos son heredables y reversibles a
nivel celular (Beckerman et al., 2014). Los principales mecanismos epigenéticos que se
han estudiado para explicar el efecto del medio en la activación o represión de genes de
un organismo son la modificación en las histonas, la organización de la cromatina, el
micro ARN y la metilación del ADN.
La metilación del ADN es una marca epigenética que implica la adición de un grupo metilo
en la posición 5 de las citosinas. Los sitios donde ocurre la metilación son llamados CpG
(-C-fosfato-G-) y las secciones de la cadena del ADN con una alta densidad de CpG son
designadas “islas CpG”; en estas últimas es donde, generalmente, se localizan las
regiones promotoras de genes (Dolomatov et al., 2018). La metilación del ADN se lleva a
cabo mediante varias enzimas conservadas evolutivamente conocidas como ADN
metiltransferasas (DNMTs), las cuales se clasifican en de novo y mantenimiento. Las
metiltransferasas de novo son responsables de establecer nuevos patrones de metilación
dentro del genoma de un organismo (Kato et al., 2007) mientras que las metiltransferasas
de constitutivas conservan los patrones de metilación establecidos a través de las
generaciones, metilando sustratos de ADN hemimetilado (Chen et al., 2003).
Generalmente, la presencia de una o más copias de DNMTs se considera necesaria para
un sistema funcional de metilación del ADN (Goll y Bestor, 2005). La metilación del ADN
juega un papel importante en el ecosistema y en la interacción entre diferentes especies,
ejemplo. algas, plantas, peces e invertebrados, ya que se han asociado cambios
epigenéticos tanto en plantas como en insectos, como consecuencia de diferentes tipos
de estrés en su ambiente, incluyendo falta de agua, luz, temperatura, desarrollo social y,
en especial, alimentación (Vandegehuchte y Janssen, 2014).
El estudio y conocimiento de la regulación epigenética en insectos es limitado (Glastad et

al., 2011). Sin embargo, se ha reportado que la metilación del ADN es indispensable para
la sobrevivencia de algunas especies como la Musca domestica donde la metilación del
ADN está involucrada en la diferenciación sexual, detectándose niveles de metilación
globales diferentes en hembras y machos (Schutt y Nothiger, 2000; Dubendorfer et al.,
2003), para el caso del escarabajo Tribolium castaneum la metilación del ADN está
4
ANTECEDENTES
asociada al cambio de estadios durante su desarrollo fisiológico, observándose altos

porcentajes de metilación del ADN en embriones, comparados con los niveles en larvas,
pupas y adultos, y disminuyendo el porcentaje global de metilación del ADN en la etapa
de metamorfosis (Feliciello et al., 2013), por otra parte, los cambios fisiológicos que
presenta la polilla Ephaestia kuehniella al exponerse a altas temperaturas, se han
asociado a cambios epigenéticos que resultan en un fenotipo diferente en las poblaciones
de esta especie (Pavelka y Koudelová, 2001). El porcentaje de metilación del ADN
también se ha relacionado con la alimentación de los insectos, como en el caso de Apis
mellifera donde la alimentación de las larvas de los huevos fecundados definirá la casta
social a la que pertenecerá la abeja. La abeja reina se alimentará de jalea real propiciando
niveles altos de metilación del ADN que darán lugar a ese fenotipo, en tanto que la
alimentación de las obreras se basará principalmente de miel (Weiner y Toth, 2012).
Actualmente, los métodos para la determinación de niveles de metilación en el ADN se

dividen en al menos seis grupos: metilación global del ADN, metilación del ADN por
regiones, análisis de todo el genoma, análisis de metilación del ADN por secuenciación,
detección de patrones de metilación específicos y análisis CpG individuales (De-la-Peña
et al., 2015), los cuales han sido usados en plantas y animales.
1.3 Syntomeida epilais
Syntomeida epilais, perteneciente a la superfamilia Noctuoidea, familia Arctiinae,

subfamilia Ctenuchidae (Sanderford y Conner, 1995), se localiza en climas cálidos y su
distribución se extiende en gran parte del continente Americano.
El ciclo de vida de S. epilais es holometábolo, con cuatro etapas de vida: huevo, larva,
pupa y polilla. En la primera etapa la hembra coloca huevos (racimos de 12-75 huevos)
por debajo de las hojas de su planta hospedera (Figura 1.1 a); una vez eclosionados, los
huevos se convierten en larvas. El primer alimento de las larvas es el corión de su huevo
rico en carbohidratos (Montero, 2007), y posteriormente se alimentan de las hojas de la
planta hospedera. La etapa de larva se subdivide en seis estadios y durante esta etapa
las larvas se caracterizan por ser folívoras y presentar una coloración anaranjada con
setas negras, relacionadas con colores aposemáticos (Figura 1.1 b). Una vez concluidos
los seis estadios, el siguiente proceso es el de pupa (Figura 1.1 c), seguido de la etapa de
adulto (polilla) donde S. epilais presenta alas de color azul o verde incandescente con
5
ANTECEDENTES
lunares de color blanco, abdomen de color rojo o naranja relacionados con colores
aposemáticos (Figura 1.1 d).
Figura 1.1 Ciclo de vida holometábolo de S. epilais (a) Huevo (b) Larva (c) Pupa (d)
Polilla.
Un estudio realizado con diferentes plantas, algunas reconocidas por su contenido de

cardenólidos (Helleborus viridis, Digitalis purpurea, Euonymus europaea), reveló que la
selección de plantas utilizadas como alimento en estado inmaduro (larval) es muy
importante, pues S. epilais presento poca tolerancia a varias de las especies y problemas
para alcanzar su desarrollo al consumir otras plantas. Por esta razón, y dado que
inicialmente la única planta que permitió un desarrollo y crecimiento normales de la polilla
después de ingerirla fue Nerium oleander, S. epilais fue clasificada como monófaga (Wink
y Schneider, 1990).
1.4 Plantas hospederas de S. epilais
Aun cuando N. oleander es considerada como la principal planta hospedera (Abe y

Yamauchi, 1992), de S. epilais, se ha reportado que, durante su etapa larval, la polilla
puede alimentarse de diferentes plantas (Tabla 1.1). Recientemente se observó la
6
ANTECEDENTES
presencia de larvas e individuos adultos de S. epilais en plantas de Pentalinum andrieuxii,

sugiriendo la probable presencia de cardenólidos en las hojas de esta planta.
Tabla 1.1 Plantas hospederas de S. epilais y cardenólidos asociados al secuestro de defensa

contra depredadores.
Planta Familia Cardenólidos Distribución Fuente

reportados
en plantas
Adenium Apocynaceae N/I Sudáfrica (Black, 1976)
multiforum
Adenium Apocynaceae oleandrigenina “W. Trop”. África a (Quinn, 2008;
obesum gitoxigenina Arabia Versiani et al.,
digitoxigenina Pensilvania y 2014)
Tanzania
Angadenia Apocynaceae N/I Florida al caribe (Black, 1976)
berterii
Bougainvillea Nyctaginaceae N/R España y América (Quinn, 2008)
sp.
Carissa Apocynaceae N/I México, España, (Quinn, 2008)
grandiflora EU, África y
Australia
Echites Apocynaceae N/I Florida a (Quinn, 2008;
umbellatus honduras Black, 1976)
Nerium Apocynaceae oleandrina, Europa, Asia y (Black, 1976;
oleander nerigósida, América Abe y
gitoxigenina Yamauchi,
1992; Quinn,
2008)
Urechites Apocynaceae urechitoxina y Florida al caribe (Black, 1976;
lutea oleandrina Hassall, 1951)
N/R= no reportados, N/I no identificado
El estudio fitoquímico de N. oleander como planta hospedera de S. epilais, demostró el

secuestro de cardenólidos, identificado a oleandrina y nerigosida (Figura 1.2) como los
presentes en mayor concentración en la polilla (Wink y Schneider, 1990). Sin embargo N.
oleander, produce más de 20 cardenólidos incluyendo a oleandrina, 8-hidroxi-
oleandrigenin-3-O-β-D-diginósida, 5α-oleásida A, 14-carbonil-neriásida, 16-hidroxi-
oleásida A, 21-hidroxi-neriásida y 3β-O-(β-D-diginosil)-14β-hidroxi-5β, 14β-card-8,
16,20(22)-dienólida (Cao et al., 2018), por otra parte, 50 son los cardenólidos identificados
en A. obesum, siendo el mayor grupo de metabolitos producidos por la planta. Ejemplo de
7
ANTECEDENTES
esto son la somalina, ongelina, obésida C y D (Versiani et al., 2014). Finalmente, aunque
en P. andrieuxii no se ha reportado la presencia de cardenólidos existe evidencia de la
producción de urechitoxina y oleandrina, cardenólidos encontrados en Pentalinun lutea
(Hassall, 1951) demostrando así, que aunque aún no se han encontrado cardenólidos en
todas las plantas que se han reportado como fuente de alimento para S. epilais. En las
que se tienen estudios fitoquímicos, se reportan estructuras químicas similares.
Figura 1.2 Estructuras de olenadrina, nerigosida y urechitoxina, así como los azúcares
presentes en cada uno de los diferentes cardenólidos.
1.5 Pentalinon andrieuxii
Pentalinon andrieuxii es una enredadera de la familia Apocynaceae, tribu Echites,

conocida como bejuco guaco, cantibteac o contrayerba (Figura 1.3). Se distribuye en la
península de Yucatán, del sur de México hasta Nicaragua; se caracteriza por ser una
planta trepadora con látex lechoso, flores amarillas, fruto de dos folículos, angostamente
terete, de 18–28 cm de largo y 4–7 mm de ancho, con semillas apicalmente comosas
(Herbario CICY, 2010).
Pentalinon andrieuxii es conocida por su uso en la medicina tradicional maya, para curar
las lesiones de leishmaniosis (úlcera del chiclero), como antinflamatorio y antidepresivo.
8
ANTECEDENTES
Como resultado de la búsqueda de metabolitos bioactivos producidos por esta especie

(Chan-Bacab y Pena-Rodriguez, 2001), se identificaron trinorsesquiterpenos (Urechitol A
y B) (Yam-Puc et al., 2009), triterpenos (Domínguez-Carmona et al., 2010), derivados
esteroides (Yam-Puc et al., 2012) y esteroles (Pan et al., 2012)
Figura 1.3 Planta de Pentalinon andrieuxii cultivada en

vivero.
9
ANTECEDENTES
JUSTIFICACIÓN
La selección del alimento de S. epilais en estado larval, asociada a la producción de

cardenólidos en sus plantas hospederas, le ha conferido ventajas para su proliferación. La
adaptación desarrollada por la polilla para secuestrar estos metabolitos puede ser
consecuencia de la expresión de genes relacionados con la tolerancia y/o resistencia a la
toxicidad de los mismos; esta expresión puede estar relacionada con factores no
genéticos como la metilación del ADN dado que se ha demostrado que los niveles de
metilación del ADN pueden influir en los procesos elementales del ciclo de vida de
algunos insectos.
Por otra parte, tomando en cuenta que cardenólidos como la oleandrina y nerigosida,
presentes en las hojas de N. oleander, son secuestrados por las larvas de S. epilais para
asegurar su protección hasta el estado adulto, el estudio fitoquímico de otras plantas
hospederas del insecto permitirá establecer la importancia de los cardenólidos en la
selección de las mismas para su alimentación. Finalmente, los resultados obtenidos
contribuirán al conocimiento fitoquímico, en general, y a la identificación de cardenólidos,
en particular de P. andrieuxii y A. obesum.
10
ANTECEDENTES
HIPÓTESIS
Dado que N. oleander y P. andrieuxii pertenecen a la familia Apocynaceae y ambas

especies son reconocidas como hospederas de S. epilais, es posible que, al igual que en
N. oleander, las hojas de P. andrieuxii contengan cardenólidos que son secuestrados por
S. epilais para su desarrollo y/o defensa y que esta dieta induzca cambios epigenéticos en
el insecto.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la producción de cardenólidos en Pentalinon andrieuxii y evaluar el efecto de

estos metabolitos en la metilación del ADN en Syntomeida epilais.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Analizar la presencia de cardenólidos en Pentalinon andrieuxii utilizando técnicas

cromatográficas de separación y espectroscópicas de identificación.
2. Investigar la presencia de los cardenólidos de P. andrieuxii en Syntomeida epilais.
3. Establecer una metodología para la cría de S. epilais en condiciones de cautiverio
4. Determinar el papel fisiológico de los cardenólidos en el desarrollo de S. epilais
mediante la metilación de ADN.
11
ANTECEDENTES
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Figura 1.4 Estrategia experimental.
12
CAPÍTULO II
CAPÍTULO II
2. CRÍA Y REPRODUCCIÓN EN CAUTIVERIO DE Syntomeida epilais
2.1 INTRODUCCIÓN
Syntomeida epilais ha sido considerada una plaga en plantas ornamentales

pertenecientes a la familia Apocynaceae. La especie se distribuye desde Honduras,
México y Florida. Aunque, las poblaciones en Florida muestran diferencias morfológicas
con las presentes en México y Centro América por lo que se ha propuesto que estas
pertenecen a la subespecie S. epilais juncundissima (Dyar, 1907).
La principal fuente de alimento reportada para S. epilais es Nerium oleander (Wink y
Schneider, 1990; Black, 1976), una especie introducida al continente americano. Sin
embargo, hasta ahora no hay registros que asocien a alguna de las 385 especies de la
familia Apocynaceae que se distribuyen en México como plantas hospederas de esta
polilla (González-Rocha y Cerros-Tlatilpa, 2015).
Los colores aposemáticos (Mcauslane, 2008), al igual que el comportamiento sexual

(Sanderford y Conner, 1995) y su capacidad para secuestrar metabolitos secundarios
tóxicos (cardenólidos) (Bowers, 2009) han generado el interés necesario para estudiar
esta especie. El estudio del secuestro de cardenólidos por parte de S. epilais, que ocurre
únicamente durante su etapa folívora y es aprovechado durante todo su ciclo de vida, ha
permitido conocer las estrategias de defensa de esta polilla y entender el mecanismo de
adaptación que asegura su éxito reproductivo. Sin embargo, el problema principal para el
estudio adecuado de S. epilais es la generación y mantenimiento de una población de
insectos que permita el suministro de individuos en cada una de las etapas de su vida.
Actualmente, la información sobre el comportamiento sexual de S. epilais se limita al

conocimiento de sus hormonas sexuales (Matsuoka et al., 2008) y a los sonidos acústicos
de machos y hembras (Weller et al., 2000). De igual forma, no existe información
relevante sobre la madurez sexual del insecto, la duración de la cópula y la relación
sexual operacional que garantice el éxito del apareamiento. El conocimiento de estas
variables es de particular importancia para asegurar el apareamiento y la sobrevivencia de
una colonia en el laboratorio (Barradas-Juanz et al., 2016).
13
CRÍA Y REPRODUCCIÓN EN CAUTIVERIO DE Syntomeida epilais
Hasta ahora, y a pesar de su importancia ecológica y evolutiva, no existe un método

simple para criar S. epilais en condiciones controladas de laboratorio; los estudios
existentes sobre el ciclo de vida de S. epilais se han realizado con larvas desarrolladas en
condiciones silvestres. En estos casos, el número de individuos depende de factores
como la abundancia de la planta huésped, los depredadores y la estacionalidad (Chacón y
Montero, 2007; Allen et al., 2005). Aun cuando no existen reportes de la cría en cautiverio
de S. epilais u otros Ctenuchidos, para algunos miembros de la superfamilia Noctuoidea
como Spodoptera exigua y S. frugiperda se han desarrollado metodologías para su
crianza y estudio (Elvira et al., 2010; Castro et al., 2009). Con base en lo anterior, uno de
los objetivos de este estudio fue el establecer un protocolo que permitiera el
establecimiento de una colonia de S. epilais que permitiera conocer o confirmar sus
plantas hospederas y registrar su comportamiento durante el apareamiento para
garantizar el éxito reproductivo.
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1 Establecimiento de crianza en condiciones controladas de larvas de S. epilais
Durante la etapa larval, y para asegurar la sobrevivencia de S. epilais en condiciones

controladas, se probaron tres diferentes contenedores: de vidrio (22.0 cm de Ø X 10.5
cm), de vidrio con cartón de huevo (22.0 cm de Ø X 10.5 cm) (ambos cubiertos con
plástico transparente perforado) y de plástico (11.0 cm de Ø X 13.5 cm), cubiertos con tela
de malla (Figura 2.1). Las larvas fueron alimentadas con hojas frescas de N. oleander y
mantenidas bajo condiciones de fotoperiodo 12:12 a temperatura ambiente (34 °C). Se
registró la aceptación del alimento proporcionado en cada uno de los diferentes
contenedores y midiendo la perdida de humedad.
Figura 2.1 Contenedores usados para la cría de S. epilais a) contenedor de plástico, b)
14
contenedor de vidrio c) contenedor de vidrio con cartón de huevo.
Para la prueba de pérdida de humedad del diferente material vegetal de los diferentes
contenedores usados para la crianza de S. epilais se pesaron 16 g de hojas de N.
oleander y se pusieron en cada recipiente por triplicado. Los pesos de las hojas se
registraron a las 24 y 48 horas.
2.2.2 Prueba de alimentación
Se realizó una prueba de alimentación usando hojas frescas de N. oleander, A. obesum,

Bougainvillea sp. P. andrieuxii y Lactuca sp. como control negativo. Se usaron 30 larvas
por planta proporcionada como alimento, que se colocaron en contenedores de vidrio con
cartón de huevo. Se evaluó la aceptación de la dieta y la formación de pupa.
2.2.3 Actividad de apareamiento
Las pupas fueron sexadas utilizando un estereoscopio. Los individuos se separaron en un

cartón de huevo, en jaulas de tela de malla de 30 x 30 x 30 cm, una para cada sexo, y una
vez eclosionadas fueron colocadas en otra jaula de tela de malla (30 X 30 X 80 cm), con
flujo de aire directo y constante, para su reproducción. Las polillas fueron alimentadas con
sacarosa al 10% en un algodón colocado en la parte superior de la jaula de reproducción.
Para el apareamiento se evaluaron cuatro diferentes proporciones: 1♀:1♂ 1♀:2♂ 1♀:3♂

1♀:4♂. Cada proporción fue realizada por triplicado, realizándose observaciones durante
dos noches.
2.2.4 Plantas usadas como alimento
Las plantas (N. oleander, A. obesum, P. andrieuxii, Bougainvillea sp. y Lactuca sp.)
utilizadas como alimento para las larvas de S. epilais se recolectaron en Mérida, Yucatán
y para el caso de N. oleander, A. obesum y P. andrieuxii se depositaron ejemplares de
herbario en el herbario de la Unidad de Recursos Naturales del Centro de Investigación
Científica de Yucatán A.C. con el número de registro 68854 (N. oleander), 68853 (A.
obesum), y, 68850 (P. andrieuxii). Las hojas de Lactuca sp. se adquirieron en un
supermercado local.
15
2.3 RESULTADOS
Como primer acercamiento a la crianza de S. epilais en cautiverio, se estandarizó el

contenedor usado para la fase larval, probando tres diferentes contenedores. Los
resultados obtenidos mostraron que el contenedor de vidrio con cartón de huevo es el
más adecuado debido a que este ofrece una mayor superficie para el movimiento de las
larvas en el contenedor y evita el contacto de las heces con la comida (Figura 2.2).
Adicionalmente, el vidrio facilita la limpieza del contenedor y disminuye la pérdida de
humedad en las hojas de las plantas (Figura 2.3), reduciendo al mismo tiempo el estrés y
el desarrollo de enfermedades en las larvas.
Figura 2.2 Enfermedades detectadas en larvas de S. epilais asociadas a la humedad en el

contenedor y contacto con sus heces. a) larvas muertas de S. epilais, b) larva de S. epilais
con hongo c) larvas de S. epilais enfermas sobre hojas de N. oleander.
Posteriormente se evaluó el porcentaje de pérdida de humedad del material vegetal en

cada recipiente. (Figura 2.3). Los recipientes que mostraron una menor pérdida de
humedad fueron los contenedores de vidrio y de vidrio con cartón de huevo, ya que
ambos podían mantener la humedad de las hojas hasta por 48 horas, con pérdidas
menores al 15%.
16
Figura 2.3 Porcentaje de pérdida de humedad en hojas de plantas

usadas como alimento para larvas de S. epilais.
Una vez identificado el mejor contenedor para la cría de larvas de S. epilais en

condiciones de laboratorio, se realizaron pruebas de alimentación con hojas frescas de N.
oleander, A. obesum, P. andrieuxii, Bougainvillea sp. y Lactuca sp., encontrándose que
las larvas de la polilla solo pueden alimentarse y desarrollarse hasta pupa teniendo como
fuente de alimento las tres especies pertenecientes a la familia Apocynaceae (Tabla 2.1).
Tabla 2.1 Resultados de pruebas de alimentación para S. epilais.
Alimentación Observaciones
Pentalinon andrieuxii (Apocynaceae) Se desarrollaron hasta pupa
Adenium obesum (Apocynaceae) Se desarrollaron hasta pupa
Nerium oleander (Apocynaceae) Se desarrollaron hasta pupa
Bougainvillea sp. (Nyctaginaceae) Sin crecimiento
Lactuca sp. (Asteraceae) Muerte de insectos
Establecida la forma óptima de crianza de las larvas de S. epilais, las larvas de S. epilais
fueron criadas con una dieta mixta de hojas de N. oleander, A. obesum y P. andrieuxxi en
las condiciones establecidas anteriormente, obteniéndose un porcentaje de sobrevivencia
del 72% hasta su última etapa larval (prepupa).
Una vez formadas las pupas, estas fueron sexuadas tomando en cuenta sus
características fisiológicas (Figura 2.4) y colocadas en diferentes recipientes uno para
machos y otro para hembras, hasta su eclosión.
17
Figura 2.4 Pupas de S. epilais y características morfológicas sexuales a) macho b)

hembra.
Los adultos (polillas) de S. epilais fueron colocados en jaulas para su reproducción,

logrando identificar que la proporción sexual 1♀: 3♂ fue la única donde se observó cópula
a las 24 h (n=20) (Figura 2.5 a), en todas las ocasiones se registró entre las 6-8 am, con
una duración de 4-6 horas.
Después de la cópula, a las 48 horas las hembras ovipositarón en hojas de P. andrieuxii

en racimos de entre 3 a 90 huevos (Figura 2.5 b). Al observar los huevos recién
ovipositados se identificaron huevos infértiles o inviables que presentaban una forma
ovalada, aparentemente no turgente y colapsada (Figura 2.6), sin emergencia comparado
con un 100% de eclosión en huevos turgentes. Con las proporciones sexuales 1♀:1♂
1♀:2♂,1♀:4♂, no hubo registro de cópula después de 48 horas.
Finalmente, durante el proceso de seguimiento del ciclo de vida de S. epilais se estableció

el tiempo de duración de cada uno de sus diferentes estadios de la polilla (Tabla 2.2)
logrados en condiciones controladas de laboratorio.
Tabla 2.2 Ciclo de vida de S. epilais establecido en

condiciones de cautiverio.
Etapa de vida de S. epilais Días
Huevo 4-6
Larva 26-46
Pre-pupa 1
Pupa 12-19
Polilla 6-20
18
Figura 2.5 Cópula de S. epilais en cautiverio a) Cópula de polillas en una relación de 3 machos
y 1 hembra b) Hembra ovipositando en hojas de P. andrieuxii en condiciones de cautiverio.
Figura 2.6 Huevos de S. epilais, círculo negro: huevos no viables presentando

características amorfas y círculo azul: huevos viables, presentando
características óptimas para su desarrollo.
19
2.4 DISCUSIÓN
Para la crianza de larvas de lepidópteros se han usado múltiples contenedores

destacando el uso de plástico como material (Castro et al., 2009; Carpenter et al., 2001;
Elvira et al., 2010). Sin embargo, en este trabajo se observó que, en las condiciones
usadas para la crianza de larvas, el uso de plástico dificultaba la limpieza y causaba una
mayor pérdida de humedad. El contenedor de vidrio permitió mayor superficie de
movimiento a las larvas, y evitó el contacto de las excretas con la comida, además de
presentar una buena retención de la humedad después de 48 h. En los contenedores que
no tenía el cartón para aislar las excretas del alimento presentó una rápida pérdida de
humedad en el hospedero, por lo que las larvas perdieron el interés debido a la posible
falta de palatabilidad. De igual manera, las larvas se mantuvieron alejadas de sus
excretas y hojas viejas debido a la posible proliferación de patógenos (Figura 2.2). Las
principales causas de mortalidad en los Lepidópteros son los factores bióticos como virus,
hongos, bacterias y depredadores así como también los factores abióticos; como la
intensidad de luz, la temperatura y la tasa de humedad (Vílchez y Rocha, 2004).
El ciclo de vida holometábolo de lepidópteros es un parámetro variable de acuerdo con la

especie y a las condiciones medioambientales (Chacón y Montero, 2007; Allen et al.,
2005). Para el caso de S. epilais se observó que en condiciones de cautiverio existe una
gran variación en la duración de cada una de sus fases. Independientemente de las
condiciones controladas de temperatura, luz y alimentación. En vida silvestre solo el 5%
del total de huevos ovipositados por las hembras sobreviven en el medio natural y se
transforman en adultos reproductivos (Gómez, 2006). Al comparar los datos obtenidos en
vida silvestre de S. epilais, las larvas tienen una duración en esta etapa de entre 18 a 59
días dependiendo de la estación del año en la cual se desarrolle, lo cual se encuentra
dentro del rango obtenido en este trabajo para esa etapa de vida de la polilla (Bratley,
1932).
En la prueba de alimentación, se partió de conocer que N. oleander es el principal

hospedero de S. epilais. Sin embargo, aún no hay suficiente información que pueda
relacionar a A. obesum y Bougainvillea sp. como plantas hospederas de S. epilias. Los
resultados mostrados en esta prueba confirmaron la dieta monófaga de plantas
pertenecientes a la familia Apocynaceae, y se confirmó a P. andrieuxxi como planta
20
hospedera, siendo este el primer registro de esta planta como hospedera de S. epilais.
Por otro lado, el uso de Bougainvillea sp. resultó en la muerte de las larvas, por lo tanto, el
reporte que existe acerca de esta especie como planta hospedera de S. epilais puede
deberse a que sea usada como fuente floral para el adulto de esta polilla y no como
fuente de alimento para las larvas o un posible error en la identificación de la larva. Para
obtener un buen número de individuos para la reproducción en cautiverio las larvas de S.
epilais que se alimentaron con una dieta mixta de hojas de N. oleander, A. obesum y P.
andrieuxxi presentaron supervivencia del 72% hasta su última etapa larval (prepupa). Es
importante destacar que en la fase de prepupa es muy frágil y se debe evitar movimientos
bruscos para evitar la muerte del insecto.
La proporción de 1♀: 3♂ tiene es adecuada para garantizar una cópula exitosa en

cautiverio de S epilais. Aunque se conoce que S. epilais emite sonidos y feromonas para
la cópula, aún es poco el conocimiento acerca de su comportamiento sexual. En esta
especie las hembras son las únicas productoras de feromonas que se notaron
importantes a la hora de llamar a la cópula (Sanderford y Conner, 1995), realizando
llamados entre las 05.00 y 06.00 horas antes del amanecer con una actividad máxima de
1 hora después de amanecer y observando las cópulas en las primeras horas de la
mañana 06:00 a 08:00 horas teniendo un promedio de 5 horas la duración de la cópula.
Aunque las polillas de S. epilais son nocturnas (Hernández-Baz et al., 2015), exhiben
poca actividad durante la noche pasando el período oscuro en reposo.
Los estudios sobre la proporción de sexos ayudan a identificar las condiciones en las que
no se puede esperar la fertilización de todas las hembras (Vahl et al., 2013) o se pueden
maximizar. Para el caso de H. grandella la proporción menos adecuada para la crianza en
el laboratorio es 1♀: 3♂ (Barradas-Juanz et al., 2016), caso contrario para S. epilais pues
esta misma relación fue con la única que se observaron copulas.
El conocimiento básico del comportamiento de S. epilais en cautiverio podría mejorar con

el estudio de estas polillas y resolver el enigma sobre su sistema específico de protección.
21
22
CAPÍTULO III
CAPÍTULO III
3. BÚSQUEDA DE CARDENÓLIDOS EN N. oleander, P. andrieuxii Y A.

obesum
3.1 INTRODUCCIÓN
La diversidad fitoquímica, es una característica de la vida en la Tierra, para su estudio se

han empleado diferentes técnicas como las cromatográficas, las cuales han ayudado a
entender la amplia diversidad de los productos naturales o metabolitos secundarios. Ya
que estos se presentan como mezclas complejas en matrices biológicas.
Los metabolitos secundarios, se han podido asociar a ciertas respuestas en los

organismos que interactúan con las plantas, de tal forma que los herbívoros ven a las
especies vegetales como “blancos evolutivos móviles” donde la diversidad de los
metabolitos secundarios es en sí misma es una característica defensiva. Dentro de esta
gran diversidad estructural de metabolitos usados como mecanismo de defensa, se
encuentran los cardenólidos.
Los cardenólidos son un grupo de metabolitos C-23 esteroidales de plantas ampliamente

estudiados por su actividad biológica y papel ecológico. Su estudio ha permitido identificar
a la familia Apocynaceae como una de las principales productoras de esto metabolitos.
Identificando hasta el año 2016, 109 diferentes cardenólidos, solo en esta familia (Wen et
al., 2016). La extracción para su estudio y elucidación a partir de las plantas ha sido
complicada debido a las bajas concentraciones en las que encuentran de forma natural
(Tian et al., 2016),(Jolad et al., 1981), (Kareru et al., 2010), (Wen et al., 2016).
En México la familia Apocynaceae es una de las más diversas y además de cardenólidos

se han reportado la presencia de diversos metabolitos secundario incluyendo; alcaloides,
terpenos, esteroides, flavonoides y glicósidos entre otros metabolitos. A los cuales se les
han asociado diversas actividades biológicas (Bhadane et al., 2018).
Para el caso específico de N. oleander, especie perteneciente a la familia Apocynaceae

se han reportado la presencia de 20 cardenólidos incluyendo a oleandrina, 8-hidroxi-
oleandrigenina-3-O-β-D-diginosida, 5α-oleasida A, 14-carbonil-neriasida, 16-Hidroxi-
oleasida A, 21-Hidroxi-neriasida y 3β-O-(β-D-diginosil)-14β-hidroxi-5β, 14β-card-8,
23
BÚSQUEDA DE CARDENÓLIDOS EN N. oleander, P. andrieuxii Y A. obesum
16,20(22)- dienolide (Cao et al., 2018). Por otra parte, se han identificado 50 cardenólidos
en A. obesum incluyendo somalina, ongelina, obesidá C y D, siendo el mayor grupo de
metabolitos producidos por la planta(Versiani et al., 2014). Finalmente, aunque cuando
hasta ahora no se ha reportado la presencia de cardenólidos en P. andrieuxii, existe
evidencia de la producción de urechitoxina y oleandrina en otras especies del mismo
género, ejemplo. Pentalinun lutea (Hassall, 1951). La búsqueda de cardenólidos en estas
tres especies de plantas se realiza con el fin de establecer su producción y estudiar el
papel ecológico en la interacción con S. epilais.
3.2.1 Colecta y extracción del material vegetal
El material vegetal (hojas) se obtuvo colectando las plantas en la ciudad de Mérida

Yucatán, para la elección de las plantas se tomaron en cuenta los reportes de plantas
hospederas de S. epilas, en tanto que para el caso de P. andireuxxi se tomaron en cuenta
observaciones de campo por parte del grupo de química del Centro de Investigación
Científica de Yucatán (CICY). Se prepararon ejemplares de herbario que se depositaron
en el herbario del Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. (CICY) con los
números de colecta en listados en la (Tabla 3.1).
Tabla 3.1 Datos de colecta de plantas y No. de ejemplar del Herbario.
No. De Planta No. de ejemplar Fecha de Lugar de

colecta herbario CICY colecta colecta
1 N. oleander 68854 24/03/17 Casa
particular
2 P. andrieuxii 68850 24/04/17 Vivero CICY
3 A. obesum 68853 24/04/17 Terrenos
CICY
Una vez colectadas las hojas de las tres diferentes especies de plantas, se congelaron
con N2, trituraron y se liofilizaron. El material vegetal seco y molido se pesó y se extrajo
por maceración con metanol (1:3, m/v). Después de 24 horas se filtró y evaporó el
disolvente con un rota vapor. El procedimiento de maceración se realizó por triplicado
obteniendo los rendimientos mostrados en la (Tabla 3.2).
24
Tabla 3.2 Rendimientos de extractos de plantas hospederas de S. epilais y plantas control.
Material vegetal Pesos seco Extracto metanólico Rendimiento (%)

(g) (g)
P. andrieuxii 43.3 7.6 18
Adenium obesum 5.5 1.9 35
Nerium oleander 24.5 7.40 30
Bougainvillea sp. 33.5 6.4 20
Lactuca sp. 19.9 3.7 19
3.2.1 Fraccionamiento de los extractos metanólicos
Los extractos metanólicos de N. oleander, A. obesum y P. andrieuxii se suspendieron en

una mezcla metanol/agua 2:3. La suspensión acuosa resultante se extrajo sucesivamente
con Hx (1:1) y AcOEt (1:1), obteniéndose las fracciones de baja polaridad y polaridad
media respectivamente, la fracción residual se tomó como la fracción de alta polaridad.
Los rendimientos se muestran en la (Tabla 3.3).
Tabla 3.3 Rendimientos de particiones de los extractos metanólicos de hojas de N. oleander, A.

obesum y P. andrieuxii.
Planta Extracto Partición Hx Partición Acuosa

crudo AcEtOH
(PA) 7.61 g 1.92 g 0.42 g 3.55 g
P. andrieuxii 25% 5% 47%
(AO) 1.95 g 0.49 g 0.27 g 1.20 g

A. obesum 25% 14 % 60%
(NO) 7.40 g 0.57 g 2.92 g 1.30 g

N. oleander 7% 39% 20%
3.2.3 Método para el análisis de oleandrina, oleandrigenina y gitoxigenina por HPLC
Los extractos metanólicos de las tres especies de plantas recolectadas y polilla S. epilais
fueron inyectadas en un HPLC Waters con una bomba binaria Waters 600 y un
automuestrador 717.
25
Se utilizó un método de gradiente con una mezcla de acetonitrilo (CH3CN) y H2O, con un
tiempo de corrida de 15 min, flujo de 0.5 mL/min y detector a 220 nm. El volumen total
inyectado fue de 10 µL por muestra; se utilizó una columna fase reversa C-18 X select
HSS 250 × 4.6 mm 5 µm. Como estándar se usó una muestra comercial de oleandrina
(Sigma 465-16-7), oleandrigenina y gitoxigenina fueron obtenidas por la hidrólisis ácida de
oleandrina.
3.2.4 Condiciones para el análisis de extractos crudos y fracciones semipurificadas

de plantas por cromatografía de gases-masas (CG-ES)
La obtención de perfiles cromatográficos de plantas en CG se realizó con un cromatógrafo

GC- OP2010 Plus (Shimadzu, Duisburg, Alemania) equipado con una columna capilar de
sílice fundida (Equity TM-5; 30 m, 0.25 mm, espesor de película de 0.25 m; SUPELCO,
Bellefonte, PA) y un detector de masas con ionización de electrones a 70 eV. Las
muestras (1 μL al 1%) se inyectaron a una temperatura de interfaz de 280 °C y a una
presión de entrada de helio de 135 kPa. La columna se ejecutó a 150 °C durante 3 min y
luego con un gradiente de temperatura de 20 °C/min hasta una temperatura final de 300
°C que se mantuvo durante 35 min.
3.2.4 Aislamiento de oleandrina a partir de hojas de N. oleander
El extracto metanólico de hojas de N. oleander (IF9, 79.00 g) se suspendió en una mezcla

metanol/agua 2:3. La suspensión acuosa resultante se extrajo sucesivamente con Hx
(IF9A) y AcOEt (IF9B), obteniéndose las fracciones de baja polaridad y polaridad media
respectivamente.
La fracción de mediana polaridad (IF9B, 17.90 g) se purificó por VLC, para lo cual primero
se adsorbió una solución de la muestra en gel de sílice (Sigma-Aldrich, tamaño de
partícula de 0.063-0.200 mm) en una relación de 2:1 (p/p). La muestra se colocó en la
parte superior de una columna de gel de sílice grado CCD de 10 cm Ø por 6 cm de altura
y la elución se llevó a cabo de manera isocrática con una mezcla de CH2Cl2/An (8:2, v/v),
monitoreando por CCD, las 19 fracciones obtenidas. Las fracciones que presentaban
oleandrina se combinaron (IF9B, 1.96 g) para su posterior purificaron por cromatografía
en columna por gravedad
La purificación por cromatografía en columna por gravedad de la muestra (IF9BA, 1.96 g)

se adsorbió en gel de sílice (Sigma-Aldrich, tamaño de partícula de 0.063-0.200 mm), en
26
una relación de 2:1 (p/p) y se colocó en la parte superior de una columna de 5 cm Ø y 60

cm de altura empacada con el mismo tipo de gel de sílice. La elución se llevó a cabo de
manera isocrática utilizando una mezcla de Hx/AcOEt/MeOH (60:37:3) colectándose
fracciones de 10 mL. De las 70 fracciones obtenidas, las fracciones 22-29 mostraron la
presencia de oleandrina pura (IF9BA4, 20 mg).
3.2.5 Hidrólisis ácida de oleandrina y extractos metanólicos de plantas de estudio
Metodología 1. En un matraz de 5 mL se colocaron 6.8 mg de oleandrina y 3 mL de una

mezcla de EtOH:H2SO4 (95:5, v/v), la mezcla se dejó en agitación constante a
temperatura ambiente durante 24 h. El curso de la reacción se siguió por CCD y para la
recuperación del producto de hidrólisis, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos
veces con CH2Cl2 (2:1, v/v). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 al 5% (1:1, v/v) y
Después de filtrar y eliminar el disolvente a presión reducida se obtuvo el producto
hidrolizado crudo 4.4 mg.
Metodología 2. En un matraz de 5 mL se colocaron 2.0 mg de oleandrina y 3.0 mL de una

mezcla de EtOH:HCl (95:5, v/v), la mezcla se dejó en agitación constante a temperatura
ambiente durante 24 h. El curso de la reacción se siguió por CCD y para la recuperación
del producto de hidrólisis, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos veces con CH2Cl2
(2:1, v/v). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 al 5% (1:1, v/v) y después de filtrar y
eliminar el disolvente a presión reducida se obtuvo el producto hidrolizado crudo (1.0 mg).
Metodología 3; En un matraz de 5 mL se colocaron 5.0 mg de oleandrina y 3 mL de una
mezcla de EtOH:HCl (95:5 v/v) y la mezcla se calentó a reflujo (70º C) en agitación
constante por 1 h. El curso de la reacción se siguió por CCD y para la recuperación del
producto de hidrólisis, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos veces con CH2Cl2
(2:1, v/v). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 al 5% (1:1, v/v) y después de filtrar y
eliminar el disolvente a presión reducida se obtuvo el producto hidrolizado crudo (3.5 mg).
Para la hidrólisis de los extractos metanólicos y las diferentes fracciones (polaridad baja,
polaridad media, polaridad alta) de P. andrieuxii, A. obesum y N. oleander se siguió la
metodología 3, utilizando con 500 mg de extracto de cada una de las plantas para el caso
de extracto metanólico y 100 mg para las fracciones.
27
3.2.7 Aislamiento de oleandrigenina y gitoxigenina
Para el aislamiento de los productos de hidrólisis se utilizaron 42.5 mg de oleandrina y la

metodología 3 de hidrólisis, obteniéndose 31 mg del producto crudo de reacción, el cual
fue purificado por CCDP, utilizando cromatoplacas de 20 × 20 cm impregnadas con 0.25
mm y 0.5 mm de espesor de gel de sílice 60 FG254 (E.M. Merck), y una elución múltiple (5
veces) con Hx:AcOEt:MeOH (70:25:5). De esta forma se obtuvieron 8.4 mg de
oleandrigenina y 4.3 de gitoxigenina.
3.3 RESULTADOS
Los perfiles cromatográficos por CCD de los extractos metanólicos de N. oleander, A.

obesum y P. andrieuxii (Figura 3.1) mostraron que A. obesum y N. oleander presentan
una mayor similitud, comparado con los de P. andrieuxii.
Figura 3.1 Perfiles cromatográficos por CCD de

extractos totales de plantas hospederas de S. epilais.
PA) P. andrieuxii, AO) A. obesum, NO) N oleander
De la misma forma al comparar los perfiles cromatográficos por CCD (Figura 3.2) y CG-
EM (Figura 3.3) de las fracciones semipurificadas obtenidas a partir de los extractos
crudos de las tres plantas, las fracciones de polaridad baja mostraron la mayor similitud
28
entre las tres especies. El análisis por CG-EM permitió detectar la presencia de escualeno
(tR = 16.30 min), vitamina E (tR = 18.47 min), β-sitosterol (tR = 20.21 min) y lupeol (tR =
20.85 min) en las fracciones de baja polaridad; la presencia de β-sitosterol y lupeol fue
confirmada por comparación con muestras auténticas.
Figura 3.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones semipurificadas

de plantas hospederas de S. epilais,(AO) A. obesum, (NO) N.
oleander y (PA) P. andrieuxii. a) Polaridad baja, b) Polaridad media y
c) Polaridad alta
El análisis por HPLC de las fracciones de cada una de las plantas permitió detectar la
presencia de oleandrina (tR = 8.01 min), en la fracción de mediana polaridad del extracto
de N. oleander (Figura 3.4).
29
Figura 3.3 Perfiles cromatográficos de las fracciones de plantas hospederas de S. epilais en

CG-ES a) Polaridad baja, b) Polaridad media.
0.50
0.40
0.30
AU
0.20
0.10
0.00
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
Minutes
Figura 3.4 Perfiles cromatográficos por HPLC de oleandrina (negro tR min 8.01 min y
fracción de mediana polaridad de N. oleander enriquecida con oleandrina (azul).
Para confirmar la presencia de oleandrina en la fracción de mediana polaridad de Nerium

oleander, ¡se llevó a cabo su purificación por métodos cromatográficos y su identificación
con base a sus datos espectroscópicos (1H-, 13
C RMN y experimentos bidimensionales
Figura 1.3 y Tabla 3.4; Anexo Figura 9.1, 9.2 y 9.3).
30
Tabla 3.4 Datos espectroscópicos de RMN de oleandrina aislada de hojas de N.

oleander.
C/H δC δH (J Hz) COSY HMBC

1 30.5
2
3 71.4 3.90 s
4
5 36.5
6 35.3
7
8
9 41.9
10 35.7
11 84.4
12 50.1
13 39.3
14
15 41.3 (a) 2.74 d (15.6, 9.7) H-16 9, 16, 17
(b) 1.78 11, 12, 16, 17
16 74.0 5.48 td (9.5, 2.6) H-15, H-17 11, 20, 24
17 56.2 3.19 d (8.8) 11, 12, 16, 20, 21,
23
18 16.0 0.94 1, 6, 10
19 23.9 0.94 11, 12, 13, 17
20 167.8
21 121.5 5.98 t (1.7) H-23 17, 20, 22, 23
22 174.2
23 75.7 (a) 4.98 dd, (18.1, 1.19) 20, 21, 22
(b) 4.85 dd (18.1, 1.18) H-23(a)
24 170.5
25 21.2 1.97 H-15(a) 24
1’ 95.6 4.96 d (2.0) 3, 3’, 5’
2’ 34.6 2.21 ddd (12.5, 4.8, 1.1) H-3’ 1’, 3’, 4’
3’ 78.5 3.54 ddd (11.4, 8.9, 4.8) H-2’,H-4’ 4’, 5’, 7’
4’ 76.4 3.16 t (9.2) 2’,3’,5’,6’
5’ 67.7 3.72 dq (9.4, 6.2) H-6’,H-4’
6’ 17.9 1.27 d (6.3 ) H-5’ 4’,5’
7’ 56.5 3.41 s H-5’, H-16 3’
De igual manera, el análisis por HPLC de la fracción de polaridad media obtenida a partir
del extracto metanólico crudo de larvas de S. epilais alimentadas de N. oleander, permitió
detectar la presencia de oleandrina (Figura 3.5), confirmando el secuestro del cardenólido
por parte del insecto.
.
31
Figura 3.5 Perfiles de HPLC de la fracción de mediana polaridad del extracto

metanólico de S. epilais y el estándar de oleandrina (tR = 8.01 min).
El perfil cromatográfico por CG-ES del producto de hidrólisis de oleandrina utilizando HCl
a reflujo por una hora, mostró la presencia de un componente principal (tR = 23.7 min), con
un ion molecular correspondiente al peso molecular de oleandrigenina (432 g/mol).
La purificación del producto de hidrólisis de oleandrina resultó en la obtención de siete

productos puros (Figura 3.6).
Figura 3.6 Perfil cromatográfico en CCD de los

productos asilados de la hidrólisis ácida de oleandrina.
32
El producto obtenido con un Rf de 0.12 se identificó como Oleandrigenina (Figura 3.7 b)

(Anexo Figura 9.5, 9.6 y Tabla 9.1, espectro de 1H y 13
C), en tanto que el producto con Rf
de 0.075 se identificó como gitoxigenina (Figura 3.7 c), (Anexo Figura 9.7, 9.8 y Tabla 9.2,
espectro de 1H y 13
C). Observándose para el caso de oleandrigenina la pérdida de las
señales de los azúcares ubicados en la región de 3 a 5 ppm y en el caso de la
gitoxigenina, el desplazamiento a un campo más bajo del H-16 (5.48 ppm, td, 1H) y la
pérdida de H-25 (1.97 ppm) correspondiente al acetato en el C-16.
Figura 3.7 Estructuras de cardenólidos a) oleandrina, b) oleandrigenina,

c) gitoxigenina.
El análisis por CG-ES de las muestras puras de oleandrigenina y gitoxigenina mostró que
ambas presentan un componente principal con el mismo tiempo de retención y un patrón
de fragmentación similar.
El análisis por HPLC de los tres CDs aislados mostró que la gitoxigenina es la de mayor
polaridad (Figura 3.8).
33
Figura 3.8 Perfiles cromatográficos por HPLC de los cardenólidos purificados
En un primer experimento, se decidió realizar la hidrólisis del extracto total de A. obesum,

Los perfiles por HPLC de los productos de hidrólisis de los extractos crudos de N.
oleander, A. obesum y P. andrieuxii no permitieron detectar la presencia de gitoxigenina u
oleandrigenina en ninguno de ellos (Figura 3.9).
Figura 3.9 Perfiles cromatográficos del producto de hidrólisis de P. andrieuxii, A. obesum y

N. oleander extractos totales.
Sin embargo, los perfiles cromatográficos por HPLC de los productos de hidrólisis de las
fracciones de mediana y alta polaridad de A. obesum y P. andrieuxii, permitió detectar la
presencia de oleandrigenina (tR = 4.96) en los productos de hidrólisis de las fracciones de
polaridad media de P. andrieuxii y A. obesum y de gitoxigenina (tR = 3.71) en el producto
de hidrólisis de la fracción de alta polaridad de P. andrieuxii (Figura 3.10).
34
Figura 3.10 Perfiles cromatográficos de los productos de hidrólisis de las fracciones de

mediana y alta polaridad de P. andrieuxii y A. obesum.
3.4 DISCUSIÓN
En el estudio preliminar de los extractos crudos y fracciones semipurificadas de A.

obesum, N. oleander y P.andrieuxii por CCD y CG-ES, se determinó que la fracción con
menor polaridad es la que presenta mayor similitud de las tres plantas. Logrando
identificar a Escualeno (precusor de terpenos), vitamina E (usada para el crecimiento y
procesos fisiologicos), β-sitosterol (fitoesterol) y lupeol (Hasanuzzaman et al., 2014). Sin
embargo, el analisis comparativo de las fracciones semipurificades de las tres diferentes
plantas no resultó en la identificación de cardenólidos.
Por otra parte oleandrina es una cardenólido mono glicosilado por oleandrosa el cual ha
sido aislado de las hojas de N. oleander (Liu et al., 2018) y asociado al secuestro de
cardenolidos por parte de S. epilais. Con esta información se buscó la presencia de
oleandrina en los extractos crudos y fracciones semipurficadas de A. obesum y
P.andrieuxii para reafirmar que este cardenólido es el buscado por la polilla para la
selección de su alimento. Los resultados mostraron que oleandrina solo está presente en
la fracción semipurificada de mediana polaridad de N. oleander y que S. epilais al
alimentarse de las hojas de esta planta secuetra a oleandrina para usarlo como uno de
sus mecanimos de defensa. Por otra parte con estos resultados se establece que S.
epilais realiza el secuestro de diferentes cardenólidos dependiendo su planta hospedera
35
ya sea N. oleander, A. obesum o P. andrieuxii posiblemente con la misma aglicona

(oleandrigenina) pero diferente glicosilación.
Para el estudio de la producción de cardenolidos producidos por A. obesum y P.

andrieuxii se trabajo con las agliconas de oleandrina obtenidas por medio de hidrólisis
ácida. Con esto se busco evaluar la presencia de agliconas en la fracciones
semipurificadas de las plantas de forma natural como lo reporta (Agrawal et al., 2012)
para plantas de la familia Apocynaceae.
En la estandarización de la detección de las agliconas de cardenolidos se comenzó

utilizando CG- ES, mostrando en los perfiles cromatograficos del producto de hidrólisis, un
componente principal con características a las de oleandrigenina. Sin embargo, al purificar
los productos resultantes de la hidrólisis y determinar su estructura por RMN se logro
identificar a oleandrigenina y gitoxigenina, que al ser comparados sus perfiles
cromatográficos y patrones de fragmentación, se observaron ser los mismos en ambos
casos, a pesar de presentar diferentes características estructurales. Por lo que un proceso
pirolisis en la columna de CG pudiera estar sucediendo como se observa para el caso de
lupeol-3-(3′R)-hidroxi-esterato (Yam-Puc et al., 2013).
Finalmente, HPLC mostró los mejores resultados para el estudio de los cardenolidos,
mostrando en un primer análisis que las fracciones semipurificadas de las tres plantas no
presentaban las agliconas oleandrigenina y gitoxigenina de forma natural probablemente
por no presentar las condiciones que indujera la liberación de estas. Sin embargo, al
hidrolizar la fracción de mediana polaridad y alta polaridad de A. obsum y P. andrieuxii los
perfiles cromatograficos por HPLC sugieren la presencia de cardenolidos con diferentes
características de glicolisacion. Para el caso de A. obesum podría deberse a Obesida B y
C, Obebiosida B y C, Hongeliotriosida y Obetriosida B ya reportadas anteriormente en A.
obesum (Yamauchi y Abe, 1990). Y para el caso de P. andriueuxii podría deberse a la
Urechitoxina encontrada en Pentalinun lutea (Hassall, 1951).
36
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
4. METILACIÓN DE 5-mC ASOCIADOS A LA ALIMENTACIÓN Y

DESARROLLO DE S. epilais
4.1 INTRODUCCIÓN
La metilación del ADN se basa en la modificación covalente que ocurre con la adición de
un grupo metilo a las citosinas del ADN. Desempeña un papel en el silenciamiento y
expresión de los genes (Bewick et al., 2017), su estudio ha sido empleado para evaluar
los cambios a gran escala como la hipometilación e hipermetilación durante el
crecimiento, desarrollo, reproducción y adaptación a señales ambientales en plantas y
animales (Glastad et al., 2011).
Las enzimas ADN metiltransferasas (DNMTs) son las encargadas de regular y llevar a
cabo la metilación del ADN, clasificándolas de novo y mantenimiento, encontrando a las
DNMT3a y DNMT3b asociadas a la metilación de novo y la DNMT1 a la metilación de
mantenimiento (Goll y Bestor, 2005).
Las DNMTs se encuentran en animales e insectos, las cuales son asociadas a la

diversidad y plasticidad (Glastad et al., 2014). En genomas eucariontes, el porcentaje de
metilación de citosinas en insectos es del 0-3%, en mamíferos y pájaros del 5%, en peces
y anfibios del 10% y en algunas plantas más del 30% (Field et al., 2004).
La presencia de 5-mC ha sido reportada en varias especies de insectos, aunque de igual

manera se ha presentado la ausencia del ADN metilado en ciertos ordenes de insectos.
Sin embargo, estos datos deben ser interpretados con precaución, debido a que la
metilación del ADN puede restringirse a etapas de desarrollo particulares, ya que es
posible que la metilación del ADN se conserva en la mayoría, si no es que en todas las
especies de insectos (Field et al., 2004). En lepidópteros la metilación global del ADN se
ha reportado por debajo del 5% tanto en las áreas codificantes como en las no
codificantes, encontrando principalmente DNMT1 y DNMT2 (Bewick et al., 2017). Sin
embargo, aún se desconoce la función específica que realiza en insectos. Por lo que
establecer los niveles de metilación asociados a diferentes dietas y durante el crecimiento
de S. epilais un lepidóptero asociado a su alimentación especializada ayudara a identificar
las posibles aplicaciones de la metilación del ADN en insectos y desarrollo de tolerancia.
37
METILACIÓN DE 5-mC ASOCIADOS A LA ALIMENTACIÓN Y DESARROLLO DE
S. epilais
4.2.1 Colecta de insectos
Se colectaron larvas de S. epilais en sus plantas hospederas para ser criadas en

cautiverio como lo indica el Capítulo 2. Las larvas fueron alimentadas con diferentes
dietas proporcionándoles hojas de N. oleander, A. obesum y P. andrieuxii con el fin de
obtener mayor cantidad de individuos. Después de ser criada S. epilais en cautiverio se
muestrearon 3 individuos por cada estadio (Larva, Prepupa, Pupa y Polilla) y por cada
dieta proporcionada. Para posteriormente congelarlas a -80 °C hasta tener todas las
muestras para su posterior análisis (Anexo Tabla 9.3).
Para la obtención del material biológico correspondiente a las larvas alimentadas de

Lactuca sp. Se colectaron 30 larvas entre el tercer y cuarto instar, las cuales habían sido
alimentadas previamente con hojas de N. oleander, posterior a esto se alimentaron con
hojas de Lactuca sp por 10 días, pasando este periodo se colectaron las larvas y
congelaron a -80 °C.
4.2.2 La extracción de ADN genómico
La extracción del ADN de los diferentes estadios de S. epilais, se realizó siguiendo el

método (Echevarría-Machado et al., 2005). El ADN extraído se re-suspendió en 50 µL de
agua para HPLC con Ph ajustado, su integridad se verificó a través de un gel de agarosa
al 1% y cuantifico espectrofotométricamente mediante un equipo NanoDrop para su
posterior análisis (Anexo Tabla 9.5).
4.2.3 Evaluación del porcentaje de metilación del ADN en S. epilais
Para la determinación del porcentaje de metilación en cada uno de las etapas de vida de
S. epilais, se usó un kit comercial 5-mC DNA ELISA, 2 × 96 rxns, marca Zymoresearch,
evaluando a una concentración de 100 ng/μL de ADN señalada por el kit.
4.3 RESULTADOS
S. epilais fue criada en condiciones controladas para poder ser colectadas cada una de
las muestras del insecto. Se compararon los pesos individuales de las larvas, prepupas
pupas y polillas realizando un análisis de varianza de un factor (ANOVA, -p < 0.05).
38
S. epilais
Encontrándose diferencias significativas exclusivamente en las larvas alimentadas con
Lactuca sp. (Figura 4.1).
Figura 4.1 Pesos de S. epilais durante su desarrollo holometábolo presentando diferentes

dietas en la etapa larval.
La extracción del ADN de insectos fue siguiendo la metodología establecida por

(Echevarría-Machado et al., 2005). Las muestras del ADN, fueron cuantificadas (Anexo
Tabla 9.5) y relacionadas con un gel de electroforesis para confirmar su integridad (Figura
4.2). Para la extracción de ADN solo fueron procesadas dos de las tres muestras
obtenidas de cada uno de los insectos debido a la capacidad del KIT usado para la
evaluación de la metilación global del ADN.
39
S. epilais
Figura 4.2 Gel de agarosa con muestras de ADN de

las diferentes etapas de vida de S. epilais, usadas en el
análisis de metilación del ADN.
Confirmada la integridad del ADN y su cuantificación, se realizaron diluciones a 100 ng/µl

para la evaluación de la metilación global del ADN por medio del kit comercial 5-mC DNA
ELISA. Para este análisis se realizó una curva de calibración con el fin de evaluar el
porcentaje de metilación global de ADN (Anexo Figura 9.9).
Los resultados de la evaluación de la metilación global del ADN en el ciclo de vida
holometábolo de S. epilais alimentada con diferentes dietas, muestran no tener
diferencias significativas independientemente de la fuente de alimento con la que fueron
40
S. epilais
criadas en estado larval. Sin embargo, se puede observar que en su desarrollo
holometábolo presenta una ligera tendencia en el aumento del porcentaje global de
metilación del ADN ya que en estado larval presenta un promedio del 2% en la metilación
global comparado con un 2.5-3% en el de polillas. Finalmente, al evaluar el porcentaje de
metilación en larvas alimentadas de Lectuca sp. se observó un aumento de una unidad
con esta dieta (Figura 4.3, Anexo Tabla 9.4).
Figura 4.3 Metilación global en el ciclo holometábolo de S. epilais
41
S. epilais
4.4 DISCUSIÓN
En el ciclo de vida de S. epilais, los pesos de larvas, prepupas, pupas y polillas no

mostraron diferencias significativas asociados a la dieta proporcionada. Sin embargo,
durante el desarrollo de la metamorfosis los valores presentaron diferencias significativas
con una tendencia a la pérdida de peso. Estos datos son consistentes con la pérdida de
peso esperada para lepidópteros del 20-80% durante la metamorfosis (Molleman, 2011).
Los resultados asociados a la metilación global de 5-mC durante el desarrollo de la

metamorfosis y dieta proporcionada no presentaron diferencias significativas. Y aunque se
sabe que los insectos presentan un gran estrés durante el proceso de metamorfosis y
selección de su alimento aún no queda claro cómo se da a nivel molecular la expresión de
los diversos genes que ayudaran a la formación de cada uno de sus fenotipos o en la
respuesta a cierto estrés (Jones, 1986; Jin et al., 2018). Un primer acercamiento en el
estudio epigenético asociado a la metilación del ADN fue el realizado para Mamestra
brassicae mostrando un aumento en el porcentaje de metilación global comparando la
etapa larval con un 8.9% y polilla con un 9.3% (Mandrioli y Volpi, 2003). Patrón
ligeramente observado en S. epilais durante el proceso de metamorfosis, que, aunque el
porcentaje de metilación se observa dentro del rango del 2 y 3 por ciento los resultados se
observan con una tendencia a aumentar de larvas a polillas. Por otra parte se ha visto que
durante la metamorfosis en lepidópteros también influyen otros mecanismos epigenéticos
como lo es la acetilación de las histonas con Galleria mellonella el cual reportó una mayor
acetilación en las histonas al darse la metamorfosis (Mukherjee et al., 2012). Estos
resultados podrían sugerir el uso de mecanismos epigenéticos sinérgicos en el desarrollo
de la metamorfosis y el ciclo de vida de lepidópteros.
Aunque el trabajo se enfocó en la determinación del porcentaje de metilación de 5-mC. Es

importante tener en cuenta otras marcas epigenética asociadas a la metilación del ADN
que pudiera jugar un papel importante como lo son la N 6-metil adenina (6mA), N 4- metil
citosina (4mC), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC) y 5-carboxilcitosina
(5caC). Ya que para el caso de la modificación N 6- metiladenina (6mA) recientemente se
reportó como una marca importante para el desarrollo de Bombyx mori (Wang et al.,
2018). Quizá sea este el motivo por el cual el porcentaje de metilación global de 5-mC sea
bajo en lepidópteros comparado con otros organismos.
42
CAPÍTULO V
CAPÍTULO V
5. DISCUSIÓN GENERAL
Durante el seguimiento del ciclo de vida de S. epilais y de acuerdo a trabajos publicados,

el tiempo que tarda el desarrollo de cada una de sus etapas de vida, varia y no presenta
un patrón en el tiempo de crecimiento. Así también, en las condiciones de laboratorio
probadas, se logró obtener copulas de la polilla y huevos para continuar con su estudio,
aun cuando trabajos previos mencionan no haber podido criar en cautiverio a la polilla
(Wink y Schneider, 1990).
Por otra parte, dentro de las plantas hospederas reportadas para S. epilais, en estado
larval, se había reportado a Bougainvillea sp la cual no produce CDs (Quinn, 2008). Los
resultados de la prueba de alimentación, arrojaron que las larvas únicamente se alimentan
de plantas pertenecientes a la familia Apocynaceae y el reporte de Bougainvillea sp como
planta hospedera puede deberse a que el adulto (polilla) la use como una de sus fuentes
florales para su alimentación en esta etapa de vida. Por otra parte y debido a que la
familia Apocynaceae es reportada como principal productora de CDs (Wen et al., 2016),
para la búsqueda de estos metabolitos se trabajó exclusivamente con plantas
pertenecientes a esta familia.
En el estudio fitoquímico de los extractos metanólicos de N. oleander, A. obesum y P.

andrieuxii, se observó, en los perfiles cromatográficos por CCD y CG- ES una alta
similitud en la fracción menos polar, lo cual podría deberse a que se conoce que plantas
de la misma familia producen metabolitos secundarios similares de acuerdo a su
parentesco quimiotaxonómico (Chen et al., 2017). Estas características ayudan al
sustento de la producción de CDs en P. andieuxii la cual aún no ha sido reportada con la
presencia de estos metabolitos secundarios, que, caso contrario para N. oleander y A.
obesum se han reportado la producción de CDs con el mismo núcleo esteroideo y
diferente glicosilación (Versiani et al., 2014; Quinn, 2008), probablemente debido a que
las dos especies de plantas son hermanas al estar muy próximas en el árbol filogenético
(Agrawal et al., 2012).
En el estudio de los CDs asociados en la interacción planta-insecto, oleandrina se

pensaba era uno de los principales CDs relacionados con el secuestro de S. epilais y
43
DISCUSIÓN GENERAL
podría ser el determinante para que las polillas elija a sus plantas hospederas (Rothschild
et al., 1973). Sin embargo, los resultados obtenidos mostraron que este CD solo está
presente en N. oleander de tres plantas estudiadas (Figura 3.4), lo que refleja que son
otras características las que busca para que la polilla elija una planta huésped.
Continuando con el estudio de CDs se optó por trabajar con las agliconas pues se había
reportado que S. epilais podría estar hidrolizando los CDs para usarlos de esa manera
(Black, 1976). Sin embargo, en S. epilais solo se identificó en el extracto de mediana
polaridad a oleandrina y las agliconas de CDs no se lograron identificar en ninguna
fracción semipurificada tanto de plantas como de insectos. Por otra parte, para obtener un
acercamiento sobre lo cardenólidos producidos en P. endrieuxii se realizaron hidrólisis
ácida a las fracciones de la planta, identificando que en la fracción de mediana y alta
polaridad están presentes cardenólidos similares a oleandrigenina y gitoxigenina.
La importancia de este tipo de estudios está en el hecho de que en algunos insectos se

ha observado la acumulación de una gran cantidad de compuestos tóxicos que pueden
ser excretados o secuestrados para ser utilizados como sustancias defensivas contra
predadores y patógenos (Zagrobelny et al., 2004; Ode, 2006; Nishida, 2002), para que
pueda darse este mecanismo de defensa se requiere un transporte selectivo y la
capacidad de almacenar que evite la interferencia de la toxina con procesos fisiológicos
del insecto (Kuhn et al., 2004) estos mecanismos de tolerancia a la toxicidad podrían ser
regulados por mecanismos epigenéticos ya que para el caso del árbol filogenético de las
familias Arctiinae y Nymphalidae, S. epilais es la única que presenta este mecanismo de
defensa (secuestro de cardenólidos) lo cual podría deberse a modificaciones puntuales en
el ADN que permitieran la expresión de proteínas que a su vez permitan la adaptación
para esta especie (Wink y Von Nickisch-Rosenegk, 1997).
Con relación a los resultados de metilación global del ADN, no presentaron diferencias
significativas en la dieta proporcionada y en el desarrollo holometábolo de S. epilais.
Mostrando que la metilación del ADN no está asociada a la alimentación folívora. Sin
embargo, no se descarta que pudiera estar asociada en la tolerancia de los cardenólidos
que este secuestrando independiente de la fuente donde los obtenga. Ya que, aunque se
ha reportado que los insectos que realizan su ciclo de vida holometábolo muestran niveles
bajos de metilación global del ADN para Apis melífera resulta importante la presencia de
este mecanismo para poder establecer las castas sociales (Provataris et al., 2018), así
44
DISCUSIÓN GENERAL
también es importante continuar con el estudio y determinación de las zonas donde se

encuentra metilado el ADN pues se reporta que las zonas metiladas del ADN para caso
de insectos puede no representar la inhibición de la expresión del gen y por lo contrario
observarse una zona conservada y mayor expresada, todo dependerá de la zona donde
se encuentre metilado el ADN (Jeong et al., 2018).
45
DISCUSIÓN GENERAL
46
CAPÍTULO VI
CAPÍTULO VI
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
6.1 CONCLUSIONES
En la búsqueda de cardenólidos en Pentalinon andrieuxii el uso de controles como N.

oleander y A. obesum ayudaron para la comparación de perfiles cromatográficos e
identificar que solo N. oleander produce oleandrina. Con esto se estableció la posible
producción de diferentes cardenólidos en las tres especies, logrando identificar
tentativamente la presencia de agliconas de CDs en P. andrieuxii, lo cual ayudará en
estudios futuros para establecer la interacción de P. andrieuxxi- S. epilais.
Para el análisis del papel fisiológico de los cardenólidos en el desarrollo de S. epilais

orientado a la metilación del ADN, se estableció una metodología para la crianza en
cautiverio de la polilla, con la cual se pudo obtener el suficiente número de individuos para
observar que en la metilación de 5mC del ADN, existen variación en cada una de sus
etapas de vida, aumentando conforme se va desarrollando la metamorfosis y en relación
a la dieta proporcionada no existen variaciones significativas.
47
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
6.2 PERSPECTIVAS
De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, se propone continuar trabajando

en el estudio de los insectos que usen como plantas hospederas a P. andrieuxii, N.
oleander y A. obesum, ya que durante la observación en campo. Se logró identificar a
diferentes insectos con diferentes preferencias alimenticias, es decir monófagos, olífagos
y generalistas. Con esto se pretende tener un registro más completo de los insectos
depredadores de estas plantas y contribuir a su estudio en relación a la tolerancia de sus
metabolitos tóxicos que presenta.
De igual manera se invita a continuar en la búsqueda de cardenólidos. Primeramente,

confirmando la presencia de agliconas de CDs en P. andrieuxii y A. obesum, con el
objetivo de establecer la relación que presentan con la polilla S. epilais, así como el
estudio metabólico de plantas que han sido hospedadas por S. epilas y plantas que no lo
han sido. Con el objetivo de establecer las características específicas que busca S. epilais
para ovipositar en su planta hospedera, así como posibles defensas que presentan las
plantas para evitar a sus depredadores.
Por otra parte, continuar con el estudio de S. epilais como modelo del secuestro de
cardenólidos. Estableciendo para el estado larval una dieta artificial con y sin cardenólidos
además de agregarle azacitidina en su dieta, con el fin de establecer si la metilación del
ADN está directamente asociada a la metamorfosis en S. epilais y a la tolerancia a
cardenólidos. Además de usar la tecnología MethylC-Seq para identificar los genes que
se estén metilando y a su vez puedan estar asociados a la metamorfosis o estrés.
Finalmente, investigar diferentes mecanismos epigenéticos como la modificación en las

histonas, la organización de la cromatina o micro ARN en la metamorfosis y secuestro de
cardenólidos, podría dar un panorama más completo de los diversos métodos que usa S.
epilais para generar las adaptaciones y desarrollo de su especie.
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56
ANEXOS
8. ANEXOS
CAPÍTULO 3
1
Figura 8.1 Espectroscopia de oleandrina de RMN H, (CDCl3, 500 MHz)
13
Figura 8.2 Espectroscopia de oleandrina de RMN C, (CDCl3, 500 MHz)
57
ANEXOS
Figura 8.3 Espectroscopia de oleandrina de RMN, espectro de HMBC
Figura 8.4 Espectroscopia de oleandrina de RMN, espectro de HSQC
58
ANEXOS
1
Figura 8.5 Espectroscopia de oleandrigenina de RMN H, (CDCl3, 600 MHz )
13
Figura 8.6 Espectroscopia de oleandrigenina de RMN C, (CDCl3, 600 MHz)
59
ANEXOS
Tabla 8.1 Datos espectroscópicos obtenidos experimentalmente de

oleandrigenina comparados con oleandrina
oleandrina oleandrigenina
C/H δC δH (J Hz) δC δH (J Hz)
1 30.5
2
3 71.4 3.90 s 66.8 4.15 p
4
5 36.5 35.8
6 35.3 35.2
7
8
9 41.9 41.7
10 35.7 35.4
11 84.4 84.2
12 50.1 49.9
13 39.3 39.2
14
15 41.3 (a) 2.74 d 41.2 (a) 2.75 dd
(15.6, 9.7) (15.7, 9.6)
(b) 1.78
16 74.0 5.48 td 73.8 5.49 ddd
(9.5, 2.6) (9.6, 8.7,
2.6)
17 56.2 3.19 d (8.8) 56.1 3.2 d (8.7)
18 16.0 0.94 s 15.9 0.95 s

19 23.9 0.94 s 23.6 0.96 s
20 167.8 167.6
21 121.5 5.98 t (1.7) 121.4 5.98 t (1.9)
22 174.2 173.9
23 75.7 (a) 4.98 dd, 75.5 (a) 5.00 dd,
(18.1, 1.19) (18.2, 1.9)
(b) 4.85 dd (b) 4.87 dd

(18.1, 1.18) (18.2, 1.8)
24 170.57 170.3
25 21.22 1.97 s 1.98 s
60
ANEXOS
1
Figura 8.7 Espectroscopia de gitoxigenina de RMN H, (Acetona-D6, 600 MHz)
13
Figura 8.8 Espectroscopia de gitoxigenina de RMN C, (Acetona-D6, 600 MHz)
61
ANEXOS
Tabla 8.2 Datos espectroscópicos obtenidos experimentalmente de gitoxigenina

13
comparados con los reportados en la literatura ( C) y experimentalmente de
oleandrigenina
Datos de 13C obtenidos de gitoxigenina datos experimentales

(Tori et al., 1973) en TMS
C/H δC δC δH (J Hz)
1 30.0 29.6
2 28.0 27.7
3 66.8 63.6 4.02 m
4 33.5 33.4
5 36.4 36.0
6 27.0 26.6
7 21.4 20.8
8 41.8 41.6
9 35.8 35.1
10 35.8 35.2
11 21.9 21.2
12 41.2 40.0
13 50.4 49.7
14 85.2 84.3
15 42.6 42.7 (a) 2.62 dd (14.8, 7.8)
16 72.8 72.1 4.65 d (7.5)
17 58.8 58.2 3.11 d (7.6)
18 16.9 16.1 0.94 s

19 23.9 23.3 0.96 s
20 171.8 170.5
21 76.7 75.3 5.98 t (1.9)
22 119.6 119.3
23 175.3 173.4 (a) 5.09 dd, (18.2, 1.9)
(b) 5.02 dd (18.2, 1.8)
62
ANEXOS
CAPÍTULO 4
Tabla 8.3 Pesos de insectos muestreados (mg)
Larvas Prepupas Pupas Pupas Polillas Polillas

alimentadas hembra macho hembra macho
Nerium oleander
403.8 383 333.8 337 156.1 172
475.9 355.9 373.7 286.1 222.8 152.5
382.2 362.1 430.5 386.4 153.8 110.1
Adenium obesum
470.2 397 277 281 214 199.8
532.3 350.2 301.1 302.3 237.1 168.3
435.2 233 189.4 313.8 170.6 208.4
Pentalinum andrieuxii
546.2 249.2 216.3 210.1 339.5 207
408.8 309.2 303.6 371.1 208.5 286.4
487.8 407.3 255.8 311.6 114 220.4
Figura 8.9 Curva de calibración con estándares de 5-mC
Tabla 8.4 Porcentaje de metilación de 5mC
A. obesum N. oleander P. andrieuxii Lactuca sp.

Larva 2.0 2.4 2.1 3.3
Prepupa 2.3 2.6 2.4
Pupa macho 2.6 2.4 2.4
Pupa hembra 2.7 2.6 2.8
Polilla macho 2.6 2.7 2.2
Polilla hembra 2.5 2.7 3.3
63
ANEXOS
Tabla 8.5 Resultados de extracción de ADN
A. obesum N. oleander P. andrieuxii Lactuca sp.

ng/µl 260/280 260/230 ng/µl 260/280 260/230 ng/µl 260/280 260/230 ng/µl 260/280 260/230
Larva 1 364.5 1.46 0.58 285.0 1.03 0.46 145.0 1.73 0.73 70.0 1.96 1.16
Larva 2 390.8 1.17 0.62 204.2 1.55 0.59 141.3 1.91 1.15 74.4 1.96 1.39
85.1 1.92 1.33
Prepupa 1 174.0 1.77 1.28 261.5 1.20 0.50 174.7 1.74 1.11
Prepupa 2 220.0 1.49 0.61 207.0 1.19 0.49 87.9 1.55 0.78
Pupa macho 94.7 1.82 1.38 160.7 1.77 0.93 263.2 1.93 1.49
1
Pupa macho 155.0 1.20 0.42 267.0 1.60 0.78 268.7 1.88 1.42
2
Pupa 280.6 1.72 1.16 193.0 1.33 0.57 306.8 1.90 1.38
hembra 1
Pupa 210.0 1.59 0.89 163.6 1.18 0.34 200.1 1.81 1.35
hembra 2
Polilla macho 168.0 1.50 0.60 150.7 1.91 1.08 247.8 1.59 2.36
1
Polilla macho 231.0 1.19 0.55 104.0 1.33 0.48 100.7 1.86 1.12
2
Polilla 165.0 1.75 0.82 136.4 1.87 1.13 127.0 2.00 1.70
hembra 1
Polilla 260.1 1.90 1.39 113.0 1.75 0.89 136.0 1.99 1.56
hembra 2
64

PCB M Tesis 2019 Ismael Villegas Acosta

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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

EL PAPEL DE LOS CARDENÓLIDOS EN LA

Tesis que presenta

ISMAEL FERNANDO VILLEGAS ACOSTA

(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de

Al CONACYT, por la beca otorgada número 453923.

A mis compañeros del Laboratorio de Química Orgánica y Laboratorio de Epigenética y

OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 11

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ..................................................................................... 12

2. CRÍA Y REPRODUCCIÓN EN CAUTIVERIO DE Syntomeida epilais .................... 13

2.1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 13

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 14

2.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 16

2.4 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 20

CAPÍTULO III .................................................................................................................. 23

3. BÚSQUEDA DE CARDENÓLIDOS EN N. oleander, P. andrieuxii Y A. obesum .. 23

3.1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 23

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 24

3.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 28

3.4 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 35

4. METILACIÓN DE 5-mC ASOCIADOS A LA ALIMENTACIÓN Y DESARROLLO DE

4.1 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 37

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 38

4.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 38

4.4 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 42

5. DISCUSIÓN GENERAL ........................................................................................... 43

6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ..................................................................... 47

6.1 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 47

6.2 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 48

Figura 1.3 Planta de Pentalinon andrieuxii cultivada en vivero. ......................................... 9

Figura 1.4 Estrategia experimental.................................................................................. 12

Figura 2.1 Contenedores usados para la cría de S. epilais a) contenedor de plástico, b)

Figura 2.2 Enfermedades detectadas en larvas de S. epilais asociadas a la humedad en

Figura 2.4 Pupas de S. epilais y características morfológicas sexuales a) macho b)

Figura 2.5 Cópula de S. epilais en cautiverio a) Cópula de polillas en una relación de 3

Figura 2.6 Huevos de S. epilais, círculo negro: huevos no viables presentando

Figura 3.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones semipurificadas de plantas

hospederas de S. epilais,(AO) A. obesum, (NO) N. oleander y (PA) P. andrieuxii. a)

Figura 3.3 Perfiles cromatográficos de las fracciones de plantas hospederas de S. epilais

Figura 3.7 Estructuras de cardenólidos a) oleandrina, b) oleandrigenina, c) gitoxigenina.

Figura 3.9 Perfiles cromatográficos del producto de hidrólisis de P. andrieuxii, A. obesum

Figura 3.10 Perfiles cromatográficos de los productos de hidrólisis de las fracciones de

Figura 4.1 Pesos de S. epilais durante su desarrollo holometábolo presentando diferentes

Figura 4.3 Metilación global en el ciclo holometábolo de S. epilais ................................. 41

Figura 8.3 Espectroscopia de oleandrina de RMN, espectro de HMBC........................... 58

Figura 8.4 Espectroscopia de oleandrina de RMN, espectro de HSQC ........................... 58

Figura 8.9 Curva de calibración con estándares de 5-mC ............................................... 63

Tabla 1.1 Plantas hospederas de S. epilais y cardenólidos asociados al secuestro de

Tabla 2.1 Resultados de pruebas de alimentación para S. epilais. .................................. 17

Tabla 2.2 Ciclo de vida de S. epilais establecido en condiciones de cautiverio................ 18

Tabla 3.2 Rendimientos de extractos de plantas hospederas de S. epilais y plantas

Tabla 3.3 Rendimientos de particiones de los extractos metanólicos de hojas de N.

Tabla 3.4 Datos espectroscópicos de RMN de oleandrina aislada de hojas de N. oleander.

Tabla 8.1 Datos espectroscópicos obtenidos experimentalmente de oleandrigenina

Tabla 8.2 Datos espectroscópicos obtenidos experimentalmente de gitoxigenina